專利名稱：與植物缺鐵相關(guān)的cDNA序列及其編碼蛋白和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與植物礦質(zhì)營養(yǎng)相關(guān)的cDNA序列及其編碼蛋白，尤其涉及一種 與玉米缺鐵相關(guān)的cDNA序列及其編碼蛋白，本發(fā)明還涉及含有該cDNA序列的重組表達(dá)載 體以及該cDNA序列在提高植物抗缺鐵脅迫的用途，屬于植物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鐵是人們最早發(fā)現(xiàn)的微量元素，發(fā)現(xiàn)至今已有兩千多年的歷史。鐵在地球上現(xiàn)存 的原核生物和真核生物的生命活動(dòng)中具有不可替代的功能。植物中鐵的研究可追溯至一個(gè) 半世紀(jì)以前的1843年，Gris發(fā)現(xiàn)生長在石灰性土壤上的葡萄葉片失綠癥與缺鐵有關(guān)。后 經(jīng)植物學(xué)家Sachs和Molisch研究，將其確定為植物生長的必需微量元素，同時(shí)鐵也是最早 發(fā)現(xiàn)的植物必需營養(yǎng)元素。植物需要10_7-10_4mol/L的鐵才能達(dá)到最佳的生長狀態(tài)，但在中 性或石灰質(zhì)土壤中，可溶性鐵的濃度低于lCTVol/L。鐵位居植物必需微量元素的首位，輕 度缺鐵會(huì)導(dǎo)致葉綠素合成減少，光合速率降低，嚴(yán)重缺鐵時(shí)，葉綠素合成停止，新葉變黃。植 物缺鐵不僅影響植物的生長發(fā)育，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且也影響動(dòng)物和人類食用鐵的 吸收，從而導(dǎo)致貧血病的發(fā)生(Guerinot ML,et al. 1994)。植物缺鐵失綠癥是一個(gè)世界性 植物營養(yǎng)失調(diào)問題。在許多國家的干旱、半干旱地區(qū)的石灰性土壤上廣泛存在著植物缺鐵 問題，在鹽堿土上植物也往往發(fā)生缺鐵現(xiàn)象。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界約有40%的土壤缺鐵。北美大 陸、地中海沿岸、前蘇聯(lián)南部、南美的部分地區(qū)都嚴(yán)重缺鐵。我國南起四川盆地，北至內(nèi)蒙古 高原，東至淮北平原，西到黃土高原及甘肅、青海、新疆等都有缺鐵現(xiàn)象的發(fā)生。雖然土壤缺 鐵只在一定類型的土壤和地區(qū)存在，但由于總面積較大，所以植物缺鐵失綠成為全世界普 遍關(guān)注的問題，也是本世紀(jì)初以來植物營養(yǎng)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。植物體內(nèi)鐵的含量一般為干重的0. 3%，鐵是細(xì)胞色素的組分，是許多重要酶的輔 基。鐵比較集中地分布在葉綠體內(nèi)，Terry等報(bào)道葉片中60%的鐵被固定在葉綠體的類囊 體膜上，20%在葉綠體基質(zhì)中貯存，其余的20%則在葉綠體外。當(dāng)植物受到缺鐵脅迫時(shí)，葉 綠體基質(zhì)中的鐵大部分被再利用，類囊體膜上的鐵和葉綠體外的結(jié)構(gòu)鐵分別損失51%和 62%，由此可見，葉綠體中鐵的調(diào)控以及再利用與種子的鐵含量息息相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種過量表達(dá)能夠提高植物抗缺鐵脅迫能力的cDNA ；本發(fā)明的目的之二是提供一種由該cDNA所編碼的氨基酸；本發(fā)明的目的之三是一種含有所述cDNA的重組表達(dá)載體；本發(fā)明的目的之四是將所述cDNA應(yīng)用于提高植物抗缺鐵脅迫的性能；本發(fā)明上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明在缺鐵脅迫的環(huán)境下從玉米根中分離、克隆到高表達(dá)的ZmFDR4基因，其核 苷酸序列為(a)SEQ ID NO :1所示；(b)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與(a)所示的核苷酸序列的互補(bǔ) 序列雜交的核苷酸序列；
優(yōu)選的，所述的ZmFDR4基因的核苷酸序列為SEQ ID NO 1所示；其中，所述的“嚴(yán)謹(jǐn)條件”是指雜交液為5 6XSSC，42 75°C雜交過夜，室溫至 37°C用2 X SSC洗滌一至兩次，優(yōu)選的，所述的“嚴(yán)謹(jǐn)條件”為雜交液為6XSSC，68°C雜交過 夜，37°C用2XSSC洗滌兩次。本發(fā)明還涉及可以在植物中高效表達(dá)所述cDNA(SEQ ID N0:1)的植物表達(dá)載體。將本發(fā)明cDNA序列插入到植物表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，可操作的 與表達(dá)調(diào)控序列相連接，得到可以在植物中表達(dá)該cDNA序列的植物表達(dá)載體。例如，該植 物表達(dá)載體可以由5'非編碼區(qū)，SEQ ID N0:1所示的cDNA序列和3'非編碼區(qū)所組成，其 中，所述的5'非編碼區(qū)可以包括啟動(dòng)子序列、增強(qiáng)子序列或/和翻譯增強(qiáng)序列；所述的啟 動(dòng)子序列可以是組成型、誘導(dǎo)型、組織或器官特異性誘導(dǎo)子。所述的3'非編碼區(qū)可以包含 終止子序列、mRNA切割序列等。具體的，本發(fā)明公開了含有缺鐵誘導(dǎo)玉米根中相關(guān)基因的植物穿梭表達(dá)載體 pBI121-ZmFDR4 和酵母穿梭表達(dá)載體 pYES2. 0_ZmFDR4。本發(fā)明還在真核細(xì)胞中表達(dá)了玉米ZmFDR4基因，獲得了轉(zhuǎn)運(yùn)鐵的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞， 尤其是轉(zhuǎn)化的酵母菌株。本發(fā)明進(jìn)一步包括玉米ZmFDR4基因的編碼產(chǎn)物，該編碼蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO 2 所示。本發(fā)明整體技術(shù)方案的詳細(xì)描述本發(fā)明從一種缺鐵誘導(dǎo)的玉米根中克隆了 ZmFDR基因的全長cDNA，并對(duì)其結(jié)構(gòu)特 性和在酵母中的功能進(jìn)行了分析。結(jié)構(gòu)特性分析表明ZmFDR基因cDNA全長為3.3kb。經(jīng) ORF Finder分析發(fā)現(xiàn)其包含有兩個(gè)大小分別為1068bp和648bp的開放閱讀框，后者命名為 ZmFDR4(SEQ ID N0:1)。ZmFDR4編碼的蛋白(SEQ ID NO :2)有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，并有信號(hào) 肽，屬分泌性蛋白，它與III型分泌系統(tǒng)中FliP蛋白有相似的結(jié)構(gòu)域。但經(jīng)過廣泛的同源 性比對(duì)，在高等植物中沒有發(fā)現(xiàn)任何同源性序列。以酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明該cDNA在酵母 中的表達(dá)可以有效地轉(zhuǎn)運(yùn)鐵?？梢詫⒈景l(fā)明cDNA序列應(yīng)用于提高植物抗缺鐵脅迫的性能，例如，可將含有本發(fā) 明cDNA序列的植物表達(dá)載體導(dǎo)入到植物細(xì)胞中，培育篩選得到抗缺鐵脅迫性能提高了的 轉(zhuǎn)基因植株。


圖1為ZmFDR4蛋白的疏水性分析。圖2為ZmFDR4蛋白的PSI-Blast比對(duì)結(jié)果，具有III型分泌系統(tǒng)中FliP蛋白的 結(jié)構(gòu)域。圖3為表達(dá)ZmFDR4的酵母轉(zhuǎn)化株的異源功能互補(bǔ)結(jié)果。圖的上方標(biāo)注了所用Fe2+ 和螯合劑BPDS的處理濃度，分別是5、10、15 μ M。圖中每行的菌斑為同一種轉(zhuǎn)基因型酵母 菌株，所轉(zhuǎn)載體標(biāo)注于圖的左側(cè)。各小圖從左至右四個(gè)菌斑分別是按0. 10D_、0.010D_、 0. OOlOD600^O. OOOlOD600濃度的菌點(diǎn)板。30°C暗培養(yǎng)兩天。蛋白有相似的結(jié)構(gòu)域(見圖2)。
具體實(shí)施例方式
可能是一種分泌途徑中的膜蛋白。TMHMM預(yù)測ZmFDR4蛋白有4個(gè)跨膜域(見圖1)，4 個(gè)跨膜螺旋所含的氨基酸數(shù)目為84個(gè)。它與III型分泌系統(tǒng)中FliP蛋白有相似的結(jié)構(gòu)域 (見圖2)。試驗(yàn)例1 玉米ZmFDR4基因的功能分析一、酵母表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)以下一對(duì)引物，在ZmFDR4 5，端和3，端分別引入Hind III和EcoR I酶切位點(diǎn)。c-myc 上游5，CGTAAGCTTATGGGGGGTTCTC 3，c-myc fdr4 下游5，TCAGAATTCTCACTTGTAGGTGGAG 3，以植物表達(dá)載體pBI121-ZmFDR4(pBI121購自Invitrogen)為模板進(jìn)行PCR;分別 將PCR產(chǎn)物和酵母穿梭表達(dá)載體pYES2. O (購自Invitrogen)用Hin III和EcoR I雙酶切， 并將酶切產(chǎn)物回收、連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10。經(jīng)鑒定，得到含有ZmFDR4基因的酵母表 達(dá)載體。二、酵母的轉(zhuǎn)化構(gòu)建好的酵母穿梭表達(dá)載體pYES2. 0-ZmFDR4轉(zhuǎn)化DEY1453(由David Eide教 授惠贈(zèng)Department of Nutritional Sciences, University offfisconsin-Madison, USA) (ΜΑΤα/MAT2 ade2/+canl/canl his3/his3 Ieu2/leu2trpl/trpl ura3/ura3 fet3-2: : HIS3/fet3-2: : HIS3 fet4_l: : LUE2/fet4_l: : LUE2) (DEY1453 的構(gòu)建方法見一)。 DEY1453為高親和和低親和鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體的雙突變體。對(duì)照用水代替質(zhì)粒。三、轉(zhuǎn)化子的篩選在含有鐵離子螯合劑，15μ M BPDS (Bathophenanthroline disulfonicacid 購自 Sigma公司)的完全極限培養(yǎng)基(即為YNB培養(yǎng)基(complete minimaldropout medium), 配制時(shí)，每IOOmL取酵母基本氮源(yeast nitrogen base,下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例一玉米ZmFDR全序列的克隆一、RNA 提取對(duì)鐵敏感的玉米品種(Zea mays L cv掖單12)用0. 5% _1 % NaOCl表面消毒，然 后在27°C萌發(fā)36h。當(dāng)根長Icm左右時(shí)，25°C下用沒有鐵素的液體(Hoagland培養(yǎng)液)培 養(yǎng)(-Fe培養(yǎng))玉米ll-24d。當(dāng)缺鐵癥狀出現(xiàn)時(shí)，每日剪取根尖約2cm儲(chǔ)存在-80°C備用， 建庫時(shí)混合隨機(jī)取樣。同時(shí)對(duì)照玉米在正常含鐵(濃度為lX10_4mol/L)的培養(yǎng)液(+Fe培 養(yǎng))中生長。二、DNA文庫的構(gòu)建按ZAP Express cDNA Synthesis Kit 和 ZAP Express Cdna Gigapack GoldII Clong Kit說明書進(jìn)行cDNA文庫的構(gòu)建。第一條鏈的合成用含Xho I位點(diǎn)的銜接物-引物 錨定5， GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3，在 RNase H 和polymerase I的催化下合成第二條鏈，雙鏈cDNA的突出末端用pfu DNA聚合酶補(bǔ)平或填 充，隨后EcoR I銜接物鏈接到平末端上。
三、差異篩選 鐵正常⑴和鐵缺乏㈠cDNA探針通過隨機(jī)弓I物RT-PCR從⑴和㈠mRNA模板合 成。經(jīng)原位噬菌斑雜交，反復(fù)篩選，最終獲得ZmFDR克隆，經(jīng)寶生物工程公司進(jìn)行5’測序。四、mFDR4的序列分析測序結(jié)果表明ZmFDR為3. 3kb的cDNA，經(jīng)ORF Finder分析發(fā)現(xiàn)其包含有兩個(gè)大小 分別為1068bp和648bp的開放閱讀框，后者命名為ZmFDR4 (SEQ IDNO 1)。ZmFDR4編碼215 個(gè)氨基酸(SEQ ID NO :2)。其表達(dá)產(chǎn)物在高等植物中沒有找到同源性序列。根據(jù)TargetP預(yù) 測結(jié)果ZmFDR4蛋白最可能定位在膜上，YNB，無氨基酸或硫酸銨)0. 67g，葡萄糖(Glucose， 配成40% detrose貯液單獨(dú)滅菌，4°C保存)2g，省卻營養(yǎng)物的氨基酸等混合物(缺尿嘧啶) (以母液形式配好)，瓊脂(Bact0-agar)2g。)平板上進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的篩選。四、異源互補(bǔ)功能驗(yàn)證DEY1453 (fet3fet4)是酵母鐵吸收的低親和系統(tǒng)FET4，以及高親和系統(tǒng)FET3-FTR 的基因發(fā)生了突變，使得突變酵母在極限(缺鐵)培養(yǎng)基中不能生長，但當(dāng)外源相應(yīng)基因 pYES-ZmFDR4轉(zhuǎn)入并表達(dá)后可以彌補(bǔ)它們的功能，使得酵母能夠生長。由圖3可以看出在加鐵條件下，轉(zhuǎn)入pYES和轉(zhuǎn)入pYES_ZmFDR4的酵母長勢相似， 而且在不同鐵濃度下，酵母的長勢區(qū)別也不是很明顯。在加有鐵的螯合劑BPDS的培養(yǎng)基 上可以很明顯地看到轉(zhuǎn)入pYES-ZmFDR4的酵母要比轉(zhuǎn)入空載體的酵母長得好，尤其是在 15 μ M濃度的條件下，即使鐵含量很少，但酵母也恢復(fù)了生長。說明ZmFDR4能夠有效轉(zhuǎn)運(yùn) 鐵，恢復(fù)了酵母的生長。序列表<110>首都師范大學(xué)<120>與植物缺鐵相關(guān)的cDNA序列及其編碼蛋白和應(yīng)用<130>KLPI08078<160>2<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>648<212>DNA<213>Zea mays<400>1atgaacgccgcgcctgacgtcggttcgctgctggtcgccgcgctcgcgctggcggtcctg60
ccgttcgtggcgatggtggtcacgtcctacaccaagatcgtggtggtgctggtcctcctg120
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一種從玉米(Zea mays)根中所分離、克隆的與植物缺鐵相關(guān)的cDNA，其特征在于該cDNA序列為以下(a)或(b)所示(a)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；或(b)在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下能與(a)所示的核苷酸序列的互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列。
2.按照權(quán)利要求1所述的cDNA，其特征在于該cDNA序列的核苷酸序列為SEQID NO 1所示。
3.由權(quán)利要求1或2所述cDNA編碼的蛋白，其特征在于該蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO 2 所示。
4.含有權(quán)利要求1或2所述cDNA的表達(dá)載體。
5.按照權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于該表達(dá)載體是植物穿梭表達(dá)載體 pBI121-ZmFDR4或酵母穿梭表達(dá)載體pYES2. 0_ZmFDR4 ；其中，所述的ZmFDR4核苷酸序列為 SEQ ID NO 1 所示。
6.包含權(quán)利要求4或5所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1或2所述cDNA在提高植物抗缺鐵脅迫性能中的應(yīng)用。
8.按照權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用包括構(gòu)建含有權(quán)利要求1或 2所述cDNA的植物表達(dá)載體；將該植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中，使所述cDNA在植物中 表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明公開了與植物缺鐵相關(guān)的cDNA序列及其編碼蛋白和應(yīng)用。本發(fā)明從缺鐵誘導(dǎo)的玉米根中克隆了ZmFDR基因的全長cDNA，并對(duì)其結(jié)構(gòu)特性和在酵母中的功能互補(bǔ)進(jìn)行了分析。結(jié)構(gòu)特性分析表明ZmFDR基因全長為3.3kb，其中包含有兩個(gè)大小分別為1068bp和648bp的開放閱讀框，后者命名為ZmFDR4(SEQ ID NO1)。其編碼的蛋白(SEQ ID NO2)有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，并有信號(hào)肽，屬分泌性蛋白，它與III型分泌系統(tǒng)中FliP蛋白有相似的結(jié)構(gòu)域。但經(jīng)過廣泛的同源性比對(duì)，在高等植物中沒有發(fā)現(xiàn)任何同源性序列。酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明該cDNA序列在酵母中的表達(dá)可有效地轉(zhuǎn)運(yùn)鐵離子。
文檔編號(hào)A01H5/00GK101892243SQ201010103650
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月29日
發(fā)明者關(guān)麗英, 劉祥林, 印莉萍, 宋秀芳, 張艷萍, 白彥霞, 閆佳潔, 霍春雁, 韓建輝, 馬小娟 申請(qǐng)人:首都師范大學(xué)