專利名稱：支鏈α-葡聚糖及生成其的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶和它們的制造方法以及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種支鏈α -葡聚糖及生成其的α _葡糖基轉(zhuǎn)移酶和它們的制造方法 以及用途，詳細(xì)來講，涉及一種支鏈α-葡聚糖及具有通過與麥芽糖及葡萄糖聚合度為3以 上的α-1，4葡聚糖作用并進行α _葡糖基轉(zhuǎn)移而生成該支鏈α-葡聚糖的作用的α-葡 糖基轉(zhuǎn)移酶和它們的制造方法、以及含有該支鏈α-葡聚糖的組合物及其用途，所述支鏈 α-葡聚糖以葡萄糖為構(gòu)成糖，其特征在于，在甲基化分析中(1) 2，3，6-三甲基-1，4，5-三乙?；咸烟谴己?，3，4-三甲基-1，5，6-三乙?；?葡萄糖醇之比在1 0. 6 1 4的范圍；(2) 2，3，6-三甲基-1，4，5-三乙?；咸烟谴己?，3，4-三甲基-1，5，6-三乙?；?葡萄糖醇的總計占部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的60%以上；(3) 2，4，6_三甲基-1，3，5-三乙?；咸烟谴紴椴糠旨谆咸烟谴家宜狨サ?0. 5%以上且低于10% ；及(4) 2，4- 二甲基-1，3，5，6-四乙?；咸烟谴紴椴糠旨谆咸烟谴家宜狨サ?0. 5%以上。
背景技術(shù)：
所謂食物纖維，本來是指動物難以消化的纖維素、木質(zhì)素、半纖維素、果膠等植物 細(xì)胞成分，但是，廣義來講，也包含不能通過淀粉酶消化的難消化性的水溶性多糖類，它們 被稱為水溶性食物纖維。近年來，食物纖維在作為其原本的功能的整腸作用、血中膽固醇降 低作用、血糖調(diào)節(jié)作用等的基礎(chǔ)上，作為改善腸內(nèi)菌叢的益生菌的功能也開始備受矚目。但 是，食物纖維與鈣被并列認(rèn)為是日本人的飲食生活中所缺少的營養(yǎng)素，現(xiàn)在的日本人的平 均食物纖維攝取量相對平成6年提出的第5次修訂“日本人的營養(yǎng)需要量”中所示的食物 纖維的目標(biāo)攝取量20 25g/日，僅達到目標(biāo)的5 8成(參照例如《食物纖維的市場動向 的調(diào)查》、“食品與開發(fā)”、第34卷、第2號、第24 27頁(1999年)等)。在這種狀況下，提 出了各種可以用作各種飲食品的原料、且作為水溶性食物纖維有用的難消化性的多糖類。例如，作為水溶性食物纖維，市場上流通有難消化淀粉(濕熱處理高直鏈淀粉玉 米)、瓜爾膠分解物、葡甘露聚糖、低分子海藻酸等以存在于自然界的多糖為原料的水溶性 食物纖維。但是，這些水溶性食物纖維均具有粘性高、添加于食品時有損味道、食感等缺點， 因此，其利用只局限于一部分。另一方面，作為低粘度的水溶性食物纖維，在食品領(lǐng)域中廣 泛利用聚葡萄糖(美國輝瑞公司開發(fā))或難消化性糊精。已知，聚葡萄糖是將葡萄糖和山 梨糖醇及檸檬酸在高真空下進行加熱、通過化學(xué)反應(yīng)使其聚合而得到的合成多糖，葡萄糖 在1，2、1，3、1，4、1，6、1，2，6、1，4，6位等具有糖苷鍵合成的支鏈。另外，難消化性糊精是在 通過化學(xué)反應(yīng)分解淀粉的同時使轉(zhuǎn)移或逆合成反應(yīng)發(fā)生，通過導(dǎo)入淀粉本來不具有的1，2、 1，3、1，2，4、1，3，4的各糖苷鍵而降低消化性的合成多糖。該難消化性糊精如下操作進行 制造，即，在淀粉中添加少量的鹽酸，將以粉末狀態(tài)進行加熱而得到的焙燒糊精溶解于水，添加α-淀粉酶進行水解，對由此得到的低粘度溶液進行精制、凝縮、噴霧干燥。也有為了 進一步降低消化性而在難消化性糊精中添加葡萄糖淀粉酶，使可消化部分分解至成為葡萄 糖，分離除去葡萄糖，同樣地進行精制、噴霧干燥而制得的制品。但是，難消化性糊精的來自 原料淀粉的收率低，并且容易著色，在工業(yè)生產(chǎn)方面具有很大缺點。一般認(rèn)為，被導(dǎo)入這些 聚葡萄糖或難消化性糊精中的新糖苷鍵同時含有α-端基及β-端基這雙種端基差向異 構(gòu)體型，而且，還原末端葡萄糖殘基部分地變化為1，6_脫水葡萄糖(參照例如《低分子水 溶性食物纖維》、食品成分系列“食物纖維的科學(xué)”、第116頁 131頁、朝倉書店(1997年)
等)ο作為葡聚糖中的葡萄糖的鍵合方式的糖苷鍵(以下，在本說明書中將“糖苷鍵”簡 稱為“鍵”。)中，由于α-1，6鍵與α _1，4鍵相比，通過淀粉酶難以使其分解，因此，含有較 多α-1，6鍵的葡聚糖也可以期待用作水溶性食物纖維用途。例如，利用來自屬于乳酸菌的 腸膜明串珠菌(leuconostoc mesenteroides)的葡聚糖蔗糖酶(EC 2.4.1.5)以蔗糖為原 料制造的葡聚糖是葡萄糖主要以^1-1，6鍵聚合的葡聚糖，有時也具有(1-1，2鍵合及(1-1， 3鍵合的支鏈。使用來自腸膜明串珠菌B-512F株的葡聚糖蔗糖酶時，期待得到的葡聚糖中 的鍵的α -1，6鍵的含量也達到90%以上，為難消化性。但是，葡聚糖因來自蔗糖的收率低， 并且粘性高，所以精制操作繁瑣，成本升高，因此，幾乎沒有進行作為水溶性食物纖維使用 的嘗試。另外，也進行了通過使淀粉酶與廉價的淀粉作用，主要分解α_1，4鍵，從而提高 α_1，6鍵的含量，制備水溶性食物纖維的嘗試。在日本特開2001-11101號公報中，提出 了如下方法通過使α-淀粉酶和β-淀粉酶的混合物與淀粉液化液作用后，回收殘留的 糊精部分，由此制備α_1，6鍵與α-1，4鍵的比提高至10 20%的支鏈糊精。但是，該 支鏈糊精通過在保持淀粉本來具有的支鏈(α-1，6鍵)的同時除掉葡萄糖以α_1，4鍵連 接的直鏈部分從而提高α-1，6鍵的比例的方法來制造，因此，存在來自原料淀粉的收率 低、不能期待大幅度的消化性降低等問題。另外，作為與淀粉部分分解物(糊精)作用而 導(dǎo)入α -1，6鍵的酶，已知有糊精葡聚糖酶(EC 2. 1. 1. 2)(參照例如山本一也等、“生物科 學(xué)·生物技術(shù)·生物化學(xué)”、第56卷、(1992年)、第169頁 173頁)。雖然糊精葡聚糖酶 是通過與淀粉部分分解物作用，主要催化α -1，6葡糖基鍵轉(zhuǎn)移反應(yīng)，從而生成葡聚糖結(jié)構(gòu) (葡萄糖以0-1，6鍵連接的結(jié)構(gòu))的酶，但是，目前已知的來自屬于醋酸菌的莢膜醋桿菌 (Acetobacter capsulatum)的糊精葡聚糖酶存在α-1，6鍵的的導(dǎo)入比例少(參照例如鈴 木雅之等、“應(yīng)用糖質(zhì)科學(xué)(Journal of AppliedGlycoscience) ”、第48卷、第2號、第143 頁 151頁(2001年)等)、并且酶自身的穩(wěn)定性低等問題，因此，未能應(yīng)用于實際中。在這 種狀況下，即使在擴展水溶性食物纖維的選擇范圍的意義上，也強烈期望提供新的難消化 性葡聚糖及制造其的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于，提供一種作為水溶性食物纖維有用的葡聚糖及其制造方法以 及其用途。為了解決上述課題，本發(fā)明人等期待開發(fā)出以麥芽糖及葡萄糖聚合度為3以上的 α-1，4葡聚糖為原料(基質(zhì))，生成具有較多支鏈(在本說明書中，所謂“支鏈”，是指在葡聚
6糖中的葡萄糖的鍵合方式中α-1，4鍵以外的葡萄糖的鍵合方式)的支鏈α-葡聚糖的酶，并 對產(chǎn)生這種酶的微生物進行了廣泛地探索。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從土壤中分離出的微生物、ΡΡ710株 及ΡΡ349株在菌體外產(chǎn)生與麥芽糖及葡萄糖聚合度為3以上的α _1，4葡聚糖作用并生成具 有α-1，4、α-1，6、α-1，3、α-1，4，6及α-1，3，6鍵的支鏈α -葡聚糖的新型α -葡糖基轉(zhuǎn) 移酶。而且發(fā)現(xiàn)，該新型酶可以由淀粉部分分解物等α-1，4葡聚糖有效地生成支鏈α-葡聚 糖，所述支鏈α-葡聚糖以葡萄糖為構(gòu)成糖，其特征在于，在甲基化分析中(1) 2，3，6-三甲基-1，4，5-三乙?；咸烟谴己?，3，4-三甲基-1，5，6-三乙?；?葡萄糖醇之比在1 0. 6 1 4的范圍；(2) 2，3，6-三甲基-1，4，5-三乙?；咸烟谴己?，3，4-三甲基-1，5，6-三乙酰基 葡萄糖醇的總計占部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的60%以上；(3) 2，4，6-三甲基-1，3，5_三乙?；咸烟谴紴椴糠旨谆咸烟谴家宜狨サ?0. 5%以上且低于10% ；及(4) 2，4- 二甲基-1，3，5，6-四乙?；咸烟谴紴椴糠旨谆咸烟谴家宜狨サ?0. 5%以上。另外，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，通過在培養(yǎng)ΡΡ710株而得到的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的粗酶液 中預(yù)先混雜分解淀粉的淀粉酶，并使用該粗酶液、或?qū)⒎蛛x出的該淀粉酶與α “葡糖基轉(zhuǎn) 移酶并用，可以制造與單獨使用α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的情況相比水溶性食物纖維含量提高了 的支鏈α-葡聚糖。而且還發(fā)現(xiàn)，除了可以并用該淀粉酶之外，通過將公知的α-淀粉酶或 淀粉去分支酶等與α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶并用，也可以調(diào)節(jié)得到的支鏈α-葡聚糖的重均分子 量或水溶性食物纖維含量。此外，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，通過這些方法而得到的支鏈α-葡聚糖 與原料α-1，4葡聚糖相比，α-1，6鍵的比例大幅度地增大，而且具有α-1，3及α_1，3， 6鍵，表現(xiàn)出顯著的難消化性，因此，作為水溶性食物纖維是有用的，也具有血糖上升抑制作 用及生物體內(nèi)類脂質(zhì)減少作用，從而完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明通過提供一種支鏈α-葡聚糖和生成該支鏈α-葡聚糖的新型α-葡 糖基轉(zhuǎn)移酶、它們的制造方法以及用途來解決上述課題，所述支鏈α-葡聚糖以葡萄糖為 構(gòu)成糖，其特征在于，在甲基化分析中(1) 2，3，6-三甲基-1，4，5-三乙?；咸烟谴己?，3，4-三甲基-1，5，6-三乙?；?葡萄糖醇之比在1 0. 6 1 4的范圍；(2) 2，3，6-三甲基-1，4，5-三乙酰基葡萄糖醇和2，3，4-三甲基-1，5，6-三乙?；?葡萄糖醇的總計占部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的60%以上；(3) 2，4，6-三甲基-1，3，5_三乙?；咸烟谴紴椴糠旨谆咸烟谴家宜狨サ?0. 5%以上且低于10% ；及(4) 2，4- 二甲基-1，3，5，6-四乙?；咸烟谴紴椴糠旨谆咸烟谴家宜狨サ?0. 5%以上。根據(jù)本發(fā)明，可以收率良好且大量、廉價地制造并供給在以食品領(lǐng)域為主的各種 領(lǐng)域中作為水溶性食物纖維是有用的、著色少的難消化性支鏈α -葡聚糖。


圖1是將分別使用來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710及來自球形節(jié)桿菌ΡΡ349的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶樣品、由淀粉部分分解物制成的葡聚糖A及B的凝膠過濾HPLC的色譜圖與作為基 質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠過濾HPLC的色譜圖進行比較的圖。圖2是示意性地表示淀粉部分分解物及本發(fā)明的支鏈α -葡聚糖的結(jié)構(gòu)的圖。圖3是表示來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的最適溫度的圖。圖4是表示來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的最適ρΗ的圖。圖5是表示來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的溫度穩(wěn)定性的圖。圖6是表示來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的ρΗ穩(wěn)定性的圖。圖7是表示來自球形節(jié)桿菌ΡΡ349的α _葡糖基轉(zhuǎn)移酶的最適溫度的圖。圖8是表示來自球形節(jié)桿菌ΡΡ349的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的最適ρΗ的圖。圖9是表示來自球形節(jié)桿菌ΡΡ349的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的溫度穩(wěn)定性的圖。圖10是表示來自球形節(jié)桿菌ΡΡ349的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的ρΗ穩(wěn)定性的圖。圖11是表示來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的淀粉酶的最適溫度的圖。圖12是表示來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的淀粉酶的最適ρΗ的圖。圖13是表示來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的淀粉酶的溫度穩(wěn)定性的圖。圖14是表示來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的淀粉酶的ρΗ穩(wěn)定性的圖。圖15是將并用來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶精制品和淀粉酶精 制品而制成的支鏈α “葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖與作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的 凝膠過濾HPLC的色譜圖進行比較的圖。圖16是將并用來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶精制品和異淀粉酶 而制成的支鏈α “葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖與作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠 過濾HPLC的色譜圖進行比較的圖。圖17是將并用來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α _葡糖基轉(zhuǎn)移酶精制品和α -淀粉 酶而制成的支鏈α “葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖與作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝 膠過濾HPLC的色譜圖進行比較的圖。圖18是將并用來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶精制品和CGTa se 而制成的支鏈α “葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖與作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠 過濾HPLC的色譜圖進行比較的圖。圖19是將并用來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶精制品和異淀粉酶 及CGTase而制成的支鏈α -葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖與作為基質(zhì)的淀粉部分分解 物的凝膠過濾HPLC的色譜圖進行比較的圖。符號的說明在圖1和圖15 19中，1 相當(dāng)于分子量1000，000道爾頓的洗脫位置2 相當(dāng)于分子量100，000道爾頓的洗脫位置3 相當(dāng)于分子量10，000道爾頓的洗脫位置4 相當(dāng)于分子量1，000道爾頓的洗脫位置5 相當(dāng)于分子量100道爾頓的洗脫位置在圖1中，a 作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠過濾HPLC的色譜圖
b 葡聚糖A的凝膠過濾HPLC的色譜圖c 葡聚糖B的凝膠過濾HPLC的色譜圖1 相當(dāng)于葡萄糖聚合度499的位置2 相當(dāng)于葡萄糖聚合度6. 3的位置3:相當(dāng)于葡萄糖聚合度384的位置4:相當(dāng)于葡萄糖聚合度22. 2的位置5 相當(dāng)于葡萄糖聚合度10. 9的位置6 相當(dāng)于葡萄糖聚合度1的位置7 相當(dāng)于葡萄糖聚合度433的位置8 相當(dāng)于葡萄糖聚合度22. 8的位置9 相當(dāng)于葡萄糖聚合度10. 9的位置10 相當(dāng)于葡萄糖聚合度1的位置在圖2中，1 淀粉部分分解物的示意圖2 本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖的示意圖a 非還原末端葡萄糖殘基b :α-1，3鍵合的葡萄糖殘基c :α-1，4鍵合的葡萄糖殘基d:a-l，6鍵合的葡萄糖殘基e :α-1，3，6鍵合的葡萄糖殘基f α-1，4，6鍵合的葡萄糖殘基斜向虛線α-1，3鍵合橫向?qū)嵕€α-1，4鍵合縱向?qū)嵕€α-1，6鍵合在圖13中，·不存在鈣離子的情況〇存在ImM鈣離子的情況在圖15中，a 作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠過濾HPLC的色譜圖b 每1克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、0. 1單位淀粉酶作用而得到的支鏈 α -葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖c 每1克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、0. 2單位淀粉酶作用而得到的支鏈 α -葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖d 每1克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、0. 5單位淀粉酶作用而得到的支鏈 α -葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖e 每1克基質(zhì)使10單位α _葡糖基轉(zhuǎn)移酶、1單位淀粉酶作用而得到的支鏈 α -葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖在圖16中，a 作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠過濾HPLC的色譜圖
b 每1克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、50單位異淀粉酶作用而得到的支鏈 α -葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖c 每1克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、200單位異淀粉酶作用而得到的支鏈 α -葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖d 每1克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、500單位異淀粉酶作用而得到的支鏈 α -葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖e 每1克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、1000單位異淀粉酶作用而得到的支 鏈α -葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖在圖17中，a 作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠過濾HPLC的色譜圖b 每1克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、0. 1單位α -淀粉酶作用而得到的支 鏈α -葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖c 每1克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、0. 2單位α -淀粉酶作用而得到的支 鏈α -葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖d 每1克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、0. 5單位α -淀粉酶作用而得到的支 鏈α -葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖e 每1克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、1. 0單位α -淀粉酶作用而得到的支 鏈α -葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖在圖18中，a 作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠過濾HPLC的色譜圖b 每1克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、0. 1單位CGTase作用而得到的支鏈 α -葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖c 每1克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、0. 2單位CGTase作用而得到的支鏈 α -葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖d 每1克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、0. 5單位CGTase作用而得到的支鏈 α -葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖e 每1克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、1. 0單位CGTase作用而得到的支鏈 α -葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖在圖19中，a 作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠過濾HPLC的色譜圖b 每1克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、50單位異淀粉酶、1單位CGTase作用 而得到的支鏈α-葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖c 每1克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、200單位異淀粉酶、1單位CGTase作 用而得到的支鏈α “葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖d 每1克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、500單位異淀粉酶、1單位CGTase作 用而得到的支鏈α “葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖e 每1克基質(zhì)使10單位α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、1000單位異淀粉酶、1單位CGTase作 用而得到的支鏈α “葡聚糖的凝膠過濾HPLC的色譜圖
具體實施例方式本發(fā)明中所說的葡聚糖，是指以葡萄糖為構(gòu)成糖的葡萄糖聚合度為3以上的寡糖 或多糖。本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖是以葡萄糖為構(gòu)成糖的α-葡聚糖，其特征在于，在甲基 化分析中(1) 2，3，6-三甲基-1，4，5-三乙?；咸烟谴己?，3，4-三甲基-1，5，6-三乙?；?葡萄糖醇之比在1 0. 6 1 4的范圍；(2) 2，3，6-三甲基-1，4，5-三乙?；咸烟谴己?，3，4-三甲基-1，5，6-三乙酰基 葡萄糖醇的總計占部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的60%以上；(3) 2，4，6_三甲基-1，3，5-三乙?；咸烟谴紴椴糠旨谆咸烟谴家宜狨サ?0. 5%以上且低于10% ；及(4) 2，4_ 二甲基-1，3，5，6_四乙?；咸烟谴紴椴糠旨谆咸烟谴家宜狨サ?0. 5%以上。本發(fā)明中所說的甲基化分析，是通常公知的確定多糖或寡糖中構(gòu)成其的單糖的鍵 合方式的方法。將甲基化分析用于葡聚糖中的葡萄糖的鍵合方式的分析時，首先，將構(gòu)成葡 聚糖的葡萄糖殘基中的全部游離的羥基甲基化，接著，將完全甲基化了的葡聚糖水解。其 次，將通過水解得到的甲基化葡萄糖還原，形成消除了端基差向異構(gòu)體型的甲基化葡萄糖 醇，而且，通過將該甲基化葡萄糖醇中的游離的羥基乙?；?，得到部分甲基化葡萄糖醇乙 酸酯(以下，在本說明書中，有時省略“部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯”中的被乙?；牟?位和“葡萄糖醇乙酸酯”的標(biāo)記，簡稱為“部分甲基化物”。)。通過用氣相色譜法對得到的 部分甲基化物進行分析，來自葡聚糖中鍵合方式各異的葡萄糖殘基的各種部分甲基化物可 以用占?xì)庀嗌V圖中的全部部分甲基化物的峰面積的峰面積的百分率(％)表示。而且，可 以由該峰面積％確定該葡聚糖中的鍵合方式不同的葡萄糖殘基的存在比、即各糖苷鍵的存 在比率。在本說明書中，部分甲基化物的“比”，是指甲基化分析的氣相色譜圖中的峰面積之 比，部分甲基化物的“ ％ ”，是指甲基化分析的氣相色譜圖中的“面積％ ”。上述(1)中的所謂2，3，6_三甲基-1，4，5-三乙酰基葡萄糖醇(以下，簡稱為“2， 3，6_三甲基化物”)，是指C-4位參與1，4鍵合的葡萄糖殘基，2，3，4-三甲基-1，5，6-三乙 ?；咸烟谴?以下，簡稱為“2，3，4_三甲基化物”)是指C-6位參與1，6鍵合的葡萄糖 殘基。而且，所謂“2，3，6-三甲基化物和2，3，4-三甲基化物之比在1 0.6 1 4的 范圍”，即指在甲基化分析中的部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的氣相色譜圖中，對于本發(fā)明的 支鏈α "葡聚糖，除C-I位以外僅C-6位參與鍵合的葡萄糖殘基與除C-I位以外僅C-4位 參與鍵合的葡萄糖殘基和除C-I位以外僅C-6位參與鍵合的葡萄糖殘基的總計的比例在 37. 5 80. 0%的范圍。上述(2)中的所謂“2，3，6_三甲基化物和2，3，4_三甲基化物的總計占部分甲基 化物的60%以上”，是指對于本發(fā)明的支鏈α -葡聚糖，除C-I位以外僅C-4位參與鍵合的 葡萄糖殘基和除C-I位以外僅C-6位參與鍵合的葡萄糖殘基的總計占構(gòu)成葡聚糖的總葡萄 糖殘基的60%以上。同樣，上述(3)中的所謂“2，4，6_三甲基-1，3，5-三乙?；咸烟谴肌?以下，簡 稱為“2，4，6_三甲基化物”)，是指C-3位參與1,3-鍵合的葡萄糖殘基，所謂“2，4，6_三甲 基化物為部分甲基化物的0. 5%以上且低于10%”，是指對于本發(fā)明的支鏈α -葡聚糖，除C-I位以外僅C-3位參與鍵合的葡萄糖殘基為構(gòu)成葡聚糖的總葡萄糖殘基的0. 5%以上且 低于10%。進而，同樣，上述(4)中的所謂“2，4_ 二甲基-1，3，5，6-四乙酰基葡萄糖醇”(以 下，簡稱為“2，4_ 二甲基化物”)，是指C-3位及C-6位雙方分別參與1，3鍵合和1，6鍵合的 葡萄糖殘基，所謂“2，4-二甲基化物為部分甲基化物的0. 5%以上”，是指對于本發(fā)明的支 鏈α "葡聚糖，除C-I位以外C-3位和C-6位參與鍵合的葡萄糖殘基為構(gòu)成葡聚糖的總葡 萄糖殘基的0.5%以上。完全滿足上述(1) (4)的條件的本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖為目前為止所未知的 新型葡聚糖。本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖在甲基化分析中，只要滿足上述(1) (4)的條件， 葡萄糖殘基的鍵合順序就沒有特別限定。本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖通常為具有葡萄糖聚合度為10以上的各種葡萄糖聚合 度的支鏈α-葡聚糖的混合物的形態(tài)。另外，在本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖中，其重均分子量 (Mw)除以數(shù)均分子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)通常小于20。進而，本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖使具有即使為鄰接于葡聚糖中的異麥芽糖結(jié)構(gòu)的 還原末端側(cè)的α-1，2、α-1，3、α-1，4及α-1，6鍵的任一種鍵也進行水解的特征的異麥芽 糖糊精酶(EC 3.2. 1.94)作用時，每單位消化物的固體成分通常生成異麥芽糖25質(zhì)量％以 上50質(zhì)量％以下。另外，對于本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖，根據(jù)平成8年5月厚生省告示第146號的 營養(yǎng)表示基準(zhǔn)、“營養(yǎng)成份等的分析方法等(刊登于營養(yǎng)表示基準(zhǔn)區(qū)別表第1的第3欄的 方法)”中的第8項、記載于“食物纖維，，的“高效液相色譜法(酶-HPLC法)”求出水溶性 食物纖維含量時，通常含有40質(zhì)量％以上水溶性食物纖維。對上述高效液相色譜法(以 下，在本說明書中簡稱為“酶-HPLC法”)的概略進行說明時，為如下方法通過利用熱穩(wěn)定 α _淀粉酶、蛋白酶及淀粉葡糖苷酶(葡萄糖淀粉酶)進行的一系列酶處理對試樣進行分解 處理，利用離子交換樹脂從處理液除去蛋白質(zhì)、有機酸、無機鹽類，由此，制備高效液相色譜 (HPLC)用試樣溶液，然后，供給到凝膠過濾HPLC中，求出色譜圖中未消化葡聚糖和葡萄糖 的峰面積，使用各自的峰面積、和預(yù)先另外利用常規(guī)方法的葡萄糖氧化酶法求出的試樣溶 液中的葡萄糖量，算出試樣的水溶性食物纖維含量。對本方法的詳細(xì)情況，將在后述的實驗 中進行說明。如后述的實驗19所示，本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖即使經(jīng)口攝取也難以利用唾液 α-淀粉酶、胰液α-淀粉酶或小腸粘膜α-糖甙酶進行分解，因此，難以被消化吸收，可以 用作使血糖急劇上升少、刺激胰島素的分泌少的低卡路里的水溶性食物纖維。另外，該支鏈 α -葡聚糖利用口腔內(nèi)的微生物，難以引起酸發(fā)酵，即使與蔗糖并用，也具有抑制成為牙垢 的原因的不溶性葡聚糖的生成的作用，因此，也可以有利地用作低蛀牙性或抗致齲性糖質(zhì)。 進而，本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖在使用小鼠的急性毒性試驗中，為不顯示任何毒性的葡聚 糖。進而，如后述的實驗20及21所示，同時攝取本發(fā)明的支鏈α _葡聚糖和通常的淀 粉時，與僅攝取淀粉的情況相比，抑制血糖值或胰島素量的上升，因此，也可以用作血糖上 升抑制劑。而且，如后述的實驗22所示，本發(fā)明的支鏈α -葡聚糖也具有通過攝取而抑制生物體內(nèi)的類脂質(zhì)的過剩蓄積的作用，因此，也可以用作生物體內(nèi)類脂質(zhì)減少劑。將本發(fā)明的支鏈α -葡聚糖用作上述血糖抑制劑或生物體內(nèi)類脂質(zhì)減少劑時，由 于水溶性食物纖維含量越高，作用效果越優(yōu)異，因此，支鏈α-葡聚糖通?？梢詢?yōu)選利用含 有40質(zhì)量％以上、優(yōu)選50質(zhì)量％以上、進一步優(yōu)選60質(zhì)量％以上的水溶性食物纖維的支 鏈α-葡聚糖。本發(fā)明中所說的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶，是指通過與麥芽糖及葡萄糖聚合度為3以上 的α-1，4葡聚糖作用、基本上不進行水解地催化α-葡糖基轉(zhuǎn)移從而生成本發(fā)明的支鏈 α-葡聚糖的酶。在水解活性弱方面、不依賴于基質(zhì)溶液的濃度地由低濃度至高濃度均具有 效率良好的轉(zhuǎn)移活性方面及也生成α-1，3及α_1，3，6鍵方面，本發(fā)明的α -葡糖基轉(zhuǎn)移 酶為與來自以往公知的真菌的α-葡糖苷酶或來自醋酸菌的糊精葡聚糖酶不同的酶。本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活性可以如下測定。以最終濃度為的方 式使麥芽糖溶解于20mM醋酸緩沖液(pH6.0)并做成基質(zhì)液，在該基質(zhì)液5ml中加入酶液 0. 5ml，在40°C下進行酶反應(yīng)30分鐘，將該反應(yīng)液0. 5ml和5ml的20mM磷酸緩沖液(pH7. 0) 混合，在沸水水浴中加熱10分鐘，由此使反應(yīng)停止，然后，按照常規(guī)方法用葡萄糖氧化酶法 測定反應(yīng)液中的葡萄糖量，算出通過反應(yīng)生成的葡萄糖量。α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的活性1單位 定義為在上述條件下1分鐘內(nèi)生成1μ摩爾的葡萄糖的酶量。作為本發(fā)明的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的一個具體例，可列舉例如具有下述理化性質(zhì)的 α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。(1)分子量在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法中，為90，000士 10，000道爾頓；(2)最適溫度在pH6. 0反應(yīng)30分鐘的條件下，為50 55°C ；(3)最適 pH在40°C反應(yīng)30分鐘的條件下，為5. 0 6. 3 ；(4)溫度穩(wěn)定性在pH6. 0保持60分鐘的條件下，在直至40°C穩(wěn)定；及(5)pH 穩(wěn)定性在4°C保持24小時的條件下，至少在pH3. 5 8. 4的范圍內(nèi)穩(wěn)定。作為本發(fā)明的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的其它具體例，可列舉例如具有下述理化性質(zhì)的 α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。(1)分子量在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法中，為90，000士 10，000道爾頓；(2)最適溫度在pH6. 0反應(yīng)30分鐘的條件下，為約50°C ；(3)最適 pH在40°C反應(yīng)30分鐘的條件下，為約6. 0 ；(4)溫度穩(wěn)定性在pH6. 0保持60分鐘的條件下，在直至40°C穩(wěn)定；及(5)pH 穩(wěn)定性
在4°C保持24小時的條件下，至少在pH4. 0 8. 0的范圍內(nèi)穩(wěn)定。雖然本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶不受其供給源的限制，但是，作為優(yōu)選的供給源， 可列舉微生物，尤其優(yōu)選使用本發(fā)明人等從土壤中分離出的微生物ΡΡ710株及ΡΡ349株。下 面，將在本發(fā)明的具有α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生能力的微生物ΡΡ710株及ΡΡ349株的鑒定試 驗中判明的細(xì)菌學(xué)各種性質(zhì)分別示于表1及2。需要說明的是，鑒定試驗按照《微生物的分 類和鑒定》(長谷川武治編、學(xué)會出版中心、1985年)進行。
<Α 細(xì)胞形態(tài)>肉汁瓊脂培養(yǎng)27°C通常為0. 5X 1. 0 2. 0X6. 0μ m的桿菌，沒有運動性，形成孢子。革蘭氏陽性。<B 培養(yǎng)性質(zhì)>肉汁瓊脂平板培養(yǎng)27°C形狀圓形大小在2天內(nèi)為1 2mm周緣全緣隆起半透鏡狀光澤暗淡光表面平滑色調(diào)半透明、灰白色肉汁瓊脂斜面培養(yǎng)27°C生長發(fā)育中等程度形狀線狀肉汁明膠穿剌培養(yǎng)27°C不液化<C 生理學(xué)性質(zhì)>VP試驗陰性吲哚的生成陰性二羥基丙酮的生成陰性淀粉的水解陽性色素的生成沒有生成可溶性色素尿素酶陰性氧化酶陰性過氧化氫酶陽性生長發(fā)育的范圍PH5. 5 10. 0、溫度 15 37°C來自葡萄糖的酸生成陰性來自葡萄糖的氣體生成陰性檸檬酸的利用陽性
酪氨酸的分解陰性苯基丙氨酸的脫氨基化陰性硝酸鹽的還原陽性對氧的喜好好氧性溶菌酶存在下的生長發(fā)育陽性DNA的GC含量53. 4%<Α 細(xì)胞形態(tài)>肉汁瓊脂培養(yǎng)2TC通常為0.4X1. 0 0.6X3. 0 μ m的球菌或桿菌,在培養(yǎng)初期主要顯示為桿菌,在培養(yǎng)后期形態(tài) 變化為短桿菌或球菌的具有桿菌-球菌循環(huán)的多形性。沒有運動性,不形成孢子。革蘭氏陽性。<Β 培養(yǎng)性質(zhì)>肉汁瓊脂平板培養(yǎng)27 形狀圓形大小在2天內(nèi)為1 2mm周緣全緣隆起半透鏡狀光澤濕光表面平滑色彩半透明、淡黃色肉汁瓊脂斜面培養(yǎng)27 生長發(fā)育中等程度形狀均質(zhì)肉汁明膠穿剌培養(yǎng)27 不液化<C 生理學(xué)性質(zhì)>對氧的喜好好氧性細(xì)胞壁主要二氨基酸賴氨酸肽聚糖賴氨酸、丙氨酸細(xì)胞壁N-?；鸵阴；图?xì)胞壁構(gòu)成主要糖成分半乳糖、葡萄糖過氧化氫酶陽性細(xì)胞外DNase陽性淀粉的水解陽性維生素要求性陰性與球形節(jié)桿菌的模式菌種97%(DSM 20124)的 16S rRNA 的相同性基于以上的細(xì)菌學(xué)性質(zhì)，參考《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》(Bergey'sManual of Systematic Bacteriology)、第 2 卷(1986 年)及《核糖體數(shù)據(jù)庫》(URL :http://rdp. cme. msu. edu/index. jsp)，分別研究微生物PP710株及PP349株與公知細(xì)菌的異同。其結(jié)果，判 明，微生物PP710株為屬于環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)的微生物，微生物PP349 株為屬于球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)的微生物。本發(fā)明人等將這2種菌株 分別命名為新型微生物環(huán)狀芽孢桿菌PP710及球形節(jié)桿菌PP349，它們都在平成19年2月 1日保藏在日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6所在的獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù) 綜合研究所專利生物保藏中心，分別以保藏編號FERMBP-10771及FERM BP-10770保藏。具 有本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生能力的微生物包含上述菌株，也包含將上述菌株誘發(fā)突 變、并進行選擇而得到的酶高產(chǎn)生變異株等。用于具有本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生能力的微生物的培養(yǎng)的培養(yǎng)基，只要是 微生物可以生長發(fā)育、可以產(chǎn)生本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的營養(yǎng)培養(yǎng)基即可，可以為合 成培養(yǎng)基及天然培養(yǎng)基中的任一種。作為碳源，只要是可以應(yīng)用于微生物生長發(fā)育的碳源 即可，例如，來自植物的淀粉或植物糖原、來自動物或微生物的糖原或普魯蘭多糖，另外還 可以使用這些部分分解物或葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖醇、山梨糖醇、糖漿等糖質(zhì)；以 及檸檬酸、琥珀酸等有機酸。培養(yǎng)基中的這些碳源的濃度可以根據(jù)碳源的種類適當(dāng)選擇。作 為氮源，可以適當(dāng)使用例如銨鹽、硝酸鹽等無機氮化合物；以及例如尿素、玉米漿、酪蛋白、 胨、酵母浸膏、肉浸膏等含有機氮物質(zhì)。另外，作為無機成分，可以適當(dāng)使用例如鈣鹽、鎂 鹽、鉀鹽、鈉鹽、磷酸鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、銅鹽、鉬鹽、鈷鹽等鹽類。而且，可以根據(jù)需要也適 當(dāng)使用氨基酸、維生素等。具有本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生能力的微生物的培養(yǎng)通常在選自溫度15 37°C、pH5. 5 10的范圍、優(yōu)選溫度20 34°C、pH5. 5 8. 5的范圍中的條件下，在有氧的情況 下進行。培養(yǎng)時間只要是該微生物可以增殖的時間即可，優(yōu)選為10小時 150小時。另外，培 養(yǎng)條件中的培養(yǎng)液的溶存氧濃度沒有特別限制，通常優(yōu)選0. 5 20ppm。因此，適當(dāng)采用調(diào)節(jié)通 氣量或攪拌等方法。另外，培養(yǎng)方式可以為分批培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)中的任一種。由此培養(yǎng)具有α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生能力的微生物后，回收含有本發(fā)明的α-葡 糖基轉(zhuǎn)移酶的培養(yǎng)物。為培養(yǎng)微生物為環(huán)狀芽孢桿菌PP710(FERM BP-10771)及球形節(jié)桿 菌PP349(FERM BP-10770)中的任一種的情況，α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性都主要在營養(yǎng)物的除 菌液中被識別，可以提取除菌液作為粗酶液，也可以將全部培養(yǎng)物用作粗酶液。從培養(yǎng)物除 去菌體時，采用常規(guī)方法的固液分離法。例如，可以適當(dāng)采用對培養(yǎng)物本身進行離心分離的 方法，或使用預(yù)涂過濾器等進行過濾分離的方法，利用平板膜、中空纖維膜等通過膜過濾進 行分離的方法等。雖然除菌液可以直接用作粗酶液，但是，一般濃縮之后再使用。作為濃縮 法，可以采用硫酸銨鹽析法；丙酮及乙醇沉淀法；使用平板膜、中空膜等的膜濃縮法等。而且，也可以使用具有α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性的除菌液及其濃縮液，利用該領(lǐng)域 常用的適當(dāng)?shù)姆椒▽ⅵ?葡糖基轉(zhuǎn)移酶固定化。作為固定化的方法，可以適當(dāng)采用例如對 離子交換體的結(jié)合法；與樹脂及膜等的共有結(jié)合法、吸附法；使用高分子物質(zhì)的包埋法等。如上所述，本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶雖然可以將粗酶液直接或濃縮而使用，但 也可以根據(jù)需要利用該領(lǐng)域常用的適當(dāng)?shù)姆椒ɡ琨}析、離子交換色譜法、疏水色譜法、凝 膠過濾色譜法、親和色譜法、制備用電泳等方法進行進一步分離、精制而利用。作為成為本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的基質(zhì)的葡萄糖聚合度為3以上的α-1， 4葡聚糖，可列舉淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原等或利用淀粉酶或酸等將它們部分水解 而得到的淀粉糊精、麥芽糊精及麥芽糖以上的麥芽寡糖等淀粉部分分解物。作為通過淀 粉酶分解而成的部分分解物，可以采用例如記載于《淀粉酶和相關(guān)酶手冊》(Handbookof Amylases and Related Enzymes) (1988 年)”一辦毛 > · 7° l· 7 公司(東京)的、使用 α -淀粉酶(EC 3. 2. 1. 1)、β -淀粉酶(EC 3. 2. 1. 2)、麥芽四糖生成淀粉酶(EC 3. 2. 1. 60)、 麥芽五糖生成淀粉酶、麥芽六糖生成淀粉酶(EC 3.2. 1.98)、環(huán)麥芽糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶 (EC2.4. 1. 19，以下，在本說明書中，簡稱為“CGTase”)等淀粉酶將淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀 粉、糖原等分解而得到的部分分解物。進而，在制備部分分解物時，也可以使支鏈淀粉酶(EC 3.2. 1.41)、異淀粉酶(EC3.2. 1.68)等淀粉去分支酶作用。淀粉可以為來自例如玉米、小 麥、稻米等的地上淀粉，還可以為來自馬鈴薯、甘薯、木薯等的地下淀粉。在由淀粉制造本發(fā) 明的葡聚糖時，通常優(yōu)選將如上所述的原料淀粉糊化和/或液化而使用。淀粉的糊化、液化 的方法本身可以采用公知的方法。進而，本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的基質(zhì)可以是將醚化 淀粉(羥丙基淀粉、羧甲基淀粉、醋酸淀粉等)、酯化淀粉(磷酸化淀粉、辛烯基琥珀酸淀粉 等)及交聯(lián)淀粉(乙?；憾峤宦?lián)淀粉、磷酸交聯(lián)淀粉、羥丙基化磷酸交聯(lián)淀粉等)等 淀粉的一部分利用化學(xué)方法進行衍生物化而成的化工淀粉。在使本發(fā)明的α _葡糖基轉(zhuǎn)移酶作用于基質(zhì)時，其基質(zhì)濃度沒有特別限定，例如， 即使在使用基質(zhì)濃度0.5% (w/v)的較低濃度的溶液的情況下，也促進本發(fā)明的α-葡糖基 轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)而生成支鏈α-葡聚糖。工業(yè)上優(yōu)選基質(zhì)濃度選自(w/v)以上、優(yōu)選5 60% (w/v)以上、進一步優(yōu)選10 50% (w/v)的范圍的濃度，在該條件下，可以有利地生成 本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖。反應(yīng)溫度只要在反應(yīng)進行的溫度、即至60°C左右的溫度下進行即可。優(yōu)選使用30 50°C左右的溫度。反應(yīng)pH通常調(diào)整為4 8的范圍、優(yōu)選pH5 7的范 圍。酶的使用量和反應(yīng)時間存在密切的關(guān)系，根據(jù)作為目的的酶反應(yīng)的促進適當(dāng)選擇即可。例如，使本發(fā)明的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶與淀粉或其部分分解物或直鏈淀粉的水溶液 作用時的支鏈α-葡聚糖的生成機理推測如下。(1)本酶與作為基質(zhì)的麥芽糖和/或葡萄糖聚合度為3以上的α_1，4葡聚糖作 用，將非還原末端葡萄糖殘基主要α-1，4或α_1，6葡糖基轉(zhuǎn)移到其它的α_1，4葡聚糖的 非還原末端葡萄糖殘基上，由此生成非還原末端葡萄糖殘基的4位或6位羥基上α-鍵合 有葡萄糖的α-1，4葡聚糖(葡萄糖聚合度增加1的α-葡聚糖)和葡萄糖聚合度減少1 的α-1，4葡聚糖。(2)本酶進一步與(1)中產(chǎn)生的葡萄糖聚合度減少1的α-1，4葡聚糖作用，相對 (1)中產(chǎn)生的葡萄糖聚合度增加1的α-葡聚糖，與(1)同樣地進行分子間α-1，4或α-1， 6葡糖基轉(zhuǎn)移，由此，在(1)中產(chǎn)生的葡萄糖聚合度增加1的α-葡聚糖的非還原末端葡萄 糖殘基的4或6位羥基上進一步轉(zhuǎn)移葡萄糖，使鏈長延長。(3)通過重復(fù)上述(1)及(2)的反應(yīng)，由麥芽糖和/或葡萄糖聚合度為3以上的 α-1，4葡聚糖生成具有α-1，4及α-1，6鍵的葡聚糖。(4)雖然頻率低，但是，本酶通過進一步催化α -1，3葡糖基轉(zhuǎn)移或相對位于葡聚 糖的內(nèi)部的α-1，6鍵合的葡萄糖殘基的α_1，4或α _1，3葡糖基轉(zhuǎn)移，生成也具有α_1， 3鍵、α-1，4，6鍵及α-1，3，6鍵的葡聚糖。(5)作為重復(fù)上述(1) (4)的反應(yīng)的結(jié)果，葡萄糖主要以α-1，4鍵及α-1，6鍵 鍵合，生成具有少量α-1，3鍵、α-1，4，6鍵及α-1，3，6鍵的支鏈α-葡聚糖。另外判明，具有本發(fā)明的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生能力的環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710 (FERM ΒΡ-10771)，在其培養(yǎng)物中不僅產(chǎn)生本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶，同時還產(chǎn)生某種淀粉酶， 并意外地并用α“葡糖基轉(zhuǎn)移酶和該淀粉酶使其與麥芽糖和/或葡萄糖聚合度為3以上的 α-1,4葡聚糖作用時，與單獨使α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶作用的情況相比，可以制造水溶性食物 纖維含量進一步提高了的支鏈α-葡聚糖。作為環(huán)狀芽孢桿菌PP710(FERM ΒΡ-10771)產(chǎn)生的淀粉酶，可列舉具有下述理化性 質(zhì)的淀粉酶。(1)作用在水解淀粉的同時，催化葡糖基的轉(zhuǎn)移，生成環(huán)糊精。水解普魯蘭多糖，生成潘 糖；(2)分子量在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法中，為58，000士 10，000道爾頓；(3)最適溫度在pH6. 0反應(yīng)30分鐘的條件下，為55°C ；(4)最適 pH在35°C、30分鐘反應(yīng)的條件下，為6 7 ；(4)溫度穩(wěn)定性在pH6. 0保持60分鐘的條件下，在直至40°C的范圍穩(wěn)定，在pH6.0、lmM Ca2+離子存在下，在直至50°C的范圍穩(wěn)定；及
(6)pH 穩(wěn)定性在4°C保持24小時的條件下，在pH6. 0 8. 0的范圍內(nèi)穩(wěn)定。作為在并用本發(fā)明的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶和該淀粉酶并使其與淀粉部分分解物作 用時得到的支鏈α-葡聚糖的水溶性食物纖維的含量比僅使用α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶制成的 支鏈α-葡聚糖的情況高的理由，推測為相對通過α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的作用生成的支鏈 α -葡聚糖，淀粉酶進一步轉(zhuǎn)移葡糖基，進一步提高了葡聚糖中的支鏈的程度(頻率)。另外，通過酶反應(yīng)制備本發(fā)明的支鏈α -葡聚糖時，通過并用其它公知的淀粉酶來 使其反應(yīng)，可以有利地實施支鏈α-葡聚糖的分子量分布的調(diào)節(jié)、以及消化性進一步降低了 的支鏈α-葡聚糖的形成、進而還原能力的降低。例如，通過在淀粉液化液中并用本發(fā)明的 α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶、和α-淀粉酶或CGTase等水解淀粉內(nèi)部的α _1，4鍵而產(chǎn)生新的非還原 末端葡萄糖殘基的酶，并使其作用，也可以有利地實施使分子量分布的幅度變窄、使粘度降低 并進一步增加有助于消化性的降低的α-1，3、α_1，6及α_1，3，6鍵的比例。另外，通過并 用異淀粉酶等淀粉去分支酶，使分子量分布的幅度變窄，使粘度降低，或通過并用日本特開 平7-143876號公報等中公開的非還原性糖質(zhì)生成酶(別名麥芽寡糖基海藻糖生成酶(EC 5. 4. 99. 15))，可以有利地實施將還原末端部分部分地變換為海藻糖結(jié)構(gòu)而使還原能力降低。另外，本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖也可以通過在含有麥芽糖和/或葡萄糖聚合度為 3以上的α _1，4葡聚糖的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生能力的 微生物，提取在培養(yǎng)液中生成的支鏈α-葡聚糖來制造。通過上述反應(yīng)或培養(yǎng)而得到的支鏈α -葡聚糖也可以直接做成支鏈α -葡聚糖制 品。另外，也可以根據(jù)需要使選自α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶及α-葡糖苷酶 中的1種或2種以上與反應(yīng)液作用，水解可消化部分后，通過分級回收非消化部分，或通過 使用了酵母等的發(fā)酵處理除去以葡萄糖為主的分解物，由此制備消化性進一步降低的支鏈 α-葡聚糖。一般而言，含有支鏈α-葡聚糖的反應(yīng)液可進一步精制后再使用。作為精制方 法，適當(dāng)采用用于糖的精制中使用的通常的方法即可，例如，可以適當(dāng)采用利用活性炭進行 的脫色；利用H型、OH型離子交換樹脂進行的脫鹽；利用醇及丙酮等有機溶劑進行的分離、 利用具有適當(dāng)?shù)姆蛛x性能的膜進行的分離等1種或2種以上的精制方法。本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶與糊化淀粉或較低DE^extroseEquivalent)、優(yōu)選 低于DE20的淀粉部分分解物作用時，幾乎不生成葡萄糖或麥芽糖等低分子寡糖，因此，雖 然不特別需要用柱色譜法等精制方法精制得到的反應(yīng)生成物，但是，可以根據(jù)用途等目 的進一步分級。在分級中采用離子交換色譜法時，可以有利地采用使用例如日本特開昭 58-23799號公報、日本特開昭58-72598號公報等中公開的強酸性陽離子交換樹脂的柱色 譜法。此時，可以采用固定床方式、移動床方式、模擬移動床方式中的任一種方式。由此得到的本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖雖然可以以溶液的方式直接利用，但是，為 了有利于保存、且容易根據(jù)用途利用，優(yōu)選進行干燥形成粉末品。干燥通?？梢允褂美鋬龈?燥或噴霧干燥或滾筒干燥等方法。干燥物也可以根據(jù)需要有利地實施粉碎而進行粉末化、 或篩選或制粒而調(diào)整為特定粒度的范圍。另外，本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖具備浸透壓調(diào)節(jié)性、賦形性、光澤賦予性、保濕性、 粘度賦予性、膠粘性、其它糖的結(jié)晶抑制性、難發(fā)酵性等性質(zhì)。因此，本發(fā)明的支鏈α-葡聚 糖或含有其的糖質(zhì)可以以水溶性食物纖維、品質(zhì)改良劑、穩(wěn)定劑、賦形劑等有利地應(yīng)用于飲食品、嗜好品、飼料、餌料、化妝品、醫(yī)藥品等各種組合物。本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖也可以與例如粉糖、葡萄糖、果糖、異性化糖、砂糖、麥芽 糖、海藻糖、蜂蜜、槭糖、山梨糖醇、麥芽糖醇、二氫查爾酮、甜菊糖、α-葡糖基甜菊糖、羅漢 果甜味劑、甘草甜素、甜蛋白、三氯蔗糖、天門冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精、甘氨酸、丙氨酸等 之類的甜味劑和糊精、淀粉、葡聚糖、乳糖等之類的增量劑混合使用。另外，本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖的粉末狀制品可以直接或根據(jù)需要與增量劑、賦 形劑、粘合劑等混合，成形為顆粒、球狀、短棒狀、板狀、立方體等各種形狀而使用。另外，本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖即使經(jīng)口攝取也難以被消化，因此，可以作為水溶 性食物纖維有利地應(yīng)用于普通的飲食品等?？梢杂欣赜米骼玑u油、粉末醬油、豆醬、粉 末豆醬、未過濾的酒、醬、撒在飯上的粉狀食品、蛋黃醬、調(diào)味汁、食醋、三杯醋、壽司醋粉、中 國調(diào)料、高湯、面條湯、辣醬油、番茄醬、燒烤醬、咖喱炒面、燉肉料、湯料、海帶木魚湯料、復(fù) 合調(diào)味品、料酒、新鮮料酒、蔗糖、咖啡糖等各種調(diào)味劑的品質(zhì)改良劑等。另外，可以有利地 用作例如煎餅、炸碎塊年糕、米花糖、皮糖樣的點心、餅類、豆沙包、米粉糕、餡類、羊羹、軟羊 羹、錦玉、果凍、蛋糕、糖果等各種點心、面包、餅干、椒鹽餅干、小甜餅、餡餅、布丁、摻糖奶 油、乳蛋糕乳脂、奶油餡點心、蛋奶烘餅、海綿松蛋糕、炸面餅圈、巧克力、口香糖、焦糖、杏仁 糖、冰棒等各種西式點心、冰激凌、果子露等冰點心、果實罐頭、冰蜜等糖漿類、面粉膏、花生 膏、果實膏等膏類；果醬、橘皮果醬、罐頭、糖果等果實、蔬菜的加工食品類；什錦八寶醬菜、 用少量鹽和曲子漬的蘿卜、千層咸菜等咸菜類；腌蘿卜調(diào)料、腌白菜調(diào)料等咸菜調(diào)料；火 腿、香腸等肉制品類；魚肉火腿、魚肉香腸、魚糕、烤成的筒狀魚卷、炸蝦等魚肉制品、海膽、 咸墨魚、醋海帶、炸魷魚、鱈魚、加級魚、蝦等魚松等各種珍味類；用海苔、蔬菜、干魷魚、小 魚、貝等制造的咸烹海味類；煮豆菜、炸馬鈴薯(土豆)片、海帶卷等家常菜食品；乳制品、 魚肉、畜肉、果實、蔬菜的瓶裝、罐頭類、合成酒、增釀酒、清酒、果酒、發(fā)泡酒、啤酒等酒類；咖 啡、可可茶、果汁、碳酸飲料、乳酸飲料等清涼飲料水、布丁混合粉Purin Mix、熱香餅混合 粉、快餐果汁、快餐咖啡、快餐年糕小豆湯、快餐湯等快餐食品；還有斷奶食品、醫(yī)療食品、清 涼齊U、肽食品、冷凍食品等各種飲食品中可以配合的水溶性食物纖維。另外，作為用于家畜、家禽、其它蜜蜂、蠶、魚等飼養(yǎng)動物的飼料、飼料等，也可以以 改善整腸、便秘、防止肥胖為目的而使用。此外，可以以香煙、牙膏、口紅、潤唇膏、內(nèi)服藥、藥 片、片劑、肝油丸、口氣清新劑、口香糖、含漱劑等各種固體成分、膏狀、液體狀等形態(tài)有利地 用作對嗜好品、化妝品、醫(yī)藥品等各種組合物的品質(zhì)改良劑、穩(wěn)定劑等。作為品質(zhì)改良劑、穩(wěn)定劑，可以有利地應(yīng)用于容易失去有效成分、活性等的各種生 理活性物質(zhì)或含有其的健康食品、功能性食品、醫(yī)藥品等。例如，干擾素-α、-β、-Y、腫瘤壞 死因子-α、-β、巨噬細(xì)胞、巨噬細(xì)胞游走抑制因子、菌落刺激因子、轉(zhuǎn)移因子、白細(xì)胞介素II 等淋巴因子含有液、胰島素、成長激素、催乳激素、紅細(xì)胞生成素、卵細(xì)胞刺激激素等激素含有 液、BCG疫苗、日本腦炎疫苗、麻疹疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、牛痘疫苗、破傷風(fēng)類毒素、波布抗毒 素、人免疫球蛋白等生物制劑含有液、青霉素、紅霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素、硫酸卡那霉素 等抗生素含有液、硫胺素、核黃素、L-抗壞血酸、肝油、類胡蘿卜素、麥角留醇、生育酚等維生 素含有液、EPA、DHA、花生酸等高度不飽和脂肪酸或其酯衍生物、脂酶、酯酶、尿激酶、蛋白酶、 β -淀粉酶、異淀粉酶、葡糖酶、乳糖酶等酶含有液、藥用人參浸膏、龜浸膏、小球藻浸膏、蘆薈 浸膏、蜂膠浸膏等浸膏類、病毒、乳酸菌、酵母等活菌疫苗膏、蜂王漿等各種生理活性物質(zhì)都將本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖用作品質(zhì)改良齊IJ、穩(wěn)定劑，由此，其有效成分、活性不會喪失，可以容 易地制造穩(wěn)定且高品質(zhì)的液體狀、膏狀或固體狀的健康食品、功能性食品或醫(yī)藥品等。作為在如上所述的各種組合物中含有本發(fā)明的支鏈α _葡聚糖的方法，只要在其制 品完成的步驟之前含有即可，可以選擇例如混合、混捏、溶解、熔化、浸漬、浸透、分散、涂敷、被 覆、噴霧、注入、固化等公知的方法。其量通常優(yōu)選含有0. 1質(zhì)量％以上、優(yōu)選1質(zhì)量％以上。另外，本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶與含有麥芽糖及葡萄糖聚合度為3以上的α-1， 4葡聚糖作用時，將α-1，4葡聚糖變換為本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖，因此，也可以用作含有 麥芽糖及葡萄糖聚合度為3以上的α -1，4葡聚糖的組合物的改性劑。而且，本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶與麥芽糖及葡萄糖聚合度為3以上的α_1，4 葡聚糖作用時，生成本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖，另一方面，本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖通過異 麥芽糖糊精酶(EC 3. 2. 1. 94)消化時，每基質(zhì)固體成分生成異麥芽糖25質(zhì)量％以上50質(zhì) 量％以下，因此，對本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶，可以以麥芽糖及葡萄糖聚合度為3以上的 α -1，4葡聚糖為原料，通過這2個段的酶反應(yīng)來制造異麥芽糖或含有其的糖質(zhì)。下面，利用實驗對本發(fā)明進行詳細(xì)說明。<實驗1 使用來自環(huán)狀芽孢桿菌PP710(FERM BP-10771)的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的 葡聚糖的制備〉<實驗1-1 來自環(huán)狀芽孢桿菌PP710(FERM BP-10771)的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的制
備〉在1個500ml容積三角燒瓶中加入由淀粉部分分解物(商品名《八^ )亍”卞 #4》、松谷化學(xué)工業(yè)株式會社出售)1. 5w/v%、酵母萃取物(商品名《聚胨》、日本制藥株式會 社出售)0. 5w/v%、酵母萃取物(商品名《酵母浸膏S》、日本制藥株式會社出售)0. lw/v%, 磷酸二鉀0. lw/v%、磷酸一鈉· 2水合物0. 06w/v%、硫酸鎂· 7水合物0. 05w/v%、硫酸 錳·5水合物0. 00w/v%、硫酸亞鐵·7水合物0. 001 八％及水構(gòu)成的液體培養(yǎng)基100ml，用 高壓滅菌器在121°C滅菌20分鐘并冷卻，接種環(huán)狀芽孢桿菌PP710(FERM BP-10771)，將在 27°C以230rpm旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)48小時得到的產(chǎn)物作為菌種培養(yǎng)。在12個500ml容積三角燒瓶中加入與菌種培養(yǎng)相同組成的液體培養(yǎng)基各100ml， 進行加熱滅菌、冷卻并設(shè)定為27°C后，接種各菌種培養(yǎng)液約1ml，在溫度27°C旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng) 24小時。培養(yǎng)后，從三角燒瓶抽出培養(yǎng)液，進行離心分離(8，000rpm、20分鐘)并除去菌體， 測定得到的培養(yǎng)上清液的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性，結(jié)果為2. 8單位/ml。在該培養(yǎng)上清液約 IL中以成為80%飽和的方式添加硫酸銨并溶解，在4°C放置24小時，由此進行鹽析。通過 離心分離(ll，000rpm、30分鐘)回收沉淀的鹽析物，將其溶解于20mM醋酸緩沖液(pH4. 5) 后，相對同緩沖液進行透析，得到粗酶液約20ml。將該粗酶液供給到使用用20mM醋酸緩沖 液(pH4.5)平衡化了的東〃 一株式會社制《CM-卜3 ^ — > 650S》凝膠的陽離子交換柱色 譜法(凝膠容量20ml)。將非吸附蛋白質(zhì)洗脫后，以食鹽濃度OM 0. 5M的線性梯度使其洗 脫，回收在食鹽濃度約0. 18M左右 0. 45M左右洗脫的組分，相對20mM醋酸緩沖液(pH6. 0) 進行透析。將得到的透析液作為α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶樣品。<實驗1-2 使用α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的支鏈α -葡聚糖的制備>將由實驗1-1得到的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶樣品IOOml用作酶液，其中以終濃度為 30w/v%的方式添加淀粉部分分解物(商品名《〃°八、乂 m卞#100》松谷化學(xué)工業(yè)株式會社出售)，在40°C下反應(yīng)72小時后，在約100°C下熱處理10分鐘，由此停止反應(yīng)。過濾不溶 物并除去后，使用三菱化學(xué)制離子交換樹脂《夕· ^ ~ ^才> SK-1B》和《夕· 4 ~ 4才> WA30》 及才&力“制陰離子交換樹脂《IRA411》進行脫色、脫鹽并精密過濾，然后，用蒸發(fā)器濃縮， 從用作基質(zhì)的淀粉部分分解物以每固體成分85. 8%的收率得到固體成分濃度30質(zhì)量％的 葡聚糖溶液?！磳嶒?使用來自球形節(jié)桿菌PP 349 (FERM BP-10770)的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的葡 聚糖的制備〉<實驗2-1 來自球形節(jié)桿菌PP 349 (FERM ΒΡ-10770)的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的制備>取代環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710 (FERM BP-10771),接種球形節(jié)桿菌PP349 (FERM BP-10770)，除此之外，將與實驗1-1同樣地培養(yǎng)成的產(chǎn)物作為菌種培養(yǎng)。在12個500ml容積三角燒瓶中加入與菌種培養(yǎng)相同的液體培養(yǎng)基各100ml，進行 加熱滅菌、冷卻并設(shè)定為27°C后，接種各菌種培養(yǎng)液約1ml，在溫度27°C旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)24 小時。培養(yǎng)后，從三角燒瓶抽出培養(yǎng)液，進行離心分離(8，000rpm、20分鐘)并除去菌體，測 定得到的培養(yǎng)上清液的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性，結(jié)果為0.53單位/ml。在該培養(yǎng)上清液約 IL中以成為80%飽和的方式添加硫酸銨并溶解，在4°C放置24小時，由此進行鹽析。通過 離心分離(11，OOOrpm,30分鐘)回收沉淀的鹽析物，將其溶解于20mM醋酸緩沖液(pH6. 0) 后，相對同緩沖液進行透析。將該粗酶液供給到使用用20mM醋酸緩沖液(pH6.0)平衡化 了的東〃 一株式會社制《DEAE-卜3 〃一& 650S》凝膠的陰離子交換柱色譜法(凝膠容量 20ml)。將非吸附蛋白質(zhì)洗脫后，以食鹽濃度OM 0. 5M的線性梯度使其洗脫，回收在食鹽 濃度約0. 05M左右 0. 2M左右洗脫的組分，相對20mM醋酸緩沖液(pH6. 0)進行透析。將 得到的透析液作為α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶樣品。〈實驗2-2:使用α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的葡聚糖的制備〉將由實驗2-1得到的α _葡糖基轉(zhuǎn)移酶樣品20ml用作酶液，其中以終濃度為30w/ 的方式添加淀粉部分分解物(商品名《〃 P〒”卞#100》松谷化學(xué)工業(yè)株式會社出
售)，在40°C下使其反應(yīng)72小時后，在約100°C下熱處理10分鐘，由此停止反應(yīng)。過濾不溶 物并除去后，使用三菱化學(xué)制離子交換樹脂《夕· ^ ~ ^才> SK-1B》和《夕· 4 ~ 4才> WA30》 及才&力“制陰離子交換樹脂《IRA411》進行脫色、脫鹽并精密過濾，然后，用蒸發(fā)器濃縮， 從用作基質(zhì)的淀粉部分分解物以每固體成分83. 6%的收率得到固體成分濃度為30質(zhì)量％ 的葡聚糖溶液。在以下的實驗3及4中，為了區(qū)別由實驗1-2得到的葡聚糖和由實驗2-2得到的 葡聚糖，將各自稱為“葡聚糖A”和“葡聚糖B”。<實驗3 作為葡聚糖A及B的水溶性食物纖維的評價>將得到的葡聚糖的水溶性食物纖維含量按照營養(yǎng)表示基準(zhǔn)(平成8年5月厚生省 告示第146號)中的營養(yǎng)成份等分析方法等(刊登于營養(yǎng)表示基準(zhǔn)區(qū)別表第1的第3欄 的方法)”、8.食物纖維、(2)高效液相色譜法(酶-HPLC法)記載的方法，利用下述方法進 行研究。作為酶處理用的試劑盒，使用總食物纖維測定的試劑盒(Dietary Fiber, Total, Assay, Control Kit、*7公司制造)。另外，以作為用于葡聚糖A及B的制備的基質(zhì)的 淀粉部分分解物(商品名《^ ^ ) r ,々^ #100》松谷化學(xué)工業(yè)株式會社出售)為對照1， 以市售的難消化性葡聚糖(商品名《〃< ” τ ^ 〃一》松谷化學(xué)工業(yè)株式會社出售)為對照2，同樣地研究各自的水溶性食物纖維含量。<分析用試樣溶液的制備>在試管中取固體成分0. Ig的葡聚糖作為被檢試樣，添加0. 08M磷酸緩沖液5ml，將 PH調(diào)整為6. 0。其中，加入附有食物纖維測定試劑盒的熱穩(wěn)定α -淀粉酶(來自地衣芽孢桿 菌的耐熱性α “淀粉酶、^ ι公司制造)溶液0. 01ml，用鋁箔覆蓋，在沸騰水浴中每5分 鐘進行攪拌，同時使其反應(yīng)30分鐘并冷卻。在得到的反應(yīng)液中添加0. 275M氫氧化鈉溶液 約1ml，將pH調(diào)整為7. 5后，加入附有試劑盒的蛋白酶(來自地衣芽孢桿菌、^ ^ 公司制 造)溶液0. Olml，用鋁箔覆蓋，在60°C的水浴中振蕩，同時使其反應(yīng)30分鐘并冷卻。在得到 的蛋白酶處理液中添加0. 325M鹽酸約1ml，將pH調(diào)整為4. 3后，加入附有試劑盒的淀粉葡 糖苷酶(來自黑曲霉、〉々'7公司制造)溶液0. 01ml，用鋁箔覆蓋，在60°C的水浴中振蕩， 同時使其反應(yīng)30分鐘并冷卻。接著，將得到的反應(yīng)液約7ml以SVl. 0通液到離子交換樹脂 (將才Aif 乂株式會社出售的7^卜IRA-67(0H型)和7 >廣一，4卜200CT(H 型)以1 1混合)，由此進行脫鹽，進一步用3倍量的去離子水洗脫，將洗脫液的總量設(shè)定 為約28ml。用蒸發(fā)器濃縮得到的洗脫液，用孔徑0. 45 μ m的膜濾器進行過濾后，將用量瓶定 容為25ml的洗脫液作為分析用試樣溶液。<高效液相色譜法條件>將上述得到的分析用試樣溶液供給到述條件的高效液相色譜法。柱串聯(lián)連接2根TGKgel G2500PWXL(內(nèi)徑7. 8mm X長度300mm，株式會社東乂 一 製)而得到的色譜圖洗提液去離子水試樣糖濃度0.8質(zhì)量％柱溫度80°C流速0.5ml/ 分鐘檢測差示折射計注入量20μ1分析時間50分鐘<被檢試樣的水溶性食物纖維含量的計算>在由上述得到的色譜圖中，將通過酶處理也不被分解而殘留的未消化葡聚糖作為 水溶性食物纖維。分別求出被分解成水溶性食物纖維而生成的葡萄糖的峰面積，另外，使用 通過常規(guī)方法的葡萄糖氧化酶法進行定量的分析用試樣溶液中的葡萄糖量，利用下述式1 求出水溶性食物纖維量。而且，利用下述式2求出被檢試樣的水溶性食物纖維含量。式1 水溶性食物纖維量(mg)=水溶性食物纖維的峰面積/葡萄糖的峰面積X分析用 試樣溶液中的葡萄糖質(zhì)量* (mg)* (分析用試樣溶液中的葡萄糖濃度(mg/ml) X 25ml)式2 水溶性食物纖維含量(質(zhì)量％ )=被檢試樣水溶性食物纖維量(mg) /被檢試樣固體成分質(zhì)量(mg) X 100利用上述酶-HPLC法求出的葡聚糖A及葡聚糖B的水溶性食物纖維含量分別為 42. 1質(zhì)量％及41. 8質(zhì)量％。另一方面，對照1的淀粉部分分解物通過酶處理全部分解為 葡萄糖，水溶性食物纖維含量評價為0質(zhì)量％。另外，對照2的市售的難消化性糊精(商品 名《^ ^ 7 τ ^ K一》松谷化學(xué)工業(yè)株式會社出售)的水溶性食物纖維含量為48.7質(zhì)量％。 這些結(jié)果顯示通過以不含有水溶性食物纖維的淀粉部分分解物為基質(zhì)使本發(fā)明的α -葡 糖基轉(zhuǎn)移酶作用，可以容易地制備表示與市售的難消化性糊精幾乎同等的水溶性食物纖維 含量的葡聚糖。<實驗4 葡聚糖A及B的結(jié)構(gòu)分析><實驗4-1 甲基化分析>在用實驗1-2及2-2的方法得到的葡聚糖A及B中，按照常規(guī)方法進行甲基化分 析，用下述條件的高效液相色譜法研究部分甲基化物。將結(jié)果匯總于表3。 造)
分鐘
<氣相色譜法條件>
柱DB-5毛細(xì)管柱(內(nèi)徑0. 25mmX長度30mX膜厚1 μ m，J&WScientific公司制
載氣氦
柱溫度在130°C下保持2分鐘后，以5°C /分鐘升溫至250°C，在250°C下保持20
流速1.0ml/分鐘 檢測FID
注入量3μ1 (分流1/30) 分析時間46分鐘
部分曱基化物的種類對應(yīng)的葡萄糖殘基存在比(面積%)原料淀粉*部 分分解物葡聚糖A葡聚糖B2, 3,4, 6-四甲基化物非還原末端葡萄糖殘基5. 810. 19. 83, 4，6-三曱基化物1,2鍵合的葡萄糖殘基0. 00. 00. 02, 4，6-三甲基化物1,3鍵合的葡萄糖殘基0. 01.10.92, 3，6-三甲基化物1,4鍵合的葡萄糖殘基89. 851. 549.12, 3，4-三甲基化物1，6鍵合的葡萄糖殘基0. 032. 233.92，4-二曱基化物1,3, 6鍵合的葡萄糖殘基0. 00. 81. 12，3-二曱基化物1,4, 6鍵合的葡萄糖殘基4.44. 55.2* 八4父r夕夕叉#100葡聚糖A :由來自PP710株的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶制成的葡聚糖葡聚糖B 由來自ΡΡ349株的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶制成的葡聚糖由表3的結(jié)果得知，將利用來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710及來自球形節(jié)桿菌ΡΡ349的 α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶分別制成的葡聚糖A及B的甲基化分析結(jié)果與作為基質(zhì)的淀粉部分分解 物的甲基化分析結(jié)果比較時，任一種葡聚糖的情況都顯著降低2，3，6-三甲基化物，另一方
23面，2，3，4_三甲基化物顯著增加至30%以上。該情況表明通過來自環(huán)狀芽孢桿菌PP710及 來自球形節(jié)桿菌PP349的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)，具有主要通過α-1，4鍵聚合有葡萄糖 的結(jié)構(gòu)的淀粉部分分解物變換為含有30%以上α_1，6鍵的支鏈α-葡聚糖。另外也判明 由于2，3，4，6-四甲基化物、2，4，6-三甲基化物及2，4-二甲基化物增加，因此，重新生成非 還原末端葡萄糖、α-1，3鍵及α-1，3，6鍵。葡聚糖A中的部分甲基化物中的2，4，6_三甲 基化物及2，4- 二甲基化物的含量分別為1. 1 %及0. 8%，葡聚糖B中的2，4，6-三甲基化物 及2，4_ 二甲基化物的含量分別為0.9%及1. 1%。而且，在葡聚糖A及B中，2，3_二甲基化 物的存在比與基質(zhì)幾乎沒有差異，因此認(rèn)為，在原來存在于基質(zhì)的作為支鏈的α-1，4，6鍵 上沒有大的變化。由該結(jié)果判明葡聚糖A及B與作為基質(zhì)的淀粉部分分解物有很大差異， 葡萄糖的鍵合方式為以α-1，4鍵及α-1，6鍵為主體、也稍微具有α_1，3鍵及α_1，3，6 鍵的支鏈葡聚糖(支鏈α-葡聚糖)。需要說明的是，構(gòu)成支鏈α-葡聚糖A及B的葡萄糖 的1位的端基差向異構(gòu)體型在核磁共振(NMR)分析中，從1H-NMR光譜來看，全部為α型。<實驗4-2 支鏈α -葡聚糖A及B的異麥芽糖糊精酶消化試驗>為了使支鏈α _葡聚糖A及B的結(jié)構(gòu)帶有特征，進行異麥芽糖糊精酶消化試驗。在 支鏈α-葡聚糖A及B的水溶液(最終濃度中每1克基質(zhì)固體成分加入100單位 的來自球形節(jié)桿菌的異麥芽糖糊精酶(在株式會社林原生物化學(xué)研究所內(nèi)制備)，在50°C、 pH5. 0下作用16小時，在100°C下保持10分鐘并停止反應(yīng)后，使用高效液相色譜法(以下 簡稱為“HPLC法”。)及氣相色譜法研究該反應(yīng)液中的糖組成。HPLC在柱中使用2根“MCI GEL CK04SS”(株式會社三菱化學(xué)制造)，在洗提液中使用水，在柱溫度80°C、流速0. 4ml/分 鐘的條件下進行，使用差示折射計RI D-10A(株式會社島津制作所制造)進行檢測。GC按照 常規(guī)方法將糖質(zhì)進行三甲基甲硅烷基化(TMS化)后，在柱中使用《2%硅0V-17ChrOmOSOrb ff/Aff-DMS))(株式會社夕一 工A ·寸^工> 7制造)，每1分鐘以7. 5°C的升溫速度從溫 度160°C升溫至320°C。使用氮氣作為載氣，用FID法進行檢測。在異麥芽糖糊精酶消化中， 由作為用于支鏈α"葡聚糖的制備的基質(zhì)的淀粉部分分解物沒有完全生成異麥芽糖，與此 相對，由支鏈α-葡聚糖A生成作為糖組成的28.4質(zhì)量％的異麥芽糖，另外，由α-葡聚糖 B生成作為糖組成的27.2質(zhì)量％的異麥芽糖。該結(jié)果顯示，α-葡聚糖A及B分別至少含 有異麥芽糖結(jié)構(gòu)28. 4質(zhì)量％及27. 2質(zhì)量％左右，支鏈α -葡聚糖支持顯示有α _1，6鍵的 比例增加的實驗4-1中的甲基化分析的結(jié)果。需要說明的是，異麥芽糖糊精酶如果為連接 于葡聚糖中的異麥芽糖結(jié)構(gòu)的還原末端側(cè)的α-葡糖基鍵，則具有其為α-1，3、α_1，4及 α-1,6鍵的任一種都進行水解的特異性，因此，得到的異麥芽糖在α -葡聚糖A及B中以怎 樣的鍵合方式鍵合，其詳細(xì)情況不清楚。<實驗4-3 支鏈α -葡聚糖A及B的α -葡糖苷酶及葡萄糖淀粉酶消化試驗>在支鏈α-葡聚糖A及B的水溶液(最終濃度lw/v % )中使來自黑曲霉 (Aspergillus niger)的α -葡糖苷酶(商品名《反式葡糖苷酶端基差向異構(gòu)體L》、天野 -巧^ A制)及來自海洋真菌屬(Rhizopus sp.)的葡萄糖淀粉酶同時作用，進行消化試 驗。每1克基質(zhì)固體成分加入5，000單位的α -葡糖苷酶和100單位的葡萄糖淀粉酶，在 50°C、pH5. 0下作用16小時，在100°C下保持10分鐘并停止反應(yīng)后，在與實驗4_2相同的條 件下使用HPLC研究其酶反應(yīng)液的糖組成。其結(jié)果，α -葡聚糖A及B都與作為基質(zhì)的淀粉 部分分解物的情況同樣，基本上完全被分解為葡萄糖。該結(jié)果顯示，α-葡聚糖A及B都是以葡萄糖為構(gòu)成糖的α-葡聚糖?！磳嶒?-4:分子量分布分析〉對支鏈α -葡聚糖A及B用常規(guī)方法的凝膠過濾HPLC法分析分子量分布。凝膠過 濾HPLC法在柱中使用連接有2根《TSK GEL α -Μ》(株式會社東” 一制)的柱，在洗提液中 使用IOmM磷酸緩沖液(ρΗ7. 0)，在柱溫度40°C、流速0. 3ml/分鐘的條件下進行，使用差示 折射計RID-10A(株式會社島津制作所制造)進行檢測。需要說明的是，試樣中的葡聚糖的 分子量基于將分子量測定用普魯蘭樣品(株式會社林原生物化學(xué)研究所出售)同樣地供給 到凝膠過濾分析并制成的分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線算出。圖1將支鏈α-葡聚糖A及B的凝膠過 濾HPLC色譜圖(圖1中的符號b及c)與用作基質(zhì)的淀粉部分分解物(商品名《〃M
,” ^ #100》的凝膠過濾HPLC色譜圖(圖1中的符號a)比較，同時分別表示。需要說明的 是，圖1中的符號4、口、〃、二及t/ *分別是指相當(dāng)于分子量1，000，000、100，000、10，000、 1，000及100道爾頓的洗脫位置(在后述的圖15 19中也同樣)。另外，表4表示基于用 凝膠過濾HPLC得到的色譜圖分析有各試樣的分子量分布的結(jié)果。
分析項目原料淀粉*部分分解物葡聚糖A葡聚糖B數(shù)均分子量(Mn)(道爾頓)6，6803，8404，050重均分子量(Mw)(道爾頓)98，89059, 00065, 700Mw/Mn14. 815. 416. 2峰值的葡萄糖聚合度(個)499 及 6. 3384.22. 2.10. 9 及 1433,22. 8、10. 9 及 1* > r、”卞 #100葡聚糖A :由來自PP710株的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶制成的葡聚糖葡聚糖B 由來自ΡΡ349株的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶制成的葡聚糖用作基質(zhì)的淀粉部分分解物為在分子量分布分析中在相當(dāng)于葡萄糖聚合度499及 6. 3的位置上具有2個峰值(圖1的色譜圖a中的符號1及2)的糖質(zhì)混合物，與此相對，支 鏈α -葡聚糖A為在相當(dāng)于葡萄糖聚合度384、22. 2、10. 9及1的位置上具有4個峰值(圖 1的色譜圖b中的符號3、4、5及6)的糖質(zhì)混合物，另外，支鏈α-葡聚糖B為在相當(dāng)于葡萄 糖聚合度433、22. 8、10. 9及1的位置上具有4個峰值(圖1的色譜圖c中的符號7、8、9及 10)的糖質(zhì)混合物。雖然符號6及10的峰值相當(dāng)于葡萄糖，但是，其含量極少，因此得知，來 自環(huán)狀芽孢桿菌PP710及球形節(jié)桿菌PP 349的酶的水解作用微小。由表4得知，與作為基 質(zhì)的淀粉部分分解物相比，葡聚糖A及B的數(shù)均分子量及重均分子量同時減少至60%程度， 作為主體進行低分子化。另外認(rèn)為，由于作為分子量分布的擴展的指標(biāo)的重均分子量(Mw) 除以數(shù)均分子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)在淀粉部分分解物和葡聚糖A及B之間沒怎么變 化，因此，來自環(huán)狀芽孢桿菌PP710及球形節(jié)桿菌PP349的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶僅作用于淀粉 部分分解物的非還原末端。由表3的結(jié)果判明在用作基質(zhì)的淀粉部分分解物中，葡萄糖的鍵合方式的90% 為α-1，4鍵，稍微具有α-1，4，6鍵，與此相對，葡聚糖A及B為相對α-1，4鍵的α_1，6鍵 的比例非常高、含有在α-1，4，6鍵的基礎(chǔ)上也具有α-1，3鍵及α-1，3，6鍵的支鏈的葡聚 糖。具有這種結(jié)構(gòu)的支鏈α-葡聚糖迄今為止還不為人知。
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基于甲基化分析的結(jié)果推定本發(fā)明的支鏈α -葡聚糖結(jié)構(gòu)，將示意性地表示其結(jié) 構(gòu)的圖與作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的圖一同示于圖2。圖2中，符號1及2分別為各自 原料淀粉部分分解物及本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖的示意圖。需要說明的是，在圖2中，符號 a、b、c、d、e及f分別是指淀粉部分分解物或本發(fā)明的支鏈α _葡聚糖中的非還原末端葡 萄糖殘基、α-1，3鍵合的葡萄糖殘基、α _1，4鍵合的葡萄糖殘基、α_1，6鍵合的葡萄糖殘 基、α_1，3，6鍵合的葡萄糖殘基及α_1，4，6鍵合的葡萄糖殘基。另外，同示意圖中的葡萄 糖間的斜虛線、橫實線及縱實線分別是指α-1，3鍵合、α_1，4鍵合及α_1，6鍵合?！磳嶒?:來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710株的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的生產(chǎn)〉在2個500ml容積三角燒瓶中加入由淀粉部分分解物(商品名《^ ^、巧‘”卞 #4》松谷化學(xué)工業(yè)株式會社制造)1. 5w/v%、酵母萃取物(商品名《聚胨》、日本制藥株式會 社制造)0. 5w/v %、酵母萃取物(商品名《酵母浸膏S》、日本制藥株式會社制造)0. lw/v %、 磷酸二鉀0. lw/v %、磷酸一鈉· 2水合物0. 06w/v%、硫酸鎂· 7水合物0. 05w/v%、硫酸 錳·5水合物0. 001w/v%、硫酸亞鐵·7水合物0. 001w/v%及水構(gòu)成的液體培養(yǎng)基各100ml， 用高壓滅菌器在121°C滅菌20分鐘并冷卻，接種環(huán)狀芽孢桿菌PP 710(FERM BP-10771)，將 在27°C以230rmp旋轉(zhuǎn)振蕩48小時培養(yǎng)成的產(chǎn)物作為菌種培養(yǎng)。在容量30L的發(fā)酵罐中加入與菌種培養(yǎng)相同組成的液體培養(yǎng)基約20L，進行加熱 滅菌、冷卻并設(shè)定為27°C后，接種菌種培養(yǎng)液約200ml，保持在溫度27°C、pH5. 5 8. 0，同時 通氣攪拌培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)后，從酵母罐抽出培養(yǎng)液，進行離心分離(8，000rpm、20分鐘) 并除去菌體，得到培養(yǎng)上清液約18L。對培養(yǎng)液及培養(yǎng)上清液測定α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性， 結(jié)果培養(yǎng)液的該酶活性約為2. 7單位/ml，培養(yǎng)上清液的該酶活性約為2. 6單位/ml。判明 由環(huán)狀芽孢桿菌PP710生產(chǎn)的本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的大部分存在于菌體外?！磳嶒?:來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的精制〉在由實驗5得到的培養(yǎng)上清液中，在約4L (總活性約10，400單位)中以成為80% 飽和的方式添加并溶解，4°C放置24小時，由此進行鹽析。通過離心分離(11，OOOrpm,30分 鐘)回收沉淀的鹽析物，將其溶解于20mM醋酸緩沖液(pH4. 5)后，相對同緩沖液進行透析， 得到粗酶液約65ml。粗酶液中的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性約為74單位/ml (總活性約4，780 單位)。將該粗酶液供給到使用東〃 一株式會社制《CM-卜3 〃一& 650S》凝膠的陽離子交 換柱色譜法(凝膠容量70ml)。α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性吸附于用20mM醋酸緩沖液(pH4. 5) 平衡化的《CM-卜3650S))凝膠，以食鹽濃度OM 0. 5M的線性梯度使其洗脫，結(jié)果 在食鹽濃度約0. 4M左右洗脫?；厥赵摶钚越M分，以終濃度為IM的方式添加硫酸銨，在4°C放 置24小時，然后進行離心分離，除去不溶物，供給到使用東〃 一株式會社制《丁基-卜3 〃一 & 650M》凝膠的疏水柱色譜法(凝膠容量9ml)。本發(fā)明的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性吸附于用含 有IM硫酸銨的20mM醋酸緩沖液(pH6.0)平衡化的《CM-卜3 " —> 650M》凝膠，以硫酸銨濃度 IM OM的線性梯度使其洗脫，結(jié)果在硫酸銨濃度約0. 2M左右洗脫?；厥赵摶钚越M分，將其相 對20mM醋酸緩沖液(pH4. 5)透析后，供給到使用東、乂 一株式會社制《CM-5PW》凝膠的陰離子交 換柱色譜法(凝膠容量3. 3ml)。α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性吸附于用20mM醋酸緩沖液(pH4. 5)平 衡化的《CM-5PW》凝膠，以食鹽濃度OM 0. 5M的線性梯度使其洗脫，結(jié)果食鹽濃度在約0. 4M左 右洗脫。回收該活性組分，將其相對20mM醋酸緩沖液(pH6.0)進行透析。將各精制的各步驟中 的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性、α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性的比活性及收率示于表5。
26步驟α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性(單位)α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶比活性(單位/mg蛋白)收率(％)培養(yǎng)上清液10，40010100硫酸銨鹽析后的透析液4，78022. 846. 0離子交換柱洗脫液3，96026538. 1疏水柱洗脫液3，80030736. 5離子交換柱洗脫液3，30032731. 7
〔0274:1 〔027S
對精制好的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶樣品，利用5 20w/v%濃度梯度聚丙烯酰胺凝膠電 泳檢定酶樣品的純度，結(jié)果為蛋白鍵單一、純度高的樣品?！磳嶒?:來自環(huán)狀芽孢桿菌PP710的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的性質(zhì)〉<實驗7-1 分子量>將由實驗6得到的來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶精制樣品供給到 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(5 20 八％濃度梯度)，同時與泳動的分子量標(biāo)記(日本〃 4才·，、；/ K ·，#，卜u 一<株式會社制)比較并測定分子量，結(jié)果判明，本α-葡糖基 轉(zhuǎn)移酶的分子量為90，000士 10，000道爾頓。<實驗7-2 酶反應(yīng)的最適溫度及最適ρΗ>使用由實驗6得到的來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶精制樣品，按 照活性測定的方法研究溫度、PH給酶活性帶來的影響。將這些結(jié)果示于圖3 (最適溫度) 及圖4(最適ρΗ)。判明本α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的最適溫度在pH6. 0反應(yīng)30分鐘的條件下， 為50 55°C，最適ρΗ在40°C反應(yīng)30分鐘的條件下，為5. 0 6. 3。<實驗7-3 酶的溫度穩(wěn)定性及ρΗ穩(wěn)定性>使用由實驗6得到的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶精制樣品研究本酶的溫度穩(wěn)定性及ρΗ穩(wěn) 定性。溫度穩(wěn)定性通過將酶溶液(20mM醋酸緩沖液、ρΗ6.0)保持在各溫度60分鐘并進行 水冷后、測定殘留的酶活性來求出。PH穩(wěn)定性通過將本酶在各ρΗ的20mM醋酸緩沖液中、 在4°C保持24小時后、將ρΗ調(diào)整為6. 0并測定殘留的酶活性來求出。將這些結(jié)果示于圖 5(溫度穩(wěn)定性)及圖6(pH穩(wěn)定性)。由圖5及圖6得知，本α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶在40°C之前 穩(wěn)定，另外，在PH3. 5 8. 4內(nèi)穩(wěn)定。<實驗7-4 金屬鹽給酶活性帶來的影響>使用由實驗6得到的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶精制樣品，在濃度ImM的各金屬鹽存在下， 按照活性測定的方法研究金屬鹽給酶活性帶來的影響。將結(jié)果示于表6。
^^ I^l "πτ .相對活性(％ )^^ I^l "πτ .相對活性(％ )無添加100MgCl2102CaCl2101MnCl299CoCl2100NiCl2102CuCl252ZnCl2101FeCl291PbCl297FeCl394EDTA99HgCl23由表6的結(jié)果判明本α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的活性受到Hg2+離子顯著阻礙，受到Cu2+ 離子阻礙。<實驗8 來自球形節(jié)桿菌ΡΡ349 (FERM ΒΡ-10770)的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的制備>取代環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710，接種球形節(jié)桿菌ΡΡ349 (FERMBP-10770)，除此之外，與 實施例5同樣地培養(yǎng)，作為菌種培養(yǎng)。在容量30L的發(fā)酵罐中加入與菌種培養(yǎng)相同組成的液體培養(yǎng)基約20L，進行加熱 滅菌、冷卻并設(shè)定為27°C后，接種菌種培養(yǎng)液約200ml，保持在溫度27°C、pH5. 5 7. 0，同時
28通氣攪拌培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)后，從酵母罐抽出培養(yǎng)液，進行離心分離(8，000rpm、20分鐘) 并除去菌體，得到培養(yǎng)上清液約18L。對培養(yǎng)液及培養(yǎng)上清液測定α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性， 結(jié)果培養(yǎng)液的該酶活性約為0. 36單位/ml，培養(yǎng)上清液的該酶活性約為0. 42單位/ml。判 明由球形節(jié)桿菌PP349生產(chǎn)的本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶其大部分存在于菌體外。<實驗9 來自球形節(jié)桿菌ΡΡ349的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的精制>在由實驗8得到的培養(yǎng)上清液約18L(總活性約7，560單位)中，以成為80%飽和 的方式添加并溶解，放置24小時，由此進行鹽析。通過離心分離(ll，000rpm、30分鐘)回收 沉淀的鹽析物，將其溶解于20mM醋酸緩沖液(pH6. 0)后，相對同緩沖液進行透析，進行離心 分離而除去不溶物，得到粗酶液約500ml。粗酶液中的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性約為14單位 /ml (總活性約7，000單位)。將該粗酶液以終濃度為2M的方式添加硫酸銨，進行離心分離 而除去不溶物，供給到用使用含有2M硫酸銨的20mM醋酸緩沖液(pH6. 0)平衡化的東、乂 一 株式會社制《苯基-卜3 ^ — > 650M))凝膠的疏水柱色譜法(凝膠容量300ml)。α -葡糖 基轉(zhuǎn)移酶活性吸附于凝膠，以硫酸銨濃度2Μ OM的線性梯度使其洗脫，結(jié)果在硫酸銨濃度 約0.6Μ左右洗脫?；厥赵摶钚越M分，將其相對20mM醋酸緩沖液(pH6. 0)進行透析后，供給 到使用東〃 一株式會社制《DEAE- 3 〃一 > 650S》凝膠的陰離子交換柱色譜法(凝膠容量 100ml)。α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性吸附于用20mM醋酸緩沖液(pH6. 0)平衡化的《DEAE- 3八 一 > 650S))凝膠，以食鹽濃度OM 0. 5M的線性梯度使其洗脫，結(jié)果在食鹽濃度約0. 4M左 右洗脫。將各精制的各步驟中的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性、α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性的比活性 及收率示于表7。
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對精制好的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶樣品，利用5 20w/v%濃度梯度聚丙烯酰胺凝膠電 泳檢定酶樣品的純度，結(jié)果為蛋白鍵單一、純度高的樣品。
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|(%) IO O -I-HCD CNJ OiCM — LOOC LO CO(5星玢畝)躲毖羽耀黠韓奪截經(jīng)-DCD -I-H寸 LOO CO -I-HLO -I-H 寸(玢畝)躲毖耀黠韓奪截經(jīng)-DO CD LO 卜―O O O 卜―O OC COO -I-H CNTM逖捿:T裴輯mmm^mmmm
<實驗10 來自球形節(jié)桿菌PP349的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的性質(zhì)><實驗10-1 分子量>將由實驗9得到的來自球形節(jié)桿菌ΡΡ349的α _葡糖基轉(zhuǎn)移酶精制樣品供給到 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(5 20 八％濃度梯度)中，同時與泳動的分子量標(biāo)記(日本 Kj才·，F(xiàn) ·卜>J 一 *株式會社制)比較并測定分子量，結(jié)果判明，本α-葡糖 基轉(zhuǎn)移酶的分子量為90，000士 10，000道爾頓。<實驗10-2 酶反應(yīng)的最適溫度及最適ρΗ>使用由實驗9得到的來自球形節(jié)桿菌ΡΡ349的α _葡糖基轉(zhuǎn)移酶精制樣品，按照 活性測定的方法研究溫度、PH給酶活性帶來的影響。將這些結(jié)果示于圖7 (最適溫度)及 圖8 (最適ρΗ)。判明本α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的最適溫度在pH6. 0反應(yīng)30分鐘的條件下，為 約50°C，最適ρΗ在40°C反應(yīng)30分鐘的條件下，為約6. 0。<實驗10-3 酶的溫度穩(wěn)定性及ρΗ穩(wěn)定性>使用由實驗9得到的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶精制樣品研究本酶的溫度穩(wěn)定性及ρΗ穩(wěn) 定性。溫度穩(wěn)定性通過將酶溶液(20mM醋酸緩沖液、ρΗ6.0)保持在各溫度60分鐘并進行 水冷后、測定殘留的酶活性來求出。PH穩(wěn)定性通過將本酶在各ρΗ的20mM醋酸緩沖液中、在 4°C保持24小時后、將ρΗ調(diào)整為6. 0并測定殘留的酶活性來求出。將這些結(jié)果示于圖9 (溫 度穩(wěn)定性)及圖10 (ρΗ穩(wěn)定性)。由圖9及圖10得知，本發(fā)明的來自球形節(jié)桿菌的α-葡 糖基轉(zhuǎn)移酶在40°C之前穩(wěn)定，另外，在pH4.0 8.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定。<實驗10-4 金屬鹽給酶活性帶來的影響>使用由實驗9得到的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶精制樣品，在濃度ImM的各金屬鹽存在下， 按照活性測定的方法研究金屬鹽給酶活性帶來的影響。將結(jié)果示于表8。
^^ I^l "πτ .相對活性(％ )^^ I^l "πτ .相對活性(％ )無添加100MgCl2104CaCl2104MnCl2103CoCl298NiCl2100CuCl245ZnCl2100FeCl291PbCl296FeCl395EDTA99HgCl22由表8的結(jié)果判明本α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的活性受到Hg2+離子顯著阻礙，受到Cu2+ 離子阻礙。<實驗11 對各種糖質(zhì)的作用>使用各種糖質(zhì)研究本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的基質(zhì)特異性。制備含有甲 基_ α -葡糖基、甲基_ β _葡糖基、對硝基苯基-α -葡糖基、對硝基苯基-β -葡糖基、葡萄 糖、蔗糖、麥芽糖、異麥芽糖、海藻糖、曲二糖、黑霉糖、新海藻糖、纖維二糖、乳糖、麥芽三糖、 麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖、異麥芽三糖或異潘糖的水溶液。在這些基質(zhì)溶液 中加入最終濃度20mM醋酸緩沖液(pH6. 0)后，每1克基質(zhì)固體成分分別加入各10單位由 實驗6得到的來自環(huán)狀芽孢桿菌PP710的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶精制樣品，以成為的方
31式調(diào)制基質(zhì)濃度，使其在40°C、pH6. 0下作用24小時。為了研究酶反應(yīng)前后的反應(yīng)液的糖 質(zhì)，使用作為展開溶劑的正丁醇、吡啶、水混合溶液(容量比6 4 1)、另外作為薄層板 的乂 >夕公司制造《* 一60》(鋁板、10 X 20cm)，進行展開2次的硅膠薄層色譜法
(以下，簡稱為TLC)，將10%硫酸-甲醇溶液進行噴霧后，進行加熱，由此檢測糖質(zhì)。研究 TLC中的基質(zhì)糖質(zhì)以外的反應(yīng)生成物的生成的有無，確認(rèn)對各自的糖質(zhì)的酶作用的有無或 強度的程度。將其結(jié)果示于表9。需要說明的是，對來自球形節(jié)桿菌PP349的α-葡糖基 轉(zhuǎn)移酶，也同樣地研究基質(zhì)特異性，結(jié)果與來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶同 樣。
基質(zhì)作用基質(zhì)作用甲基-α-葡糖基-纖維二糖-甲基-β-葡糖基-蔗糖-PNP*- α -葡糖基-乳糖-PNP*- β -葡糖基-麥芽三糖++葡萄糖-麥芽四糖++海藻糖-麥芽五糖++新海藻糖+麥芽六糖++曲二糖士麥芽七糖++黑霉糖+異麥芽三糖+麥芽糖++異潘糖+異麥芽糖+注)表中，_表示“沒有作用”，士表示“稍微作用”，+表示“作用”，++表示“充分
作用”。* 對硝基苯基由表9的結(jié)果得知，本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶在試驗過的糖質(zhì)中與麥芽糖、麥芽 三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖充分作用，另外，與黑霉糖、異麥芽糖、新海 藻糖、異麥芽三糖、異潘糖作用。而且，與曲二糖也稍微作用。從作用的糖質(zhì)來看，均為發(fā)現(xiàn) 分解生成物的同時，也發(fā)現(xiàn)糖轉(zhuǎn)移生成物。另一方面，沒有發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶 與甲基-α -葡糖基、甲基-β -葡糖基、對硝基苯基-α -葡糖基、對硝基苯基-β -葡糖基、 新海藻糖、纖維二糖、蔗糖、乳糖等作用。由這些結(jié)果及本α _葡糖基轉(zhuǎn)移酶與淀粉部分分 解物作用而生成支鏈α-葡聚糖判明本酶與麥芽糖及葡萄糖聚合度為3以上的α_1，4葡 聚糖或由葡萄糖構(gòu)成的α-葡萄寡糖廣泛地作用。〈實驗12:作用機理〉為了研究本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的作用機理，研究與作為最小的基質(zhì)的麥芽 糖作用時的生成糖的結(jié)構(gòu)，需要說明的是，使用來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α-葡糖基轉(zhuǎn) 移酶的情況和使用來自球形節(jié)桿菌ΡΡ349的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的情況的結(jié)果相同。在本實 驗中，表示使用來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶精制樣品的結(jié)果?！磳嶒?2-1來自麥芽糖的生成物〉在最終濃度的麥芽糖水溶液中加入最終濃度IOmM醋酸緩沖液(pH6. 0)后， 每1克基質(zhì)固體成分加入10單位用實驗6的方法得到的α "葡糖基轉(zhuǎn)移酶精制樣品，在
3240°C、pH6. 0下作用，經(jīng)時進行取樣，在100°C下保持10分鐘并停止反應(yīng)。使用HPLC及GC 測定其酶反應(yīng)液的糖組成。HPLC及GC使用實驗4-2中記載的條件進行，將結(jié)果示于表10。
SJL時間DPlDP2DP3DP4DP5DP6(時間)葡萄 糖絲糖異絲糖新海萊 糖麥芽三 糖雜異潘 糖異麥芽 SM以上00. 099.20. 00. 00. 80. 00. 00. 00.00. 00. 0112.155.00.70. 013.216.10.00.02.90.00.0218.433.51.00. 014. 424.10.00.07.61.00.0423.717. 32.50.010.029.30.00.013.04.20.0827. 010.44.70. 04.927. 80.00.015.95.34.02430.46.010.02.61.411.01.03.615.310.28.54831.56.213.83.90.74.11.54.212.410.311.4DP 葡萄糖聚合度由表10的結(jié)果得知，在反應(yīng)初期(反應(yīng)1時間)中，利用本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn) 移酶的作用，由基質(zhì)麥芽糖主要生成葡萄糖、麥芽糖及潘糖。進而，從反應(yīng)2小時及4小時 生成葡萄糖聚合度為4及5的寡糖。反應(yīng)進行時，麥芽三糖在反應(yīng)2小時(14.4%)后減少 到峰值，潘糖在反應(yīng)4小時(29.3%)后減少到峰值，在其減少的同時，發(fā)現(xiàn)異麥芽糖增加。 而且，反應(yīng)至48小時時，發(fā)現(xiàn)異麥芽糖及聚合度為4以上的寡糖的增加。由這些結(jié)果推測時得知，本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶與麥芽糖作用，在反應(yīng)初期 催化α-1，4葡糖基轉(zhuǎn)移和α _1，6葡糖基轉(zhuǎn)移的兩葡糖基轉(zhuǎn)移，由此生成葡萄糖、麥芽三 糖及潘糖，伴隨著反應(yīng)的進行，在葡萄糖中生成α-1，6葡糖基轉(zhuǎn)移的異麥芽糖或在該異麥 芽糖中生成α _1，4葡糖基轉(zhuǎn)移及α _1，6葡糖基轉(zhuǎn)移的異潘糖及異麥芽三糖。在本實驗中， 難以鑒定多種存在的聚合度為4以上的寡糖，因此，在實驗12-2中，以聚合度比麥芽糖高的 麥芽五糖為基質(zhì)，進一步分析反應(yīng)機理。<實驗12-2 來自麥芽糖的生成物>在最終濃度的麥芽五糖水溶液中加入最終濃度IOmM醋酸緩沖液(pH6. 0) 后，每1克基質(zhì)固體成分加入10單位用實驗6的方法得到的α “葡糖基轉(zhuǎn)移酶精制樣品， 在40°C、pH6. 0下作用，經(jīng)時進行取樣，在100°C下保持10分鐘并停止反應(yīng)。使用HPLC測 定其酶反應(yīng)液的糖組成。HPLC使用實驗4-2中記載的條件進行。另外，對酶反應(yīng)液按照常 規(guī)方法進行甲基化分析，用氣相色譜法研究部分甲基化物。由生成的部分甲基化物的組成 求出葡萄糖的鍵合方式中的各葡糖基鍵的存在比。另外，與實驗4-2同樣地也進行異麥芽 糖糊精酶消化試驗。將反應(yīng)中的糖組成的變化示于表11，將反應(yīng)生成物的甲基化分析和異 麥芽糖糊精酶試驗的結(jié)果示于表12。
33反應(yīng)時 間(時 間)糖組成(質(zhì)量%)DPlDP 2DP 3DP4DP 5DP 6DP7DP8DP9 以上00. 00. 00. 31. 297. 40. 10. 00. 00. 010. 41. 03. 415. 053. 421. 93. 30. 80. 141. 22. 07. 515. 227. 125. 512. 35. 73. 082. 93. 48. 912. 618. 220. 014. 28. 99. 7246. 93. 78. 18. 212. 514. 213. 911. 221. 1
DP
葡萄糖聚合度
反應(yīng) 時間 (時 間)部分曱基面積W異麥芽 糖含量 *(質(zhì)量 K)2, 3’ 4, 6-四 曱基摘3, 4’ 6-三甲 基碟2, 4, 6-三 曱基條2, 3’ 6-三 曱基她2，3’ 4-三甲 基條2’ 4-二曱 基_2, 3- 二 甲基化非還原末端 葡萄糖@1,2鍵合的 葡萄糖 ％1,3鍵合 的葡萄糖 絲1,4鍵合 的葡萄糖 m.1,6鍵合的 葡萄糖·1,3,6 鍵 合的葡萄 糖絲1,4,6 鍵合的 葡萄糖 絲020.00. 00. 080. 00.00. 00.00. 0120.90. 00.176.91.70. 00.42.7424.20. 00.867.57.20. 00.311.9826.10. 01. 055. 416.10. 70.823. 32428.60. 00.837.030.81.61.240.9* 異麥芽糖糊精酶消化后由表11及12的結(jié)果得知，在反應(yīng)初期(反應(yīng)1小時)，由基質(zhì)麥芽五糖優(yōu)先生成 葡萄糖聚合度比基質(zhì)小1的寡糖和葡萄糖聚合度比基質(zhì)大1的寡糖，因此確認(rèn)，該酶催化葡 糖基轉(zhuǎn)移。進一步進行反應(yīng)時，生成具有各種葡萄糖聚合度的反應(yīng)生成物，在反應(yīng)24小時 后，葡萄糖聚合度為9以上的葡聚糖也達到21. 1%。由甲基化分析的結(jié)果判明，隨著反應(yīng) 進行，在反應(yīng)生成物中1，4鍵合的葡萄糖殘基減少，同時，1，6鍵合的葡萄糖殘基顯著增加， 另外，1，3鍵合的葡萄糖殘基、1，4，6鍵合的葡萄糖殘基及1，3，6鍵合的葡萄糖殘基緩慢增 加。另外，異麥芽糖糊精酶消化后的糖組成中的異麥芽糖含量也與反應(yīng)的進行同時顯著增 加。需要說明的是，使用來自球形節(jié)桿菌PP349的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶同樣地進行試驗的情 況也可得到大致同樣的結(jié)果。由實驗12-1及12-2的結(jié)果來看，認(rèn)為本發(fā)明的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)機理如下。(1)本酶與作為基質(zhì)的麥芽糖和/或葡萄糖聚合度為3以上的α_1，4葡聚糖作 用，將非還原末端葡萄糖殘基主要α-1，4或α_1，6葡糖基轉(zhuǎn)移到其它的α_1，4葡聚糖的 非還原末端葡萄糖殘基上，由此生成非還原末端葡萄糖殘基的4位或6位羥基上α -鍵合
34有葡萄糖的α -1，4葡聚糖(葡萄糖聚合度增加1的α -葡聚糖)和葡萄糖聚合度減少1 的α-1，4葡聚糖。(2)本酶進一步與(1)中產(chǎn)生的葡萄糖聚合度減少1的α-1，4葡聚糖作用，相對 (1)中產(chǎn)生的葡萄糖聚合度增加1的α-葡聚糖，與(1)同樣地進行分子間α-1，4或α-1， 6葡糖基轉(zhuǎn)移，由此，在(1)中產(chǎn)生的葡萄糖聚合度增加1的α-葡聚糖的非還原末端葡萄 糖殘基的4或6位羥基上進一步轉(zhuǎn)移葡萄糖，使鏈長延長。(3)通過重復(fù)上述(1)及(2)的反應(yīng)，由麥芽糖和/或葡萄糖聚合度為3以上的 α-1，4葡聚糖生成具有α-1，4及α-1，6鍵的葡聚糖。(4)雖然頻率低，但是，本酶通過進一步催化α _1，3葡糖基轉(zhuǎn)移或相對位于葡聚 糖的內(nèi)部的α-1，6鍵合的葡萄糖殘基的α_1，4或α _1，3葡糖基轉(zhuǎn)移，生成也具有α_1， 3鍵、α-1，4，6鍵及α-1，3，6鍵的葡聚糖。(5)作為重復(fù)上述(1) (4)的反應(yīng)的結(jié)果，葡萄糖主要以α-1，4鍵及α-1，6鍵 鍵合，生成具有少量α-1，3鍵、α-1，4，6鍵及α-1，3，6鍵的支鏈α-葡聚糖。〈實驗13 α _葡糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)和反應(yīng)液的還原力的變化>在麥芽糖水溶液(最終濃度1或30w/v% )中加入最終濃度20mM醋酸緩沖 液(pH6. 0)后，每1克基質(zhì)固體成分加入4單位用實驗6的方法得到的來自環(huán)狀芽孢桿 菌PP710的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶精制樣品，在40°C、pH6. 0下作用，經(jīng)時進行取樣，在100°C 下保持10分鐘并停止反應(yīng)。用實驗4-2記載的HPLC法及GC法進行定量。另外，用 somogyi-nelson method定量酶反應(yīng)液的還原糖量，用蒽酮法定量總糖量，用下式還原力 =(還原糖量/總糖量)χ 100算出還原力。將其結(jié)果示于表13。
反應(yīng)時間 (時間)麥芽米I濃度1質(zhì)量％30質(zhì)量？4麥芽糖殘留量 (%)還原力 (相對W麥芽糖殘留量 (%)還原力 (相對%)099. 743. 6 (100%)99. 743. 6 (100%)464. 245. 0 (103%)68. 843. 6 (100%)843. 046. 0 (106%)51. 843. 6 (100%)1620. 946. 7 (107%)28. 843. 7 (100%)248. 147. 9 (109%)13. 343. 8 (101%) 由表13的結(jié)果得知，使本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶與麥芽糖作用，結(jié)果在麥芽糖 濃度為比較低的情況下，發(fā)現(xiàn)極少的還原力的增加，另外，麥芽糖濃度為30 八％比
35較高的情況下，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)反應(yīng)液的還原力的增加。麥芽糖濃度為較低，為、且麥 芽糖的殘留量在10%以下的情況下，反應(yīng)液的還原力的增加極少，是指本發(fā)明的α-葡糖 基轉(zhuǎn)移酶為基本上催化轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶，在反應(yīng)時幾乎不進行水解。得知，本發(fā)明的α-葡糖 基轉(zhuǎn)移酶為有效地進行α-葡糖基轉(zhuǎn)移的酶。需要說明的是，使用來自球形節(jié)桿菌ΡΡ349 的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶同樣地進行試驗時，也可得到大致同樣的結(jié)果。<實驗14 支鏈α -葡聚糖的生成中的精制α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶和粗酶液的比較>考慮支鏈α _葡聚糖的工業(yè)生產(chǎn)時，只要可以使用α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的粗酶，就會 節(jié)省精制酶的麻煩和勞力，更優(yōu)選。因此，使用來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α-葡糖基轉(zhuǎn)移 酶的粗酶研究是否可得到與由實驗1-2制成的葡聚糖A同等的支鏈α _葡聚糖。用實驗1-1 中記載的方法培養(yǎng)ΡΡ710，將上清液進行硫酸銨鹽析，將相對20mM醋酸緩沖液(pH4. 5)進行 透析而得到的透析液作為α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的粗酶液。用實驗1-2中記載的方法使該粗酶 液與淀粉部分分解物(商品名《〃 ^ ) r , ” ^ #100》松谷化學(xué)工業(yè)株式會社出售)作用， 從用作基質(zhì)的淀粉部分分解物以每固體成分88. 2%的收率得到固體成分濃度30%的葡聚 糖溶液。將得到的支鏈α-葡聚糖命名為“葡聚糖C”，將進行其甲基化分析的結(jié)果示于表 14，另外，將利用實驗4及實驗3中記載的方法測定分子量分布及水溶性食物纖維含量的結(jié) 果分別示于表15。需要說明的是，為了進行比較，表14及表15分別表示使用表3及表4制 備的原料的淀粉部分分解物和部分精制α"葡糖基轉(zhuǎn)移酶制成的葡聚糖A的數(shù)據(jù)。
部分甲基化物的種類對應(yīng)的葡萄糖殘基存在比(面積％)原料淀粉*部 分分解物葡聚糖 A葡聚糖 C2，3，4，6-四曱基化物非還原末端葡萄糖殘基5. 810. 116. 03，4, 6-三曱基化物1,2鍵合的葡萄糖殘基0. 00. 00. 02, 4, 6-三曱基化物1，3鍵合的葡萄糖殘基0. 01. 13. 02，3’ 6-三曱基化物1,4鍵合的葡萄糖殘基89. 851. 530. 02，3，4-三曱基化物1，6鍵合的葡萄糖殘基0. 032. 240. 32，4-二甲基化物1，3，6鍵合的葡萄糖殘基0. 00. 84. 82，3-二甲基化物1，4，6鍵合的葡萄糖殘基4.44. 55. 8* '、° 4 > r 夕夕叉 #100葡聚糖A :由來自PP710株的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶(部分精制酶)制成的葡聚糖葡聚糖C:由來自ΡΡ710株的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(粗酶)制成的葡聚糖
分析項目原料淀粉*部分分解物葡聚糖A葡聚糖C數(shù)均分子量(Mn)(道爾頓)6，6803，8402，840重均分子量(Mw)(道爾頓)98，89059, 0006，220Mw/Mn14. 815. 42. 2峰值的葡萄糖聚合度(個)499 及 6. 3384,22.2, 10.9及 126. 7 及 1水溶性食物纖維含量(% )0. 042. 175. 8
* > r ”卞 #100葡聚糖A :由來自PP710株的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶(部分精制酶)制成的葡聚糖葡聚糖C 由來自ΡΡ710株的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶(粗酶)制成的葡聚糖如表14所示，使用來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的粗酶制成的葡 聚糖C在甲基化分析中，相當(dāng)于非還原末端葡萄糖殘基的2，3，4，6_四甲基化物和相當(dāng)于 α _1，6鍵合的葡萄糖殘基的2，3，4_三甲基化物的含量與葡聚糖A相比，意外地增加。該結(jié) 果表明，葡聚糖C與葡聚糖A相比，非還原末端多，另外，存在更多的α-1，6鍵。而且，在葡 聚糖C中，2，4- 二甲基化物為4. 8%時，與葡聚糖A的0. 8相比增加了。該結(jié)果顯示，參與 1，3鍵合和1，6鍵合雙方的葡萄糖殘基增加。另外，由表15得知，葡聚糖C與葡聚糖A相比，數(shù)均分子量及重均分子量都小(葡 萄糖聚合度小)，顯示遠遠高的水溶性食物纖維含量。該結(jié)果表明，在來自環(huán)狀芽孢桿菌 ΡΡ710的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的粗酶中預(yù)先混雜與α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶不同的其它酶，該混雜酶 有助于支鏈α-葡聚糖中的α_1，6鍵的增加、參與1，3鍵合和1，6鍵合雙方的葡萄糖殘基 增加、低分子化及水溶性食物纖維含量的增加。<實驗15 混雜于來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的粗酶的酶的鑒 定和分離、精制〉與來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的粗酶混雜，鑒定與支鏈α-葡 聚糖中的α-1，6鍵的增加、參與1，3鍵合和1，6鍵合雙方的葡萄糖殘基增加、低分子化及 水溶性食物纖維含量的增加有關(guān)的酶，進行分離、精制的實驗。<實驗15-1 混雜的酶的鑒定和活性測定>用與實驗1-1同樣的方法培養(yǎng)環(huán)狀芽孢桿菌？ 710(冊冊8 -10771)，將得到的上 清液約3L進行硫酸銨鹽析后，將相對含有ImM氯化鈣的50mM醋酸緩沖液(pH6. 0)進行透 析而得到的透析液約40ml作為粗酶液。使該粗酶液與可溶性淀粉溶液或2 八％淀 粉溶液在pH6.0、40°C下作用16小時，在100°C加熱10分鐘使反應(yīng)停止，然后，供給到使用 縱10cm、橫20cm的硅膠60F254 ( ^ ^ 公司制造)TLC板的TLC。使用作為展開溶劑的正丁 醇吡啶水(容量比6 4 1)進行2次展開，噴霧20%硫酸-甲醇溶液后，在100°C 下加熱5分鐘，檢測生成物的斑點。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由可溶性淀粉生成麥芽糖及葡萄糖聚合度 為3以上的麥芽糖寡糖，另外，由普魯蘭多糖生成很少的麥芽糖和潘糖。判明在來自環(huán)狀 芽孢桿菌PP710(FERM BP-10771)的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的粗酶中混雜分解淀粉、而且也分解 普魯蘭多糖的淀粉酶?；祀s的淀粉酶的活性如下測定。S卩，以最終濃度為1 八％的方式使短鏈直鏈淀粉 (商品名“直鏈淀粉ΕΧ-Ι”、株式會社林原生物化學(xué)研究所出售、平均聚合度17)溶解于含有 ImM氯化鈣的50mM醋酸緩沖液(pH6. 0)并作為基質(zhì)液，在該基質(zhì)液2ml中加入酶液0. 2ml, 在35 °C下進行酶反應(yīng)30分鐘，將該反應(yīng)液0. 2ml與8ml的0. 02N硫酸溶液混合并使反應(yīng)停 止后，添加0. 2ml的0. IN碘溶液，在25°C下保持15分鐘后，測定660nm的吸光度。對另外 反應(yīng)0小時的反應(yīng)液同樣地進行測定，測定每反應(yīng)時間的碘呈色度的減少。淀粉酶的活性 1單位定義為在上述條件下使20mg的短鏈直鏈淀粉的660nm處的吸光度(碘呈色)降低 10%的酶量的10倍量。<實驗15-2 混雜淀粉酶的分離、精制>
將由實驗15-1制成的粗酶液供給到使用東” 一株式會社制《DEAE-卜3 一 > 650S》凝膠的陽離子交換柱色譜法(凝膠容量70ml)。具有淀粉酶活性的組分不吸附于用 ImM的氯化鈣20mM三-鹽酸緩沖液(pH7. 5)平衡化了的《DEAE-卜3 " —義650S》凝膠， 在非吸附組分洗脫?；厥赵摻M分，以終濃度為1. 5M的方式添加硫酸銨，在4°C放置24小時 后，進行離心分離而除去不溶物，供給到使用7 7 A"7 八^才歹夕制《U V — 7PHE》凝 膠的疏水柱色譜法(凝膠容量Iml)。具有目的的淀粉酶活性的組分吸附于用含有1. 5M硫 酸銨、ImM氯化鈣的20mM三-鹽酸緩沖液(pH7. 5)平衡化了的《U η ΡΗΕ》凝膠，以硫 酸銨濃度1. 5Μ OM的線性梯度洗脫，結(jié)果在硫酸銨濃度約0. 3Μ左右洗脫?；厥?、濃縮該 活性組分后，供給到使用^ 7 * 7 才〒夕制《7 一”一 fi ” τ, 200pg》凝膠的凝 膠過濾柱色譜法(凝膠容量118ml)，在含有0. 2M食鹽、ImM氯化鈣的20mM三-鹽酸緩沖液 (pH7. 5)中洗脫。回收活性組分，供給到使用7 7 > * 7 KJ才歹夕制《乂 一 7 Q》凝 膠的陰離子交換柱色譜法(凝膠容量Iml)。具有淀粉酶活性的組分不吸附于用ImM的氯化 鈣20mM三-鹽酸緩沖液(pH7. 5)平衡化了的V” 一卞Q》凝膠，在非吸附組分洗脫。將得 到的活性組分作為淀粉酶精制樣品。將各精制的各步驟中的淀粉酶活性、淀粉酶的比活性 及收率示于表16。
步驟淀粉酶活性(單位)淀粉酶比活性(單位/mg蛋白)收率(％ )硫酸銨鹽析后的透析液3583. 4100離子交換柱洗脫液17430. 948. 6疏水柱洗脫液56. 842. 515. 9凝膠過濾柱洗脫液34. 451. 89. 6離子交換柱洗脫液32. 852. 69. 2 對精制好的淀粉酶樣品，利用5 20 八％濃度梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳檢定酶 樣品的純度，結(jié)果為蛋白鍵單一、純度高的樣品。<實驗16 來自環(huán)狀芽孢桿菌PP710的淀粉酶的性質(zhì)><實驗16-1 分子量>將由實驗15-2得到的淀粉酶精制樣品供給到SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(5 20 八％濃度梯度)，同時與泳動的分子量標(biāo)記(日本A 4才·，？ K ·，#，卜〗J 一文株 式會社制)比較并測定分子量，結(jié)果判明，該淀粉酶的分子量為58，000士 10，000道爾頓。<實驗16-2 淀粉酶反應(yīng)的最適溫度及最適pH>使用由實驗15-2得到的來自環(huán)狀芽孢桿菌PP710的淀粉酶精制樣品，按照活性測 定的方法研究溫度、PH給淀粉酶活性帶來的影響。將這些結(jié)果示于圖11 (最適溫度)及圖 12(最適pH)。判明該淀粉酶的最適溫度在pH6.0反應(yīng)30分鐘的條件下，為55°C，最適pH 在35°C反應(yīng)30分鐘的條件下，為6. 0 7. 0。<實驗16-3 淀粉酶的溫度穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性>使用由實驗15-2得到的淀粉酶精制樣品研究溫度穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性。溫度穩(wěn)定 性通過將酶溶液(20mM醋酸緩沖液、pH6. 0或含有ImM氯化鈣的同緩沖液)保持在各溫度 60分鐘并進行水冷后、測定殘留的酶活性來求出。pH穩(wěn)定性通過將本酶在各pH的20mM醋 酸緩沖液中、在4°C保持24小時后、將pH調(diào)整為6. 0并測定殘留的酶活性來求出。將這些結(jié)果示于圖13 (溫度穩(wěn)定性)及圖14(pH穩(wěn)定性)。由圖13及圖14得知，該淀粉酶在鈣離 子的非存在下、在40°C之前穩(wěn)定，另外，在ImM鈣離子的存在下、在50°C之前穩(wěn)定。另外，該 淀粉酶在PH6. 0 8. 0的范圍內(nèi)穩(wěn)定。<實驗16-5 淀粉酶的基質(zhì)特異性>使用由實驗15-2得到的淀粉酶精制樣品研究對該淀粉酶的各種基質(zhì)的作用，結(jié) 果判明，該淀粉酶在水解淀粉、麥芽糖及葡萄糖聚合度為3以上的α _1，4葡聚糖的同時，也 催化葡糖基轉(zhuǎn)移。另外也判明，該淀粉酶具有由淀粉生成環(huán)糊精、水解普魯蘭多糖并生成潘 糖的作用。〈實驗17并用α _葡糖基轉(zhuǎn)移酶和淀粉酶的支鏈α -葡聚糖的制備>使用用實驗6的方法得到的來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的淀粉酶精制樣品和由實 驗15-2得到的淀粉酶精制樣品，研究是否可以再現(xiàn)使用實驗14中記載的來自環(huán)狀芽孢桿 菌ΡΡ710的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的粗酶的葡聚糖C的制備。即，以濃度為30 八％的方式使 淀粉部分分解物(商品名《〃 P〒”；#100》松谷化學(xué)工業(yè)株式會社出售)溶解于水， 將其調(diào)整為ΡΗ6. 0，每1克固體成分加入10單位用實驗6的方法得到的來自環(huán)狀芽孢桿菌 ΡΡ710的淀粉酶精制樣品，每1克固體成分進一步加入0、0. 1,0. 2,0. 5或1. 0單位由實驗 15-2得到的淀粉酶精制樣品，在40°C、pH6. 0下作用72小時，然后，將該反應(yīng)液煮沸10分 鐘，使反應(yīng)停止。將根據(jù)各反應(yīng)條件分別得到的支鏈α-葡聚糖供給到實驗4-4記載的凝 膠過濾HPLC法，將得到的色譜圖與用作基質(zhì)的淀粉部分分解物的色譜圖一同示于圖15。在 圖15中，符號a為作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠過濾HPLC色譜圖，符號b、c、d及e分 別為將α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶全部設(shè)定為10單位、使0. 1單位、0. 2單位、0. 5單位及1. 0單位 淀粉酶作用而得到的支鏈α-葡聚糖的凝膠過濾HPLC色譜圖(僅使10單位α-葡糖基轉(zhuǎn) 移酶作用的支鏈α-葡聚糖的凝膠過濾HPLC色譜圖與圖1所示的葡聚糖A的色譜圖大致 同樣，在圖5中省略。對后述的圖16-19也同樣)。將基于由這些凝膠過濾HPLC得到的色 譜圖的各支鏈α -葡聚糖的分子量分布分析的結(jié)果和用實驗3記載的酶-HPLC法得到的水 溶性食物纖維含量一同示于表17。另外，將對用作基質(zhì)的淀粉部分分解物研究的分子量分 布分析和水溶性食物纖維含量的結(jié)果(α “葡糖基轉(zhuǎn)移酶0單位、淀粉酶0單位)同時記載 于表6。
酶作用量(單位/g-基 質(zhì))葡聚糖的分子量分布水溶性食物纖 維舍量(質(zhì)量 %)α -葡糖基 轉(zhuǎn)移酶淀粉酶數(shù)均分子量 (Mn)(道爾頓)重均分子量 (Mw)(道爾頓)Mw/Mn00, 06,670100’ 34015. 00. 0100. 05,53097, 45017. 641. 1100. 13,2357’ 7992. 471. 5100. 23’ 0136, 6272. 273. 7100. 52’ 7895,8942. 176. 7101. 02,5445, 3042. 176. 8
由表17的結(jié)果得知，與α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶并用淀粉酶時，得到的支鏈α -葡聚糖 的分子量降低，水溶性食物纖維含量迅速增加。另外判明，隨著淀粉酶的作用量增多，得到 的支鏈α-葡聚糖的數(shù)均分子量及重均分子量均降低，而且，重均分子量(Mw)除以數(shù)均分 子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)也降低，因此，分子量分布的幅度變窄。淀粉酶的作用量為每 1克固體成分0. 5單位時，Mw/Mn降低至2. 1。而且，得到的支鏈α -葡聚糖中的水溶性食 物纖維的含量在淀粉酶的作用量為每1克固體成分0. 5單位以上達到約76質(zhì)量％。由該結(jié)果確認(rèn)，在實驗14中，在使用來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α -葡糖基轉(zhuǎn)移 酶的粗酶而得到的葡聚糖C中，分子量小、食物纖維升高是由混雜于粗酶中的淀粉酶引起 的。推測為，混雜的淀粉酶部分地水解作為基質(zhì)的淀粉部分分解物及作為α-葡糖基轉(zhuǎn)移 酶的產(chǎn)物的支鏈α -葡聚糖，由此，使支鏈α -葡聚糖的分子量降低，另外，通過將葡糖基進 一步轉(zhuǎn)移到支鏈α-葡聚糖，結(jié)果，以提高食物纖維含量的方式作用。而且，該結(jié)果顯示，通 過使淀粉酶與α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶組合，可以制造分子量小、提高了水溶性食物纖維含量的 支鏈α-葡聚糖。<實驗18 并用α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶和其它公知的淀粉酶的支鏈α _葡聚糖的制備
>并用本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶和其它公知的淀粉酶，使其與淀粉部分分解物 作用而制備支鏈α-葡聚糖，研究其結(jié)構(gòu)的特征及水溶性食物纖維含量。需要說明的是， 使用來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的情況和使用來自球形節(jié)桿菌ΡΡ349 的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的情況的結(jié)果相同，因此，在本實驗中，表示使用來自環(huán)狀芽孢桿菌 ΡΡ710的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶精制樣品的結(jié)果。<實驗18-1 并用α _葡糖基轉(zhuǎn)移酶和異淀粉酶的支鏈α -葡聚糖的制備和得到 的支鏈α“葡聚糖的分子量分布和水溶性食物纖維含量>變更來自環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710的淀粉酶，每1克固體成分加入0、50、200、500或 1，000單位來自淀粉皮假單胞菌(Pseudomonasamyloderamosa)的異淀粉酶(株式會社林原 生物化學(xué)研究所制)，除此之外，與實驗17同樣地反應(yīng)。將根據(jù)各反應(yīng)條件分別得到的支鏈 α -葡聚糖供給到實驗4-4記載的凝膠過濾HPLC法，將得到的色譜圖與用作基質(zhì)的淀粉部 分分解物的色譜圖一同示于圖16。在圖16中，符號a為作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠 過濾HPLC色譜圖，符號b、c、d及e分別為將α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶全部設(shè)定為10單位、使50 單位、200單位、500單位及1，000單位異淀粉酶作用而得到的支鏈α -葡聚糖的凝膠過濾 HPLC色譜圖。另外，將基于由這些凝膠過濾HPLC得到的色譜圖的各支鏈α-葡聚糖的分 子量分布分析的結(jié)果和用實驗3記載的酶-HPLC法得到的水溶性食物纖維含量一同示于表 18。酶作用量(單位/g-基質(zhì))葡聚糖的分子iΓ分布水溶性食物纖維 舍量(質(zhì)量Wα -葡糖 基轉(zhuǎn)移酶異淀粉酶數(shù)均分子量 (Mn)(道爾頓)重均分子量 (Mw)(道爾頓)Mw/Mn006, 670100’ 34015. 00. 01005, 53097, 45017. 641. 110503,49019,9805. 740. 6102002’ 5606’ 5802. 642. 4105002, 2304, 3401. 943. 71010002，1404，0201. 941. 6由表18的僅使α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶與淀粉部分分解物作用時的結(jié)果得知，雖然僅 α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶給分子量分布帶來很大影響，但是，由表18及圖16的結(jié)果判明隨著異 淀粉酶的作用量增多，得到的支鏈α-葡聚糖的數(shù)均分子量及重均分子量均降低，而且，重 均分子量(Mw)除以數(shù)均分子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)也降低，因此，分子量分布的幅度變 窄。異淀粉酶的作用量為每1克固體成分1000單位時，Mw/Mn降低至1. 9，支鏈α -葡聚糖 顯示在葡萄糖聚合度20. 6處具有峰值的分子量分布。另一方面，根據(jù)各反應(yīng)條件得到的支 鏈α “葡聚糖中的水溶性食物纖維的含量不怎么受異淀粉酶的作用量的影響，為40 44 質(zhì)量％左右。由該結(jié)果判明，通過在本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶進一步并用異淀粉酶并使其與 淀粉部分分解物作用，可以制造幾乎不使水溶性食物纖維含量變化的分子量降低了的支鏈 α-葡聚糖。<實驗18-2 與α _葡糖基轉(zhuǎn)移酶并用α -淀粉酶的支鏈α -葡聚糖的制備和得 到的支鏈α“葡聚糖的分子量分布和水溶性食物纖維含量>取代來自淀粉皮假單胞菌的異淀粉酶，每1克固體成分加入0、0. 1、0. 2、0. 5或1. 0 單位的市售的α “淀粉酶(商品名“才、才^夕一七ΡΚ2” f力‘七生物化學(xué)工業(yè)株式會社 制)，除此之外，與實驗18-1同樣地反應(yīng)。將根據(jù)各反應(yīng)條件分別得到的支鏈α-葡聚糖供 給到實驗4-4記載的凝膠過濾HPLC法，將得到的色譜圖與用作基質(zhì)的淀粉部分分解物的色 譜圖一同示于圖17。在圖17中，符號a為作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠過濾HPLC色 譜圖，符號b、c、d及e分別為將α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶全部設(shè)定為10單位、使0. 1單位、0. 2單 位、0. 5單位及1. 0單位α -淀粉酶作用而得到的支鏈α -葡聚糖的凝膠過濾HPLC色譜 圖。另外，將基于由這些凝膠過濾HPLC得到的色譜圖的各支鏈α-葡聚糖的分子量分布分 析的結(jié)果和用實驗3記載的酶-HPLC法得到的水溶性食物纖維含量一同示于表19。酶作用量(單位/g-基質(zhì))葡聚糖的分子量分布水溶性食物纖維 含量(質(zhì)量%)α -葡糖 基轉(zhuǎn)移酶α -淀粉酶數(shù)均分子量 (Mn)(道爾頓)重均分子量 (Mw)(道爾頓)Mw/Mn00. 06，670100, 34015. 00. 0100. 05，53097,45017. 641. 1100. 12’ 83515’ 6985. 548. 4100. 22, 1898，6564. 051. 7100. 51,6944，7552. 853. 5101. 01’ 4753，5522. 454. 0由圖17及表19的結(jié)果判明隨著α-淀粉酶的作用量增多，得到的支鏈葡 聚糖的數(shù)均分子量及重均分子量均降低，而且，重均分子量(Mw)除以數(shù)均分子量(Mn)所得 的值(Mw/Mn)也降低，因此，分子量分布的幅度變窄。α _淀粉酶的作用量為每1克固體成 分1. 0單位(圖17的符號e)時，Mw/Mn降低至2. 4，支鏈α -葡聚糖顯示在葡萄糖聚合度 11. 8處具有峰值的分子量分布。另一方面，發(fā)現(xiàn)，有α-淀粉酶的作用量越多，根據(jù)各反應(yīng) 條件得到的支鏈α-葡聚糖中的水溶性食物纖維的含量越增加的傾向。由該結(jié)果判明，通過在本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶中進一步并用α-淀粉酶并 使其與淀粉部分分解物作用，可以制造水溶性食物纖維含量增加、分子量降低了的支鏈 α-葡聚糖。<實驗18-3 并用α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶和CGTase的支鏈α -葡聚糖的制備和得到的 支鏈α-葡聚糖的分子量分布和水溶性食物纖維含量〉取代來自淀粉皮假單胞菌的異淀粉酶，每1克固體成分加入0、0. 1、0. 2、0. 5或1. 0 單位的來自環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus thermophilus)的CGTase (株式會社林原生物化學(xué)研 究所制)，除此之外，與實驗18同樣地反應(yīng)。將根據(jù)各反應(yīng)條件分別得到的支鏈α-葡聚糖 供給到實驗4-4記載的凝膠過濾HPLC法，將得到的色譜圖與用作基質(zhì)的淀粉部分分解物 的色譜圖一同示于圖18。在圖18中，符號a為作為基質(zhì)的淀粉部分分解物的凝膠過濾HPLC 色譜圖，符號b、c、d及e分別為將α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶全部設(shè)定為10單位、使0. 1單位、0. 2 單位、0. 5單位及1. 0單位CGTase作用而得到的支鏈α -葡聚糖的凝膠過濾HPLC色譜圖。 另外，將基于由這些凝膠過濾HPLC得到的色譜圖的各支鏈α _葡聚糖的分子量分布分析的 結(jié)果和用實驗3記載的酶-HPLC法得到的水溶性食物纖維含量一同示于表20。酵作用！!:(單位/g-基質(zhì))葡聚糖的分子量分布水溶性食物 纖維含量(質(zhì) 量%)α -葡 糖基轉(zhuǎn) 移醉CGTase數(shù)均分子量 (Mn)(道爾 頓)重均分子量 (Mw)(道爾 頓)Mw/Mn00. 06，670100，34015. 00. 0100. 05, 53097, 45017. 639. 1100. 14，73332,8336. 957. 5100. 24, 73323，4184. 962. 8100. 54，50116, 3573. 668. 2101. 04，40114，1073. 270. 5CGTase 環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶由圖18及表20的結(jié)果判明隨著CGTase的作用量增多，數(shù)均分子量及重均分子 量均降低，而且，重均分子量(Mw)除以數(shù)均分子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)也降低，因此，分 子量分布的幅度變窄。CGTase的作用量為每1克固體成分1. 0單位(圖18的符號e)時， Mw/Mn降低至3. 2，支鏈α -葡聚糖顯示在葡萄糖聚合度79. 1處具有峰值的分子量分布。另 一方面，發(fā)現(xiàn)，CGTase的作用量越多，支鏈α -葡聚糖中的水溶性食物纖維的含量增加得越 多的傾向，與并用實驗18-2的α-淀粉酶的情況相比顯著增加，每1克固體成分使用1.0 單位CGTase時，水溶性食物纖維含量達到70. 5質(zhì)量％。由該結(jié)果判明，通過與本發(fā)明的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶并用CGTase并與淀粉部分分解 物作用，可以制備分子量降低、水溶性食物纖維含量顯著增加的支鏈α -葡聚糖。CGTase與 α _1，4鍵的水解作用同時也具有轉(zhuǎn)移作用，因此，與α-淀粉酶相比，不使分子量非常降低 并生成非還原末端葡萄糖殘基，因此推測，α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶作用的頻率升高，與α-淀粉 酶添加相比，可得到水溶性食物纖維含量增加的支鏈α-葡聚糖。<實驗18-4 并用α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶和異淀粉酶及CGTase的支鏈α -葡聚糖的制 備和得到的支鏈α“葡聚糖的分子量分布和水溶性食物纖維含量>在記載于實驗18-1的實驗中，每1克固體成分進一步加入0或1. 0單位來自嗜熱 脂肪芽孢桿菌的CGTase，除此之外，與實驗18-1同樣地反應(yīng)。將根據(jù)各反應(yīng)條件分別得到 的支鏈α “葡聚糖供給到實驗4-4記載的凝膠過濾HPLC法，將得到的色譜圖與用作基質(zhì)的 淀粉部分分解物的色譜圖一同示于圖19。在圖19中，符號a為作為基質(zhì)的淀粉部分分解物 的凝膠過濾HPLC色譜圖，符號b、c、d及e為將全部α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶和CGTase分別設(shè)定 為10單位及1單位、使50單位、200單位、500單位及1，000單位異淀粉酶作用而得到的支 鏈α-葡聚糖的凝膠過濾HPLC色譜圖。另外，將基于由這些凝膠過濾HPLC得到的色譜圖 的各支鏈α “葡聚糖的分子量分布分析的結(jié)果和用實驗3記載的酶-HPLC法得到的水溶性 食物纖維含量一同示于表21。酶作用量(單位/g-基質(zhì))葡聚糖的分子量分布水溶性食物纖CX-葡糖基異淀粉CGTase數(shù)均分子量重均分子量Mw/Mn維含量(質(zhì)量》轉(zhuǎn)移酶酵(Mn)(道爾頓)(Mw)(道爾頓)000. 06, 670100’ 34015. 00. 01000. 05,53097’ 45017. 641. 11001. 04,40114, 1073.270. 510SO1. 02,4235,4452. 274. 0102001. 01,9564，0212. 173. 8105001. 01,7053，3672. 072. 31010001. 01,6013’ 0861. 970. 6CGTase 環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶由圖19及表21的結(jié)果得知，并用本發(fā)明的α _葡糖基轉(zhuǎn)移酶和每1克固體成分1 單位的CGTase制成的支鏈α-葡聚糖的重均分子量(Mw)除以數(shù)均分子量(Mn)所得的值 (Mw/Mn)降低至3. 2，而且，在并用每1克固體成分1000單位的異淀粉酶時(圖19的符號 e)，降低至1. 9。組合α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶和CGTase而制成的支鏈α -葡聚糖的水溶性食物 纖維含量增加至70質(zhì)量％，而且，并用異淀粉酶時也不降低，維持高的含量。 由該結(jié)果判明，通過并用本發(fā)明的α _葡糖基轉(zhuǎn)移酶和異淀粉酶及CGTase并使其 與淀粉部分分解物作用，可以制備分子量顯著降低、同時水溶性食物纖維含量顯著增加的 支鏈α-葡聚糖。<實驗19 支鏈α -葡聚糖的功能性>作為水溶性食物纖維含量最高、分子量比較小的支鏈α-葡聚糖，選擇在實驗 18-4中組合每1克固體成分10單位的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、50單位的異淀粉酶及1單位 CGTase而制成的支鏈α -葡聚糖，研究該支鏈α _葡聚糖的消化性及結(jié)構(gòu)的特征及功能性。〈實驗19-1并用α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶和異淀粉酶及CGTase的支鏈α-葡聚糖的精 制〉使用每1克固體成分10單位的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶、50單位的異淀粉酶，及1單位 的CGTase，與實驗18_4同樣地反應(yīng)，將得到的支鏈α -葡聚糖的反應(yīng)液過濾并除去不溶物 后，使用三菱化學(xué)離子交換樹脂《夕· < ~ <才> SK-1B》和《夕· 4 ~ 4才> WA 30》及才義辦 7制陰離子交換樹脂《IRA411》進行脫色、脫鹽并精密過濾，然后，用蒸發(fā)器濃縮，從使用的 淀粉以每固體成分85. 8%的收率得到固體成分濃度為30質(zhì)量％的支鏈α-葡聚糖含有液。 將用實驗4-1記載的方法進行得到的支鏈α-葡聚糖的甲基化分析的結(jié)果示于表22。另 外，用實驗4-4記載的凝膠過濾HPLC法進行的分子量分布分析、用實驗3記載的酶-HPLC 法求出的水溶性食物纖維含量、用實驗4-2記載的異麥芽糖糊精酶消化試驗的結(jié)果匯總于 表23 ο
部分甲基化物的種類對應(yīng)的葡萄糖殘基存在比(面積％)2，3，4，6-四甲基化物非還原末端葡萄糖殘基13. 73，4，6-三甲基化物1，2鍵合的葡萄糖殘基0 由表22及23的結(jié)果得知，得到的支鏈α-葡聚糖在甲基化分析中，以1 2. 4的 比例含有作為部分甲基化物的2，3，6-三甲基化物和2，3，4-三甲基化物，2，3，6-三甲基化 物和2，3，4_三甲基化物的總計占部分甲基化物的77.5%。支鏈α-葡聚糖中，2，4，6_三甲 基化物和2，4_二甲基化物分別顯示為部分甲基化物的1. 6%和2. 4%。另外，本支鏈α -葡 聚糖為顯示重均分子量5，480道爾頓、Mw/Mn2. 3、利用酶-HPLC法求出的水溶性食物纖維 含量為68. 6質(zhì)量％、通過異麥芽糖糊精酶消化、每糖組成生成異麥芽糖36. 4質(zhì)量％的葡聚 糖。為了評價本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖的有用性，使用由實驗19-1制成的支鏈α-葡 聚糖，在實驗19-2 19-7中研究給致齲性、消化性、血糖值和胰島素量帶來的影響及急性毒性。<實驗19-2 利用支鏈α -葡聚糖的致齲菌的酸發(fā)酵性試驗>使用用實驗19-1的方法得到的支鏈α-葡聚糖，按照《感染與免疫》(Infection and Immunity)第39卷、43 49頁(1983年)記載的大島等方法，進行使用致齲菌的酸發(fā) 酵性試驗。作為致齲菌，使用遠緣鏈球菌(Str印tococcus SObrinuS)6715株及變形鏈球菌 (Str印tOCOCCusmutans)0MZ-176株的2株。作為對照，使用蔗糖同樣地操作。將結(jié)果示于 表24。 由表24的結(jié)果得知，進行酸發(fā)酵的蔗糖的情況降低至pH約4，與此相對，本發(fā)明 的支鏈α -葡聚糖幾乎不進行由遠緣鏈球菌及變形鏈球菌引起的酸發(fā)酵，pH維持約6，為牙 齒的琺瑯質(zhì)脫灰的臨界PH即高于5. 5的pH。確認(rèn)本發(fā)明的支鏈α _葡聚糖的致齲性非常 低。<實驗19-3 支鏈α -葡聚糖的消化性試驗>使用用實驗19-1的方法得到的支鏈α-葡聚糖，按照日本營養(yǎng)糧食學(xué)會志、第43 卷、第23 29頁(1990年)記載的R田等方法，在試管內(nèi)研究利用唾液淀粉酶、人工胃液、 胰液淀粉酶及小腸粘膜酶的本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖的消化性。作為對照，使用市售的難 消化性糊精(商品名V”、乂 m K一》、松谷化學(xué)工業(yè)株式會社制造)。將結(jié)果示于表 25。
消化酶分解率(%)支鏈OC-葡聚糖 (本發(fā)明)難消化性糊精 (對照)唾液淀粉酶0. 00. 3人工胃液0. 00. 0胰液淀粉酶0. 22. 4小腸粘膜酶16. 441.1由表25的結(jié)果得知，本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖利用唾液淀粉酶、人工胃液時完全 不能消化，利用胰液淀粉酶時極少被分解。另外，利用對照的難消化性糊精的小腸粘膜酶 的分解率為41.1%，與此相對，支鏈α -葡聚糖的分解率低至16. 4 %，判明本發(fā)明的支鏈 α-葡聚糖比市售的難消化性糊精更難消化。<實驗19-4 支鏈α -葡聚糖的攝取對血糖值及胰島素量產(chǎn)生的影響>使用用實驗19-1的方法得到的支鏈α _葡聚糖研究血糖值的上升及胰島素的上 升。使用7周齡的Wistar系雄大鼠各組5只，禁食1天后，用胃探針經(jīng)口給藥支鏈α _葡 聚糖溶液。給藥量每大鼠體重Ikg設(shè)定為固體成分為1.5g。在經(jīng)口給藥之前、經(jīng)口給藥15 分鐘后、30分鐘后、60分鐘后、120分鐘后，從尾靜脈采集血液。將各自的血液采取到肝素 處理劑采血管，進行離心分離(2，00011)111、10分鐘)，得到血漿。血糖值用葡萄糖氧化酶法進 行測定，胰島素量使用大鼠胰島素測定試劑盒(株式會社森永生科學(xué)研究所制造)進行測 定。作為對照1，使用葡萄糖，作為對照2，使用市售的難消化性糊精(商品名《〃 4 > 7 τ· ^八一》、松谷化學(xué)工業(yè)株式會社制造)。將結(jié)果示于表26及表27。
46 由表26及表27到結(jié)果判明本發(fā)明的支鏈α -葡聚糖與市售的難消化性糊精同 樣，血糖值的上升及胰島素量的上升比葡萄糖低。<實驗19-5 急性毒性試驗>使用小鼠，經(jīng)口給藥用實驗19-1的方法得到的支鏈α-葡聚糖，進行急性毒性試 驗。其結(jié)果，本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖為無毒性，在可以給藥的最大量中沒有出現(xiàn)死亡例， 其LD5tl值為5g/kg_小鼠體重以上。<實驗20 支鏈α -葡聚糖的血糖上升抑制作用>在實驗19-4中，判明通過支鏈α-葡聚糖的攝取，血糖值及胰島素量的上升比葡 萄糖低，因此，使用用后述的實施例5的方法得到的支鏈α -葡聚糖，進一步詳細(xì)地研究支 鏈α-葡聚糖的攝取對血糖上升產(chǎn)生的影響。<實驗20-1 支鏈α -葡聚糖的攝取對淀粉部分分解物攝取時的血糖值及胰島素
量產(chǎn)生的影響>研究本發(fā)明的支鏈α -葡聚糖對淀粉部分分解物(商品名《〃 ^ >》、松谷化學(xué)工 業(yè)株式會社制造)攝取后的血糖上升產(chǎn)生的影響。用大鼠飼養(yǎng)用飼料(株式會社林原生 物化學(xué)研究所制備、“AIN-93G”；參照營養(yǎng)學(xué)雜志(Journal of Nutrition)、第123卷、第 1939-1951 (頁)(1993)、以下稱為“精制飼料”。參照后述的表33所示的配合組成)，使用預(yù)先飼養(yǎng)了 1周的7周齡的Wistar系雄性大鼠(日本f ~ 一V 一株式會社出售)3組 各組5只，禁食1天后，用胃探針經(jīng)口給藥溶解有淀粉部分分解物(作為固體成分為1. 5g/ kg ·體重)和支鏈α -葡聚糖的水溶液。支鏈α -葡聚糖的給藥量設(shè)定為每大鼠體重Ikg 為固體成分0. 15g、0. 30g或0. 75g。在經(jīng)口給藥之前、經(jīng)口給藥15分鐘后、30分鐘后、60分 鐘后、120分鐘后、180分鐘后、240分鐘后，從尾靜脈采集大鼠的血液。將各自的血液采取 到肝素處理劑采血管，進行離心分離(2，00011)111、10分鐘)，得到血漿。用與實驗19-4同樣 的方法測定血糖值和胰島素量。作為對照1，對1組5只大鼠僅經(jīng)口給藥固體成分為1. 5g/ kg·體重的淀粉部分分解物。另外，作為對照2，取代葡萄糖，將市售的難消化性糊精(商品 名《7 4 K — / 7 > 2》、松谷化學(xué)工業(yè)株式會社制造)與淀粉部分分解物同時，對2組各組 5只的大鼠每體重Ikg經(jīng)口給藥固體成分為0. 15g或0. 75g的任一個。將各自的試驗體系 中的血糖值的變化、血糖值的AUC值(血中濃度-時間曲線下面積)、胰島素量及胰島素量 的AUC值的測定結(jié)果分別示于表28、表29、表30及表31。 * 相對難消化性糊精(0. 75g/kg ·體重)為顯著性差異(ρ < 0. 05或ρ < 0. 01) * 相對難消化性糊精(0. 75g/kg ·體重)為顯著性差異(ρ < 0. 01) * 相對難消化性糊精(0. 75g/kg ·體重)為顯著性差異(ρ < 0. 05) 由于胰島素濃度比給藥之前低，因此，不計算AUC。由表28 31的結(jié)果判明與單獨攝取淀粉部分分解物的情況(對照1)相比，本 發(fā)明的支鏈α-葡聚糖與市售的難消化性糊精(對照2)同樣，用量依賴性地抑制糖質(zhì)(淀 粉部分分解物)負(fù)荷時的血糖值、血糖值的AUC值、胰島素量及胰島素量的AUC值的上升。 另外，將這些上升抑制效果的程度進行比較時，在測定的任一種指標(biāo)中都顯示本發(fā)明的支 鏈α“葡聚糖一方比市售的難消化性糊精具有強的抑制效果。<實驗20-2 支鏈α -葡聚糖的分子量對淀粉部分分解物攝取時的血糖值及胰島
素量的影響>在實驗20-1中，判明本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖都抑制糖質(zhì)(淀粉部分分解物) 負(fù)荷時的血糖值、血糖值的AUC值、胰島素量及胰島素量的AUC值的上升，因此，研究該支 鏈α“葡聚糖的分子量的差異給糖質(zhì)負(fù)荷時的血糖值及胰島素量的上升抑制作用帶來的 影響。即，調(diào)整α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶、淀粉酶的使用量，制備表32所示的重均分子量的支鏈 α -葡聚糖。與實驗20-1同樣，使用用精制飼料預(yù)先飼養(yǎng)了 1周的7周齡的Wistar系雄性 大鼠(日本★ ~ 一'J K 一株式會社出售)9組各組5只，禁食1天后，對8組各組5只 的大鼠用胃探針經(jīng)口給藥溶解有淀粉部分分解物(作為固體成分為1.5g/kg·體重)或表 32所示的支鏈α-葡聚糖的任一種的水溶液。支鏈α-葡聚糖的給藥量設(shè)定為每大鼠體 重Ikg為固體成分0. 75g。對剩余的1組5只大鼠僅經(jīng)口給藥淀粉部分分解物每大鼠體重 Ikg為固體成分1. 5g，設(shè)定為對照組。在經(jīng)口給藥之前及給藥30分鐘后從尾靜脈采集這些 大鼠的血液。將各自的血液采取到肝素處理劑采血管，進行離心分離(2，000rpm、10*#)， 得到血漿。將各組中的血糖值及胰島素量的測定結(jié)果一同示于表32。需要說明的是，在僅 給藥淀粉部分分解物時，給藥后的采血時間設(shè)定為血糖值及血中胰島素量為峰值的給藥30 分鐘后。 由表32的結(jié)果得知，重均分子量在1，168 200，000的范圍的本發(fā)明的支鏈 α-葡聚糖均可以抑制經(jīng)口給藥淀粉部分分解物后的血糖值及胰島素量的上升。另外，用 該血糖值及胰島素量的上升抑制效果的強度的程度進行比較時，支鏈α-葡聚糖的分子量 在1，168 60，000 (水溶性食物纖維含量為58. 1 80. 4質(zhì)量％ )時，抑制效果顯著，在 2，670 44，151 (水溶性食物纖維含量為64. 2 80. 4質(zhì)量％)時，發(fā)現(xiàn)特別強的抑制效^ ο<實驗20-3 支鏈α -葡聚糖的長期攝取對淀粉部分分解物攝取時的血糖值及胰
島素量產(chǎn)生的影響>在實驗20-1中，判明通過本發(fā)明的支鏈α -葡聚糖的攝取，抑制糖質(zhì)負(fù)荷時的血 糖值、血糖值的AUC值、胰島素量及胰島素量的AUC值的上升，因此，研究在長期攝取該支鏈 α-葡聚糖后(8周)，糖質(zhì)負(fù)荷時的血糖值、血糖值的AUC值、胰島素量及胰島素量的AUC值 的上升抑制作用。使用用精制飼料預(yù)先飼養(yǎng)了 1周的7周齡的Wistar系雄性大鼠(日本 m、'J K一株式會社出售)5組各組5只。將3組各組5只的大鼠用配合有各個表 33所示的支鏈α -葡聚糖(固體成分換算)1、2或5質(zhì)量％的三種試驗飼料的任一種飼養(yǎng) 8周。飼養(yǎng)期間中的飼料及水為自由攝取。在試驗飼料中的飼養(yǎng)4周和8周，禁食1天后， 以固體成分為1. 5g/kg ·體重的方式用胃探針經(jīng)口給藥淀粉部分分解物的水溶液。在經(jīng)口 給藥之前、給藥15分鐘后、30分鐘后、60分鐘后、120分鐘后、180分鐘后、240分鐘后，從尾 靜脈采集大鼠的血液。將各自的血液采取到肝素處理劑采血管，進行離心分離(2，000rpm、 10分鐘)，得到血漿。用與實驗19-4同樣的方法測定血糖值和胰島素量。作為對照1，僅用 精制飼料飼養(yǎng)1組5只的大鼠。另外，將余下的1組5只大鼠作為對照2，用以市售的難消 化性糊精(商品名《^4 τ ^ K 一 2》、松谷化學(xué)工業(yè)株式會社制造)取代了一部分精 制飼料的玉米淀粉的表33所示的配合組成的飼料飼養(yǎng)。由于飼養(yǎng)4周和8周為大致相同 的結(jié)果，因此，將用試驗飼料飼養(yǎng)4周時的各自的試驗體系中的血糖值、血糖值的AUC值、胰 島素量及胰島素量的AUC值的測定結(jié)果分別示于表34、表35、表36及表37。
*:相對配合有5質(zhì)量％難消化性糊精的飼料為顯著性差異(ρ <0.05或ρ < 0. 01) *:相對配合有5質(zhì)量％難消化性糊精的飼料為顯著性差異(ρ < 0.05或ρ < 0. 01) *:相對配合有5質(zhì)量％難消化性糊精的飼料為顯著性差異(ρ <0.05或ρ < 0. 01) *:相對配合有5質(zhì)量％難消化性糊精的飼料為顯著性差異(ρ < 0.05或ρ < 0. 01)由表33 37的結(jié)果判明與僅用精制飼料飼養(yǎng)的情況(對照1)相比，本發(fā)明的 支鏈α-葡聚糖與市售的難消化性糊精(對照2)同樣地抑制糖質(zhì)(淀粉部分分解物)負(fù)荷 時的血糖值、血糖值的AUC值、胰島素量及胰島素量的AUC值的上升。另外，這些數(shù)值上升 的抑制依賴于配合于飼料的支鏈α “葡聚糖的濃度，其效果在配合有固體成分為2質(zhì)量％ 的支鏈α-葡聚糖時顯著，如果為5質(zhì)量％，則發(fā)現(xiàn)特別強的抑制效果。另外，發(fā)現(xiàn)用配合 有固體成分為5質(zhì)量％的市售的難消化性糊精的飼料飼養(yǎng)的大鼠中的這些指標(biāo)的抑制程 度與配合有固體成分為1質(zhì)量％的支鏈α-葡聚糖的飼料同程度的抑制，因此確認(rèn)，本發(fā)明 的支鏈α-葡聚糖與該難消化性糊精相比，糖質(zhì)(淀粉部分分解物)負(fù)荷時的血糖值、血糖 值的AUC值、胰島素量及胰島素量的AUC值的上升抑制效果優(yōu)異。而且也得知，將淀粉部分 分解物給藥前的血糖值及胰島素量進行比較時，攝取了配合有固體成分為2質(zhì)量％或5質(zhì) 量％的支鏈α-葡聚糖的飼料的組比攝取了僅精制飼料或含有固體成分為5質(zhì)量％的難消 化性糊精的飼料的組低，與市售的難消化性糊精相比，本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖具有通過 長期攝取而有效地抑制空腹時血糖值及血中胰島素量的作用。需要說明的是，在用試驗飼 料或?qū)φ诊暳巷曫B(yǎng)4周及8周比較大鼠的體重，結(jié)果，在任一個組間都沒有發(fā)現(xiàn)平均體重上 的差異，因此判斷，由本實驗確認(rèn)的支鏈α-葡聚糖引起的血糖值及胰島素量的上升抑制 作用對大鼠的健康狀態(tài)沒有產(chǎn)生任何影響。<實驗21 支鏈α -葡聚糖的攝取對人體的血糖值及胰島素量產(chǎn)生的影響>得知使大鼠攝取支鏈α-葡聚糖時，與攝取淀粉部分分解物的情況相比，抑制血 糖值及胰島素量的增加，因此，進行了研究支鏈α“葡聚糖的攝取對人體的血糖值及血中 胰島素量產(chǎn)生的影響的試驗。使用市售的淀粉部分分解物(松谷化學(xué)工業(yè)株式會社制造、 商品名《〃M y r , ” % #1)))及根據(jù)后述的實施例5的方法制成的支鏈α-葡聚糖，研究 人體中的血糖值及胰島素量的上升。以健康的志愿者的男性12名(年齡26 54歲、平均 41 士7歲)為被檢者，在試驗前一天的21點以后至第二天的試驗開始時(9點鐘)之間，禁 止水以外的飲食品的攝取。對該被檢者，首先在攝取開始至2分鐘以內(nèi)攝取將淀粉部分分 解物50g(固體成分換算)溶解于水并設(shè)定為總量200ml的試驗樣品。在經(jīng)口給藥之前、經(jīng)口給藥15分鐘后、30分鐘后、45分鐘后、60分鐘后、120分鐘后采集血液。然后，空出1周以 上的間隔，對相同的被檢者使用將淀粉部分分解物50g(固體成分換算)溶解于水并設(shè)定為 總量200ml的試驗樣品，除此之外，與淀粉部分分解物同樣地進行試驗、采血。將各自的血 液的血糖值及胰島素量委托給民間的臨床檢查機關(guān)(社團法人R山市醫(yī)師會綜合醫(yī)藥中 心)并進行測定。將試驗樣品攝取時的血糖值及胰島素量的經(jīng)時變化及基于該數(shù)值計算出 的攝取之后至攝取120分鐘血糖值的AUC值(血中濃度-時間曲線下面積AUC°_2to(mg.hr/ dl))及胰島素量的AUC°i(yU.hr/dl)值、攝取之后至120分鐘血糖值的AUC值的增加量 及胰島素量的AUC值的增加量(AAUC^i)匯總于表38表示。 * 相對對照為顯著性差異(ρ < 0. 05或ρ < 0. 01)由表38的結(jié)果判明在攝取本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖時，與使用大鼠的實驗(實 驗20)同樣，血糖值、血糖值的AUC值、胰島素量及胰島素量的AUC值與攝取了淀粉部分分 解物的情況相比顯著低。<實驗22 支鏈α -葡聚糖的生物體內(nèi)類脂質(zhì)減少作用>在實驗19-4、實驗21中，判明通過攝取支鏈α -葡聚糖，降低血糖值及血中胰島 素量的上升，因此，對該支鏈α “葡聚糖的攝取給生物體內(nèi)類脂質(zhì)帶來的影響進行研究。<實驗22-1 支鏈α -葡聚糖的攝取對脂肪吸收產(chǎn)生的影響>使用用后述的實驗例5的方法制成的支鏈α -葡聚糖，將7周齡的Wistar系雄性 大鼠(日本★ ~ 一'J K一株式會社出售)隨機分為4組各組15只，用表33所示的精 制飼料飼養(yǎng)1周后，2組各15只用同表所示的配合有固體成分為5質(zhì)量％的支鏈α -葡聚 糖的組成的飼料飼養(yǎng)4周或8周。剩余的2組各15只作為對照，用精制飼料同樣地飼養(yǎng)4 周或8周。將用支鏈α -葡聚糖配合飼料飼養(yǎng)的1組15只在飼養(yǎng)開始4周及將剩余1組 15只在飼養(yǎng)開始8周，分別在乙醚麻醉下由大靜脈采血后進行屠宰、解剖，研究內(nèi)臟蓄積脂 肪量、血清類脂質(zhì)、腸粘膜濕質(zhì)量及盲腸內(nèi)容物等。對照的大鼠也同樣地進行處理。將其結(jié) 果示于表39。大鼠的飼養(yǎng)在整個試驗期間過程中每2或3天測定體重和攝取量，并且與實 驗20-1同樣地在整個試驗期間過程中自由攝取飼料及水。另外，解剖前禁食一晚上。將 支鏈α -葡聚糖配合飼料飼養(yǎng)4周及8周的體重增加量、攝料量、飼料利用率(體重增加
量/攝料量)、解剖時的體重、臟器等質(zhì)量、腸粘膜質(zhì)量、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量、盲腸內(nèi)的內(nèi)容物的 質(zhì)量、水分、PH示于表39。另外，血清類脂質(zhì)的測定結(jié)果也一同示于表39。需要說明的是， 在血清類脂質(zhì)中，中性脂肪、總膽固醇及HDL-膽固醇的測定分別使用市售的中性脂肪甘油 三酯測定用試劑盒(商品名“甘油三酯E- f 7卜7 二一”、和光純藥工業(yè)株式會社出售)及 HDL-膽固醇測定用試劑盒(商品名“HDL-膽固醇E-〒；^卜7 二一”、和光純藥工業(yè)株式會 社出售)。另外，由總膽固醇值減去HDL-膽固醇值而設(shè)定為LDL-膽固醇值。
固醇(mg/dl)15. 0±4. 911. 8±3. 124. 4土6. 121. 2土5. 5* 相對對照，ρ < 0. 05顯著# 相對對照，ρ < 0. 01顯著由表39的結(jié)果得知，攝取配合有固體成分為5%的本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖的飼 料時，與僅用精制飼料飼養(yǎng)的情況相比，在攝取4周后，腎臟周圍及睪丸周圍脂肪質(zhì)量顯示 低值，在攝取8周后，腎臟周圍及睪丸周圍脂肪都顯著地顯示低值，其降低在睪丸周圍脂肪尤其顯著。另外，在攝取4周及攝取8周后腸粘膜質(zhì)量顯著地增加，其增加在攝取8周后變 顯著。另外，在攝取8周后盲腸內(nèi)pH顯著地降低。而且，觀察血清類脂質(zhì)時，中性脂肪值在 攝取8周后、總膽固醇在攝取4周及8周后都顯示降低傾向，LDL-膽固醇也降低。除此以 外的測定值與對照沒有差異。需要說明的是，雖然沒有表示出具體的數(shù)據(jù)，但盲腸內(nèi)的有機 酸濃度與對照的沒有差異。該結(jié)果表明，本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖具有減少生物體內(nèi)類脂 質(zhì)的作用。另外，推測為由于腸粘膜的質(zhì)量增加，因此，對于支鏈α-葡聚糖引起的類脂質(zhì) 的過剩蓄積的抑制或由實驗20 21確認(rèn)的耐糖性的增強，伴隨由該試驗確認(rèn)的粘蛋白分 泌的增大的小腸粘膜層的肥厚引起的消化酶的作用性降低或被消化成的葡萄糖或脂肪的 消化、吸收阻礙、延遲起重要的作用。<實驗22-2 支鏈α -葡聚糖的分子量對生物體內(nèi)類脂質(zhì)的過剩蓄積抑制產(chǎn)生的
影響〉在實驗22-1中，判明通過本發(fā)明的支鏈α -葡聚糖的攝取，抑制生物體內(nèi)類脂質(zhì) 的過剩蓄積，因此，研究該支鏈α-葡聚糖的重均分子量的不同產(chǎn)生的作用。S卩，制備在精 制飼料中分別配合有固體成分為5質(zhì)量％的與實驗20-2中使用的支鏈α -葡聚糖相同的 重均分子量不同的8種支鏈α -葡聚糖的8種試驗飼料。將7周齡的Wistar系雌性大鼠 (日本f Y — 'J K一株式會社出售)45只隨機分為9組各組5只，用精制飼料預(yù)先飼養(yǎng) 1周。在該大鼠中，對8組用配合有表40所示的重均分子量不同的支鏈α-葡聚糖的任一 種的試驗飼料(試驗飼料1 8)飼養(yǎng)8周。剩余的1組5只大鼠用精制飼料照原樣飼養(yǎng)8 周，設(shè)定為對照組。將攝取配合有支鏈α-葡聚糖的飼料并經(jīng)過了 8周的大鼠及攝取精制 飼料并經(jīng)過了 8周的對照組的大鼠分別在乙醚麻醉下采血后，進行屠宰，用與實驗22-1相 同的方法測定其腸間膜周圍、腎臟周圍及睪丸周圍的脂肪質(zhì)量(濕質(zhì)量)以及血清中的中 性脂肪及總膽固醇。將結(jié)果示于表40。
60. 9+8. 2由表40的結(jié)果得知，攝取重均分子量不同的支鏈α -葡聚糖時，在任一個組中，與 對照組相比，內(nèi)臟脂肪質(zhì)量及血清脂質(zhì)量都為低值，本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖抑制內(nèi)臟脂 肪質(zhì)量及血清脂質(zhì)量的上升。另外，以該抑制效果的程度進行比較時，支鏈α-葡聚糖的重 均分子量為2，670 44，151，效果顯著，在2，670 25，618時具有特別強的效果。由以上的實驗19-2 19-5的結(jié)果判明，本發(fā)明的支鏈α -葡聚糖即使經(jīng)口攝取， 也難以成為齲齒，難以被消化吸收，可以有利地用作低卡路里的水溶性食物纖維。另外，由 實驗20 22的結(jié)果也判明，本發(fā)明的支鏈α -葡聚糖可以用作血糖上升抑制劑及生物體 內(nèi)類脂質(zhì)減少劑。下面，將本發(fā)明的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的制造例示于實施例1及2，將本發(fā)明的支鏈 α-葡聚糖的制造例示于實施例3 6。另外，將本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖的物理化性質(zhì) 例示于實施例7。將含有本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的品質(zhì)改良劑示于實施例8，而且，將 含有本發(fā)明的支鏈α -葡聚糖的組合物示于實施例9 22。實施例1按照實驗5的方法，在發(fā)酵罐中培養(yǎng)環(huán)狀芽孢桿菌ΡΡ710 (FERMBP-10771)約24小 時。培養(yǎng)后，進行離心分離，回收上清液，以成為80%飽和的方式添加硫酸銨，在4°C放置24 小時，由此進行鹽析。將鹽析物進行離心分離并回收，其中溶解于20mM醋酸緩沖液(pH6. 0) 后，相對同緩沖液進行透析、膜濃縮，制備粗酶液。本濃縮粗酶液的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性 為200單位/ml。另外，在本濃縮粗酶液中也具有約25單位/ml的淀粉酶活性。本品可以 有利地應(yīng)用于使用淀粉的基質(zhì)的本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖的制造、還有飲食品中所含的淀 粉的品質(zhì)改良劑等。
實施例2按照實驗8的方法，在發(fā)酵罐中培養(yǎng)球形節(jié)桿菌PP349(FERMBP-10770)約24小 時。培養(yǎng)后，進行離心分離，回收上清液，以成為80%飽和的方式添加硫酸銨，在4°C放置24 小時，由此進行鹽析。將鹽析物進行離心分離并回收，其中溶解于20mM醋酸緩沖液(pH6. 0) 后，相對同緩沖液進行透析、膜濃縮，制備粗酶液。本濃縮粗酶液的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性 為50單位/ml。本品可以有利地應(yīng)用于使用淀粉的基質(zhì)的本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖的制 造、還有飲食品中所含的淀粉的品質(zhì)改良劑等。實施例3將淀粉部分分解物(商品名《〃° ^ V r ” ” ^ #100》松谷化學(xué)工業(yè)株式會社出售) 以濃度為30質(zhì)量％的方式溶解于水，將其調(diào)整為pH6. 0，加入用實施例1的方法得到的濃縮 粗酶液每1克基質(zhì)固體成分為10單位作為α “葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性，在40°C作用48小時。 反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液加熱到95°C，保持10分鐘后，進行冷卻、過濾，將得到的濾液按照常 規(guī)方法用活性炭進行脫色，利用H型及OH型離子樹脂進行脫鹽并精制、進一步濃縮，得到濃 度50質(zhì)量％的支鏈α-葡聚糖溶液。本支鏈α-葡聚糖在甲基化分析中，2，3，6_三甲基 化物和2，3，4_三甲基化物之比顯示1 1.3，2，3，6-三甲基化物和2，3，4-三甲基化物的 總計占部分甲基化物的70.3%。另外，2，4，6_三甲基化物及2，4_ 二甲基化物分別為部分 甲基化物的3.0%及4.8%。另外，本支鏈α-葡聚糖的重均分子量為6，220道爾頓，重均 分子量(Mw)除以數(shù)均分子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)為2. 2。而且，本支鏈α _葡聚糖通 過異麥芽糖糊精酶的消化，每消化物的固體成分生成異麥芽糖35. 1質(zhì)量％，利用酶-HPLC 法求出的水溶性食物纖維含量為75. 8質(zhì)量％。本品具有非致齲性、難消化性的性質(zhì)、適當(dāng) 的粘度，可以以水溶性食物纖維、脂肪替代食物材料、日常飲食用飲食品、品質(zhì)改良劑、穩(wěn)定 劑、賦形劑、增粘劑、增量劑等有利地應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥品等各種組合物。實施例4在30%木薯淀粉乳中以最終濃度為0. 1質(zhì)量％的方式加入碳酸鈣后，調(diào)整為 ΡΗ6.5，在其中以每1克淀粉為0.2質(zhì)量％的方式加入α-淀粉酶()#公司制造、商品名 夕一 ^ S—；ι 60L)，在95°C下使其反應(yīng)15分鐘。將該反應(yīng)液進行高壓滅菌器(120°C)10 分鐘后，冷卻至40°C，在其中加入用實施例2的方法制成的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的濃縮粗酶液 每1克固體成分為10單位，進一步加入來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的CGTase (株式會社林原生 物化學(xué)研究所制)每1克固體成分為1單位，在40°C、pH6. 0下作用72小時。將該反應(yīng)液 在95°C下保持10分鐘后，進行冷卻、過濾，將得到的濾液按照常規(guī)方法用活性炭進行脫色， 利用H型及OH型離子樹脂進行脫鹽并精制、進一步進行濃縮、噴霧干燥，得到支鏈α -葡聚 糖粉末。本支鏈α-葡聚糖在甲基化分析中，2，3，6_三甲基化物和2，3，4_三甲基化物之比 顯示1 1.6，2，3，6-三甲基化物和2，3，4-三甲基化物的總計占部分甲基化物的80.0%。 另外，2，4，6_三甲基化物及2，4_ 二甲基化物分別顯示部分甲基化物的1.4及1.7%。另外， 本支鏈α-葡聚糖的重均分子量為10，330道爾頓，重均分子量(Mw)除以數(shù)均分子量(Mn) 所得的值(Mw/Mn)為2.9。而且，本支鏈α -葡聚糖在異麥芽糖糊精酶的消化中，每消化物 的固體成分生成異麥芽糖40. 7質(zhì)量％，利用酶-HPLC法求出的水溶性食物纖維含量為68. 6 質(zhì)量％。本支鏈α-葡聚糖具有非致齲性、難消化性的性質(zhì)、適當(dāng)?shù)恼扯?，可以以水溶性?物纖維、脂肪替代食物材料、日常飲食用飲食品、品質(zhì)改良劑、穩(wěn)定劑、賦形劑、增粘劑、增量劑等有利地應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥品等各種組合物。實施例5在27. 1質(zhì)量％玉米淀粉液化液(水解率3. 6%)中以最終濃度為0. 3質(zhì)量％的方 式加入亞硫酸氫鈉，另外，以最終濃度為ImM的方式加入氯化鈣后，冷卻至50°C，在其中加 入用實施例1的方法制成的濃縮粗酶液每1克固體成分為11. 1單位，進一步在50°C、pH6. 0 下作用68小時。將該反應(yīng)液在80°C下保持60分鐘后，進行冷卻、過濾，將得到的濾液按照 常規(guī)方法用活性炭進行脫色，利用H型及OH型離子樹脂進行脫鹽并精制、進一步進行濃縮、 噴霧干燥，得到支鏈α-葡聚糖粉末。本支鏈α-葡聚糖在甲基化分析中，作為部分甲基 化物的2，3，6_三甲基化物和2，3，4_三甲基化物之比顯示1 2. 5，2，3，6_三甲基化物和 2，3，4_三甲基化物的總計占部分甲基化物的68.4%。另外，2，4，6_三甲基化物及2，4_ 二 甲基化物分別顯示部分甲基化物的2. 6及6.8%。另外，本支鏈α-葡聚糖的重均分子量 為4，097道爾頓，重均分子量(Mw)除以數(shù)均分子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)為2. 1。而且， 本支鏈α -葡聚糖在異麥芽糖糊精酶的消化中，每消化物的固體成分生成異麥芽糖35. 6質(zhì) 量％，利用酶-HPLC法求出的水溶性食物纖維含量為79. 4質(zhì)量％。本支鏈α-葡聚糖具有 非致齲性、難消化性的性質(zhì)、適當(dāng)?shù)恼扯龋梢砸运苄允澄锢w維、脂肪替代食物材料、日常 飲食用飲食品、品質(zhì)改良劑、穩(wěn)定劑、賦形劑、增粘劑、增量劑等有利地應(yīng)用于食品、化妝品、 醫(yī)藥品等各種組合物。實施例6取代濃縮粗酶液，使用用實驗6的方法制成的來自環(huán)狀芽孢桿菌PP710(FERM BP-10771)的精制α _葡糖基轉(zhuǎn)移酶，加入來自淀粉皮假單胞菌的異淀粉酶(株式會社林原 生物化學(xué)研究所制)每1克固體成分為1，000單位，除此之外，與實施例5同樣地操作，得到 支鏈α-葡聚糖粉末。本支鏈α-葡聚糖在甲基化分析中，作為部分甲基化物的2，3，6_三 甲基化物和2，3，4-三甲基化物之比顯示1 4，2，3，6-三甲基化物和2，3，4-三甲基化物的 總計占部分甲基化物的67.9%。另外，2，4，6_三甲基化物及2，4_ 二甲基化物分別顯示部 分甲基化物的2. 3及5.3%。另外，本支鏈α-葡聚糖的重均分子量為2，979道爾頓，重均 分子量(Mw)除以數(shù)均分子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)為2. 0。而且，本支鏈α _葡聚糖在 異麥芽糖糊精酶的消化中，每消化物的固體成分生成異麥芽糖40. 6質(zhì)量％，利用酶-HPLC 法求出的水溶性食物纖維含量為77質(zhì)量％。本支鏈α-葡聚糖具有非致齲性、難消化性的 性質(zhì)、適當(dāng)?shù)恼扯龋梢砸运苄允澄锢w維、脂肪替代食物材料、日常飲食用飲食品、品質(zhì)改 良劑、穩(wěn)定劑、賦形劑、增粘劑、增量劑等有利地應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥品等各種組合物。實施例7對由實施例5制成的支鏈α-葡聚糖，按照常規(guī)方法研究理化性質(zhì)，作為本發(fā)明的 支鏈α-葡聚糖的性質(zhì)的一例匯總于表41。
性狀為白色的無晶形粉末,無味、無臭溶解性不溶于乙醇、丙酮、己烷、苯、醋酸乙酯、四氯化碳、氯仿及乙醚可溶于水、甲酰胺及二甲基亞砜水溶液的PH弱酸性構(gòu)成糖僅葡萄糖比旋光度+194. 1° 194. 4° (濃度、20°C)呈色反應(yīng)蒽酮硫酸反應(yīng)及苯酚硫酸反應(yīng)陽性滴定管反應(yīng)、羅利福林反應(yīng)及N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)(Elson-Morgan)陽性熔點不顯示明確的熔點
60 實施例8〈品質(zhì)改良劑〉將無水麥芽糖(注冊商標(biāo)《7 7· 4 >卜一 7》、株式會社林原商事出售)400質(zhì)量 份、海藻糖(注冊商標(biāo)《卜 >〃》、株式會社林原商事出售)200質(zhì)量份及用實驗6的方法制 成的來自環(huán)狀芽孢桿菌PP710(FERMBP-10771)的精制α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶2質(zhì)量份均勻混 合，利用常規(guī)方法進行通風(fēng)干燥，制備含有α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的酶劑。通過在制造含有淀 粉的飲食品時配合本品，可以將淀粉改性，抑制淀粉的老化，因此，可以有利地用作品質(zhì)改 良劑、尤其是抗淀粉老化劑。實施例9< 年糕 >將糯米粉500質(zhì)量份和上新粉500質(zhì)量份均勻混合后，加入水700質(zhì)量份并混合， 用水蒸氣蒸40分鐘。用攪拌機(ACM20LVW、株式會社愛工舍制作所)攪拌蒸好的物質(zhì)，并且 質(zhì)地約55°C時，以α _葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性最終為每1克淀粉為50單位的方式將蔗糖360質(zhì) 量份、海藻糖(注冊商標(biāo)《卜 >〃》、株式會社林原商事出售)240質(zhì)量份及用實驗6的方法 精制而得到的本發(fā)明的α “葡糖基轉(zhuǎn)移酶分成4次而添加、混合，其后，混合30分鐘后，裝 入塑料制的內(nèi)徑60mm、高度22mm的容器中進行成形、自然冷卻并保存。本品為通過α-葡糖 基轉(zhuǎn)移酶的作用將淀粉改性為支鏈α “葡聚糖的抑制老化、使柔韌度持續(xù)而具有拉伸性、 松脆的高品質(zhì)的年糕。實施例10〈糯米飯團〉將麥芽糖(注冊商標(biāo)《寸> 7 >卜》、株式會社林原商事出售)350質(zhì)量份、海藻糖 (注冊商標(biāo)《卜 > 〃》、株式會社林原商事出售)150質(zhì)量份溶解于溫水，制備濃度70質(zhì)量％ 的糖液并保溫于55°C。然后，利用常規(guī)方法用蒸籠蒸煮預(yù)先在水中浸漬過的1000質(zhì)量份的 年糕米，冷卻至55°C后，以每1克淀粉為25單位的方式加入上述糖液500質(zhì)量份和用實驗 9的方法精制而得到的本發(fā)明的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶并均勻地攪拌。將其放入保溫容器保持 在45 50°C約1小時后，取出，使用豆沙餡制備糯米飯團。本品為通過α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶 的作用將糊化淀粉改性為支鏈α -葡聚糖并抑制老化、在冷藏或冷凍保存后即使解凍也不 產(chǎn)生失水等、保持制備之后的柔韌度的高品質(zhì)的糯米飯團。實施例11<加糖煉乳>在原乳100質(zhì)量份中溶解用實施例3的方法得到的支鏈α -葡聚糖溶液2質(zhì)量 份及蔗糖3重量，用片式加熱器進行加熱滅菌，然后，濃縮為濃度70%，在無菌狀態(tài)下裝罐， 得到制品。本品為溫和的甜味且味道也好，作為較多地含有水溶性食物纖維的加糖煉乳，可 以有利地應(yīng)用于水果、咖啡、可可茶、紅茶等調(diào)味用。實施例12〈乳酸菌飲料〉
將脫脂粉乳175質(zhì)量份、用實施例4的方法得到的支鏈α _葡聚糖粉末50質(zhì)量份 及乳果糖高含有粉末(株式會社林原商事出售、注冊商標(biāo)《乳果寡糖》)50質(zhì)量份溶解于水 1，500質(zhì)量份，在65°C下殺菌30分鐘，冷卻至40°C后，其中按照常規(guī)方法植菌乳酸菌的發(fā)酵 劑30質(zhì)量份，在37°C下培養(yǎng)8小時，得到乳酸菌飲料。本品味道良好，含有作為水溶性食物 纖維的支鏈α-葡聚糖或寡糖，作為不僅穩(wěn)定地保持乳酸菌、而且具有雙尾菌增殖促進作 用、整腸作用的乳酸菌飲料優(yōu)選。實施例13<粉末果汁>相對通過噴霧干燥制成的橙果汁粉末33質(zhì)量份，將用實施例4的方法得到的支 鏈α “葡聚糖粉末10質(zhì)量份、含水結(jié)晶海藻糖20質(zhì)量份、無水結(jié)晶麥芽糖20質(zhì)量份、檸檬 酸酐0. 65質(zhì)量份、蘋果酸0. 1質(zhì)量份、2-0- α -葡糖基-L-抗壞血酸0. 2質(zhì)量份、檸檬酸鈉 0. 1質(zhì)量份及適量的粉末香料充分混合攪拌并粉碎，做成微粉末，將其放入流動層制粒機， 設(shè)定為排風(fēng)溫度40°c，其中適量噴霧用實施例3的方法得到的支鏈α “葡聚糖溶液作為粘 合劑，制粒30分鐘并計量、包裝，得到制品。本品為果汁含量約30%的粉末果汁。另外，本 品作為沒有異味、異臭，高品質(zhì)、較多地含有水溶性食物纖維的低卡路里的果汁，為商品價 值高的制品。實施例14<卡士達醬>將玉米淀粉100質(zhì)量份、用實施例3的方法得到的支鏈α -葡聚糖溶液30質(zhì)量 份、海藻糖含水結(jié)晶70質(zhì)量份、蔗糖40質(zhì)量份及食鹽1質(zhì)量份充分混合，加入雞蛋280質(zhì) 量份并攪拌，其中緩慢地加入沸騰的牛奶1，000質(zhì)量份，進一步火焰加熱并攪拌，在玉米 淀粉完全糊化、全部為半透明時關(guān)火，將其冷卻并加入適量的華尼拉香料，進行測量、填充、 包裝，得到制品。本品為具有平滑的光澤、味道良好、較多地含有水溶性食物纖維的高品質(zhì) 的卡士達醬。實施例15〈餡〉在原料小豆10質(zhì)量份中按照常規(guī)方法加水并煮沸、除澀、去澀味，除去水溶性夾 雜物，得到小豆粒餡約21質(zhì)量份。在該生餡中加入蔗糖14質(zhì)量份、用實施例3的方法得 到的支鏈α “葡聚糖溶液5質(zhì)量份和水4質(zhì)量份并煮沸，在其中加入少量的色拉油以不使 粒餡變質(zhì)的方式精煉，得到制品的餡約35質(zhì)量份。本品都不褪色、失水，穩(wěn)定，較多地含有 作為水溶性食物纖維的支鏈α-葡聚糖，味覺、味道良好，作為帶餡面包、團子、豆餡糯米點 心、冰點心等制點心材料優(yōu)選。實施例16< 面包 >將小麥粉100質(zhì)量份、酵母菌2質(zhì)量份、蔗糖5質(zhì)量份、用實施例4的方法得到的 支鏈α -葡聚糖粉末1質(zhì)量份及無機食物0. 1質(zhì)量份按照常規(guī)方法用水柔和，在26°C下使 菌種發(fā)酵2小時，其后，成熟、燒制30分鐘。本品為色澤、形狀都良好、含有較多作為水溶性 食物纖維的支鏈α -葡聚糖、具有適當(dāng)?shù)膹椓?、溫和的甜味的高品質(zhì)的面包。實施例17
<粉末肽>將用實施例4的方法得到的支鏈α -葡聚糖粉末2質(zhì)量份與40%食品用大豆肽溶 液(不二制油株式會社出售、商品名《〃 < 二-一卜S》)1質(zhì)量份混合，放入塑料制大桶中， 在50°C下進行減壓干燥并粉碎，得到肽。本品味道良好，不僅作為預(yù)混合物、冰激凌等低卡 路里制點心材料是有用的，而且，作為經(jīng)口流動食物、用于經(jīng)管流動食物的食物纖維或整腸 劑量也是有用的。實施例18<化妝用霜>將單硬脂酸聚氧乙二醇2質(zhì)量份、自乳化型單硬脂酸甘油5質(zhì)量份、用實施例4的 方法得到的支鏈α -葡聚糖粉末2質(zhì)量份、α _葡糖基蘆丁(株式會社林原出售、商品名α G 蘆丁)1質(zhì)量份、流動石蠟1質(zhì)量份、三辛酸甘油10質(zhì)量份及適量的防腐劑按照常規(guī)方法進 行加熱熔解，在其中加入L-乳酸2質(zhì)量份、1，3- 丁二醇5質(zhì)量份及蒸餾水66質(zhì)量份，用均 化器乳化，進一步加入適量的香料進行攪拌混合，制造化妝用霜。本品因配合支鏈α-葡聚 糖而具有優(yōu)異的保濕性，穩(wěn)定性高，可以有利地用作高品質(zhì)的防曬、美膚劑、美白劑等。實施例19< 牙膏 >將磷酸氫鈣45質(zhì)量份、月桂基硫酸鈉1. 5質(zhì)量份、甘油25質(zhì)量份、聚氧乙烯山梨 糖醇酐月桂酸酯0. 5質(zhì)量份、用實施例3的方法得到的支鏈α -葡聚糖溶液15質(zhì)量份、糖 精0.02質(zhì)量份與水18質(zhì)量份混合，得到牙膏。本品不使表面活性劑的清潔力降低，使用后 感覺也良好。實施例20〈流食用固體制劑〉制備由用實施例4的方法得到的支鏈α _葡聚糖粉末100質(zhì)量份、海藻糖含水結(jié) 晶200質(zhì)量份、含有較多麥芽四糖的粉末200質(zhì)量份、蛋黃粉270質(zhì)量份、脫脂粉乳209質(zhì) 量份、氯化鈉4. 4質(zhì)量份、氯化鈣1. 8質(zhì)量份、硫酸鎂4質(zhì)量份、硫胺素0. 01質(zhì)量份、L-抗 壞血酸鈉0. 1質(zhì)量份、維生素E乙酸酯0. 6質(zhì)量份劑煙酰胺0. 04質(zhì)量份構(gòu)成的配合物，將 鈣配合物填充于各25克的防濕性層疊體小袋并進行熱密封，得到制品。本品將水溶性食物 纖維進行強化，作為整腸作用優(yōu)異的流食，通過經(jīng)口或向鼻腔、胃、腸等經(jīng)管的使用方法進 行利用，可以有利地應(yīng)用于對生物體的能量補充。實施例21〈片劑〉在阿司匹林50質(zhì)量份中充分混合海藻糖含水結(jié)晶粉末14質(zhì)量份、用實施例4 的方法得到的支鏈α “葡聚糖粉末4質(zhì)量份后，按照常規(guī)方法利用壓片機壓片，制造厚度 5.25讓、1片680!^的藥片。由于本品利用難消化性葡聚糖和海藻糖的賦形性，因此，沒有 吸濕性，物理強度也充分，而且水中的崩解也非常良好。另外，由于支鏈α-葡聚糖作為水 溶性食物纖維起作用，因此，是也具有整腸作用的藥片。實施例22〈外傷治療用膏藥〉在麥芽糖400質(zhì)量份中加入溶解有碘3質(zhì)量份碘甲醇50質(zhì)量份并混合，進一步加入用實施例4的方法得到的支鏈α -葡聚糖粉末10w/v%水溶液20質(zhì)量份并混合，得到顯 示適當(dāng)?shù)睦煨?、附著性的外傷治療用藥膏。本品為具有支鏈?葡聚糖引起的適當(dāng)?shù)恼?度、保濕性、經(jīng)時變化少、商品價值高的膏藥。另外，本品不僅具有由碘產(chǎn)生的殺菌作用，而 且也作為利用麥芽糖對細(xì)胞補充能量的能量補充劑起作用，因此，治療時間縮短，創(chuàng)面也全 部治愈。工業(yè)上應(yīng)用的可能性本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖由于安全性高，消化性也不比市售的難消化性糊精差， 因此，充分具備作為水溶性食物纖維的功能。另外，本發(fā)明的支鏈α-葡聚糖也具有血糖上 升抑制作用或生物體內(nèi)類脂質(zhì)減少作用，因此，作為健康食品也是有用的。根據(jù)本發(fā)明，目 前，可以以淀粉部分分解物為基質(zhì)，用酶法大量且效率好地制造具有與利用化學(xué)反應(yīng)或繁 瑣且效率低的方法由淀粉制成的難消化性糊精同等的難消化性的支鏈α-葡聚糖。提供難 消化性的支鏈α -葡聚糖和其制造方法的本發(fā)明，對飲食品、化妝品、醫(yī)藥品等應(yīng)用領(lǐng)域有 較大貢獻，其工業(yè)意義非常重大。
權(quán)利要求
一種支鏈α 葡聚糖，其以葡萄糖為構(gòu)成糖，其特征在于，在甲基化分析中，具有下述特征(1)2，3，6 三甲基 1，4，5 三乙?；咸烟谴己?，3，4 三甲基 1，5，6 三乙?；咸烟谴贾仍?∶0.6～1∶4的范圍；(2)2，3，6 三甲基 1，4，5 三乙酰基葡萄糖醇和2，3，4 三甲基 1，5，6 三乙酰基葡萄糖醇的總計占部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的60％以上；(3)2，4，6 三甲基 1，3，5 三乙?；咸烟谴紴椴糠旨谆咸烟谴家宜狨サ?.5％以上且小于10％；及(4)2，4 二甲基 1，3，5，6 四乙?；咸烟谴紴椴糠旨谆咸烟谴家宜狨サ?.5％以上。
2.如權(quán)利要求1所述的支鏈α-葡聚糖，其特征在于，葡萄糖聚合度為10以上，重均分 子量(Mw)除以數(shù)均分子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)小于20。
3.如權(quán)利要求1或2所述的支鏈α-葡聚糖，其特征在于，通過異麥芽糖糊精酶(EC 3. 2. 1. 94)消化，每單位消化物的固體成分生成異麥芽糖25質(zhì)量％以上50質(zhì)量％以下。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項所述的支鏈α-葡聚糖，其特征在于，利用高效液相色譜 法(酶-HPLC法)求出的水溶性食物纖維含量為40質(zhì)量％以上。
5.一種α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于，具有通過與麥芽糖及葡萄糖聚合度為3以上 的α -1，4葡聚糖作用并進行α -葡糖基轉(zhuǎn)移而生成權(quán)利要求1 4中任一項所述的支鏈 α-葡聚糖的作用。
6.如權(quán)利要求5所述的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于，具有下述理化性質(zhì)(1)分子量在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法中，為90，000士 10，000道爾頓；(2)最適溫度在pH6. 0反應(yīng)30分鐘的條件下，為50 55°C ；(3)最適pH在40°C反應(yīng)30分鐘的條件下，為5. 0 6. 3 ；(4)溫度穩(wěn)定性在pH6. 0保持60分鐘的條件下，直到40°C穩(wěn)定；及(5)pH穩(wěn)定性在4°C保持24小時的條件下，至少在pH4. 0 8. 0內(nèi)穩(wěn)定。
7.如權(quán)利要求5或6所述的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于，來自屬于芽孢桿菌屬或節(jié) 桿菌屬的微生物。
8.如權(quán)利要求7所述的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于，芽孢桿菌屬微生物為環(huán)狀芽孢 桿菌(Bacillus circulars)PP710(獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心、 保藏編號FERM BP-10771)或其變異株。
9.如權(quán)利要求7所述的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶，其特征在于，節(jié)桿菌屬微生物為球形節(jié)桿 菌(Arthrobacter globiformis) ΡΡ349 (獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏 中心、保藏編號FERM BP-10770)或其變異株。
10.一種α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶的制造方法，其特征在于，從培養(yǎng)具有權(quán)利要求5 9中任一項所述的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)生能力的微生物而得到的培養(yǎng)物提取α-葡糖基轉(zhuǎn)移 酶。
11.一種微生物，具有權(quán)利要求5 9中任一項所述的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生能力，其 特征在于，為環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)pp710(獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究 所專利生物保藏中心、保藏編號FERM BP-10771)、球形節(jié)桿菌(Arthrobacterglobiformis) PP349(獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心、保藏編號FERM BP-10770) 或它們的變異株。
12.—種權(quán)利要求1 4中任一項所述的支鏈α -葡聚糖的制造方法，其特征在于，包 含下述步驟使權(quán)利要求5 9中任一項所述的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶與麥芽糖和/或葡萄糖 聚合度為3以上的α -1，4葡聚糖作用，生成權(quán)利要求1 4中任一項所述的葡聚糖的步驟； 提取其的步驟。
13.如權(quán)利要求12所述的支鏈α-葡聚糖的制造方法，其特征在于，在生成權(quán)利要求 1 4中任一項所述的葡聚糖的步驟中，并用選自淀粉酶、淀粉去分支酶及環(huán)糊精葡萄糖轉(zhuǎn) 位酶中的1種或2種以上。
14.如權(quán)利要求13所述的支鏈α-葡聚糖的制造方法，其特征在于，淀粉酶具有下述理 化性質(zhì)(1)作用在水解淀粉的同時，催化葡糖基的轉(zhuǎn)移，并生成環(huán)糊精，水解普魯蘭多糖，生成潘糖；(2)分子量在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法中，為58，000 士 10，000道爾頓；(3)最適溫度在pH6. O反應(yīng)30分鐘的條件下，為55°C ；(4)最適pH在35°C反應(yīng)30分鐘的條件下，為6 7 ；(4)溫度穩(wěn)定性在pH6. O保持60分鐘的條件下，直到40°C穩(wěn)定，在pH6. OUmM Ca2+存在下，直到50°C穩(wěn)定；及(6)pH穩(wěn)定性在4°C保持24小時的條件下，至少在pH6. 0 8. 0的范圍內(nèi)穩(wěn)定。
15.如權(quán)利要求13或14所述的支鏈α-葡聚糖的制造方法，其特征在于，淀粉酶來自 屬于芽孢桿菌屬的微生物。
16.如權(quán)利要求15所述的支鏈α-葡聚糖的制造方法，其特征在于，芽孢桿菌屬微生物 為環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulars)PP710(獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生 物保藏中心、保藏編號FERMBP-10771)或其變異株。
17.—種權(quán)利要求1 4中任一項所述的支鏈α -葡聚糖的制造方法，其特征在于，包 含下述步驟使用含有麥芽糖和/或葡萄糖聚合度為3以上的α -1，4葡聚糖的營養(yǎng)培養(yǎng) 基，培養(yǎng)具有權(quán)利要求5 9中任一項所述的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生能力的微生物的步驟； 提取培養(yǎng)液中生成的權(quán)利要求1 4中任一項所述的支鏈α-葡聚糖的步驟。
18.—種組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求1 4中任一項所述的支鏈α -葡聚糖。
19.如權(quán)利要求18所述的組合物，其特征在于，為飲食品、化妝品、醫(yī)藥品、醫(yī)藥部外品 或工業(yè)原料。
20.—種血糖上升抑制劑，其特征在于，含有權(quán)利要求1 4中任一項所述的支鏈 α-葡聚糖作為有效成分。
21.一種生物體內(nèi)類脂質(zhì)減少劑，其特征在于，含有權(quán)利要求1 4中任一項所述的支 鏈α-葡聚糖作為有效成分。
22.—種品質(zhì)改良劑，其特征在于，用于以權(quán)利要求5 9中任一項所述的α-葡糖基 轉(zhuǎn)移酶為有效成分的麥芽糖和/或葡萄糖聚合度為3以上的α -1，4葡聚糖。
23.一種麥芽糖和/或葡萄糖聚合度為3以上的α _1，4葡聚糖的改性方法，其特征在 于，使權(quán)利要求5 9中任一項所述的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶作用。
24.一種異麥芽糖或含有其的糖質(zhì)的制造方法，其特征在于，包含下述步驟與權(quán)利要 求5 9中任一項所述的α -葡糖基轉(zhuǎn)移酶一同，使異麥芽糖糊精酶與麥芽糖和/或葡萄 糖聚合度為3以上的α -1，4葡聚糖作用，生成異麥芽糖的步驟；回收得到的異麥芽糖或含 有其的糖質(zhì)的步驟。
全文摘要
本發(fā)明通過提供一種支鏈α-葡聚糖和生成該支鏈α-葡聚糖的新型的α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶、它們的的制造方法以及用途來解決上述課題，所述支鏈α-葡聚糖以葡萄糖為構(gòu)成糖，其特征在于，在甲基化分析中，具有下述特征(1)2，3，6-三甲基-1，4，5-三乙?；咸烟谴己?，3，4-三甲基-1，5，6-三乙?；咸烟谴贾仍?∶0.6～1∶4的范圍；(2)2，3，6-三甲基-1，4，5-三乙?；咸烟谴己?，3，4-三甲基-1，5，6-三乙酰基葡萄糖醇的總計占部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的60％以上；(3)2，4，6-三甲基-1，3，5-三乙?；咸烟谴紴椴糠旨谆咸烟谴家宜狨サ?.5％以上且小于10％；及(4)2，4-二甲基-1，3，5，6-四乙酰基葡萄糖醇為部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5％以上。
文檔編號C12R1/09GK101932719SQ20088001758
公開日2010年12月29日 申請日期2008年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月26日
發(fā)明者奧和之, 山本拓生, 津崎桂二, 渡邊光, 福田惠溫, 茶圓博人, 西本友之 申請人:株式會社林原生物化學(xué)研究所