專利名稱:增強植物耐缺鐵性的多肽及其應用的制作方法
技術領域:
本發(fā)明是關于植物耐缺鐵性的發(fā)明,具體而言是關于能使植物耐缺鐵 性得以增強的多肽的研究。
背景技術:
幾乎所有的生物在自身成長和繁殖過程中都需要鐵。植物吸收土壤中 的可溶性鐵,并將此供給給動物和人類。但是雖然土壤中有豐富的礦物鐵,
在有氧高PH條件下鐵表現(xiàn)為幾乎不可溶。因此,占世界耕地面積30%的 堿性土壤中,植物通常會呈現(xiàn)出被稱為缺綠癥(因缺乏葉綠素引起的植物 黃色化)的缺鐵癥狀,影響植物的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此,具有高度耐缺鐵性 的植物很有需求。
高等植物具有在缺鐵狀態(tài)下吸收鐵的策略--螯合(策略II)和還原(策 略I)。在此之中,策略II是禾本科植物特有的策略,利用天然的鐵螯合劑 —麥根酸(mugineic acid)類植物鐵載體(phytosiderophore) (MAs)與土 壤中的鐵螯合,再經(jīng)由根部細胞的細胞膜中存在的轉運蛋白(YS1)將鐵 導入細胞內(nèi)。
至今為止,通過廣范圍的生理學,生物化學,以及分子水平的研究, MAs的生物合成回路以及生物合成酶的基因已得到鑒定。例如煙酰胺合 成酶(NAS),煙酰胺氨基轉移酶(NAAT), IDS2, IDS3等。這些生物合 成酶已知會在缺鐵狀態(tài)下強化表達。
但是,上述對缺鐵狀態(tài)的應答,即在缺鐵狀態(tài)下與鐵吸收相關的基因 的強化表達的分子機制幾乎是不明的。本發(fā)明人對缺鐵時被誘導表達的大 麥IDS2基因的啟動子區(qū)域進行解析,鑒定了新的缺鐵應答性順式元件 IDEl(Fe-deficiency responsive elementl)以及IDE2(Fe-deficiency responsiveelement2)。 IDE1以及IDE2在煙草根部,水稻的根部以及葉部中,協(xié)同誘 導對缺鐵狀態(tài)進行應答的基因的表達(專利文獻1)。
日本公開專利公報《特開2005-6599號公報(公表日平成17年1月 13日)》
發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明人的構想,通過應用與上述順式元件相結合的轉錄因子, 可以使植物中與鐵吸收相關的基因強化表達,從而獲得耐缺鐵性得以增強 的植物。
但是,因為與上述順式元件(cis-element)結合的轉錄因子沒有被鑒 定,該轉錄因子無法被利用。
本發(fā)明的目的在于提供與上述順式元件相結合,而增強植物耐缺鐵性 的轉錄因子。
本發(fā)明人經(jīng)潛心研究的結果,鑒定了與上述順式元件相結合的多肽, 發(fā)現(xiàn)了該多肽可增強植物的耐缺鐵性,從而完成了本發(fā)明。
也就是說,本發(fā)明中所涉及的多肽,是由(A) (C)中任一氨基 酸序列構成,并且使植物耐缺鐵性得以增強(A)序列號l, 4或7中任 一所示的氨基酸序列;(B)在序列號l, 4或7中任一所示的氨基酸序列 中, 一個或多個氨基酸被取代、缺失或附加的氨基酸序列;或者(C)序 列號1所示的氨基酸序列的第243 355號被序列號10, 13, 16, 19, 22, 25或28中任一所示的氨基酸序列所取代的氨基酸序列。
本發(fā)明中所涉及的多核苷酸,其特征在于編碼本發(fā)明記載的多肽。
本發(fā)明中所涉及的多核苷酸,由(A) (D)中任一堿基序列所構 成,其編碼使植物耐缺鐵性得以增強的多肽(A)序列號2, 5或8中任 一所示的堿基序列;(B )在序列號2, 5或8中任一所示的堿基序列中, 一個或多個核苷酸被取代、缺失或附加的堿基序列;(C)與序列號2, 5或8中任一所示的堿基序列的互補序列在嚴格條件下可雜交的堿基序列; 或者(D)序列號2所示的堿基序列的第727 1065號被序列號11, 14, 17, 20, 23, 26或29中任一所示的堿基序列所取代的堿基序列。
本發(fā)明中所涉及的載體(vector),以含有本發(fā)明中所涉及的多核苷酸 為特征。
本發(fā)明中所涉及的轉化體,以導入了本發(fā)明中所涉及的多核苷酸為特征。
本發(fā)明中所涉及的抗體,以與本發(fā)明中所涉及的多肽特異性結合為特征。
本發(fā)明中所涉及的耐缺鐵性提高的植物的制作方法,以包括將本發(fā)明 中所涉及的多核苷酸導入植物的工序為特征。
本發(fā)明中所涉及的用于制作耐缺鐵性提高的植物的組合物,以含有本 發(fā)明中所涉及的多核苷酸或本發(fā)明中所涉及的載體為特征。
本發(fā)明中所涉及的用于制作耐缺鐵性提高的植物的套件,以具備本發(fā) 明中所涉及的多核苷酸或本發(fā)明中所涉及的載體為特征。
本發(fā)明中所涉及的耐缺鐵性提高的植物的育種方法,以包括了對植物 提取物中本發(fā)明中所涉及的多肽的進行檢測工序為特征。
本發(fā)明中所涉及的耐缺鐵性提高的植物的育種方法,也可以包括將植 物提取物與本發(fā)明中所涉及的抗體共同培養(yǎng)的工序。
本發(fā)明中所涉及的耐缺鐵性得以增強的植物的育種用組合物,優(yōu)選含 有本發(fā)明中所涉及的抗體。
本發(fā)明中所涉及的耐缺鐵性得以增強的植物的育種用套件,優(yōu)選裝備 了本發(fā)明中所涉及的抗體。
本發(fā)明中所涉及的耐缺鐵性得以增強的植物的育種方法,進一步可以 包括以下工序植物提取物中含有的本發(fā)明中所涉及的多核苷酸,或由序 列號12, 15, 18, 21, 24或27中任一所示的堿基序列所構成的多核苷酸 的檢測工序。
6本發(fā)明中所涉及的耐缺鐵性得以增強的植物的育種方法,再進一步可 以包括以下工序?qū)⒅参锾崛∥锱c,本發(fā)明中所涉及的多核苷酸,或由序
列號12, 15, 18, 21, 24或27中任一表示的堿基序列所構成的多核苷酸 共同培養(yǎng)的工序。
本發(fā)明中所涉及的耐缺鐵性得以增強的植物的育種用組合物,可以含 有本發(fā)明中所涉及的多核苷酸,或由序列號12, 15, 18, 21, 24或27中 任一所示堿基序列所構成的多核苷酸。
本發(fā)明中所涉及的耐缺鐵性得以增強的植物的育種用套件,可以具有 本發(fā)明中所涉及的多核苷酸,或由序列號12, 15, 18, 21, 24或27中任
一所示堿基序列所構成的多核苷酸。
本發(fā)明中對編碼使植物耐缺鐵性得以增強的多肽的多核苷酸進行檢 測的方法,以包含以下工序為特征;將候補多肽,與由序列號12, 15, 18, 21, 24或27中任一所示堿基序列所構成的多核苷酸進行雜交的工序。
本發(fā)明其他的目的、特征以及優(yōu)點,可從下述記載中充分了解。關于 本發(fā)明的優(yōu)點,也可參考附圖與
。
圖1是IDE1序歹IJ, IDE1狀序列,以及經(jīng)過改變的IDE1序列。
圖2是ABI3/VP1家族轉錄因子系統(tǒng)樹。
圖3是IDE1酵母結合分析結果圖。
圖4是IDE1凝膠移位分析的結果圖。
圖5是IDE1拮抗實驗結果圖。
圖6是IDE1的RNA印跡的結果圖。
圖7是IDE2單雜交篩選法及酵母結合分析的結果圖。
圖8是NAC家族轉錄因子系統(tǒng)樹。
圖9是IDE2凝膠移位分析結果圖。
7圖10是IDE2拮抗實驗結果圖。
圖11是IDEF2的RNA印跡的結果圖。
圖12是IDE2拮抗實驗說明圖,(a)為IDE2拮抗實驗中所用序列, (b)為IDE2精密拮抗實驗結果。
圖13是經(jīng)本發(fā)明中所涉及的多核苷酸轉化的煙草的特性圖,(a)為經(jīng) 本發(fā)明中所涉及的多核苷酸轉化的煙草根部GUS活性(b)為經(jīng)本發(fā)明中 所涉及的多核苷酸轉化的煙草葉部的葉綠素量。
圖14是酵母結合分析中所用結構的構造示意圖。
圖15是本發(fā)明中所涉及的轉化體在缺鐵狀態(tài)下的特性圖,(a)為缺鐵 狀態(tài)下本發(fā)明中所涉及的轉化體葉部葉綠素量的變化,(b)為缺鐵狀態(tài)下 本發(fā)明中所涉及的轉化體莖葉的高度變化。
圖16是本發(fā)明中所涉及的轉化體在缺鐵狀態(tài)下的特性圖,(a)為缺鐵 狀態(tài)下本發(fā)明中所涉及的轉化體葉部葉綠素量的變化,(b)為缺鐵狀態(tài)下 本發(fā)明中所涉及的轉化體莖葉的高度變化。
圖17是利用RNAi使IDEF2表達受抑制時的結果圖,(a)所示為表 達受抑制的IDEF2, (b)為經(jīng)RNAi使IDEF2表達受抑制的植物體內(nèi),與 鐵吸收機制相關的基因的表達量。
圖18是IDEF1及其同系物的氨基酸序列比較圖。
圖19是IDEF2及其同系物的氨基酸序列比較圖。
具體實施例方式
在一個方面,本發(fā)明提供了使植物的耐缺鐵性得以增強的多肽。在本 說明書中使用時,[植物的耐缺鐵性]指的是在可溶性鐵成份少的土壤中也 能得以生長的植物特性。具體是指在堿性土壤等中生長時也不容易顯現(xiàn)缺 綠癥等的植物特性。判斷植物是否具有耐缺鐵性時,可采用后述實施例中 記載的,在缺鐵條件下以SPAD指數(shù)等的葉片中葉綠素含有量等作為指標,但不局限于此。
在本說明書中使用時,用語[多肽],可與[肽]或[蛋白質(zhì)]交換使用。多
肽的[片斷],指該多肽的部分片斷。本發(fā)明中涉及的多肽,可以從天然供 厶厶、、厄出zv離^旦茶" at t f、i 乂u塔入rfv-旦不ii
用語[分離得到]的多肽或蛋白質(zhì),指從天然環(huán)境中取出的多肽或蛋白 質(zhì)。例如,在宿主細胞中表達的經(jīng)基因重組生產(chǎn)的多肽及蛋白質(zhì),與經(jīng)任 意適當?shù)募夹g手段得以實質(zhì)上精制的天然或重組多肽以及蛋白質(zhì)一樣,均 可認為是分離得到的。
本發(fā)明中所涉及的多肽,以序列號1, 4或7中任一所示的氨基酸序 列構成的多肽或其變異體為優(yōu)選。
在本說明書中用于蛋白質(zhì)或多肽時,用語[變異體],是指保持了目的 多肽特定活性的多肽。[由序列號l, 4或7中任一所示的氨基酸序列構成 的多肽變異體],是指有增強植物耐缺鐵性活性的多肽。
構成多肽的氨基酸序列中的幾個氨基酸可在不對該多肽結構和功能 產(chǎn)生實質(zhì)影響的情況下容易被改變,這在本技術領域中是眾所周知的。進 一步而言,不只是人為的改變,在天然的蛋白質(zhì)中存在不實質(zhì)上改變該蛋 白質(zhì)的結構和功能的變異體,也是眾所周知的。
本領域所屬技術人員,應用眾所周知的技術,可以使多肽氨基酸序列 中一個或多個氨基酸容易地發(fā)生變異。例如應用公知的點變異導入法,可 以使編碼多肽的多核苷酸的任意堿基發(fā)生變異。此外,通過設計與編碼多 肽的多核苷酸的任意部位相對應的引物,可以制作缺失變異體和附加變異 體。
理想的變異體具有保存性或非保存性的氨基酸取代,缺失或附加。這 些不改變本發(fā)明中所涉及多肽增強植物耐缺鐵性的活性。
此外,理想的變異體,可以是本發(fā)明中多肽的特定結構域,被該多肽 同系物的該結構域所取代的嵌合多肽。對于特定的多肽,氨基酸序列相同 性高的同系物,具有同一功能的必然性高,本領域中所屬技術人員可以很 容易理解到,用這樣的同系物的氨基酸序列,取代該多肽的特定結構域,可以容易得到有相同功能的變異體。作為上述的特定結構域,以上述多肽
中與DNA相結合的結構域為優(yōu)選,例如可以是序列號1所示氨基酸序列 第243號 355號氨基酸。此外,作為上述同系物,上述結構域中氨基酸 序列相同性50%以上為優(yōu)選,相同性60%以上為更理想,可以是例如圖18 所示的大麥(Barleyl、 Barley2),小麥(Wheat),玉米(Maize),高粱(Sorghum), 甘蔗(Sugaecane),或水稻(AK072874)的同系物。因此,做為優(yōu)選的嵌合多 肽,可以是序列號1所示的氨基酸序列中第243 355號氨基酸,被序列 號IO, 13, 16, 19, 22, 25或28中任一所示的氨基酸序列所取代的氨基 酸序列所構成的多肽。特定的結構域中,沒有必要是該結構域的全區(qū)域被 取代, 一部分區(qū)域被同系物對應區(qū)域所取代即可。
如上所述,本實施方案中的多肽,是具有增強植物耐缺鐵性活性的多 肽。以(1)序列號l, 4或7中任一所示氨基酸序列所構成的多肽;(2) 序列號1, 4或7中任一所示氨基酸序列中, 一個或多個氨基酸被取代, 缺失或附加的氨基酸序列所構成的多肽;或(3)序列號1所示氨基酸序 列的第243 355號氨基酸,被序列號10, 13, 16, 19, 22, 25或28中 所示任一氨基酸序列所取代的氨基酸序列所構成的多肽為優(yōu)選。
本發(fā)明中所涉及的多肽,包括天然物的精制產(chǎn)物,化學合成的產(chǎn)物, 以及在原核生物宿主或真核生物宿主中(例如細菌細胞,酵母細胞,高等 植物細胞,昆蟲細胞,以及哺乳動物細胞)經(jīng)過基因重組技術得到的產(chǎn)物。 基因重組中依存于其宿主,本發(fā)明中的多肽可以是被糖基化,或是脫糖基 化的。此外,本發(fā)明中多肽在某些時候,做為宿主介入過程的結果,可能 含有宿主由來的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明涉及的多肽,是氨基酸經(jīng)過肽鍵結合而形成的多肽即可,但并 不局限于此,可以是含有多肽以外的結構的復合多肽。在本說明書中使用 時,[多肽以外的結構],以糖鏈以及類異蝥戊二烯為例,但不局限于此。
此外,此發(fā)明中涉及的多肽,可以含有附加性的多肽。附加性的多肽, 可以舉例為His、 Myc、 Flag等的表位附加(epitope)標識多肽。
本發(fā)明中所涉及的多肽,具有使植物耐缺鐵性得以增強的活性,是因 為該多肽具有使植物在缺鐵狀態(tài)下被誘導的基因(缺鐵應答性基因)增強表達的活性。
缺鐵應答性基因,以OsNAATl, OsNASl, HvNAAT-A, IDS3為例。
經(jīng)這些基因編碼的多種蛋白質(zhì)與植物從土壤中吸收不可溶的鐵成份的機 制(鐵吸收機制)相關。因此,應用本發(fā)明中所涉及的多肽,使上述基因 增強表達,可以植物可以吸收更多的鐵成份,從而在可溶性鐵少的土壤中 也能得以生長。
反過來說,本領域所屬技術人員可以容易的理解到,以上述缺鐵誘導 基因的表達為指標,可以判斷任意的多肽是否具有使植物耐缺鐵性得以增 強的活性。
此外,本發(fā)明中所涉及的多肽具有使缺鐵誘導基因增強表達的活性, 是因為該多肽,與很多缺鐵誘導基因上流區(qū)域中普遍存在的順式元件相結 合,作為轉錄因子使得其近旁的基因增強表達。
作為上述順式元件,有序列號30所示的順式元件(IDE1)以及序列 號32所示的順式元件(IDE2)(可參考專利文獻1)。本發(fā)明中涉及的多肽 中,序列號1所示的氨基酸序列所構成的多肽(IDEF1: IDE binding factorl) 以及其變異體與IDEF1相結合,序列號4或7所示的氨基酸序列所構成的 多肽(IDEF2: IDE binding factor2)以及其變異體與IDEF2相結合。
更為優(yōu)選的是,IDEF1及其變異體將序列號31所示堿基序列識別為核 心序列,IDEF2及其變異體將序列號33所示堿基序列識別為核心序列。在 本說明書中,[核心序列]指的是與轉錄因子結合的堿基序列的最小單位。 IDE1和IDE2分別含有序列號31以及序列號33所示的堿基序列,IDEF1 及其變異體可以與IDE1結合,IDEF2及其變異體可以與IDE2結合。
如上所述本發(fā)明中所涉及的多肽,作為轉錄因子與很多的缺鐵應答基 因的上流區(qū)域中普遍存在的順式元件相結合,使得缺鐵誘導基因得以增強 表達。
此外,反過來說,本領域所屬技術人員可以容易地理解到,可以通過 與上述順式元件是否可能結合,來判斷任意多肽是否具有使植物耐缺鐵性 得以增強的活性。判斷任意多肽能否與上述順式元件結合,可以應用后述實施例中凝膠移位分析法,但不局限于此。
此外,如后述,本發(fā)明中所涉及的多肽,在缺鐵狀態(tài)下特異性的使缺 鐵誘導性基因增強表達。也就是說,本發(fā)明中涉及的多肽,在植物對缺鐵 狀態(tài)的應答中,控制著該應答相關基因表達的上流區(qū)域。
上述IDE1以及IDE2存在于缺鐵誘導性基因的啟動子區(qū)域近旁,協(xié)同 作用使得該基因強化表達(參考專利文獻l)。
從其它角度講,本發(fā)明提供了使植物耐缺鐵性得以增強的活性多肽的 生產(chǎn)方法。
在一實施方案中,本發(fā)明中所涉及的多肽的生產(chǎn)方法,以應用含有編 碼該多肽的多核苷酸的載體為特征。
在本實施方案的一個方面,本實施方案中所涉及的多肽的生產(chǎn)方法, 以上述載體在重組表達體系中被應用為優(yōu)選。重組表達體系中,將編碼本 發(fā)明多肽的多核苷酸導入重組表達載體后,可以采用如下方法用公知的 方法導入表達可能的宿主,然后精制在宿主內(nèi)翻譯得到的多肽。重組表達 載體,可以是質(zhì)?;虿皇琴|(zhì)粒,可以將目的多核苷酸導入宿主即可。本實 施方案中所涉及的多肽的生產(chǎn)方法,以包括將上述載體導入宿主的工序為 優(yōu)選。
如上所述,在將外源多核苷酸導入宿主時,為了使外源多核苷酸得以 表達,表達載體中含有在宿主內(nèi)作用的啟動子為優(yōu)選。精制轉基因所生產(chǎn) 的多肽的方法,根據(jù)其宿主,多肽性質(zhì)而異,但應用標識(tag)等可以比 較容易地精制目的多肽。
本實施方案中所涉及的多肽的生產(chǎn)方法,以包括從含有該多肽的細胞 或組織提取液中精制該多肽的工序為優(yōu)選。精制多肽的工序,以采用眾所 周知的方法(例如,將細胞或組織破壞后經(jīng)離心分離回收可溶性成分的方 法)從細胞或組織調(diào)制得到細胞提取液后,再從該細胞提取液中用眾所周 知的方法(例如,硫酸銨沉淀或乙醇沈殿,酸萃取,陰離子或陽離子交換 色譜,磷酸纖維素層析,疎水性相互作用色譜,親和層析,羥基磷灰石層 析,以及凝集素層析)進行精制的工序為優(yōu)選,但不局限于此。最理想是在精制過程中應用高效液相層析色譜([HPLC])。
在本實施方案的另一方面,本實施方案中所涉及的多肽的生產(chǎn)方法, 以將上述載體應用于無細胞蛋白合成體系為優(yōu)選。應用無細胞蛋白合成體 系時,可以用各種市場上出售的套件。本實施方案中多肽的生產(chǎn)方法,以 包括將上述載體與無細胞蛋白質(zhì)合成液共同培養(yǎng)的工序為優(yōu)選。
無細胞蛋白質(zhì)合成體系,是鑒定細胞內(nèi)mRNA與克隆得到的cDNA 編碼的多種蛋白質(zhì)時廣泛應用的手法,無細胞蛋白質(zhì)合成體系(也稱為無 細胞蛋白質(zhì)合成法,無細胞蛋白質(zhì)翻譯體系)中應用的是無細胞蛋白質(zhì)合 成液。
作為無細胞蛋白質(zhì)合成體系,可以舉例如下;小麥胚芽萃取液系,兔 網(wǎng)狀紅血球萃取液系,大腸菌S30萃取液系,以及從植物脫液胞化原生質(zhì) 體中得到的細胞成分萃取液等。 一般來說,真核生物由來基因翻譯時應用 真核細胞體系,也就是說,應用小麥細胞萃取液還是兔網(wǎng)狀紅血球萃取液, 根據(jù)被翻譯的基因的由來(真核生物/原核生物),以及合成后的蛋白質(zhì)的 使用目的,從上述合成體系中選擇即可。
另外,各種病毒由來的基因產(chǎn)物,在其翻譯之后,很多是經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng), 高爾基體等的細胞內(nèi)膜相關的復雜生物化學反應才使其活性得以表達,為
了使各種生物化學反應在試管內(nèi)得到再現(xiàn),需要添加細胞內(nèi)膜成分(例如 微粒體膜)。從植物脫液胞化原生質(zhì)體中得到的細胞成分萃取液,可以作 為保持了細胞內(nèi)膜成分的無細胞蛋白質(zhì)合成液來使用,不必添加微粒體 膜,因此較為優(yōu)選。
在本說明書中使用時,[細胞內(nèi)膜成分]指的是于細胞質(zhì)內(nèi)存在的由細 胞膜組成的細胞小體(指的是內(nèi)質(zhì)網(wǎng),高爾基體,線粒體,葉綠體,液泡 等所有細胞內(nèi)顆粒)。特別是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體在蛋白質(zhì)翻譯后的修飾過 程中起重要作用,是膜蛋白和分泌蛋白的成熟過程中所必需的細胞成分。
在其它實施方案中,本發(fā)明中所涉及的多肽的生產(chǎn)方法,以從天然表 達該多肽的細胞或組織中,精制得到該多肽為優(yōu)選。本實施方案中所涉及 的多肽的生產(chǎn)方法,以包括以下工序為優(yōu)選;應用后述抗體及寡核苷酸,
13鑒定將本發(fā)明中所涉及的多肽進行天然表法的細胞和組織。此外,本實施 方案中多肽的生產(chǎn)方法,以進一步包含將該多肽進行精制的工序為優(yōu)選。
在其他實施方案中,本發(fā)明中所涉及多肽的生產(chǎn)方法,以化學合成本 發(fā)明中所涉及的多肽為特征。本領域所屬技術人員可以容易地理解到,對 本說明書中記載的本發(fā)明中所涉及多肽的氨基酸序列,應用眾所周知的化 學合成技術,可以化學合成本發(fā)明中所涉及的多肽。
如上所述,應用本發(fā)明中所涉及的多肽的生產(chǎn)方法而得到的多肽,可 以是天然存在的變異多肽,也可以是人為制作的變異多肽。
本發(fā)明中所涉及的多肽的生產(chǎn)方法,至少是基于該多肽的氨基酸序 列,或基于編碼該多肽的多核苷酸的堿基序列,應用公知慣用技術既可。 也就是說有一點需要留意,既包括上述種種工序之外的工序的生產(chǎn)方法, 也屬于本發(fā)明的技術范圍內(nèi)。
(2:多核苷酸)
從一方面,本發(fā)明提供了編碼具有增強植物耐缺鐵性活性的多肽的基因。
在本說明書中使用時,用語[多核苷酸],可以與[基因],[核酸]或[核酸 分子]交換使用,指的是核苷酸的聚合體。在本說明書中使用時,用語[堿 基序列],可以與[核酸序列]或[核苷酸序列]交換使用,指的是脫氧核糖核 酸(省略為A、 G、 C以及T)序列。
本發(fā)明中所涉及的多核苷酸,以編碼本發(fā)明中所涉及的多肽為優(yōu)選。 得到了特定的多肽氨基酸序列時,可以容易地設計編碼該多肽的多核苷酸 的堿基序列。
本發(fā)明的涉及多核苷酸,以序列號2, 5或8中任一所示的堿基序列 所構成的多核苷酸及其變異體為優(yōu)選。
本說明書中對于多核苷酸使用時,用語[變異體],指的是編碼與特定 活性多肽具有相同活性的多肽的多核苷酸,[序列號2, 5或8中任一所示的堿基序列所構成的多核苷酸的變異體],指的是編碼增強植物耐缺鐵性活 性多肽的多核苷酸。也就是說,在本說明書中使用的時候,多核苷酸觀點 上所謂的變異體,使指編碼增強植物耐缺鐵性的活性多肽的多核苷酸,可 以是
1. 序列號2, 5或8中任一所示的堿基序列,其中一個或數(shù)個堿基被 取代,缺失,或附加的堿基序列所構成的多核苷酸;
2. 與序列號2, 5或8中任一所示的堿基序列的互補序列,在嚴格條 件下可雜交的多核苷酸;或
3. 序列號2所示的堿基序列,其第727 1063號氨基酸被序列號11, 14, 17, 20, 23, 26或29中任一所示的堿基序列所取代的堿基序列所構 成的多核苷酸。
序列號2所示堿基序列,其第727 1063號氨基酸,被序列號ll, 14, 17, 20, 23, 26或29中任一所示的堿基序列所取代的堿基序列所組 成的多核苷酸,是編碼上述序列號l所示的氨基酸序列,其第243 355 號氨基酸被序列號IO, 13, 16, 19, 22, 25或28中任一所示的氨基酸序 列所取代的氨基酸序列所構成的嵌合多肽的嵌合多核苷酸。本領域所屬技 術人員可以容易地理解到,應用已知和慣用的技術,可以容易的得到上述 嵌合多核苷酸。
本發(fā)明中所涉及的多核苷酸,可以以RNA (例如mRNA)的形態(tài), 或DNA的形態(tài)存在(例如cDNA或基因組DNA)。 DNA可以雙鏈或單鏈 形式存在。單鏈DNA或RNA、可以是編碼鏈(也稱為有義鏈),或非編 碼連(也稱為非有義鏈)。
在本說明書中,用語[寡核苷酸],指的是數(shù)個或數(shù)十個核苷酸結合而 成,可與[多核苷酸]交換使用。在寡核苷酸中,短的指二核苷酸(二聚體), 三核苷酸(三聚體),長的指為30聚體或100聚體等的核苷酸聚合物。寡 核苷酸可以是長的多核苷酸的斷片,也可以是化學合成得到的。
本發(fā)明中所涉及的多核苷酸,其5,端或3,端可以與編碼上述標記 標識(標記序列或?qū)Ρ任镄蛄?的多核苷酸相融合。
15雜交,可以通過Sambrook在Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2dEd., Cold Spring Harbor Laboratory(l989)中記載的方法,用眾所周知的 方法實現(xiàn)。通常溫度越高,鹽濃度越低嚴格度越高(難以雜交),更容易 取得相同的多核苷酸。合適的雜交溫度,根據(jù)堿基序列以及堿基序列長度 而異,例如,將編碼6個氨基酸的18個堿基構成的DNA片段作為探針使 用時,以5(TC以下的溫度為宜。
在本說明書中使用時,用語[嚴格的雜交條件],指的是在雜交液(含 有50%甲酰胺,5XSSC(150mMNACl, 15mM擰檬酸三鈉),50mM磷酸鈉 (pH7.6), 5XDenhardts溶液,10%硫酸葡聚糖,以及20 " g/ml的変性剪斷 鮭精子DNA)中,42。C下培養(yǎng)一晚后,在約65。C下在0.1XSSC中進行濾 膜洗滌。與多核苷酸的[一部分]雜交的多核苷酸,與參照物的多核苷酸之 間,至少要有約15個核苷酸,以至少有約20nt以上為優(yōu)選,至少有約30nt 以上為進一步理想,比約30nt更長的多核苷酸雜交為更加理想。如上所述, 與多核苷酸的[一部分]雜交的多核苷酸(寡核苷酸),在說明書中可以作為 詳細考察的檢測用探針使用。
如上所述,本發(fā)明中所涉及的多核苷酸,指的是編碼增強植物耐缺鐵 性活性多肽的多核苷酸,以下述任一為優(yōu)選;
U)序列號2, 5,或8中任一所示的堿基序列所構成的多核苷酸;
(2) 序列號2, 5,或8中任一所示的堿基序列中, 一個或數(shù)個堿基被取 代,缺失,或附加的堿基序列所構成的多核苷酸;
(3) 與在序列號2, 5或8中任一所示的堿基序列中的一個或數(shù)個堿基被 取代,缺失,或附加的堿基序列的互補序列所構成的多核苷酸,在嚴格條 件下可雜交的多核苷酸;或是
(4) 序列號2所示的堿基序列的第727 1063號氨基酸,被序列號11, 14, 17, 20, 23, 26或29其中之一的堿基序列所取代的,堿基序列所構 成的多核苷酸。
本發(fā)明中涉及多核苷酸,可以含有非翻譯區(qū)域(UTR)序列或載體序 列(包括表達載體序列)。本發(fā)明中所涉及的多核苷酸的供給源,不被特殊限定,以生物材料為 優(yōu)選。在本說明書中使用時,用語[生物材料],指生物學樣本(從生物體 內(nèi)得到的組織樣本或細胞樣本),在下述實施例中用的是禾本科植物,但 不局限于此。
本發(fā)明提供了含有編碼具有增強植物耐缺鐵性活性的多肽的多核苷 酸的載體。
本發(fā)明中所涉及的載體,可以通過應用眾所周知的基因重組技術,將 本發(fā)明中所涉及的多核苷酸插入特定載體制作而得。上述載體,可以以重 組表達載體以及克隆載體為例,但不局限于此。本發(fā)明中所涉及的載體, 可以用于制作本發(fā)明中所涉及的多肽,也可以用于制作本發(fā)明中所涉及的 轉化體。
本發(fā)明提供了耐缺鐵性得以增強的植物的制作方法。[耐缺鐵性得以增 強的植物的制作方法],指的是制作耐缺鐵性得以增強的植物體的方法。本 發(fā)明中所涉及的耐缺鐵性得以增強的植物的制作方法,包括將本發(fā)明中所 涉及的多核苷酸導入植物體內(nèi)的工序既可。在某實施方案中,本發(fā)明中涉 及的耐缺鐵性得以增強的植物的制作方法,包括了含有將沒有表達本發(fā)明 中涉及的多核苷酸的植物體,與本發(fā)明中涉及的多核苷酸得以表達的植物 體進行交配的工序的制作方法,這是制作非轉化體的植物體的理想方法。
在其他實施方案中,本發(fā)明中所涉及的耐缺鐵性得以增強的植物的制
作方法,是包括以下工序的方法將含有本發(fā)明中所涉及多肽的重組載體, 導入植物,使得由此多核苷酸編碼的多肽得以表達。通過本實施方案所涉 及的方法所制作的耐缺鐵性得以增強的植物,可以是植物轉化體。
應用重組表達載體時,在植物的轉化過程中所用的載體,只要是在植 物體中,使得本發(fā)明中所涉及的多核苷酸得以表達的載體既可,不被局限。這樣的載體,例如,含有在植物細胞內(nèi)使多核苷酸得以構成性表達的啟動
子(例如花椰菜花葉病毒組3 5 S啟動子)的載體,或含有經(jīng)外界刺激后 被誘導激活的啟動子的載體。如后述,與被恒定激活的啟動子相比,應用 對缺鐵狀態(tài)進行應答的啟動子較為優(yōu)選。對缺鐵狀態(tài)應答而被激活的啟動 子,可以應用例如I D S 2啟動子(序列號6 8 、可以參考Kobayashi, T. et al . Construction of artificial promoters highly responsive to iron deficiency. Soil Sci. Plant Nutr. 50, 1167-1175(2004))。
本發(fā)明中轉化對象的植物,指植物體整體,植物器官(葉,花蕊、莖、 根、種子等),植物組織(例如表皮,柔組織、木部、維管束、柵狀組織、 海面組織等)或植物培養(yǎng)細胞,或各種形態(tài)的植物細胞(例如懸涿培養(yǎng)細 胞),原生質(zhì)體,葉部切片,愈傷組織。用作轉化體的植物,不被局限, 但以禾本科植物為優(yōu)選,以水稻,大麥,小麥或玉米為更加理想。
將基因?qū)胫参?,可以應用本領域所屬技術人員公知的轉化法(例如 農(nóng)桿菌法,基因槍法,PEG法、電穿孔法等),可以分為通過農(nóng)桿菌介入 的方法和直接導入植物細胞的方法。采用農(nóng)桿菌法時,將構建的植物用表 達載體導入適當?shù)哪摋U菌(例如根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)), 將此菌株用LeafDesk法(參考內(nèi)宮博文著、植物遺伝子操作手冊(1990)27 31頁,講談社科學出版,東京)感染無菌培養(yǎng)葉片,從而得到轉化植物。 此外,可以采用Nagel們的方法(Micribiol. Lett. 、 67、 325(1990))。此方 法首先將表達載體導入農(nóng)桿菌,接著將轉化得到的農(nóng)桿菌用PlantMolecular Biology Manual (S. B. Gelvin們、Academic Press Publishers)所記載的 方法導入植物細胞或植物組織。在此,[植物組織],包括通過植物細胞培 養(yǎng)得到的愈傷組織。應用農(nóng)桿菌法進行轉化時,可以使用pBI系并行載體。 (例如pBIG、 pBIN19、 pBIlOl、 pBI121、 pBI221、及pPZP202等。)
此外,作為將基因直接導入植物細胞或植物組織的方法,電穿孔法, 基因槍法是已知的。采用基因搶時,作為基因?qū)氲膶ο螅梢灾苯邮褂?植物體,植物器官,植物組織,也可將切片調(diào)制后使用,或者調(diào)制原生質(zhì) 體。經(jīng)此調(diào)制的樣本可以用基因?qū)胙b置(例如PDS-1000(BIO-RAD公司) 等)來處理。處理條件因植物或樣品而異,通常在壓力范圍450 2000psi、距離范圍4 12cm的條件下進行。
基因被導入的細胞或植物組織,首先經(jīng)潮霉素等的藥物耐性選擇,接 下來用規(guī)定方法再生于植物體。從轉化細胞到植物體的再生,可以根據(jù)植 物細胞的種類應用該領域所屬技術人員公知的方法來進行。選擇用參照 物,不局限于潮霉素耐性,可以舉例為對博來霉素,卡那霉素,慶大霉素, 氯霉素等的藥物耐受性。
用植物培養(yǎng)細胞作為宿主時,可以通過例如顯微注射法,電穿孔法, 聚乙二醇法,基因槍(粒子槍)法,原生質(zhì)體融合法,磷酸鈣法等,將重 組載體導入培養(yǎng)細胞來完成轉化。作為轉化的結果得到的胼胝體,莖葉
(shoot)、毛狀根等,可以直接用于細胞培養(yǎng),組織培養(yǎng),或器官培養(yǎng), 或用已知的植物組織培養(yǎng)法,通過加入適當植物激素(植物生長素(如吲 哚乙酸),細胞激動素,赤霉素,脫落酸,乙烯,黃銅質(zhì))使其再生于植 物體。
確認基因是否被導入了植物,可以通過PCR法,Southen雜交法, Northen雜交法等。例如通過轉化植物來調(diào)制DNA,設計DNA特異性引 物后進行PCR操作。PCR可以通過與調(diào)制前述質(zhì)粒時使用的相同條件來 進行。之后,增幅產(chǎn)物可以通過瓊脂糖凝膠電泳,聚丙烯下酰胺電泳,或 毛細管電泳后,由溴化乙錠,SYBR Green液體染色,檢測出一條增幅產(chǎn) 物帶,從而確認轉化成功。此外,可以應用預先被熒光色素等標記的引物 進行PCR操作,來檢測增幅產(chǎn)物。此外,可以采用將增幅產(chǎn)物結合在固相 微型板(microplate)上,通過熒光或酶反應來確認增幅產(chǎn)物的方法。
一旦獲得將本發(fā)明中所涉及的多核苷酸導入基因組內(nèi)的轉化植物,就 可以通過該植物的有性繁殖或無形繁殖而得到后代植物。該植物及其后代 植物,或這些的克隆體,例如種子,果實,切穂(cut-spike)、塊莖、塊根、 根部、胼胝體、原生質(zhì)體等,以此為基礎量產(chǎn)該植物體。也就是說,本發(fā) 明中包含了本發(fā)明涉及的多核苷酸得以表達的植物體,或與此植物體有同 一性質(zhì)的該植物的后代植物,或由此而得到的組織。
此外,本發(fā)明提供了耐缺鐵性得以增強的植物的制作用組合物以及套 件。本發(fā)明中所涉及的耐缺鐵性得以增強的植物的制作組合物,以含有本
19發(fā)明中所涉及的多核苷酸或載體為特征。本發(fā)明中所涉及的耐缺鐵性得以 增強的植物的制作用套件,以含有本發(fā)明中所涉及的多核苷酸或載體為特 征。在本說明書中使用時,[組合物],指各種成分被包含在同一物質(zhì)中的 狀態(tài),[套件],指各種成分中至少有1種,被包含在其他物質(zhì)中的狀態(tài)。[耐 缺鐵性得以增強的植物的制作用組合物],指的是為了制作耐缺鐵性得以增 強的植物體時所用的組合物,[耐缺鐵性得以增強的植物的制作用套件], 指的是為了制作耐缺鐵性得以增強的植物體時所用的套件。
本發(fā)明中所涉及的轉化體,因為己將本發(fā)明所涉及的多核苷酸導入其 基因組,本發(fā)明中所涉及的多核苷酸得以表達,耐缺鐵性得以增強。如上 所述,應用本發(fā)明涉及多核苷酸或載體,可以將本發(fā)明中所涉及的多核苷 酸導入植物體。因此含有本發(fā)明中所涉及的多核苷酸或載體的組合物,或 含有本發(fā)明中所涉及的多核苷酸或載體的套件,適用于制作耐缺鐵性得以
增強的植物。也就是說,本發(fā)明中所涉及的耐缺鐵性得以增強的植物制作 用組合物,或耐缺鐵性得以增強的植物制作用套件,在某一實施方案中如 上所述,可以在將本發(fā)明中所涉及的多核苷酸或載體導入植物體的方法 中,作為該多核苷酸或載體的供給源。
本發(fā)明中耐缺鐵性得以增強的植物的制作用組合物中,除了含有本發(fā) 明中所涉及的多核苷酸或載體,還可以含有溶劑,分散劑,試劑等。此外, 本發(fā)明中所涉及的耐缺鐵性得以增強的植物制作用套件,除了備有本發(fā)明 中所涉及的多核苷酸或載體,還可以含有溶劑,分散劑,試劑,以及使用 說明書等。在本說明書中對于套件使用時,[備有]指的是,被包含在構成 套件的各個容器(例如瓶,板,管,皿等)中任何一個容器內(nèi)的狀態(tài)。此 外,本發(fā)明中的套件,可以是將復數(shù)個組合物包在一個包裝內(nèi),在此組合 物的形態(tài)可以是上述形態(tài),溶液形態(tài)時可以被裝在容器中。本發(fā)明中所涉
及的套件,可以將物質(zhì)A及物質(zhì)B在同一容器內(nèi)混合,也可以分別放在各 自容器中。[使用說明書],可以書寫或印刷在紙或其他介質(zhì)上,或是磁帶, 或可經(jīng)電腦讀取的磁盤,磁帶或CD—ROM等電子介質(zhì)也可以。本發(fā)明中 所涉及的套件,可以備有裝有稀釋劑,容劑,洗滌劑或其他試劑的容器。[5 :抗體]
本發(fā)明提供了可以與增強植物耐缺鐵性活性的多肽特異性結合的抗 體。本發(fā)明中所涉及的抗體,是可以與上述多肽特異性結合的抗體即可, 不被局限??梢允窃摱嚯牡亩嗫寺】贵w,但以該多肽的單克隆抗體為優(yōu)選。 單克隆抗體具有形質(zhì)均一,容易供給,作為雜交瘤容易半永久性保存的優(yōu) 點。
在本說明書中使用時,用語[抗體],指免疫球蛋白(IgA、 IgD、 IgE、 IgG、 IgM以及這些免疫球蛋白的Fab片段、F(ab、)片段,F(xiàn)c片段)。可以 舉例為多克隆抗體,單克隆抗體,單鏈抗體,以及抗獨特型抗體,但不局 限于此。可以通過多種公知的方法進行制作。例如,單克隆抗體可以通 過該領域公知技術(例如,雜交瘤法(K o h 1 e r , G.及M i 1 s t ein, C., Nature256, 495 — 497 (1975))、 三瘤體法、人類B —細胞雜交瘤法(K o z b o r , Immu n o 1 o g yToday4,72(1983 ))以及E B V—雜交瘤法(可參 考M onoclonalAntibodiesand Cancer Therapy, AlanRLiss, Inc., 77 — 96(1 9 8 5 ))等)可以很容易地制作。
此外,多肽抗體,采用該領域公知的辦法,(例如Chow, M.們, Proc. Natl. Acad. Sci. USA82: 910 — 91 4 ;以及B i t t 1 e , F. J .們,J. Gen. Virol. 66: 2347 — 2354 (1985)(在本說明書中沿用))可以很容易地得 到。
Fa b, F (a b,) 2以及本發(fā)明中所涉及的其他抗體片斷,通過本 說明書中解釋的方法可以使用,這在本領域所屬技術人員中是不言而明 的。這樣的片段中,代表性的有,木瓜蛋白酶(產(chǎn)生F a b片段)以及為 蛋白酶(產(chǎn)生F (a b,) 2片段)等的酶,可以通過蛋白質(zhì)降解得到?;?與本發(fā)明所涉及的多肽結合的片段,可以通過DNA重組技術或化學合成 得到。如上所述,本實施方案中的抗體,具有與本發(fā)明中所涉及的多肽特異
性結合的片段(例如F a b片段以及F (a b') 2片段)即可,讀者應該 留意到,由不同抗體分子的F c片段所組成的免疫球蛋白也被包括在內(nèi)。
也就是說,本發(fā)明的目的在于提供與本發(fā)明中所涉及的多肽特異性結 合的抗體以及其應用,不依存于本發(fā)明書具體記載的各個免疫球蛋白的種 類(I g A、 I g D、 I g E、 I gG或I gM),或抗體制作方法。因
此讀者應該留意到,經(jīng)上述以外的方法所取得的抗體也屬于本發(fā)明的范圍 內(nèi)。
本發(fā)明提供了耐缺鐵性得以增強的植物的育種方法。本發(fā)明中所涉及 的耐缺鐵性得以增強的植物的育種方法,包括在植物體內(nèi)表達的本發(fā)明所 涉及的多肽的檢測工序即可,是通過本發(fā)明中所涉及多肽的表達的有無, 來選拔具有強耐缺鐵性的植物。
如上所述,本發(fā)明中的多肽,使在植物從土壤中獲得鐵的過程中,起 重要作用的基因強化表達。因此,上述多肽得以表達的植物獲得鐵的能力 高,耐缺鐵性得以增強。依據(jù)本發(fā)明中涉及的方法育種的植物體,可以是 天然植物體,也可以是轉化體。
在某一實施方案中,本發(fā)明中所涉及的耐缺鐵性得以增強的植物的育 種方法,包括從植物提取物中檢測本發(fā)明中所涉及的多肽的工序。
植物提取物,可以通過使用液氮的冷凍斷裂法,或市場上出售的套件 來制備,但不局限于此。此說明書中使用時,用語[提取物],可以是粗略 提純品或經(jīng)過幾個精制工序的標準可靠樣品。
在某種情況下,將上述植物提取物中含有的本發(fā)明中所涉及的多肽的 檢測工序中,通過將此植物的提取物與本發(fā)明中所涉及的抗體發(fā)生反應, 來檢測本發(fā)明中所涉及的多肽。上述抗體,與本發(fā)明中所涉及的多肽進行 特異性結合而形成免疫復合體,通過檢測該免疫復合體,可以很容易檢測 出在植物體內(nèi)表達的多肽。上述復合體的形成,可以利用例如將上述抗體
22預先用同位素標記的方法,或?qū)ι鲜隹贵w應用二次抗體來進行檢測。具體
講可以用Western印記法,蛋白芯片法等,但不局限于此。
此外,如上所述,本發(fā)明中所涉及的抗體適用于本發(fā)明耐缺鐵性得以 增強的植物的育種方法。因此,含有本發(fā)明中所涉及的抗體的組合物或套 件,適用于鐵缺乏性得以增強的植物的育種。
在其他實施方案中,本發(fā)明中所涉及的植物的育種方法包括對植物提 取物中所含有的本發(fā)明中所涉及的多肽的檢測工序。
在某種情況下,上述植物提取物中所含有的本發(fā)明中所涉及的多核苷 酸的檢測工序中,是包括將本發(fā)明中所涉及的多核苷酸的片段及其互補序 列所構成的寡核苷酸,與該植物提取物共同培養(yǎng)的工序的。理想狀態(tài)下, 本實施方案中所涉及的育種方法,以包括將植物提取物與目標植物由來的 基因組DNA, mRNA,或mRNA相對應的cDNA相雜交的工序為特征。
應用本實施方案中所涉及的育種方法,通過檢測雜交的目標多核苷 酸,可以容易地檢測出使植物耐缺鐵性得以增強的活性多肽得以表達的植 物體。此外如上所述,本發(fā)明中所涉及的多肽,在植物體對缺鐵狀態(tài)的應 答中起重要作用。因此本領域中所屬技術人員,應該可以容易地理解,上 述多肽的氨基酸序列的微小變異,可能影響植物的耐缺鐵性。本領域中所 屬技術人員可以容易地理解,應用PCR法,雜交法,以及微序列法 (microarray)等的已知慣用技術,可以檢測出多核苷酸中某一件堿基單位 的變異,從而可以檢測出該多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列中微小的變 異。因此在某種情況下,通過應用本實施方案中植物的育種方法,可以影 響植物的耐缺鐵性,通過上述多肽氨基酸序列的微小變異,可以育種耐缺 鐵性得以增強的植物。
此外,如上所述,本發(fā)明中涉及的多核苷酸,適合應用于本發(fā)明中所 涉及的耐缺鐵性得以增強的植物的育種方法中。因此,含有本發(fā)明中所涉 及的多核苷酸的組合物,以及備有該多核苷酸的套件,適合應用于育種耐 缺鐵性得以增強的植物。
此外,如下所述,序列號12, 15, 18, 21, 24或27中任一所示的堿基序列,是編碼本發(fā)明中所涉及多肽的同系物(圖18所示大麥(Barleyl、 Barley2)、小麥(Wheat)、玉米(Maize)、高粱(Sorghum )、甘蔗(Sugaecane )、 以及水稻(AK072874))的多核苷酸的部分序列。上述同系物中,功能結 構域相同性高,與本發(fā)明中所涉及的多肽具有相同功能的可能性大。通過 應用序列號12, 15, 18, 21, 24或27中任一所示的堿基序列,可以檢測 出本發(fā)明中所涉及的多肽同系物在植物體中是否得以表達,與應用上述本 發(fā)明所涉及多肽時一樣,可以容易地檢測出使植物耐缺鐵性得以增強的活 性多肽得以表達的植物體。
在本說明書中使用時,用語[寡核苷酸],是指數(shù)個,數(shù)十個或數(shù)百個 核苷酸聚合而成,可與[多核苷酸]交換使用。寡核苷酸中,短的指二核苷 酸(二聚體),三核苷酸(三聚體),長的有30聚體(也稱為30堿基,30 核苷酸。)或100聚體(也稱為100堿基,100核苷酸。)等的核苷酸聚合 物。寡核苷酸可以是更長的多核苷酸的片斷,也可以是化學合成得到。
本實施方案中所涉及的育種方法中所用到的寡核苷酸,可以作為為得 到本發(fā)明中涉及的多核苷酸或其片段時使用的PCR引物或雜交探針使用。
本領域所屬技術人員可以容易地理解,上述的所有用途,均源于本實 施方案中所涉及的育種方法中所使用的寡核苷酸和目標基因(多核苷酸) 之間的雜交,該寡核苷酸用于與目標基因(多核苷酸)進行雜交。
本發(fā)明中涉及的多核苷酸的片斷,至少是7nt(核苷酸),10nt、 12nt, 以約15nt為優(yōu)選,以至少約20nt為進一步理想,以至少約30nt為更加理 想,以至少約40nt的片段為最為理想,該領域所屬技術人員可以依據(jù)上述 用途設定適當長的長度。[至少約20nt長的片斷],指的是含有例如由序列 號2, 5, 8, 12, 15, 18, 21, 24或27中任一所示的堿基序列所組成的 20以上的連續(xù)堿基序列,或其互補序列的片段。參考本說明書即可得知序 列號2, 5, 8, 12, 15, 18, 21, 24或27之一所示的堿基序列,本領域 所屬技術人員可以容易的制作出序列號2, 5, 8, 12, 15, 18, 21, 24或 27中任一所示的DNA片段。例如使用限制性內(nèi)切酶切開或者使用超聲波 剪斷,可以容易地制作各種大小的片斷。這些片斷也可以通過合成得到。 適當?shù)钠瑪?寡核苷酸),可以通過Applied Biosystems Incorporated(ABI,850 Lincoln Center Dr. , Foster City, CA 94404)392型合成儀等進行合成。
本實施方案中所涉及的育種方法中使用的寡核苷酸,不只包括雙鏈 DNA,也包括構成雙鏈DNA的有義鏈或無義鏈等的單鏈DNA,以及RNA。 上述寡核苷酸,可以用于反義RNA機制基因表達操作的工具。通過反義 RNA技術的使用,內(nèi)源性基因由來的基因產(chǎn)物會減少。通過導入上述寡核 苷酸,可以使本發(fā)明中所涉及的多肽含量下降,從而控制植物的耐缺鐵性。
如上所述,將本實施方案中所涉及的育種方法中所用的寡核苷酸,作 為檢測編碼使植物耐缺鐵性得以增強的活性多肽的多核苷酸的檢測用雜 交探針,或是做為使該多核苷酸增幅的引物,可以容易地檢測出該活性多 肽得以表達的植物體或組織。此外,將上述寡核苷酸作為反義寡核苷酸使 用,可以控制植物體或植物組織或細胞中,使植物耐缺鐵性得以增強的活 性多肽的表達過程。
本發(fā)明提供了編碼增強植物耐缺鐵性的活性多肽的多核苷酸的檢測 方法。
本發(fā)明中所涉及的檢測方法,包括將候補多核苷酸,與序列號12, 15, 18, 21, 24或27中任一所示的堿基序列所構成的第2多核苷酸相進行雜 交的工序。
用語[候補多核苷酸],指的是編碼使植物耐缺鐵性得以增強的活性多 肽的多核苷酸的候補。上述候補多核苷酸,以構成cDNA文庫的cDNA為 優(yōu)選。
序列號12, 15, 18, 21, 24或27中任一所示堿基序列,如下所述, 是編碼本發(fā)明中所涉及的多肽同系物的多核苷酸的部分序列。因此第2多 核苷酸,與編碼上述同系物的多核苷酸特異性雜交。因此,通過將候補多 核苷酸與第2多核苷酸雜交,檢測該特異性雜交,可以檢測出編碼上述同 系物的多核苷酸。特異性的雜交,可以通過已知慣用的雙鏈DNA的檢測 手段來檢測,或?qū)⒌?多核苷酸預先用放射性同位素,熒光色素等標記,來進行檢測。
在此,上述同系物如上所述,與本發(fā)明中所涉及的多肽相同性高,具 有同一功能的可能性高。也就是說,上述同系物是能使植物耐缺鐵性得以 增強的多肽的可能性大。因此,應用本發(fā)明中的檢測方法,可以檢測出編 碼使植物耐缺鐵性得以增強的多肽的多核苷酸。
具體來講,將第2多核苷酸作為探針,將cDNA文庫應用已知慣用技 術進行篩選。例如,將上述多核苷酸作為探針,在將上述文庫的cDNA被 轉錄的膜上進行雜交,檢測出目標cDNA。
作為cDNA文庫,例如在以序列號11或26所示的堿基序列所構成的 多核苷酸作為探針的篩選過程中,使用從大麥調(diào)制而得的cDNA文庫;在 以序列號14所示的堿基序列構成的多核苷酸作為探針的篩選過程中,使 用從小麥調(diào)制而得的cDNA文庫;在以序列號17所示的堿基序列構成的 多核苷酸作為探針的篩選過程中,使用從玉米調(diào)制而得的cDNA文庫;在 以序列號20所示的堿基序列構成的多核苷酸作為探針的篩選過程中,使 用從高粱調(diào)制而得的cDNA文庫;在以序列號23所示的堿基序列組成的 多核苷酸作為探針的篩選過程中,使用從甘蔗調(diào)制而得的cDNA文庫;但 不局限于此。應用上述植物的近親種(dliedspecies)所調(diào)制的cDNA文庫 也可以。此外,文庫以從缺鐵狀態(tài)下在跟部中得以表達的mRNA調(diào)制為優(yōu) 選,但不局限于此。cDNA文庫的制作方法,可以參考例如Suzuki, M. etal. Plant J. 8, 85-97(2006)。
本發(fā)明不局限于上述各個實施方案,在權利請求范圍內(nèi)可以有種種變 化,在不同的實施方案中所開示的各種技術手段適當組合而得到的實施方 案也被包括在本發(fā)明技術范圍內(nèi)。
此外,本說明書中記載的所有學術文獻和專利文獻,在本說明書中得 以沿用,作為參考。
以下應用實施例將本發(fā)明進行具體說明,但本發(fā)明不局限于這些實施 例。沒有特殊記載的時候,應用了眾所周知的基因操作技術。 26[實施例]
本發(fā)明人為了鑒定與IDE1相結合的轉錄因子,應用了單雜交篩選法 (參考one — hybridscreening 、 Li , I., J. a ndHerskowitz, I.: Science, 262: 18 70 — 1874, 1993 ),但沒能鑒定成功該轉錄因子。
原因如下;首先,將IDE1反復而得的報道基因?qū)虢湍?YM4 2 7 1)后,酵母生育受阻,轉化率降到通常情況的10分之1左右。因此, IDEF1的表達量很少。也就是說IDEF1的分離精致,必須在IDEF1表達量 小,篩選量龐大,轉化率低,酵母生育受阻的條件下進行。將酵母菌株改 為Y 1 8 7,通常是應將報道基因?qū)牒髮⒑蜓a因子導入。通過將報道基 因和候補因子同時導入酵母,酵母的生長效率和轉化率得到了若干改善, 但最終沒能鑒定上述轉錄因子。
在這種情況下,本發(fā)明人對OsNAATl (水稻的煙酰胺氨基轉移 酶)、OsNASl、 OsNAS2 (兩者均為水稻的煙酰胺合成酶)、H vNAAT — A (大麥的煙酰胺氨基轉移酶)、HvNASl (大麥的煙 酰胺合成酶)、I D S 3等的已知的缺鐵誘導性基因的啟動子區(qū)域中存在 的各種IDE1狀序列進行了潛心研究。根據(jù)本法明人獨特的觀點,注目于
0 s NA AT 1以及O s NAS 2近旁區(qū)域的IDE1狀序列中存在的標準 S p h基元(TCCATGCAT、序列號3 6) / R Y元件(C A T G C A、序列號3 7 )(參考圖1)。在圖1中,對標準S p h基元與R Y元 件相一致的部分以實線標記,不同的部分以點線標記。
標準S p h基元/ RY元件,是屬于植物特異性AB I 3 /VP l家 族轉錄因子B3DNA結合結構域所識別的序列。上述家族轉錄因子中,玉 米的V IVIPAROUS (VP1)以及擬南芥(Ambidopsis)的脫落 酸非感受性3(ABI3:Abscisicacid insens
1 t i v e 3),被定位為脫落酸信號傳達,種子成熟的過程中促進各種 基因轉錄的多結構域轉錄因子。此外,0 s V P 1是水稻中玉米V P 1的 功能性直向同源體,水稻中唯一一個有AB I 3 /VP l家族特征的基因(參考圖2)。圖2中的各個基因,以水稻全長cDNA數(shù)據(jù)庫(K 0 M E )接受號(Accession號)、T I G R L O C番號、或擬南芥基因組開始號表示。此外,用帶狀圖來顯示了與距離相對應的氨基酸殘基的變化率。
本發(fā)明人基于O s VP 1的B 3結構域相同性進行了數(shù)據(jù)庫檢索,找到了與IDE1 (ATCAAGCATGCTTCTTGC,序列號3 0 )相結合的轉錄因子的5個候補蛋白質(zhì)(AK107456、 AK072874、 AK109920、 AK101356 (以上為水稻全長cDNA數(shù)據(jù)庫(KOME)接受號(Accession號))、以及O s 0 4 g —5 8 0 1 0(TIGR L 0 C號)。參考圖2)。對于這些候補蛋白,為了確認體內(nèi)以及體外環(huán)境下IDE1的結合性,進行了酵母結合分析與凝膠移位分析(EMS A)。
圖14顯示了在酵母結合分析中用到的報道基因以及效應質(zhì)粒的模式圖。如圖14所示,以4種反復I D E順式元件(IDE1X 3 (序列號3 8 )、IDE2—IDE1X 2 (序列號3 9 )、以及IDE2X 3 (序列號4 0 ))作為誘餌序列、與pLacZi載體(Clontech)的l a c Z基因相融合,作為報道基因使用。
此外,用以下序列所組成的引物取得了 IDEF1的候補蛋白質(zhì)的O R F :對于O s VP 1 ,序列號4 2 (正相)以及序列號4 3 (反相);對于AK 1 0 7 4 5 6 ,序列號4 4 (正相)以及序列號4 5 (反相);對于AK 0 7 2 8 7 4 ,序列號4 6 (正相)以及序列號4 7 (反相);對于AK 1 0 9 9 2 0 ,序列號4 8 (正相)以及序列號4 9 (反相);對于AK 1 0 1 3 5 6 ,序列號5 0 (正相)以及序列號5 1 (反相)。接下來,使各個ORF結合于pGAD 4 2 4質(zhì)粒的酵母ADH 1啟動子下流,與酵母G A L 4活性化結構域(G A L 4 A D)框架內(nèi)融合,作為效應子。此外,應用p G A D 4 2 4作為載體控制(V C )。
接下來,將上述質(zhì)粒按照制作者的指示導入酵母(Saccharomycescerevisiae strain YM4271、 Clontech)澳!)定了L a c Z活性。
將分別包含IDEF1各個候補蛋白質(zhì)的效應子,和以IDE1X 3作為誘餌序列的報道基因,共同導入酵母細胞;圖3顯示了酵母細胞中的半乳糖
28苷酶活性単位(平均士標準偏差;n=5)。圖3也顯示了,與載體控制(p G AD)之間的t —檢驗(*P< 0 . 0 5 =所解析的有義差。如圖3所示,只有AK 1 0 7 4 5 6實質(zhì)上誘導了L a c Z的活性。此后,在本說明書中,將A K 1 0 7 4 5 6稱作IDEF1 (IDE — binding Factor 1)。 OsVPl, AK072874, AK109920以及AK 1 0 1 3 5 6沒有誘導L a c Z活性(圖3 )。此外,采用IDE2—IDE1X 2作為誘館序列的報道基因時,也可得到與上述相同的結果。
對于IDEF1,將氨基酸序列顯示在序列號l中,ORF堿基序列顯示在序列號2中,cDNA堿基序列顯示在序列號3中。
接下來,為了進行凝膠移位分析進行了如下操作。首先,應用以下序列所構成的引物,取得了含有各個候補蛋白的候B 3 DNA結合結構域的部分ORF: 0 s VP l的第5 0 l號 第7 2 6號氨基酸中、序列號5
2 (正相)以及序列號5 3 (反相);AK1 07456的第141 第
3 6 2氨基酸中、序列號5 4 (正相)以及序列號5 5 (反相);AK072874的第151 第433氨基酸中、序列號5 6 (正相)以及序列號5 7 (反相);AK109920的第1 第28 9氨基酸中、序列號5 8 (正相)以及序列號5 9 (反相);AK101356的第287 6 7 2氨基酸中、序列號6 0 (正相)以及序列號6 1 (反相)。然后將部分O R F ,插入pMAL—c2(NewEngland Biola b s )中,使其與麥芽糖結合蛋白質(zhì)(MBP)基因在框架內(nèi)得以融合。應用得到得質(zhì)粒,依照制作者得指示制造了候補蛋白與MB P的融合蛋白。將得到的融合蛋白,與含有IDE1兩次反復串聯(lián)的堿基序列(序列號3 9)所組成的標記探針共同培養(yǎng),進行了凝膠移位分析(EMSA)。
圖4顯示了凝膠移位分析的結果。如圖4所示,IDEF1與AK0 7 28 7 4蛋白質(zhì),與IDE1發(fā)生了特異性結合。 一方面,O s V P 1 、 A K1 0 9 9 2 0以及AK 1 0 1 3 5 6未顯現(xiàn)與IDE1特異性結合(圖4)。
為了確認IDEF1以及AK 0 7 2 8 7 4的正確的認識序列,應用變異IDE1序列進行了拮抗試驗。具體來說,圖1所示的含有被改變的IDE1序列(I D Em 1 m 6 7 )的位標記多核苷酸作為拮抗劑,進行30倍量過量添加,如上所述進行了凝膠移位分析,結果如圖5所示。
根據(jù)以上拮抗試驗的結果,清楚認識到IDEF1以及AK 0 7 2 8 7 4,對IDE1中存在的C A T G C (序列號3 1 ,圖1所示方框內(nèi))進行特異性識別。此序列比在此之前被報道的A B I 3 / V P 1轉錄因子的最小識別序列(C A T G C A ,序列號3 7 )還要短。此外,存在于數(shù)個基因(HvNAS 1 、 IDS 3等)近旁的IDE1狀序列中有的欠缺C A T G C (序列號3 1 ),以這些IDE1狀序列作為拮抗劑進行拮抗試驗后,明確了 IDEF1不與這些IDE1狀序列結合。
接下來,為了檢測營養(yǎng)期的水稻根部以及葉部中AB I 3 /VP l家族基因的表達,進行了RNA印跡(Northern blotting)解析。圖6所示的是,在鐵充分條件下(+ )以及鐵缺乏條件下(一)生長兩周的水稻根部以及葉部中IDEF1的RNA印跡解析結果。從被水培的水稻(N i p p on b a r e )苗中,用S D S —苯酚法將總RNA從根部或葉部中提取出來,用^P標記進行了RNA印跡解析。各鏈中,承載了 1 0 ii g的總RNA。使用了 IDEF1全長cDNA作為探針。圖6中也顯示了轉錄產(chǎn)物的預測長度。
如圖6所示,IDEF1轉錄產(chǎn)物在根部以及葉部恒定表達,在鐵缺乏狀態(tài)下沒有觀察到顯著的控制存在??梢詸z測到幾條帶,其中最長的轉錄產(chǎn)物( 1 . 7 k b )在葉部很豐富,估計與cDNA全長對應。0 s V P 1 、AK 1 0 9 9 2 0以及AK 1 0 1 3 5 6也在根部及葉部中恒定表達,一方面,沒有檢測到AK 0 7 2 8 4 1的表達。
接下來,檢査了DEF l于細胞內(nèi)的所在。使用粒子槍(B i o i istic PDS—1000/He Particle Deiivery System 、 Bio—Rad),將洋蔥(Allium ce P a)表皮細胞進行轉化,IDEF1的C末端的一半(與第1 8 4號 36 2號氨基酸相對應)以及GFP的融合蛋白質(zhì)(IDEF1 —GFP),以及GFP自身(GFP)得到了暫時性表達。之后,將上述表皮細胞剝落,在載玻片上用相差顯微鏡觀察,可以看到IDEF1—綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)的融合蛋白質(zhì),存在于洋蔥表皮細胞的細胞核中。
此外,通過表達序列標記(E S T s)數(shù)據(jù)庫檢索,發(fā)現(xiàn)了各種禾本科植物種子中存在著IDEF1同系物(圖18)。但是,非禾本科植物中,沒 有存在明確的IDEF1同系物。圖18是禾本科IDEF1同系物,B 3區(qū)域 (IDEF1預測編碼蛋白質(zhì)的2 4 3號一 3 5 5號)氨基酸序列的序列對比 圖。AK072874的B3區(qū)域(預測編碼蛋白質(zhì)的2 8 7 — 3 9 9號 氨基酸。將B 3區(qū)域的氨基酸序列顯示在序列號2 8中、B 3區(qū)域的堿基 序列顯示在序列號29中。),OsVPl (526 — 637)以及V P 1 (5 0 7 — 6 1 9 )中也同樣進行了序列對比。G e n B a n k接受號 (Accession號)如下大麥1(Barleyl、Hordeum Vu
1 g a r e , B 3區(qū)域的氨基酸序列顯示在序列號1 0中,B 3區(qū)域的堿 基序列顯示在序列號1 1中、E S T克隆的堿基序列顯示在序列號1 2 中),CB880834 (互補)以及H arvEST databas e (http: / /www. harvest —web. org/hwe b/bin/wc. dl 1 hwebProcess hmain & vers i d = 1 )中的contig10926;大麥2 ( B a r 1 ey2、Hordeumvulgare、B3區(qū)域的氨基酸序列顯示 在序列號2 5中,B 3區(qū)域的堿基序列顯示在序列號2 6中,克隆的堿基 序列顯示在序列號27中),BQ459575;小麥(W h e a t 、 T r
iticumaestivum、B 3區(qū)域的氨基酸序列顯示在序列號 13中,B 3區(qū)域的堿基序列顯示在序列號14中,克隆的堿基序列顯示在 序列號15中),B J 2 6 3 2 0 0 (互補);玉米(Maize, Z e a mays, B 3區(qū)域的氨基酸序列顯示在序列號16中,B 3區(qū)域的堿基 序列顯示在序列號17中,克隆的堿基序列顯示在序列號18中),BG 3
2 0 3 0 1;高粱(Sorghum bicolor,B3區(qū)域的氨基 酸序列顯示在序列號19中,B 3區(qū)域的堿基序列顯示在序列號20中,克 隆的堿基序列顯示在序列號21中),BG241297;甘蔗(Suga
rcane, Saccharum officinarum, B3區(qū)域 的氨基酸序列顯示在序列號22中,B 3區(qū)域的堿基序列顯示在序列號23 中,克隆的堿基序列顯示在序列號24中),CA093694。圖18中, 文字「X」指不是堿基由來的未知氨基酸殘基。如圖18所示,大麥l,大 麥2,小麥,玉米,高粱以及甘蔗的IDEF1同系物的B 3區(qū)域,相對IDEF1的B3區(qū)域,顯示60%以上的相同性。
為了鑒定其他的I DE結合轉錄因子,采用市場出售的系統(tǒng)(MAT CHMAKER one—hybrid system、Clonte c h)進行了單雜交篩選。以IDE2—IDE1X 2 (參考圖14)作為誘餌序 列(b a i t ),對缺鐵水稻根部cDNA3 . 2X10 6個克隆體進行了篩 選。缺鐵水稻根部的cDNA文庫,是將水培的,從缺鐵狀態(tài)下第7天收獲 的水稻(Nipponbare)根部抽出總RNA而構筑得到的。
在這里,IDE2長度為2 7 b p ,作為酵母單雜交篩選法中的誘餌序列 是比較長的序列。因為較長的誘館序列與酵母的內(nèi)源性蛋白質(zhì)較容易結 合,在運用了 IDE2三次反復的誘餌序列的單雜交篩選法時,背景活性非 常高(檢測到很多假陽性克隆體),IDEF2的分離提純極為困難。通過向培 養(yǎng)基中添加大量的組氨酸合成酶阻礙剤可以使背景活性得到抑制。但是將 阻礙剤?zhí)砑拥脚囵B(yǎng)基中會影響酵母的正常生長,不能得到準確的試驗結 果,因此不理想。因此在本實施方案中,將組氨酸合成酶阻礙剤?zhí)砑恿靠?制到最小,其結果檢測到很多的假陽性克隆體。
在此,本發(fā)明人等潛心研究的結果,從IDE2突然變異體的解析結果 中,發(fā)現(xiàn)了酵母內(nèi)源性蛋白質(zhì)的結合部位,存在于IDE2與IDE2的交界處。 本發(fā)明人根據(jù)獨特的構想,通過將IDE2與IDE1串聯(lián)結合反復排列設計得 到的誘餌序列,將IDE2間連接處消除,成功控制了背景活性。
結果如圖7所示,得到一個正克隆體(c 1 o n e 5 1 ),根據(jù)DNA 測序,發(fā)現(xiàn)其歸屬于NAC家族轉錄因子。此后,本說明書中將此稱為IDEF2 (IDE — bindingFactor2 )。IDEF2的氨基酸序列被 顯示在序列號4中,0 RF堿基序列被顯示在序列號5中,cDNA堿基序 列被顯示在序列號6中。
接下來,與實施例l一樣,進行了酵母結合分析。IDEF2的ORF是 用了序列號6 2以及6 3所示的堿基序列所構成的引物來進行了增幅的。此外,對于IDEF2,應用了沒有與GAL4活性化結構域(GAL4 AD) 相融合的效應子(pYH—IDEF2)。結果如圖7所示。
如圖7所示,在IDE2—IDE1 X 2或IDE2X 3下流區(qū)域中含有1 a c Z基因的報道基因(參考圖14)被導入的酵母細胞中,沒有與G A L 4 A D融合的IDEF2,實質(zhì)上誘導了 1 a c Z的活性。也就是說,IDEF2會與 IDE2 (TTGAACGGCAAGTTTCACGCTGTCACT,序 列號3 2)特異性結合。此外,IDEF2可以使激活轉錄,可以看出其在植 物體內(nèi)起到轉錄激活因子的作用。
此外,對于缺鐵大麥根部5. 0X1 ()6個cDNA克隆體,以IDE2X 3作為誘餌序列進行了單雜交篩選。得到了作為正克隆的IDEF2相近同系 物。(HvIDEF2,參考圖19,氨基酸序列顯示在序列號7中,ORF堿基 序列顯示在序列8中,cDNA堿繼序列顯示在序列號9中)。
IDEF2以及HvIDEF2所屬的NAC家族,構成了具有高度保存的N末 端的DNA結合結構域的植物特異性的轉錄因子家族。其中若干個成員的 產(chǎn)生機制(program)以及耐干燥性以得到了報道。圖8顯示的是NAC轉 錄因子家族的系統(tǒng)樹AK063703、 AK063399以及A K 1
0 8 0 8 0:這些是水稻中的缺鐵誘導性NAC轉錄因子;T t NAM — Bl (DQ869673 ):意大利面條(pasta)小麥中控制老化的NAC 轉錄因子;HvNAM— 1 ( D Q 8 6 9 6 7 8 )與O N A C 0 1 0 (N P—9 112 4 1):分別是大麥以及水稻中的T t NAM—B 1同系物; RD26/ANAC072 (At4g2741 0), ATAF1 (At
1 g 0 1 7 2 0 )以及A TAF2 (At5g08790 ), ANAC 0 1 9 (A t 1 g 5 2 8 9 0 ):擬南芥中干燥應答性以及/或鹽分應答性NAC 轉錄因子;SNAC1 (DQ394702 ):水稻中的干燥應答性NAC轉 錄因子。如圖8所示,IDEF2與已被鑒定的任何NAC轉錄因子都沒有顯 著的類似性。
接下來,應用E M S A法對IDEF2與IDE2的特異性結合進行了確認。 對由序列號6 4以及6 5所示的堿基序列所形成的引物所增幅得到的 IDEF2的NAC結構域,采用pMAL—c2載體進行克隆篩選,再由此
33制造IDEF2—MBP融合蛋白質(zhì)。接下來,將含有IDE2的堿基序列(序 列號4 1 )所構成的被標記的IDE2探針,與5 0 0 n g的IDEF2—M B P融合蛋白質(zhì)共同培養(yǎng)。結果如圖9所示。如圖9所示,可以確認到,IDE2 探針與IDEF2—MB P融合蛋白質(zhì)進行了特異性結合。
接下來,30倍量或50倍量過量添加未被標記的拮抗劑,進行了拮抗 試驗。圖1 0以及圖1 2的(a)顯示了做為拮抗劑所用的多核苷酸片段 被導入的變異。將IDE2探針,作為30倍量或50倍量過剩的非標識拮抗 劑,與5 0 0 n g的IDEF2 —MB P融合蛋白共同培養(yǎng)。圖l 0以及圖1
2(b)顯示了拮抗試驗結果。.如圖1 0以及圖12(b)所示,IDEF2 主要識別了 IDE2中的CA [A/ C] G (TTT)序列(序列號3 3或
3 4)。
此夕卜,通過C yclicAmplification and SelectionofTarget (CASTing)實驗,明 確了 IDEF2的NAC結構域與CA [C/A] G [T/C][T/C/A] 優(yōu)先結合。此序列對應于由EMSA法所鑒定的認識序列的部分序列。但 是,含有若干個CA [C / A] G [T / C] [T / C / A](序列號3 5) 的缺鐵誘導性啟動子序列,對于IDEF2對IDE2的結合沒有有效果的發(fā)生 拮抗。根據(jù)以上結果,IDEF2將CA [A/C] G (序列號3 3)作為核 心序列進行識別,這是對IDE2中典型存在的鄰接序列進行高效的結合。 接下來的實驗,顯示了IDEF2可以,將花椰菜花葉病毒組3 5 S啟動子的 一 9 0 /— 4 7位的TGACG反復的5,末端部分,在CA [A/ C] G (序列號3 3)不存在的情況下也進行了識別。
在鐵充分條件下(+ )或鐵缺乏條件下(一)、對生長第5天或第11 天的水稻莖葉及根部中的IDEF2進行了RNA印跡解析。各個鏈中,承載 了 1 0 n g的總RNA。將IDEF20RF的3 ,末端5 0 0 b p的非NAC結 構域區(qū)域,應用序列號6 6以及6 7所示的引物進行增幅,作為探針加以 應用。結果如圖11所示。
如圖11所示,IDEF2轉錄產(chǎn)物在鐵充分條件下和鐵缺乏條件下,在水 稻莖葉以及根部恒定表達,特別是在根部,觀察到了高表達的水平。此外,與實施例1同樣,IDEF2—GFP融合性蛋白質(zhì)在洋蔥表皮細胞 得以暫時性表達,該融合蛋白存在于細胞核內(nèi)。這些結果說明了,與IDEF1 一樣,在水稻植物體內(nèi)對缺鐵狀態(tài)進行應答的IDEF2的功能性特性。
為了確定IDEF1在植物體內(nèi)的功能,制作了在2拷貝的IDE1下流中 含有e葡糖醛酸酶(GUS)基因的融合序列,并且,在恒定的3 5 S啟 動子下流中導入IDEF1基因(3 5 S —IDEF1),或含有載體控制的轉化煙 草。
煙草(Nicotiana tabacum L., Petit-Havana SRI)的葉片(leaf disk),被用于將IDE1—IDE1 —G US結構(construct)導入的,農(nóng)桿菌介入的轉化過程中。經(jīng)過卡那霉素 篩選以及得到T l種子后,代表性鏈的T l葉,被應用于3 5 S—IDEFl 或VC的導入,多重轉化體應用潮霉素B (5 0mg L-1)而進行篩選。 發(fā)芽后第l 6 1 7天的含有潮霉素B的MS (Mu r a s h i g e a n d S k o o g)培養(yǎng)基上的苗木,被移植到含有鐵(+ F e )或不含 有鐵(一F e)的新MS固體培養(yǎng)基上。將每條鏈上各2根苗木的整個根 部,最新葉部,以及第2最新葉在移植的14天后收割,應用葉綠素測量 儀(SPAD— 5 0 2 、 KONCA MNOLTA)來測定葉部葉綠素,或采用熒 光法對GUS活性進行檢測。結果如圖13所示。途中垂直帶顯示平均值。
如圖1 3 ( a)所示,這些轉化體在鐵充足條件下的根部中沒有誘導 實質(zhì)性的GU S活性,在鐵充足條件下葉部以及鐵缺乏條件下的葉部中也 是同樣的。 一方面,在鐵缺乏條件下的根部中,VC以及3 5 S—IDEFl 植物體中,均可見被重復IDE1所促進的強力GUS活性誘導。此外3 5 S—IDEF1植物體與VC植物體相比,可見GU S活性增強的傾向。此夕卜, 如圖1 3夂b )所示,3 5 S —IDEF1植物體在鐵缺乏條件下,與V C植 物體相比較具有高的葉綠素含量。此外,沒有顯示可見的形態(tài)差異??梢?被導入的IDEF1基因,在轉錄后得到了控制,這些估計與缺鐵狀態(tài)下,且 具有根部特異性的GU S表達相關。
為了進一步調(diào)查IDEF1功能,發(fā)明人對水稻恒定表達的3 5 S啟動子,或?qū)θ辫F狀態(tài)進行應答而被激活的缺鐵誘導性啟動子I DS 2啟動子(序 列號6 8 )控制下將IDEF1基因?qū)?3 5 S —IDEF1以及I 2 p — IDEF1)。為了解析對缺鐵狀態(tài)的應答,對T 1轉化體以及非轉化體(NT), 進行了水培。
3 5 S —IDEF1以及I 2 p —IDEF1結構,經(jīng)農(nóng)桿菌介入的轉化,被 導入水稻中(T s u k i n o h i k a r i )。將T 1種子播種于含有3 %蔗糖,0. 8%瓊脂糖,以及5 OmgL"潮霉素B的培養(yǎng)基上,在2 8'C, 1 6小時的明亮條件以及8小時的黑暗條件下使其發(fā)芽,并生長16 天。非轉化體,是在不含有潮霉素B的培養(yǎng)基上發(fā)芽的。苗木在其過3天 的適應期后,被轉移到水培培養(yǎng)基。NT以及I 2 p —IDEF1植物體在7 天后,3 5 S —IDEF1植物體在7 — 14天后,莖葉的高度到達20 — 3 0 c m時,將其移植到不含有F e(III)—EDTA, p H沒被調(diào)整 過的培養(yǎng)基上,使其處于缺鐵狀態(tài)下。最大葉以及最新葉的SPAD度量指 數(shù)以及莖葉的高度,是在處于缺鐵狀態(tài)后第O, 2, 4, 6, 7天后測定的。 營養(yǎng)液于第0, 4, 7天被更換。結果如圖15及16所示。
圖15 ( a )所示,是I 2 p —IDEF1轉化體(鏈9 、 1 2 、以及1 3 ) 以及NT的,在缺鐵處理開始后第O, 2, 4, 6以及7天的最新葉綠素含有 量的經(jīng)時間變化圖。圖中,黑點是SPAD指數(shù)的平均值。經(jīng)t一檢驗(*、 p < 0 . 0 5; **、 p < 0 . 01)所解析的相對于NT的有義差也被顯 示在圖中。
圖15 ( b )戶萬示,是I 2 p —IDEF1轉化體(鏈9 、 1 2 、以及1 3 ) 與NT的莖葉的高度圖。將平均值進行t-檢驗(*、 p<0. 0 5; **, p < 0 . 0 1)所解析的對于NT的有義差值也被顯示在圖中。
圖16 ( a )所示,是NT、 3 5 S —IDEF1以及I 2 p —IDEF1轉化 體的葉綠素含有量圖。對于3 5 S —IDEF1以及I 2 p —IDEF1的8條獨 立鏈與3個NT植物體,顯示了最大葉的平均SPAD參數(shù)。
圖16 ( b )所示,是NT、 3 5 S —IDEF1以及I 2 p —IDEF1轉化 體的莖葉高度圖。對于3 5 S —IDEF1以及I 2 p —IDEF1的8條獨立鏈 以及3個NT植物體,顯示了其平均高度。經(jīng)t一檢驗(^ p<0. 0 5; **、 p<0. 0 1 )所解析的對于NT的有義差值被顯示在圖中。
36圖15以及圖16中所示標本數(shù)如下第0,第2,以及第4天的鏈1 2為n二8;第0,第2,以及第4天的NT以及鏈9,第6以及第7天 的鏈l 2中11=6;第0,第2,以及第4天的鏈1 3中n = 5 ;第6以 及第7日目的NT以及鏈9中11 = 4;第6以及第7日目的鏈l 3中n二 3 c
如圖15 ( a )以及圖16 ( a )所示,在缺鐵條件下,3 5 S —IDEF1 以及I 2 p—IDEFl的多數(shù)鏈中葉綠素的衰減,比NT植物體要緩慢。通 過在缺鐵處理狀態(tài)下,對3個代表性的I 2 p —IDEF1鏈(鏈9 , 12, 以及l(fā) 3 )的經(jīng)時間變化觀察,特別是在鏈9以及鏈13中,明確了存在 著實質(zhì)性的耐缺鐵性。
但是,如圖16 ( b )所示,3 5 S —IDEF1植物體與I 2 p —IDEF1 水稻植物體一樣,顯示出緩慢的葉綠素衰減,發(fā)芽后的基本生長緩慢。對 于應激應答所涉及的轉錄因子恒定過量表達的副作用,關于控制耐干燥性 基因的D RE B轉錄因子也有相同的報道。這告訴了我們應用應激誘導性
啟動子,來使轉錄因子表達強化,具有有效性。
為了研究IDEF2的功能,制作了通過RNAi法使IDEF2表達得以控制 的轉化水稻。具體來講,將IDEF2的400bp的5,UTR以及300 b p的3 , U T R進行增幅,將其插入載體p I G 1 2 1 —RNAi—D E S T。水稻的轉化應用了公知的方法。分別制作了獨立的轉化5, RNAi以 及3, RNAi水稻植物體各20鏈。
得到的40鏈轉化水稻中,選擇了表達被強力抑制的鏈(鏈l、 2、 以及3 )以及表達被溫和控制的鏈(鏈4 )。如果詳細敘述,是從5 ' RNAi 水稻中選出IDEF2被強力抑制的1條鏈(鏈1 )、從3 ' RNAi水稻中選出 被強力抑制的2條鏈(鏈2以及3 )。然后從3 , RNAi水稻中選出被溫和 抑制的鏈(鏈4 )。將T l種子用來解析。結果如圖17( a )中各的鏈RNA 印跡結果所示。
水稻是在14小時的明亮條件,3 (TC與IO小時的黑暗條件,2 5°C 的反復中被水培的。發(fā)芽第29至31天,植物體高度到達34cm時,將Fe (III) —EDTA從培養(yǎng)液中去除,使其進入缺鐵狀態(tài)。植物在進 入缺鐵狀態(tài)后的第7天被收割。
在各個鏈中,將在小麥根部中具有吸收鐵螯合物功能的F e ( I I ) 一煙酰胺轉運蛋白O s YSL 2的表達量,用公知的RT—PCR法進行了 測定。其結果如圖l 7(b)所示。
如圖17 ( b )所示,使其在缺鐵狀態(tài)下生長時,RNAi水稻中O s Y S L 2的表達被顯著抑制。表達被強力抑制的鏈(鏈1、 2 、以及3 )中 O s Y S L 2表達被強烈抑制,以及表達被溫和抑制的鏈(鏈4 )中O s Y S L 2表達被溫和抑制。由此可以明確IDEF2與0 s Y S L 2的表達控 制相關,與植物的鐵吸收機制相關。
應用本發(fā)明,可以使植物中與鐵的吸收相關的基因增強表達,從而提 供耐缺鐵性得以增強的植物。
發(fā)明的詳細說明中記載的具體實施方案以及實施例,不過是用于明確 本發(fā)明的技術內(nèi)容,不應被狹義理解為局限于這些具體實施方案以及實施 例,在本發(fā)明的精神以及權利要求書的范圍內(nèi),可以加以各種變更來進行實施。
(工業(yè)上的利用可能性)
應用本發(fā)明可以獲得耐缺鐵性得以增強的植物,即可以得到在可溶性 鐵成份很少的堿性土壤中也可以生長的作物。
禾本科的作物,是世界糧食供給的主要來源,但水稻與玉米對缺鐵狀 態(tài)感受性很高。本發(fā)明人通過導入大麥HvNAAT基因,成功創(chuàng)建了耐缺鐵 性得以增強的未本科植物體。對缺鐵進行應答的基本控制體系,例如如果 能對轉錄因子進行操作,即可對缺鐵狀態(tài)進行應答的基因在廣范圍內(nèi)進行 遺傳性強化。此外,本發(fā)明人等明確了 IR02的過剩表達,可以使耐缺鐵 性得以增強。通過將IDEF1與IDEF2、 IR02以及其他未知因子組合操作, 可以提供在有問題的土壤中表現(xiàn)良好特性的新型作物以及其他植物。
權利要求
1.一種多肽,由(A)~(C)中任一氨基酸序列構成,并且使植物耐缺鐵性得以增強(A)序列號1,4或7中任一所示的氨基酸序列;(B)在序列號1,4或7中任一所示的氨基酸序列中,一個或多個氨基酸被取代、缺失或附加的氨基酸序列;或者(C)序列號1所示的氨基酸序列的第243~355號被序列號10,13,16,19,22,25或28中任一所示的氨基酸序列所取代的氨基酸序列。
2. —種多核苷酸,其編碼權利要求1所述的多肽。
3. —種多核苷酸,由(A) (D)中任一堿基序列所構成,其編 碼使植物耐缺鐵性得以增強的多肽 (A )序列號2, 5或8中任一所示的堿基序列;(B) 在序列號2, 5或8中任一所示的堿基序列中, 一個或多個核 苷酸被取代、缺失或附加的堿基序列;(C) 與序列號2, 5或8中任一所示的堿基序列的互補序列在嚴格 條件下可雜交的堿基序列;或者(D )序列號2所示的堿基序列的第727 1065號被序列號11, 14, 17, 20, 23, 26或29中任一所示的堿基序列所取代的堿基序列。
4. 一種載體,其含有權利要求2或3所述的多核苷酸。
5. —種轉化體,其中導入有權利要求2或3所述的多核苷酸。
6. —種抗體,其與權利要求1所述的多肽特異性結合。
7. —種耐缺鐵性提高的植物的制作方法,其包括將權利要求2或3 所述的多核苷酸導入植物的工序。
8. —種用于制作耐缺鐵性提高的植物的組合物,其含有權利要求2 或3所述的多核苷酸,或權利要求4所述的載體。
9. 一種用于制作耐缺鐵性提高的植物的套件,其具有權利要求2或3 所述的多核苷酸,或權利要求4所述的載體。
10. —種耐缺鐵性提高的植物的育種方法,其包括對植物提取物中所 含有的權利要求1所述的多肽進行檢測的工序。
11. 一種耐缺鐵性提高的植物的育種方法,其包括對植物提取物中所含有的權利要求2或3所述的多核苷酸,或由序列號12, 15, 18, 21, 24 或27中任一所示的堿基序列所構成的多核苷酸進行檢測的工序。
12. —種對編碼使植物耐缺鐵性得以增強的多肽的多核苷酸進行檢測 的方法,其包括將候補多核苷酸,與由序列號12, 15, 18, 21, 24或27 中任一所示的堿基所構成的多核苷酸進行雜交的工序。
全文摘要
本發(fā)明提供了與包含鐵吸收機制相關基因的順式元件相結合的多肽。上述多肽可以使鐵吸收機制相關基因得以增強表達。由此得到耐缺鐵性得以增強的植物。
文檔編號C12Q1/68GK101679968SQ20088001721
公開日2010年3月24日 申請日期2008年4月24日 優(yōu)先權日2007年4月26日
發(fā)明者小鄉(xiāng)裕子, 小林高范, 敏 森, 西澤直子 申請人:獨立行政法人科學技術振興機構