專利名稱：用于手術(shù)中的不用吸出的一過(guò)性粘彈性物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及適用于手術(shù)操作的粘性和粘彈性物料領(lǐng)域。具體地說(shuō)，公開了在手術(shù)結(jié)束時(shí)可以就地留下不用吸出的粘彈性物，包括一過(guò)性粘彈性物(具有不涉及剪切的可變粘度)。還公開了一過(guò)性粘彈性物在手術(shù)，特別是眼科手術(shù)中的使用方法。
白內(nèi)障是通常在老年人中發(fā)生的晶狀體不透明。為了改善視力，將白內(nèi)障性晶狀體手術(shù)摘除并在其原位插入一人造眼內(nèi)晶狀體。在這些手術(shù)操作期間，典型地將粘彈性物料注入前房和囊袋以防止前房塌陷并防止組織因物理操作引起的損壞。
已知有許多粘性或粘彈性試劑(本文后面的“試劑”)用于眼科手術(shù)。例如，Viscoat(Alcon Laboratories，Inc.)，含有透明質(zhì)酸鈉和硫酸軟骨素；Healon和HealonGV(Pharmacia Corp.)、AmviscRegular和AmviscPlus(IOLAB)、以及Vitrax(Allergan)，它們都含有透明質(zhì)酸鈉；和Cellugel(Alcon)，它含有羥丙基甲基纖維素(HPMC)，它們都可用于白內(nèi)障手術(shù)。它們被熟練的眼科醫(yī)生用于幾個(gè)目的，包括維護(hù)眼前房并在手術(shù)期間保護(hù)眼組織，特別是角膜內(nèi)皮細(xì)胞，以及作為眼組織處理時(shí)的助劑。
盡管上面所述的所有試劑在白內(nèi)障手術(shù)期間都可以使用，但是每一種都由某些意識(shí)到的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。參見美國(guó)專利US 5,273,056。然而，通常具有足夠粘性和假塑性可用于眼科手術(shù)的所有這些試劑，如果在手術(shù)結(jié)束時(shí)留在眼中，將導(dǎo)致稱之為“IOP峰”的眼內(nèi)壓(“IOP”)過(guò)性增加。(參見，Obstbaum，Postoperative pressure elevation.Arational approach to its prevention and management，J.CataractRefractive Surgery 181(1992).)壓力增加已使試劑干擾房水通過(guò)小梁網(wǎng)組織和鞏膜靜脈竇正常流出(參見，Berson等，Obstruction ofAqueous Outflow by Nodium Hyaluronate in Enucleated Human Eyes，Am.J.Ophthalmology，95668(1983)；Olivius等，Intraocular aftercataract surgery with Healon，Am.Intraocular Implant Soc.J.11480(1985)；Fry，Postoperative intraocular pressure risesA comparison ofHealon，Amvis，and Viscoat，J.Cataract Refractive Surgery 15415(1989).)IOP峰，根據(jù)其數(shù)量和持續(xù)時(shí)間，能夠?qū)σ赘行匝劢M織，包括，但不限于，視神經(jīng)造成很大和/或不可逆損害。
因此，試劑可以容易地從手術(shù)位置除去，典型地通過(guò)吸出，傳統(tǒng)上已被認(rèn)為是試劑在白內(nèi)障手術(shù)中的有用性的整體評(píng)價(jià)的一個(gè)重要特征。在手術(shù)結(jié)束之前通過(guò)除去試劑，外科醫(yī)生希望使任何顯著的IOP峰最小化或者避免之。然而，遺憾的是相對(duì)分散(與粘著相反)或者與眼組織粘連的試劑經(jīng)常難以除去并且這種除去可能給眼帶來(lái)另外的創(chuàng)傷。
已提出將該粘彈性物外源性稀釋以減輕IOP峰。參見美國(guó)專利US4,328,803。然而，根據(jù)所用的特定粘彈性物和手術(shù)技術(shù)，IOP峰可能仍然是一個(gè)問題。最近已提出通過(guò)給予降解性試劑以分解眼中傳統(tǒng)粘性或粘彈性試劑能夠降低或避免IOP峰的發(fā)生。參見例如美國(guó)專利US 5,792,103。這種方法不僅需要向眼中給予第二種藥物，酶試劑，其生物相容性必須得到保證；而且需要在特定設(shè)備中將這兩種試劑適宜混合的手段。
已將粘彈性物推廣為藥用試劑的藥物釋放設(shè)備，在手術(shù)期間涂敷該粘彈性物時(shí)將該試劑給藥。例如美國(guó)專利US 5,811,453(Yanni等)公開了含消炎化合物的粘彈性物以及這些強(qiáng)化粘彈性物在白內(nèi)障手術(shù)中的使用方法。盡管該方案可以改善因手術(shù)創(chuàng)傷引起的眼炎癥，但是這種方案仍然具有呈現(xiàn)IOP峰問題的顯著限制，如上所述。因此，這些強(qiáng)化粘彈性物仍然需要在手術(shù)結(jié)束時(shí)吸出。
因此需要一種改進(jìn)的方法降低或避免眼科手術(shù)，特別是白內(nèi)障手術(shù)中使用傳統(tǒng)粘性或粘彈性試劑帶來(lái)的IOP峰。更具體地說(shuō)，我們認(rèn)為需要一種具有可變或一過(guò)性粘性的改進(jìn)的粘性或粘彈性試劑，這樣在不加入降解試劑的情況下，在手術(shù)中其目的被使用之后其基本上沒有粘性，本文后面將這些試劑稱之為一過(guò)性粘彈性物。然后大量這種過(guò)性粘彈性物可以被外科醫(yī)生留在眼中被身體的自然處理去除，并且沒有產(chǎn)生危險(xiǎn)的IOP峰。
已知在某些體系中存在一過(guò)性粘性。在眼科領(lǐng)域，已知液體涂敷到眼上之后形成凝膠的體系。例如，這種凝膠化可以通過(guò)改變pH觸發(fā)。參見Gurney等，＂The Development and Use of In Situ FormedGels，Triggered by pH＂Biopharm.Ocul.Drug Delivery，(1993)第81-90頁(yè)。還觀察了一些乙基(羥乙基)纖維素醚類(EHECs)當(dāng)以適宜濃度與特定離子表面活性劑混合時(shí)的對(duì)溫度敏感的凝膠化體系(參見，Carlsson等，＂Thermal Gelation of Nonionic Cellulose Ethers and IonicSurfactants in Water＂Colloids Surf.，第47卷，第147-65頁(yè)(1990))以及純甲基乙基纖維素的體系(美國(guó)專利US 5,618,800(Kabra等))。最近，在美國(guó)專利US 6,177,544中公開了一種眼科用的改性膠原，報(bào)道它經(jīng)過(guò)變性失去粘性從而便于除去。然而，據(jù)信沒有這種物質(zhì)的工業(yè)實(shí)施方式可以獲得。還已知可以對(duì)卡拉膠加工將其粘性一過(guò)性調(diào)整至不同的溫度范圍。(參見，Verschueren等＂Evaluation of variouscarrageenans as ophthalmic viscolysers＂STP Pharma Sci，第6卷，第203-210頁(yè)(1996)，以及Picullel等，＂Gelling Carrageenans，＂FoodPolysaccharides and Their Applicarions，編輯Stephen，A.M.，MarcelDekkerNew York，第67卷，第204-44頁(yè)(1995).)。最后，已知吉蘭糖(Gelrite)與特定物接觸時(shí)形成凝膠。Greaves等，＂ScintigraphicAssessment of an Ophthalmic Gelling Vehicle in Man and Rabbit，＂Curr.Eye Res.，第9卷，第415頁(yè)(1990)。已提出將吉蘭糖膠體系用作眼科投藥的載體(Rozier等，＂GelriteA Novel，Ion-Activated，InSituGelling Polvmer for ODhthalmic Vehicles.Effect onBioavailability of噻嗎洛爾，＂Int.J.PSarm.，第57卷第163頁(yè)(1989))，并且目前正有一種吉蘭糖膠體系與噻嗎洛爾，一種β阻滯劑銷售作為青光眼藥物。
然而，將非膠原基一過(guò)性粘性粘彈性試劑作為有效手術(shù)工具，特別是用于眼科手術(shù)，在現(xiàn)有技術(shù)中既沒有公開也沒有暗示。為了最有效地用作眼科手術(shù)工具，該試劑，除了具有在所述溫度范圍內(nèi)具有所需的最初和一過(guò)性粘性之外，優(yōu)選應(yīng)滿足以下要求生理上可接受的摩爾滲透壓濃度和pH；相對(duì)短的粘性一過(guò)性時(shí)間；澄清(不渾濁)；生物相容性；殺菌能力。據(jù)信本發(fā)明的一過(guò)性粘彈性物滿足這些要求。
應(yīng)認(rèn)為手術(shù)期間眼組織的表面溫度約為室溫，或者約25℃或更低，我們發(fā)現(xiàn)在該溫度下它將保持適宜的粘性，但是在略高的溫度(即體溫，約37℃)下粘性快速失去。粘性失去，在沒有加入外源性降解試劑的情況下發(fā)生的，主要是由于手術(shù)結(jié)束之后眼受熱返回到體溫。
本發(fā)明的一過(guò)性粘彈性物的穩(wěn)定性是本發(fā)明的一個(gè)特別重要的特征。如果試劑在使用之前經(jīng)受很大水解、氧化或其它降解，試劑可能失去其粘性并產(chǎn)生無(wú)用或幾乎無(wú)用的粘彈性物。本發(fā)明的優(yōu)選一過(guò)性粘彈性組合物相當(dāng)穩(wěn)定，在貯藏溫度下持續(xù)高達(dá)6個(gè)月呈現(xiàn)低于1％的降解。當(dāng)使用時(shí)這些組合物將產(chǎn)生很少或者沒有IOP峰(如下面定義的)并且在常規(guī)白內(nèi)障手術(shù)之后能夠留在眼中。
適用作一過(guò)性粘彈性物的物質(zhì)包括，但不限于，疏水改性的多糖或粘多糖如透明質(zhì)酸及其鹽(HA)(有或沒有表面活性劑)；透析過(guò)的聚兩性電解質(zhì)或者帶相反電荷的聚電解質(zhì)的透析混合物；帶有陽(yáng)離子親水聚合物的多糖或粘多糖；具有溫度依賴性構(gòu)象一過(guò)性的多糖和親水合成聚合物；及其組合。優(yōu)選疏水改性的多糖或粘多糖。最優(yōu)選疏水改性的HA類，特別是HA-酰胺類。
附1是針對(duì)本發(fā)明的十二烷基酰胺HA和對(duì)照HA描述粘性作為濃度的函數(shù)的圖。
圖2是針對(duì)本發(fā)明的辛酰胺HA描述粘性作為剪切率的函數(shù)的圖。
圖3是描述本發(fā)明的辛酰胺HA的一過(guò)性粘性的圖。
圖4是描述本發(fā)明的高壓滅菌過(guò)的十二烷基酰胺HA的粘性穩(wěn)定性的圖。
圖5是描述本發(fā)明的十六烷基酰胺HA的一過(guò)性行為的穩(wěn)定性的圖。
圖6是描述本發(fā)明的酯化HA的水解速度的圖。
圖7是本發(fā)明的IOP峰模型的圖示表示。
圖8是本發(fā)明的灌注設(shè)備的部分分解斷面圖。
圖9a是用于灌注設(shè)備的眼的頂視圖。
圖9b是圖9a的眼的側(cè)視圖。


圖10是包括前段的本發(fā)明圖8的灌注設(shè)備的橫截面圖。
圖11是描述使用本發(fā)明的IOP峰模型時(shí)傳統(tǒng)粘彈性物和本發(fā)明的一過(guò)性粘彈性物對(duì)IOP的影響的圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及粘彈性物，特別是一過(guò)性粘彈性物、組合物和使用方法。該一過(guò)性粘彈性物的重要用途是在手術(shù)領(lǐng)域，其中在手術(shù)期間將一過(guò)性粘彈性物以其較粘狀態(tài)涂敷，手術(shù)之后，其粘性就地基本上失去。一過(guò)性粘彈性物的優(yōu)選用途是在白內(nèi)障手術(shù)中，其中該粘彈性物慢慢地灌輸?shù)絠)眼前房中以維持圓頂并保護(hù)暴露的組織；和/或ii)后房中以使囊袋膨脹。手術(shù)之后，留在眼內(nèi)的粘彈性物經(jīng)身體加熱至周圍體溫，失去其粘性，(比非一過(guò)性粘彈性物)更易于通過(guò)眼處理除去。本優(yōu)選用途的主要優(yōu)點(diǎn)是避免了其它體系可能發(fā)生的IOP峰。因此，本用途的另一優(yōu)點(diǎn)是外科醫(yī)生能夠采用粘彈性物的傳統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)，并且沒有在手術(shù)結(jié)束之后必須從手術(shù)位置將粘彈性物完全吸出的缺點(diǎn)。如上所述，這種吸出既浪費(fèi)時(shí)間又給患者帶來(lái)其它危險(xiǎn)。
本發(fā)明的一過(guò)性粘彈性物，當(dāng)經(jīng)受從約室溫或手術(shù)溫度(約17-26℃)到約體溫(約35-38℃)的溫度變化時(shí)，通常呈現(xiàn)70％或更多的粘性損失，并且基本上沒有水解。
如上所述，本發(fā)明的優(yōu)選一過(guò)性粘彈性物相當(dāng)穩(wěn)定。本文所用的“相當(dāng)穩(wěn)定”是指粘彈性物在約4℃的冷藏溫度下貯藏持續(xù)高達(dá)6個(gè)月時(shí)通過(guò)水解、氧化或其它降解其疏水側(cè)鏈僅損失1％或更少。
本發(fā)明粘彈性物的一過(guò)性性能優(yōu)選是可逆的。優(yōu)選實(shí)施方式的可逆粘性使得一過(guò)性粘彈性物在使用之前能夠受熱，例如熱殺菌，然后再冷卻用于手術(shù)。
本發(fā)明一過(guò)性粘彈性物的其它優(yōu)選性能包括(1)在手術(shù)之后轉(zhuǎn)變時(shí)間低于約2小時(shí)；(2)光學(xué)澄清的凝膠，很少或者沒有渾濁；(3)與眼組織粘連安全(即，能夠向精細(xì)組織提供一保護(hù)涂層)；和(4)生物相容性。
如上所述，當(dāng)用于白內(nèi)障手術(shù)操作時(shí)，本發(fā)明的一過(guò)性粘彈性物的最重要的特征是這種手術(shù)之后它們將帶來(lái)很少或者沒有IOP峰。為了本發(fā)明的目的，認(rèn)為一過(guò)性粘彈性物將呈現(xiàn)“很少或者沒有IOP峰”。如果0.5ml的10％溶液(即用緩沖等滲鹽溶液將實(shí)際產(chǎn)品組合物稀釋至其最初濃度的10％)在下面所述的驗(yàn)證過(guò)的IOP峰模型(“IOP峰模型”)中產(chǎn)生在基線IOP之上不超過(guò)平均約10mm Hg的IOP峰。
盡管不受理論約束，我們假定本發(fā)明組合物的一過(guò)性粘彈性特性可能歸因于導(dǎo)致粘性的相對(duì)低分子量分子之間的物理關(guān)系，其中所述粘性在給定濃度的這些低分子量分子所預(yù)計(jì)的之外。典型地，本發(fā)明的一過(guò)性粘彈性物是疏水側(cè)鏈與粘彈性化合物共價(jià)相連的改性粘彈性物。未改性的粘彈性物可以不同程度地用不同部分取代以產(chǎn)生本發(fā)明的一過(guò)性粘彈性物。例如，粘彈性物的所有適宜側(cè)鏈(例如就下面進(jìn)一步所述的酯和酰胺一過(guò)性粘彈性物而言，羧酸酯側(cè)鏈)可以被取代(即100％取代)或者僅一部分側(cè)鏈，例如15％取代。一般說(shuō)來(lái)，一過(guò)性粘彈性物將得自已知的粘彈性物并經(jīng)改性呈現(xiàn)上述性能。用于一過(guò)性粘彈性物的制備的可商購(gòu)獲得的粘彈性物的實(shí)例包括透明質(zhì)酸的鹽(例如透明質(zhì)酸鈉(HA))、硫酸軟骨素(CS)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)以及HA和CS的組合。用于制備一過(guò)性粘彈性物的其它粘彈性物包括透析過(guò)的聚兩性電解質(zhì)，例如羧甲基纖維素。
一過(guò)性粘彈性物可以由不同分子量的粘彈性聚合物組成。一般說(shuō)來(lái)，未改性的聚合物的平均分子量將是50,000-1,000,000道爾頓。就HA-基一過(guò)性粘彈性物而言，未改性的HA聚合物主鏈的平均分子量將優(yōu)選是約120,000-約400,000道爾頓(重均分子量)和約50,000-約350,000道爾頓(數(shù)均分子量)。這些優(yōu)選未改性的HA以常規(guī)濃度用于優(yōu)選的手術(shù)目的將呈現(xiàn)不足的粘性?？梢酝ㄟ^(guò)凝膠滲透色譜法(GPC)，也稱之為大小排除色譜法(SEC)，使用折射率檢測(cè)通過(guò)光散射或相對(duì)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)估計(jì)粘彈性物的分子量。分子量典型地影響這些已知粘彈性物的粘度。與本文所述的一過(guò)性粘彈性物有關(guān)的所有分子量，除非另有說(shuō)明，在改性獲得一過(guò)性粘彈性物之前都是未改性聚合物的數(shù)均分子量。
HA(自由酸和鹽形式)可以經(jīng)過(guò)改性呈現(xiàn)上面的性能并因此可用作本發(fā)明的一過(guò)性粘彈性物。例如，十二烷基部分可以與HA的主鏈羧酸基團(tuán)共價(jià)連接形成其十二烷基酯。正如本文所用的，通過(guò)用不同部分酯化其側(cè)鏈改性的HA被稱之為“HA-酯”?？梢栽贖A的羧酸酯基上取代的酯的實(shí)例包括，但不限于，烷基如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一基、十二基、十三基、十四基、十五基、十六基、十七基、十八基、十九基、或者含有高達(dá)30個(gè)碳原子的任何其它烷基；環(huán)烷基，例如環(huán)己基；和芳基，例如苯基；和任何前述基團(tuán)的異構(gòu)體。這些取代基可以任選進(jìn)一步被取代并且任選含有選自O(shè)、N和S的雜原子。這些HA-酯可從Fidia Advanced Biopolymers(Abano Terme，Italy)獲得，或者也可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法合成，例如美國(guó)專利US 5,466,461；5,616,568和5,652,347；將其內(nèi)容通過(guò)引用加入本文。這種取代的程度和類型將影響其低剪切或表觀粘度和低剪切內(nèi)聚力，以及高溫粘性和內(nèi)聚力。優(yōu)選疏水取代基。
由于有幾個(gè)因素影響本發(fā)明組合物的流變性能(例如，取代的類型和程度和粘彈性聚合物(未改性的)的平均分子量和濃度，因此不同參數(shù)的不同組成可以產(chǎn)生類似的流變性能。例如，14％用十二烷酸酯化羧基取代的200kDal HA的0.88％w/v溶液、11％用十二烷酸酯化羧基取代的200kDal HA的1.2％w/v溶液、和4％用十六烷酸酯化羧基取代的200kDal HA的2.55％w/v溶液都呈現(xiàn)類似的粘度和一過(guò)性行為。本發(fā)明的一過(guò)性粘彈性物因此可以通過(guò)“粘性因子”表征，它是通過(guò)下式確定的濃度(w/v％)x分子量(以千道爾頓計(jì)未改性聚合物的)x百分比取代＝粘性因子本發(fā)明的一過(guò)性粘彈性物將具有約200-約50,000的粘性因子。優(yōu)選本發(fā)明的一過(guò)性粘彈性物將具有約1000-約20,000的粘性因子。最優(yōu)選粘性因子是約2000-約10,000的那些一過(guò)性粘彈性物。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是不同參數(shù)的組合物可以產(chǎn)生類似的流變性能(參見前面段)，還應(yīng)理解的是由于參數(shù)的相互作用，具有相同或相似粘性因子的組合物可以具有顯著不同的流變性能。粘性因子僅是用于本發(fā)明預(yù)期目的的粘彈性組合物的適應(yīng)性的一個(gè)常規(guī)指示。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解到通過(guò)改變一個(gè)或多個(gè)參數(shù)，可以獲得給定目的的最佳流變性能。
優(yōu)選的改性透明質(zhì)酸酯包括HA的羧酸酯基用烷基或芳基部分酰胺改性形成HA的烷基或芳基酰胺。正如本文所用的，這些分子被稱之為“HA-酰胺”?？梢栽贖A的羧酸酯基上取代的酰胺的實(shí)例包括，但不限于，烷基如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一基、十二基、十三基、十四基、十五基、十六基、十七基、十八基、十九基、或者含有高達(dá)30個(gè)碳原子的任何其它烷基；環(huán)烷基，例如環(huán)己基；和芳基，例如苯基；和任何前述基團(tuán)的異構(gòu)體。這些取代基可以任選進(jìn)一步被取代并且可以任選含有選自O(shè)、N和S的雜原子。最優(yōu)選的酰胺取代基是十二基。
取代度也可以變化。一般說(shuō)來(lái)，取代將是約2-60％。優(yōu)選取代水平將是約5-40％。優(yōu)選的酰胺取代基是辛基、十二基和十六基；最優(yōu)選十二基。就辛酰胺HA而言，優(yōu)選的變量是取代水平為30-40％；高分子濃度是1-3％重量；并且未改性HA的分子量是200-350千道爾頓(“kDal”)(重均)或120-230kDal(數(shù)均)。就十二基酰胺HA而言，優(yōu)選變量是取代水平是5-32％，更優(yōu)選15-25％，最優(yōu)選10-20％；高分子濃度是0.35-1.2％重量；未改性HA的分子量是200-350kDal(重均)或120-230kDal(數(shù)均)?；蛘?，可以使用較低分子量未改性HA。這種較低分子量一過(guò)性粘彈性物的優(yōu)選參數(shù)是未改性HA的分子量是50-150kDal(重均)，酰胺(優(yōu)選十二基)取代水平是25-40％，并且高分子濃度是0.5-2％(wt./v.)。就該十六基酰胺HA而言，優(yōu)選的變量是取代水平是5-15％；高分子濃度是0.3-0.8％重量；未改性HA的分子量是200-350kDal(重均)或120-230kDal(數(shù)均)。取代水平可以通過(guò)實(shí)施例11中所述的NMR測(cè)定。在大多數(shù)情況下，本文的這些實(shí)施例中所述的取代水平是由HA-酰胺的供應(yīng)商，F(xiàn)idia AdvancedBiopolymers提供的。
本發(fā)明的一過(guò)性粘彈性組合物通常具有足夠的零剪切粘性，可用于粘性手術(shù)操作。典型地這種零剪切粘性在25℃下是至少1Pa-s。優(yōu)選組合物在25℃下呈現(xiàn)約5-10,000Pa-s的零剪切粘性。最優(yōu)選是在25℃下呈現(xiàn)約40-1000Pa-s的零剪切粘性的那些。
這些HA-酰胺可以從Fidia Advanced Biopolymers(Abano Terme，Italy)商購(gòu)獲得，可以通過(guò)Danishefsky和Siskovic于＂Conversion ofCarboxyl Groups of Mucopolysaccharides in Amides of Amino AcidEsters，＂Carbohydrate Res.第16卷，第199-205頁(yè)(1971)、Bulpitt和Aeschlimann＂New strategy for chemical modification of hyaluronicacidPreparation of functionalized derivatives and their use in theformation of novel biocompatible hydrogels，＂Biomed.Mater.Res.第47卷第152-169頁(yè)(1999)中所述的方法合成，或者可以通過(guò)其它方法合成。WO 00/01733(Bellini等)，公開了HA的酰胺及其制備方法，通過(guò)引用將其加入本文。該文獻(xiàn)通常公開了這些酰胺用作用于粘彈性手術(shù)或眼科手術(shù)中釋放藥物的載體，但是沒有公開或暗示本發(fā)明的新型組合物和方法。
本發(fā)明的其它一過(guò)性粘彈性物包括疏水基團(tuán)通過(guò)羥基部分、N-乙酰胺部分或羧基與HA結(jié)構(gòu)相連的改性HA，并已經(jīng)轉(zhuǎn)化形成疏水胺(＂HA-胺＂)、醚(＂HA-醚＂)、硫醚(＂HA-硫醚＂)和烷基(＂HA-烷基＂)側(cè)鏈。這些一過(guò)性粘彈性物的實(shí)例包括HA烷基醚、HA烷基胺、HA烷基硫醚、HA烷基氨基甲酸酯、HA烷基硫代氨基甲酸酯、HA烷基硫脲和HA烷基脲，其中烷基可以是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一基、十二基、十三基、十四基、十五基、十六基、十七基、十八基、十九基、或者含有高達(dá)30個(gè)碳原子的任何其它烷基；和烷基的任何異構(gòu)體，包括環(huán)烷基和芳基異構(gòu)體。這些一過(guò)性粘彈性物例如可以通過(guò)Mareh，Advanced Organic Chemistry-Reactions，Mechanisms，andStructure，John Wiley & SonsNew York，第4版，1992中公開的方法制備。
如上所述，為了獲得本發(fā)明的一過(guò)性粘彈性物，不同分子量的硫酸軟骨素(CS)可以類似于HA進(jìn)行改性。例如，羧酸酯基可以如上所述與HA類似的方式酰胺化。此外，硫酸軟骨素的羥基或N-乙酰胺部分可以如上所述與HA相同的方式使用相同的烷基、環(huán)烷基和芳基取代基轉(zhuǎn)變成疏水胺、醚、硫醚、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、脲、和硫脲，以便獲得本發(fā)明的一過(guò)性粘彈性物。這些一過(guò)性粘彈性物的實(shí)例包括CS烷基醚、CS烷基胺、CS烷基硫醚、CS烷基氨基甲酸酯、CS烷基硫代氨基甲酸酯、CS烷基硫脲和CS烷基脲，其中烷基可以是甲基、己基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一基、十二基、十三基、十四基、十五基、十六基、十七基、十八基、十九基、或者含有高達(dá)30個(gè)碳原子的任何其它烷基；和這些基團(tuán)的任何結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，包括環(huán)烷基和芳基異構(gòu)體。這些一過(guò)性粘彈性物可以通過(guò)March，AdvancedOrganic Chemistry-Reactions，Mechanisms，and Structure，John Wiley& SonsNew York，第4版，1992中公開的方法制備。
以下實(shí)施例1-6是本發(fā)明優(yōu)選組合物的實(shí)施例實(shí)施例1
實(shí)施例2
實(shí)施例3
實(shí)施例4
實(shí)施例5
實(shí)施例6
以下實(shí)施例7-18描述本發(fā)明組合物的流變性能。實(shí)施例7將本發(fā)明的HA-酰胺組合物的流變性能與類似非一過(guò)性HA組合物通過(guò)幾個(gè)濃度進(jìn)行比較。根據(jù)以下步驟制備實(shí)施例3的10％取代的十二烷基酰胺-HA制品(0.2％、0.4％、0.6％、0.8％和1.0％w/v)和含有0.2、0.4、0.6、0.8和1.0％的前體未改性HA的對(duì)照組合物。將含有不同制品的容器加蓋并在50℃下加熱4天，偶爾旋轉(zhuǎn)以確保所有十二烷基酰胺-HA或HA粉末都浸泡在緩沖液中并完全溶解。將每一溶液轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的5cc注射器中，加蓋并在2500RPM下離心去除氣泡。然后將填充過(guò)的注射器每一個(gè)經(jīng)一雙插孔裝置與一空5cc注射器相連。將這些注射器冷卻1小時(shí)并在其各自裝置上使用50個(gè)通路混合。
為了進(jìn)行流變分析，通過(guò)27號(hào)針將樣品吸入一Bohlin CS-10(Constant Stress Rheometer)樣品平皿上，同時(shí)將該儀器調(diào)整至粘度測(cè)定模式。使用1.09-52.89Pa的剪切力于16℃下相對(duì)剪切率測(cè)定樣品粘度。考慮到因高剪切率結(jié)束時(shí)的向心力可能損失樣品，因此盡可能使用接近全剪切率清掃。就每一樣品而言，使用10℃-50℃的溫度范圍和2.5℃/min的加熱速度，然后表征其一過(guò)性行為(粘度相對(duì)溫度)。對(duì)每一樣品使用相同參數(shù)處理。結(jié)果匯總于表1。表110％取代的十二烷基酰胺-HA與對(duì)照HA于16℃下的粘度
如表1所示，十二烷基酰胺-HA組合物比未改性的HA組合物粘得多。同樣，低剪切粘度通過(guò)約5個(gè)數(shù)量級(jí)的增加與遞增的十二烷基酰胺-HA濃度(即0.2％-1.0％w/v)有關(guān)。實(shí)施例8流變地評(píng)價(jià)實(shí)施例4的組合物。以與實(shí)施例6中公開的相似的方法制備該組合物。
使用粘度相對(duì)剪切力的CS-10控制應(yīng)力流變儀用與實(shí)施例6中所述相同的步驟對(duì)該樣品進(jìn)行流變處理。剪切應(yīng)力范圍是0.41-32.58Pa。結(jié)果匯總于表2。表216℃下32％取代的辛酰胺-HA的粘度對(duì)剪切應(yīng)力
如表2所示，其1％溶液證實(shí)約1000Pa-s的低剪切粘度。
在一類似試驗(yàn)中，在17℃-37℃和1.781Pa的剪切應(yīng)力下測(cè)定組合物的粘度。結(jié)果匯總于表3。表332％取代的辛酰胺-HA的1％溶液的粘度相對(duì)溫度
如表3所示，并如圖3所述，該物質(zhì)的一過(guò)性粘度損失行為與遞增的溫度線性相關(guān)。在該溫度范圍內(nèi)的總粘度損失為約88％。實(shí)施例9在以下試驗(yàn)中以殘余粘度觀察本發(fā)明的優(yōu)選組合物的貯藏穩(wěn)定性。將實(shí)施例2的十二烷基酰胺-HA于4℃和室溫(“RT”，即21-23℃)溫育5.5個(gè)月。在給定時(shí)間點(diǎn)取等量的每一組合物并進(jìn)行該樣品的流變分析(本實(shí)施例的剪切應(yīng)力范圍是0.16-52.89Pa.)。結(jié)果列于表4并描述于圖4。表410％取代的十二烷基酰胺-HA的0.8％溶液的粘度穩(wěn)定性
如表4所示，十二烷基酰胺-HA組合物在低剪切條件下在0時(shí)間對(duì)照和1個(gè)月溫育時(shí)間點(diǎn)之間粘度經(jīng)歷16Pa-s的最初偏移。然而，從1個(gè)月溫育時(shí)間點(diǎn)到5.5個(gè)月溫育時(shí)間點(diǎn)粘度穩(wěn)定。
還測(cè)定十六烷基酰胺-HA組合物于4℃下貯藏5.5個(gè)月的一過(guò)性穩(wěn)定性。結(jié)果公開于表5。表58％取代的十六烷基酰胺-HA于磷酸鹽緩沖液中4℃下貯藏的粘度相對(duì)溫度穩(wěn)定性分析
如表5和圖5所示，在溫度從25℃到37℃變化時(shí)所有組合物的粘度都是一過(guò)性的，在2.89Pa的剪切應(yīng)力下其粘度損失在70％-80％之間。這與類似開始粘度的透明質(zhì)酸溶液的粘度損失僅約35％形成對(duì)比。實(shí)施例10通過(guò)以下試驗(yàn)觀察本發(fā)明的十二烷基酰胺-HA組合物的穩(wěn)定性。將實(shí)施例7的1％w/v十二烷基酰胺-HA組合物于4℃、室溫(21-23℃)和37℃下溫育6個(gè)月。在該適宜時(shí)間下，取等量的組合物并使用毛細(xì)管氣相色譜法(GC)分析十二烷基酰胺-HA的化學(xué)穩(wěn)定性。在配備有火焰離子化檢測(cè)器(FID)的Hewlett Packard 5890A GC系統(tǒng)上使用以下參數(shù)進(jìn)行GC
所用柱是來(lái)自J&W Scientific，(Folsom，CA)的DB5熔融二氧化硅毛細(xì)管柱(長(zhǎng)30米，內(nèi)徑為0.32mm，膜厚為1.0mm)。
給定溫育時(shí)間之后，樣品與1等重量的2份醋酸乙酯和1份乙醇(也是重量)的混合物混合并在50℃下溫育1小時(shí)。向該混合物中加入3重量份以上的醋酸乙酯-乙醇混合物。這第二次加入使多糖沉淀，將其離心掉，上清液通過(guò)GC分析分解的疏水基團(tuán)，十二烷基胺的存在。如果十二烷基胺-HA的側(cè)鏈100％水解，10％取代的十二烷基胺-HA全部沉淀將在上清液獲得42ppm十二烷基胺。在不同溫度和溫育時(shí)間下，該試驗(yàn)結(jié)果顯示在處理的組合物樣品的上清液中有不到1ppm的十二烷基胺。這些結(jié)果說(shuō)明一過(guò)性粘彈性物的酰胺鍵在緩沖組合物中非常穩(wěn)定。實(shí)施例11測(cè)定疏水-改性的透明質(zhì)酸(HM-HA)化合物的疏水基團(tuán)取代水平的NMR分析向4mL玻璃小瓶中加入3-5mg的HM-HA物料。向相同小瓶中加入0.8mL水，然后將該小瓶于旋風(fēng)混合器上攪拌5-10秒鐘。將樣品小瓶放入調(diào)整至50℃的烘箱中并加熱過(guò)夜(15-20小時(shí))溶解。第二天通過(guò)折斷開密封安瓿并向含有約900單位酶(1U/uL)中加入0.8mL水制備透明質(zhì)酸酯裂解酶(600-900單位/密封安瓿，Cat.No.H-1136，Sigma Chemical Co.)酶溶液。然后向該小瓶中加入100μL(0.1mL)的該酶溶液。小瓶加蓋并放入37℃烘箱中過(guò)夜(15-20小時(shí))。
第二天，從烘箱中取出小瓶并將100μL(0.1mL)氧化氘(99.6％原子-％D，Cat.No.42，345-9 Aldrich Chemical Co.)加入小瓶中?；旌现?，使用一次性玻璃轉(zhuǎn)移移液管將溶液轉(zhuǎn)移到NMR管中。然后分析樣品，在能夠以精確積分峰信號(hào)的水分抑制模式操作的600MHzBruker NMR儀器上獲得質(zhì)子NMR光譜。
使用該酶處理過(guò)的HM-HA樣品的NMR光譜，由通過(guò)將0.8-1.3ppm的疏水殘基所指示的3個(gè)信號(hào)的積分值加在一起的積分值相對(duì)2.0-2.1ppm下的N-乙酰基甲基的2-4個(gè)信號(hào)計(jì)算疏水取代水平。
0.8-1.3ppm之間的三個(gè)信號(hào)起源于與包含n個(gè)碳原子的疏水性基因中C2-Cn碳原子鍵合的氫原子。透明質(zhì)酸裂解酶在疏水基團(tuán)區(qū)域或者N-乙?；谆盘?hào)區(qū)域沒有干擾信號(hào)。由于該N-乙酰基甲基在HA結(jié)構(gòu)的每一個(gè)重復(fù)單元上，因此疏水取代水平可以由疏水基團(tuán)的積分值與N-乙酰基甲基的積分酯之比計(jì)算。因此，具有直鏈正常烷基[-(CH2)n-1CH3]作為n碳的疏水取代基的HM-HA物質(zhì)的取代度的計(jì)算可以通過(guò)等式給出％疏水取代＝[積分0.8-1.5ppm/(2(n-1)+1)]/[積分2.0-2.1ppm/3]X100實(shí)施例12以下實(shí)施例證明不太優(yōu)選的本發(fā)明粘彈性試劑的較低穩(wěn)定性。與實(shí)施例1-6類似的組合物，其中粘彈性試劑被15％十二烷基酯-HA，鈉鹽(約200kDa)或者用43％或52％苯甲基酯-HA，鈉鹽(約200kDa最終、改性的粘彈性物)替換，以與實(shí)施例7中公開的相似方法制備。組合物于4℃、RT和37℃下溫育9.5周。使用實(shí)施例10的GC法定量十二醇或苯甲醇(各自疏水酯側(cè)鏈的分解產(chǎn)物)。
在給定溫育時(shí)間之后，將樣品與4體積的丙酮混合，這樣使得多糖沉淀。然后將沉淀的多糖離心出并通過(guò)GC分析上清液中適宜醇的存在。
十二烷基或苯甲基酯-HA側(cè)鏈的全水解將在上清液中分別獲得70ppm十二醇或400ppm苯甲醇。結(jié)果公開于表6。表6在磷酸鹽緩沖液中于4℃下貯藏的HA-酯的％水解
如上所述，在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)比改性粘彈性物的水解大于1％。由于粘彈性組合物理想地具有貯藏穩(wěn)定性(即，粘彈性產(chǎn)物典型地要求2年貨架有效期)，因此呈現(xiàn)上述水解速度的粘彈性物被認(rèn)為不能用于本發(fā)明的組合物。實(shí)施例13在具有氯化鈉的磷酸鹽緩沖液和具有平衡鹽的檸檬酸鹽/醋酸鹽緩沖液中制備50％羧酸取代的HA苯甲酯(約200kDa)的3％溶液。這些溶液形成光學(xué)澄清的粘彈性凝膠，它們易于通過(guò)27號(hào)針吸出。在25℃下，這些溶液具有可與Viscoat或Provisc相比的低剪切粘度(即約200Pa-s)并且在25℃下剪切薄化與Provisc或Viscoat相似。這些溶液顯示粘度從手術(shù)溫度(25℃)的約200Pa-s到體溫(37℃)的20Pa-s的顯著降低。實(shí)施例14在具有平衡鹽的檸檬酸鹽/醋酸鹽緩沖液中制備14.3％羧酸取代的HA十二烷基酯(約200kDa)的1％溶液以形成一澄清的粘彈性溶液，該溶液顯示出可與Provisc或Viscoat相比的流變圖譜。在25℃和低于0.085/s的剪切率下的粘度為約90Pa-s。在0.24/s下開始剪切薄化，粘度為75Pa-s。5.4/s下粘度已降低至約16Pa-s。31℃下低剪切粘度僅為約45Pa-s。在2.89Pa的恒定剪切應(yīng)力下，該制品的粘度從25℃的約100Pa-s降低至37℃的約25Pa-s。實(shí)施例15在具有平衡鹽的檸檬酸鹽/醋酸鹽緩沖液中制備14.3％羧酸取代的HA十二烷基酯(約200kDa)的0.75％溶液以形成一澄清的粘彈性溶液，該溶液顯示25℃下約25Pa-s的低剪切粘度并在534/s下剪切薄化至低于0.1Pa-s。在恒定剪切應(yīng)力(1.1Pa)下，該制品還顯示粘度從25℃的約25Pa-s降低至37℃的約5Pa-s。實(shí)施例16在具有平衡鹽的檸檬酸鹽/醋酸鹽緩沖液中制備14.3％羧酸取代的HA十二烷基酯(約200kDa)的2％溶液以形成一澄清的稠溶液，該溶液(約2cc)在125℃下經(jīng)高壓殺菌持續(xù)約20分鐘暴露時(shí)間并在緩慢排空下冷卻。冷卻至室溫之后，制品保留足夠的粘度并獲得一有用的粘彈性凝膠。實(shí)施例17在具有氯化鈉的磷酸鹽緩沖液中制備羧甲基纖維素十六烷基醚的(含有與5％重復(fù)單糖單元相連的十六烷基部分醚，約100kDa)的5％溶液。該溶液澄清并且定性地形成溶液。實(shí)施例18在PBS中通過(guò)在50℃下緩慢溶解2天制備1.0wt％的HA的20％十二烷基酰胺，鈉鹽和3％硫酸軟骨素的溶液。在PBS中通過(guò)在50℃下緩慢溶解2天同樣制備僅含有1.0wt％的HA的20％十二烷基酰胺，鈉鹽的溶液。溶解之后將這些樣品各自轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的10-mL注射器中并通過(guò)一雙插孔連接器經(jīng)100通路到另一空注射器以提供適宜混合。將樣品離心除去氣泡并通過(guò)一27號(hào)針吸到Bohlin CS-10 ConstantStress Rheometer的樣品平皿上。進(jìn)行流變分析獲得2個(gè)樣品的25℃下粘度相對(duì)剪切率的圖。兩個(gè)樣品在粘度相對(duì)剪切率圖的低剪切平穩(wěn)區(qū)具有約90Pa-s的表觀粘度值。實(shí)施例19以下是IOP峰模型的描述。
IOP峰模型該IOP峰模型使用(1)如圖7圖示的一灌注設(shè)備、泵和壓力轉(zhuǎn)換器/記錄器；(2)灌注介質(zhì)；(3)切割的人眼；和(4)待測(cè)試的粘彈性物質(zhì)。1.灌注介質(zhì)用于IOP峰模型的灌注介質(zhì)是通過(guò)將5mL的青霉素-鏈霉素溶液(10,000單位/mL來(lái)自青霉素G的青霉素(堿)和10,000μg/mL來(lái)自鏈霉素硫酸鹽的鏈霉素(堿))和0.85mL慶大霉素溶液(10mg/mL)加入到500mL細(xì)胞溫育基(Dulbecco′s modified Eagle′s medinm，葡萄糖低，具有L-丙氨酰-L-谷氨酸鹽和丙酮酸鹽(Life Technologies，GrandIsland，NY))。然后使用500mL無(wú)菌過(guò)濾裝置(0.2μm孔徑)將該灌注介質(zhì)過(guò)濾并貯藏于4℃下(使用前升至37℃)。2.眼制品可用于IOP峰模型的尸體眼必須i)當(dāng)用于該模型制備時(shí)事后不超過(guò)24-36小時(shí)；ii)將全眼貯藏在潮濕室中；iii)沒有HIV、肝炎或其它傳染試劑；和iv)沒有經(jīng)受眼手術(shù)例如青光眼過(guò)濾、鞏膜植入或IOL植入。通過(guò)下面解剖方法制備人眼的前段7(參見圖10)。
使用直且細(xì)的剪刀(Katena No.K4-7440)仔細(xì)地將眼的多余肌肉或結(jié)締組織剪除并將眼放入裝有聚維酮碘溶液(1％游離碘)的容器中于25℃下持續(xù)約2分鐘。然后將眼從碘溶液中取出，用生理鹽水充分沖洗，并定位使角膜3居中向上(參見圖9a)。參照?qǐng)D9a和9b，然后將鞏膜5做標(biāo)記(使用無(wú)菌眼科用月牙刀(Alcon No.8065940001)，使得從角膜緣向鋸齒緣徑向延伸具有24個(gè)均勻間隔的線性切口9(每一切口不超過(guò)鞏膜深度的50％并且長(zhǎng)約5mm)，從而將鞏膜靜脈打開并提供灌注介質(zhì)的出口路徑。參照?qǐng)D9b，然后將該眼球沿赤道面13和鞏膜面15之間接近中間的水平面11切割成2半。將前面(上面)半個(gè)眼與后面(下面)半個(gè)眼分離，將后面半個(gè)眼扔掉。將前面半個(gè)翻過(guò)來(lái)使角膜朝下，然后使用Graefe forceps(Katena No.K5-4821)將殘余玻璃體從前面半個(gè)除去。然后使用Wescott剪刀(Katena No.K4-4100)將這些小帶切割并使用Graefe鑷子將晶狀體從前段取出。然后將敷料鑷(KatenaNo.K5-4010)用于除去虹膜，并用Wescott剪刀在鋸齒緣處將脈絡(luò)膜沿周緣切割。然后用敷料鑷將來(lái)自鞏膜內(nèi)的任何殘余色素除去。然后用灌注介質(zhì)將剩余的前段7沖洗2次以洗掉顏料、組織遺留物或其它碎屑。3.灌注設(shè)備用于IOP峰模型的灌注設(shè)備是一種在Johnson和Tschumper以及Clark等的灌注系統(tǒng)中所述的改進(jìn)型(Johnson和Tschumper，＂Humantrabecular meshwork organ culturea new method，＂Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，28945-953(1987)；和Clarke等，＂Dexamethasone-Induced Ocular Hypertension inPerfusion-Cultured Human Eyes，＂Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，36(2)478-489(1995))。對(duì)現(xiàn)有系統(tǒng)的關(guān)鍵改進(jìn)是將室體積從約0.8-1.0mL降低至約0.5-0.6mL從而更接近假晶狀體人前段體積的體積，并在灌注期間倒置該室。通過(guò)室的平臺(tái)上的突出島實(shí)現(xiàn)體積降低，這樣減少前段的圓頂內(nèi)的空間并應(yīng)防止或減少粘彈性溶液郁積于后面死角，即小梁網(wǎng)的后面。在灌注期間上下翻轉(zhuǎn)室(相對(duì)現(xiàn)有的系統(tǒng))據(jù)信防止了粘彈性物在角膜凹面發(fā)生郁積，這樣通過(guò)在凹面方向上升的島出來(lái)的灌注應(yīng)有效地將粘彈性物混合。
灌注設(shè)備描述于圖7、8和10。設(shè)備1由基底2、圓筒4、島6、o-形環(huán)8、許多螺桿10和帽12組成。使用時(shí)，設(shè)備也還包括前段7。
基底2是盤狀頂22、底24和側(cè)面26，并且含有通道14和16、平臺(tái)18和線19，經(jīng)成型和排列，從而接收螺桿10。通道14與側(cè)面26的開口28和島6的開口20相通。通道16與側(cè)面26的開口30和平面18的開口32相通。通道14和16經(jīng)成型和排列以便提供灌注介質(zhì)到和從設(shè)備1的精確流動(dòng)(通道14)和精確壓力測(cè)定(通道16)。開口28經(jīng)排列和成型以接收一裝置(與灌注線29相連)并且開口30也經(jīng)排列和成型以接收一裝置(與變換器線31相連)。這些裝置是本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)連接器，可用于接收管或其它圓柱形線。平臺(tái)18從基底2突出，具有側(cè)面34并成圓錐形成型和排列以接收前段7。島6從平臺(tái)18的中心突出。
參照?qǐng)D8和10，圓筒4共軸和不變地放置于基底2的頂部22，并由此平齊延伸。島6具有開口20，含有一部分通道14和從平臺(tái)18延伸。o-形環(huán)8具有環(huán)形、凸面內(nèi)邊緣36和許多孔38，經(jīng)排列和成型以通過(guò)o-形環(huán)8接收螺桿10。邊緣36經(jīng)排列和成型以便當(dāng)設(shè)備1在使用時(shí)，o-形環(huán)8相對(duì)基底2的壓制將前段7的外圍夾在邊緣36和平臺(tái)18的側(cè)面34之間形成前房42。如上所述，前房42的體積已由本發(fā)明人設(shè)計(jì)成大致前房和人眼晶狀體的體積之和(通常約0.5-0.6mL)。
如圖8和10所示，帽12經(jīng)成型和排列接收一部分圓筒4并形成密封空間40。IOP峰模型的優(yōu)選灌注設(shè)備將使用聚砜基底2、聚砜島6、聚砜o-形環(huán)8、尼龍螺桿10、透明聚砜圓筒4、醫(yī)用鋼通道14和16、以及透明聚苯乙烯帽12。4.灌注設(shè)備的裝配和制備使用之前，將設(shè)備1拆開并將單個(gè)部分高壓殺菌或冷凍殺菌，然后浸泡在裝有殺孢子劑(sporicidin)消毒液(50ml/L水)的層流室中，之后在無(wú)菌去離子水中漂洗過(guò)夜。
參照?qǐng)D7和10，將灌注介質(zhì)加入泵中，該泵依次與注入線29相連，該注入線將灌注介質(zhì)通過(guò)通道14注入室42；并且變換器線31與校準(zhǔn)過(guò)的壓力變換器和能夠記錄室42的壓力的記錄器相連。設(shè)備1然后通過(guò)首先經(jīng)放置于開口28和30的連接裝置分別與注入和變換器線相連來(lái)裝配。然后將設(shè)備1以頂部22向上安裝。將前段7放置在平臺(tái)18上，角膜側(cè)向上。然后經(jīng)注射器通過(guò)通道16施加輕微的灌注介質(zhì)流動(dòng)以便適宜地將前段7放置在平臺(tái)18上。o-形環(huán)8(外徑為約1.5英寸，內(nèi)徑為0.710-0.736英寸)然后放置在前段7上。重要的是o-形環(huán)8與前段7正好裝配以免泄漏(為了提高該裝配可以使用直徑略微不同的o-形環(huán)8)。螺桿10通過(guò)孔38插入到線19中并均勻勒緊以確保將o-形環(huán)均勻密封。由于o-形環(huán)8繃緊于前段7的周圍，因此減輕了通過(guò)通道16施加的流動(dòng)，這樣沒有過(guò)大的壓力通過(guò)裝配施加到前段7。螺桿10相對(duì)基底2扭轉(zhuǎn)以便前段7的周圍緊緊夾在平臺(tái)18和o-形環(huán)8之間，但是不要太緊以致使前段7破裂。使用注射器，然后將灌注介質(zhì)通過(guò)通道14推入，同時(shí)通過(guò)開口30從通道16將灌注介質(zhì)抽出，將基底2傾斜以便存在的任何氣泡通過(guò)通道16流出室42。將氣泡清除之后，將通道14和16封閉使灌注介質(zhì)流動(dòng)。然后將設(shè)備1翻轉(zhuǎn)至頂部22向上的水平。
然后將帽12放置在圓筒4上，由此形成空間40。然后將設(shè)備1顛倒使底部24向上，并放置在37℃下保持潮濕環(huán)境(5％CO2/95％空氣)的組織溫育溫育器(Nuaire)中。變換器線31和注入線29應(yīng)相對(duì)溫育器門的密封放置，以便當(dāng)關(guān)門時(shí)這些線不受損或卷縮。壓力變換器應(yīng)與設(shè)備1保持水平。在該構(gòu)型中設(shè)備1現(xiàn)可用于IOP峰模型。5.最初灌注將灌注線打開并開啟泵(對(duì)Harvard Model No.944而言設(shè)定“6”)以便灌注介質(zhì)自由地流過(guò)開口28和通道14。使泵運(yùn)轉(zhuǎn)直至壓力升至約5-10mmHg，然后將泵速降至約2μL/min(設(shè)定“12”)。將前段7灌注高達(dá)約24小時(shí)，之后注入粘彈性候選物。如果在24小時(shí)內(nèi)沒有建立在10-40mmHg之間壓力下的穩(wěn)定基線，那么可以每次相對(duì)2-3ml的灌注體積重復(fù)調(diào)整流速，直到獲得穩(wěn)定基線IOP。如果在另一24小時(shí)問題沒有解決，并且接下來(lái)的流速調(diào)整和沖洗步驟在48小時(shí)內(nèi)對(duì)該問題沒有改善，應(yīng)認(rèn)為前段7不可靠并且終止灌注。6.粘彈性物注入和灌注一旦灌注過(guò)的前段7產(chǎn)生一10-40mmHg之間的穩(wěn)定基線IOP持續(xù)不低于4小時(shí)(灌注速度在約1.75-2.05μL/min)，就準(zhǔn)備IOP峰研究。典型地，在開始灌注24小時(shí)之后達(dá)到這一點(diǎn)。模型首先通過(guò)注入“陽(yáng)性”對(duì)照加以驗(yàn)證。陽(yáng)性對(duì)照是0.5mL的稀透明質(zhì)酸鈉(約750kDal，可從Lifecore Biomedical，Inc.，Chaska，MN獲得)，它是將1份3.5％HA的緩沖液稀釋到9份相同緩沖液中制得的，其中每1mL的緩沖液含有約0.45mg磷酸二氫鈉水合物、2.00mg磷酸氫二鈉、4.3mg氯化鈉(以及注射用水，USP級(jí)，q.s.)并具有中性pH。將0.5mL稀HA(0.35％)的陽(yáng)性對(duì)照注入灌注線29上與多閥裝配33相連的相似體積的管式循環(huán)中，并且多閥裝配33轉(zhuǎn)換至使整個(gè)樣品體積沖洗到灌注設(shè)備1中。因此，注入速度是由灌注速度決定的。連續(xù)監(jiān)控IOP并記錄。觀察并記錄在基線IOP之上的任何IOP峰。如果在24小時(shí)的注入內(nèi)陽(yáng)性對(duì)照獲得基線之上20-80mmHg的IOP峰，那么認(rèn)為該模型有效并且可用于測(cè)定候選一過(guò)性粘彈性物。
通常，一過(guò)性粘彈性物樣品可以1天間隔分2次注入單個(gè)前段(第一次注入是陽(yáng)性對(duì)照的)。樣品粘彈性物應(yīng)使用準(zhǔn)備對(duì)照樣品所用的相同緩沖液稀釋至最初濃度的1/10。在每一次新注入之前應(yīng)獲得一穩(wěn)定且可接受的基線IOP，由前面粘彈性樣品所產(chǎn)生的任何IOP峰的傾斜所示。如果基線IOP在1天內(nèi)不恢復(fù)在10-40mmHg的范圍，那么應(yīng)終止給定前段中的任何進(jìn)一步灌注。
如上所述，本發(fā)明的一過(guò)性粘彈性物(即造成很小或者沒有IOP峰)將呈現(xiàn)基線之上10mmHg或更低的平均峰。實(shí)施例20本發(fā)明的一過(guò)性粘彈性物，AL-12488，43％取代苯甲酯改性的HA(約200kDal)，在上述IOP峰方法中進(jìn)行試驗(yàn)并與陽(yáng)性對(duì)照(Benchmark)和來(lái)自Fidia的200kDal HA比較。研究結(jié)果圖示于圖11。箭頭代表不同的注入。注入1和4是0.35％陽(yáng)性對(duì)照HA，注入2是0.35％Fidia未改性的HA，注入3是0.35％AL-12488。所有注入樣品的體積是0.5ml。星號(hào)代表由注入獲得的單個(gè)IOP峰。僅一過(guò)性粘彈性物(AL-12488)能夠以呈現(xiàn)很少或者沒有IOP峰表征，這是由于其在IOP峰模型中觀察到的峰不大于，并且事實(shí)上達(dá)到低于，基線IOP之上的約10mmHg。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)清楚特定步驟的給定一過(guò)性粘彈性物在手術(shù)操作中的適應(yīng)性將取決于如下因素粘彈性物濃度、平均分子量、粘性、假塑性、彈性、韌性、內(nèi)聚力(涂敷性)、粘結(jié)性、分子電荷、和溶液的摩爾滲透壓濃度。粘彈性物的適應(yīng)性還將取決于粘彈性物所需執(zhí)行的功能和外科醫(yī)生所用的手術(shù)技術(shù)。
可以將適宜的緩沖體系(例如磷酸鈉、醋酸鈉或硼酸鈉)加入組合物中防止貯藏條件下pH偏移。
由于所有或大部分的本發(fā)明一過(guò)性粘彈性物可以在手術(shù)結(jié)束時(shí)留在眼中，因此這些粘彈性物特別適宜用作粘性手術(shù)工具和藥物釋放設(shè)備的雙重角色。
適用于本發(fā)明組合物的眼科藥物包括，但不限于抗青光眼藥，例如β-阻滯劑包括噻嗎洛爾、倍他洛爾、左倍他洛爾、卡替洛爾，縮瞳劑包括匹魯卡品、碳酸酐酶抑制劑、前列腺素、seratonergics、毒蕈堿類、多巴胺能激動(dòng)劑、腎上腺素激動(dòng)劑包括阿可樂定和溴莫尼定；抗感染藥包括喹諾酮類如環(huán)丙沙星、和氨基糖苷類如托布霉素和慶大霉素；非甾類和甾類消炎藥，例如舒洛芬、雙氯芬酸、酮咯酸、利美索龍和四氫皮醇；生長(zhǎng)因子，例如EGF；免疫抑制劑藥；和抗過(guò)敏藥包括olopatadine。眼科藥可以藥用可接受的鹽形式存在，例如噻嗎洛爾馬來(lái)酸鹽、溴莫尼定酒石酸鹽或雙氯芬酸鈉。本發(fā)明的組合物也可以包括眼藥的組合，例如以下(i)和(ii)的組合(i)選自倍他洛爾和噻嗎洛爾的β-阻滯劑，和(ii)選自以下的前列腺素拉坦前列素；15-酮拉坦前列素；氟前列醇異丙酯(特別是1R-[1α(Z)，2β(1E，3R*)，3α，5α]-7-[3，5-二羥基-2-[3-羥基-4-[3-(三氟甲基)-苯氧基]-1-丁烯基]環(huán)戊基]-5-庚烯酸、1-甲基乙酯)；和[2R(1E，3R)，3S(4Z)，4R]-7-[四氫-2-[4-(3-氯苯氧基)-3-羥基-1-丁烯基]-4-羥基-3-呋喃基]-4-庚烯酸異丙酯。
在將一藥物加入該一過(guò)性粘彈性物中，這些試劑在水中可能具有有限的溶解度并因此在組合物中可能需要表面活性劑或其它適宜的助溶劑。這些助溶劑典型地包括聚乙氧基化蓖麻油、聚山梨醇酯20、60和80；PluronicF-68、F-84和P-103(BASF Corp.，Parsippany NJ，USA)；環(huán)糊精；或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它試劑。這些助溶劑典型地以約0.01-2wt.％的量使用。也可以理想地向粘彈性物中加入藥用可接受的染料以提高手術(shù)期間粘彈性物的可見性和/或染色眼組織(特別是在白內(nèi)障手術(shù)中囊縫合期間的囊袋)用于提高這種組織的可見性。這些染料在傳統(tǒng)粘彈性物中的用途描述于WO 99/58160。優(yōu)選的染料包括臺(tái)盼藍(lán)、臺(tái)盼紅、煌焦油藍(lán)和印度酞菁綠。染料在粘彈性物溶液中的濃度優(yōu)選是約0.001-2wt.％，最優(yōu)選是約0.01-0.1wt％。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是這種添加劑(藥物、助溶劑或染料)僅可用于它們不有害地影響本發(fā)明組合物的粘彈性的程度。
本發(fā)明的方法還可以涉及具有不同粘性或內(nèi)聚性的不同粘彈性試劑的用途。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到本發(fā)明的組合物可以被熟練的外科醫(yī)生用于各種手術(shù)操作。
根據(jù)每一種粘彈性物的優(yōu)點(diǎn)，外科醫(yī)生可以將本發(fā)明的各種粘彈性組合物用于單個(gè)手術(shù)操作。盡管本發(fā)明的一過(guò)性粘彈性物的用途以前還沒有公開用于手術(shù)，但是美國(guó)專利US 5,273,056(McLaughlin等)公開了在給定眼手術(shù)期間使用不同粘彈性的粘彈性物的組合物的用途的方法，將其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用加入本文。
例如，就涉及晶狀體乳化和/或沖洗/吸出的手術(shù)步驟，例如白內(nèi)障手術(shù)而言，一般優(yōu)選使用具有相對(duì)大粘性和相對(duì)小內(nèi)聚性的粘彈性試劑。這種粘彈性試劑在本文稱之為“粘性”試劑。粘彈性試劑在溶液中的內(nèi)聚性被認(rèn)為至少部分取決于試劑的平均分子量。在給定濃度下，分子量越大，內(nèi)聚性越大。涉及處理精細(xì)組織的這部分手術(shù)操作通過(guò)具有相對(duì)大的內(nèi)聚性和相對(duì)小的粘性的粘彈性試劑通常會(huì)更好。這些試劑在本文稱之為“內(nèi)聚”試劑。就內(nèi)聚試劑，例如主要用于組織處理或維護(hù)目的(與保護(hù)目的相對(duì))的那些而言，功能上所需的粘性將是足夠熟練外科醫(yī)生使用這種試劑作為軟工具以處理或者支持手術(shù)進(jìn)行期間涉及的組織的粘性。
就主要用于保護(hù)目的(“粘性”試劑)(與組織處理目的相對(duì))的其它粘彈性試劑而言，功能上所需的粘性將是足夠使這種試劑的保護(hù)層留在手術(shù)進(jìn)行期間涉及的組織或細(xì)胞上的粘性。這種粘性典型地是約3,000cps-約60,000cps(在2sec-1的剪切率和25℃下)，優(yōu)選將是40,000cps。這種粘性試劑能夠提供前面討論的保護(hù)功能，但是不易于非故意的除去，它們可能會(huì)危害所保護(hù)的精細(xì)組織。遺憾的是，該相同特性使得對(duì)外科醫(yī)生而言有問題的手術(shù)(例如在白內(nèi)障手術(shù)中推薦所有這些可商購(gòu)獲得的產(chǎn)品)結(jié)束時(shí)吸出這種粘附的粘彈性物，并且在除去操作期間可能使涂敷組織經(jīng)受創(chuàng)傷。本發(fā)明的一過(guò)性粘彈性物的顯著優(yōu)點(diǎn)是它們可以在手術(shù)結(jié)束時(shí)留在手術(shù)位置，因此避免對(duì)所影響的軟組織的不必要的創(chuàng)傷。
本發(fā)明的優(yōu)選方法將使用多個(gè)粘彈性物在給定手術(shù)操作中的用途，其中至少一種該粘彈性物是一過(guò)性粘彈性物。在本發(fā)明的最優(yōu)選實(shí)施方式中，具有優(yōu)異粘性的一過(guò)性粘彈性物用于白內(nèi)障手術(shù)，在手術(shù)結(jié)束時(shí)一些或所有一過(guò)性粘彈性物就地留下并且造成很小或者沒有IOP峰。
本發(fā)明參照一些優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行了描述，然而，應(yīng)理解的是在不背離其精神或主要特征的情況下它可以其它具體形式或其變體設(shè)施。因此上述的實(shí)施方式應(yīng)認(rèn)為是描述性的并非限制性的，本發(fā)明的范圍將通過(guò)所附的權(quán)利要求書而不是前面的說(shuō)明書進(jìn)行描述。
權(quán)利要求
1.一種無(wú)菌、非炎性粘彈性組合物，包含高分子試劑的水溶液，其中所述組合物在25℃下呈現(xiàn)至少1Pa-s的零剪切粘性，并且其中該粘彈性組合物當(dāng)在驗(yàn)證過(guò)的IOP峰模型中測(cè)試時(shí)呈現(xiàn)很少或者沒有IOP峰。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述高分子試劑選自疏水改性的多糖或粘多糖(有或沒有表面活性劑)；透析過(guò)的聚兩性電解質(zhì)或者帶相反電荷的聚電解質(zhì)的透析混合物；帶有陽(yáng)離子親水聚合物的多糖或粘多糖的混合物；具有溫度依賴性構(gòu)象轉(zhuǎn)變的多糖和親水合成聚合物；及其組合。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中該溶液在25℃下呈現(xiàn)約5-約10,000Pa-s的零剪切粘性，和約1000-約20,000的粘性因子。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中該高分子試劑是一種選自以下的疏水改性的多糖HA-酰胺類、HA-酯類、HA-胺類、HA-醚類、HA-硫醚類、HA-烷基類及其組合。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述多糖是選自以下的HA-酰胺辛酰胺HA、十二烷基酰胺HA和十六烷基酰胺HA。
6.一種對(duì)眼進(jìn)行手術(shù)的方法，包括(a)在眼中形成一手術(shù)開口以提供進(jìn)入眼內(nèi)部的入口；(b)通過(guò)該手術(shù)開口向眼內(nèi)滴注權(quán)利要求1的粘彈性組合物；和(c)關(guān)閉該手術(shù)開口。
7.權(quán)利要求6的方法，其中該粘彈性組合物在25℃下具有約5-約10,000Pa-s的零剪切粘性，并且其中這種一過(guò)性粘彈性物經(jīng)受從約25℃-約37℃的溫度變化時(shí)粘性降低至少50％。
8.權(quán)利要求7的方法，其中在沒有提前移除粘彈性組合物的情況下將該手術(shù)開口關(guān)閉。
9.一種在沒有顯著的手術(shù)后眼內(nèi)壓力峰的情況下對(duì)眼進(jìn)行手術(shù)的方法，包括(a)向眼內(nèi)滴注第一治療有效量的一過(guò)性粘彈性物，其中所述一過(guò)性粘彈性物是一種在25℃下具有至少5Pa-s的零剪切粘性的無(wú)菌、非炎性水溶液，并且其中該一過(guò)性粘彈性物當(dāng)在驗(yàn)證過(guò)的IOP峰模型中測(cè)試時(shí)呈現(xiàn)很少或者沒有IOP峰；以及(b)在手術(shù)結(jié)束時(shí)使第二治療有效量的所述一過(guò)性粘彈性物留在眼中；其中所述第一和第二治療有效量的一過(guò)性粘彈性物可以相同或不同。
10.權(quán)利要求9的方法，其中第一治療有效量的一過(guò)性粘彈性物選自組織保護(hù)有效量、組織處理有效量、和釋放藥物的有效量的所述一過(guò)性粘彈性物；并且其中第二治療有效量的所述一過(guò)性粘彈性物選自組織保護(hù)有效量和釋放藥物有效量的該一過(guò)性粘彈性物。
11.權(quán)利要求10的方法，其中該一過(guò)性粘彈性物包括疏水改性的HA。
12.權(quán)利要求11的方法，其中該疏水改性的HA是一HA并選自辛酰胺HA、十二烷基酰胺HA和十六烷基酰胺HA。
13.權(quán)利要求12的方法，其中該手術(shù)是白內(nèi)障手術(shù)。
14.一種在手術(shù)期間保護(hù)或穩(wěn)定眼組織的方法，包括在眼中滴注保護(hù)或穩(wěn)定有效量的一種無(wú)菌、非炎性粘彈性物組合物，其中該粘彈性組合物當(dāng)在驗(yàn)證過(guò)的IOP峰模型中測(cè)試時(shí)呈現(xiàn)很少或沒有IOP峰。
15.一種無(wú)菌、非炎性一過(guò)性粘彈性組合物，包含疏水改性多糖的水溶液，其中所述溶液在25℃下呈現(xiàn)至少1Pa-s的零剪切粘性，并且其中該溶液當(dāng)其經(jīng)受從約25℃-約37℃的溫度變化時(shí)零剪切粘性降低至少50％。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中該溶液在25℃下呈現(xiàn)約5-約10,000Pa-s的零剪切粘性，和約1000-約20,000的粘性因子。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中該疏水改性的多糖選自HA-酰胺類、HA-酯類、HA-胺類、HA-醚類、HA-硫醚類、HA-烷基類及其混合物。
18.權(quán)利要求17的組合物，其中所述多糖是選自以下的HA-酰胺辛酰胺HA、十二烷基酰胺HA和十六烷基酰胺HA。
19.一種對(duì)眼進(jìn)行手術(shù)的方法，包括(a)在眼中形成一手術(shù)開口以提供進(jìn)入眼內(nèi)部的入口；(b)通過(guò)該手術(shù)開口向眼內(nèi)滴注一一過(guò)性粘彈性組合物；和(c)關(guān)閉該手術(shù)開口。
20.權(quán)利要求19的方法，其中該一過(guò)性粘彈性物在25℃下具有約5-約10,000Pa-s的零剪切粘性，并且其中這種一過(guò)性粘彈性物經(jīng)受從約25℃-約37℃的溫度變化時(shí)這種粘性降低至少50％。
21.權(quán)利要求20的方法，其中在沒有移除該一過(guò)性粘彈性物的情況下將該手術(shù)開口關(guān)閉。
22.一種在沒有顯著的手術(shù)后眼內(nèi)壓力峰的情況下對(duì)眼進(jìn)行手術(shù)的方法，包括(a)向眼內(nèi)滴注第一治療有效量的一過(guò)性粘彈性物，其中所述一過(guò)性粘彈性物是一種在25℃下具有至少5Pa-s的零剪切粘性的無(wú)菌、非炎性水溶液，并且其中該一過(guò)性粘彈性物經(jīng)受從約25℃-約37℃的溫度變化時(shí)這種粘性降低至少50％；以及(b)在手術(shù)結(jié)束時(shí)使第二治療有效量的所述一過(guò)性粘彈性物留在眼中；其中所述第一和第二藥用有效量的一過(guò)性粘彈性物可以相同或 不同。
23.權(quán)利要求22的方法，其中第一治療有效量的一過(guò)性粘彈性物選自組織保護(hù)有效量、組織處理有效量、和釋放藥物有效量的所述一過(guò)性粘彈性物；并且其中第二治療有效量的所述一過(guò)性粘彈性物選自組織保護(hù)有效量和釋放藥物有效量的該一過(guò)性粘彈性物。
24.權(quán)利要求23的方法，其中該一過(guò)性粘彈性物包括疏水改性的HA。
25.權(quán)利要求24的方法，其中該疏水改性的HA是一HA并選自辛酰胺HA、十二烷基酰胺HA和十六烷基酰胺HA。
26.權(quán)利要求25的方法，其中該手術(shù)是白內(nèi)障手術(shù)。
全文摘要
本申請(qǐng)公開了不用吸出的粘彈性物、組合物和使用方法。該不用吸出的一過(guò)性粘彈性物具有足夠用于眼科手術(shù)的粘性，但是可以留在眼中，很少或者沒有導(dǎo)致IOP峰。這些組合物特別適用于白內(nèi)障手術(shù)。
文檔編號(hào)A61K9/00GK1477951SQ01818195
公開日2004年2月25日 申請(qǐng)日期2001年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月6日
發(fā)明者M·卡拉凱勒, M 卡拉凱勒, D·L·津克森, 津克森, M·R·布倫斯泰特, 布倫斯泰特, A·S·佩特爾, 佩特爾, K·Y·錢, 錢 申請(qǐng)人:愛爾康公司