專利名稱：用于通過刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及用于通過加重ER應(yīng)激響應(yīng)來 選擇性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法、化合物和組合物。本發(fā)明還涉及用于治療癌癥的方法，包括難 以治療的癌癥、抗藥性癌癥和復(fù)發(fā)性癌癥。
背景技術(shù)：
細(xì)胞凋亡是與編程性細(xì)胞死亡或“細(xì)胞自殺”有關(guān)的過程，且在生理學(xué)條件下細(xì)胞 凋亡在細(xì)胞表面死亡受體被各種基因毒性試劑占據(jù)或激活后發(fā)生。該過程導(dǎo)致細(xì)胞色素C 的線粒體釋放，這反過來激活促進(jìn)細(xì)胞凋亡的半胱天冬酶。自從1972年Ken 等(1)首次描述了細(xì)胞凋亡后，已經(jīng)積累了很多有關(guān)這一重要 細(xì)胞過程的知識(shí)。盡管尚未在分子水平和細(xì)胞水平得到對(duì)細(xì)胞凋亡的全面理解，迄今所積 累的知識(shí)已使人們意識(shí)到，由于所述過程經(jīng)遺傳編程，因此它可能易受突變的影響并因此 可能與如病毒感染、自身免疫性疾病和癌癥等許多人類疾病的發(fā)病機(jī)理有關(guān)(2，3)?；谶@ 一認(rèn)識(shí)，已經(jīng)廣范認(rèn)可，任何針對(duì)在遭受細(xì)胞凋亡失調(diào)的患病細(xì)胞中(例如，癌癥)特異性 引發(fā)細(xì)胞凋亡的治療策略都可帶來可能有希望的治療。在近期的一篇文章中，F(xiàn)erreira等⑷對(duì)目前的利用細(xì)胞凋亡的治療潛力的策略 進(jìn)行了綜述。總的來說，該綜述指出現(xiàn)有的基于細(xì)胞凋亡的治療用策略可以被分為兩類促 凋亡法和許可凋亡法。表1顯示了各類中的示例性方法的列表。促凋亡法是旨在直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的策略。這些方法試圖通過利用如死亡受體和 半胱天冬酶等現(xiàn)存細(xì)胞參與物和途徑或通過導(dǎo)入如凋亡素(apoptin)等外源性促凋亡分 子來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡。促凋亡策略可以涉及(a)直接導(dǎo)入促凋亡參與物；(b)調(diào)節(jié)抗凋亡分 子；或(c)恢復(fù)腫瘤抑制基因的功能。然而，促凋亡策略并非基于正常細(xì)胞與癌細(xì)胞之間的 結(jié)構(gòu)差異。因此，在獲得腫瘤細(xì)胞特異性的同時(shí)使毒性最小化成為這類方法的發(fā)展中的巨 大障礙。例如，靶向如TNF和Fas等死亡受體的實(shí)驗(yàn)療法已造成數(shù)種組織中的缺血性和出 血性損害。另一方面，許可凋亡法基于以下前提通過阻斷某些介導(dǎo)在正常條件下有助于保 持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的存活信息的復(fù)雜信號(hào)途徑可以引發(fā)細(xì)胞凋亡。這類策略沒有促凋亡策略的非 特異性毒性問題，但是這類策略的成功發(fā)展極大地取決于對(duì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)理的詳細(xì)認(rèn) 識(shí)。迄今為止，對(duì)于導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的次生效應(yīng)的這類機(jī)理的理解和認(rèn)識(shí)仍不完全。
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因此，仍然需要選擇性誘導(dǎo)患病細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡的新策略以及用于實(shí)施所述策 略的新手段和方法。

發(fā)明內(nèi)容
于是，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法，所述方法可以做為新 療法的基礎(chǔ)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供可用作細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的化合物和組合物。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供用于篩選、選擇和發(fā)現(xiàn)可用作細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的化合 物的方法。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供用于治療疾病的基于細(xì)胞凋亡的治療方法。連同以下對(duì)單獨(dú)的優(yōu)選實(shí)施方式或其組合的詳細(xì)描述，本發(fā)明的這些目的和其它 目的將變得更加顯而易見，而對(duì)于導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激響應(yīng)機(jī)理的出人 意料的發(fā)現(xiàn)滿足了本發(fā)明的這些目的和其它目的。在第一方面，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)或加重細(xì)胞ER中的應(yīng)激以引發(fā)細(xì)胞凋亡的方 法。本發(fā)明該方面的實(shí)施方式通常包括以下步驟選擇性抑制細(xì)胞中的肌漿/ER鈣ATP酶 (SERCA)活性而不抑制環(huán)氧化酶-2(C0X-2)活性；并提高細(xì)胞中CCAAT/增強(qiáng)物結(jié)合蛋白 同源轉(zhuǎn)錄因子(也稱為GADD153 可誘導(dǎo)生長停滯和DNA損傷的基因153 (CHOP))的表達(dá)。 SERCA活性的抑制和CHOP表達(dá)的提高的組合造成了有利于啟動(dòng)細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的情況。在第二方面，本發(fā)明提供了用于篩選、選擇或設(shè)計(jì)可用于誘導(dǎo)或加重細(xì)胞內(nèi)ER應(yīng) 激以引發(fā)細(xì)胞凋亡的化合物的方法。本發(fā)明該方面的實(shí)施方式通常包括下述步驟獲取有 關(guān)測(cè)試化合物的信息，并且如果該測(cè)試化合物是SERCA抑制劑而非C0X-2抑制劑則將其鑒 定為潛在的ER應(yīng)激加重劑。在第三方面，本發(fā)明提供了可用作ER應(yīng)激加重劑的化合物，所述化合物具有下述 通式其中，是甲基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、烷基、氟烷基、二氟烷基、三氟烷基、多氟 烷基、羥烷基或羧烷基；R2是氫、氟、氯、溴；氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、烷基、氟烷基、二氟烷基、三氟烷 基、多氟烷基、羥烷基或羧烷基；R3 R7獨(dú)立地選自由以下基團(tuán)組成的組氫、氟、氯、溴、烷氧基(alloxy)、烷基、氟烷基、二氟烷基、三氟烷基、多氟烷基、羥烷基或羧烷基、芳基和雜芳基；R8 Rn獨(dú)立地選自由以下基團(tuán)組成的組氫、氟、氯、溴；氟甲基、二氟甲基、三氟 甲基、烷基、氟烷基、二氟烷基、三氟烷基、多氟烷基、羥烷基、羧烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜 環(huán)基、芳基或雜芳基；和R12是氫、乙?；?、?；⑼榛?、氟烷基、二氟烷基、三氟烷基、多氟烷基、羥烷基、羧烷 基；氨基?；?、氨基烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基。在第四方面，本發(fā)明還提供了可用于誘導(dǎo)或加重細(xì)胞內(nèi)ER應(yīng)激以引發(fā)細(xì)胞凋亡 的藥物組合物。本發(fā)明該方面的實(shí)施方式通常包含ER應(yīng)激加重劑；和可藥用載體。在第五方面，本發(fā)明還提供了用于通過誘導(dǎo)或加重選定患病細(xì)胞中的ER應(yīng)激以 引發(fā)細(xì)胞凋亡從而治療患者的疾病狀況的方法。本發(fā)明的該方面的實(shí)施方式通常包括以下 步驟施用藥物有效量的本發(fā)明前述方面所述的藥物組合物。根據(jù)以下描述和所附權(quán)利要求，本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。


圖1顯示了 ER應(yīng)激響應(yīng)期間的關(guān)鍵事件的簡化模型。在嚴(yán)重ER應(yīng)激的情形中 (如SERCA抑制后)，翻譯衰減隨即發(fā)生并參與后續(xù)的ER應(yīng)激響應(yīng)(ESR)事件。ESR由兩 個(gè)對(duì)抗性部分組成(1)執(zhí)行確保應(yīng)激下的細(xì)胞存活的防御性過程的保護(hù)成分(列于左框 內(nèi))，和(2)促凋亡(誘導(dǎo)死亡)成分(列于右框內(nèi))，所述促凋亡成分在應(yīng)激極為過度或 無法被緩解時(shí)(如在SERCA抑制劑的持續(xù)性存在下)開始占支配地位并引發(fā)細(xì)胞死亡(細(xì) 胞凋亡)。在往往存在于腫瘤細(xì)胞中的低水平/慢性ER應(yīng)激的情形中，左框內(nèi)的成分保持 支配地位并且即使在腫瘤組織中通常存在的不利條件下(低氧水平、低葡萄糖水平)仍支 持腫瘤細(xì)胞存活；在這些條件下，右框所示成分不存在或僅具有弱活性。然而，當(dāng)腫瘤細(xì)胞 遭遇額外的ER應(yīng)激時(shí)，如通過對(duì)SERCA的藥理學(xué)抑制，則已存在的低水平ER應(yīng)激將被極大 地加重并且右框中所示成分被激活并獲得支配地位；在這些條件下，左框中的成分的防御 效果被壓制，而右框中的成分將執(zhí)行腫瘤細(xì)胞死亡。應(yīng)注意，所列的半胱天冬酶12是指該 酶的鼠型；其人類直向同源物是半胱天冬酶4 ( S卩，人半胱天冬酶4和小鼠半胱天冬酶12在 ESR事件當(dāng)中執(zhí)行類似的功能)。圖2說明了 ER應(yīng)激響應(yīng)體系的三個(gè)主要活性水平以及GRP78和CHOP的對(duì)抗防御 性/促凋亡功能㈧“無ER應(yīng)激”情況(左)是正常細(xì)胞中的默認(rèn)情況。此處，ER腔中極 低水平的GRP78與PERK、IRE1和ATF6結(jié)合并將這些ER應(yīng)激成分維持于其無活性狀態(tài)。(B) 在癌細(xì)胞中，慢性應(yīng)激(低葡萄糖、缺氧、錯(cuò)折疊的蛋白)產(chǎn)生“低ER應(yīng)激”情況(中)。此 處，低水平的連續(xù)應(yīng)激導(dǎo)致ER應(yīng)激響應(yīng)體系的部分激活，其重點(diǎn)是GRP78的水平升高(粗 箭頭)，這提供了 ER應(yīng)激體系的保護(hù)成分并進(jìn)而增加腫瘤細(xì)胞的化療抗性。在該情形中， ER跨膜成分PERK、IRE1和ATF6顯示出低活性水平，可以推測(cè)這些跨膜成分受GRP78微調(diào) 和調(diào)節(jié)。高水平的GRP78諸如通過充當(dāng)錯(cuò)折疊蛋白的分子伴侶的能力來幫助中和初始應(yīng)激 情況的有害影響。(C)持續(xù)性高水平應(yīng)激產(chǎn)生“嚴(yán)重ER應(yīng)激”情況(右)，其特征在于經(jīng)由 PERK介導(dǎo)的對(duì)翻譯起始因子2 a (eIF2 a )的磷酸化(=失活)而嚴(yán)重(但短暫)抑制蛋白 合成(粗線)。在這些條件下，GRP78的保護(hù)效果被壓制，而促凋亡CHOP的激活和隨后的細(xì) 胞死亡的啟動(dòng)占支配地位(極粗箭頭)。我們的研究已表明，在用DMC處理腫瘤細(xì)胞期間，
7“嚴(yán)重ER應(yīng)激”情形出現(xiàn)。在該藥物的持續(xù)性存在下，盡管GRP78水平升高，細(xì)胞仍無法中 和藥物誘導(dǎo)的應(yīng)激；相反，CHOP的強(qiáng)誘導(dǎo)和半胱天冬酶4的激活啟動(dòng)了細(xì)胞凋亡，從而細(xì)胞死亡。圖3顯示了塞來昔布和DMC在不同癌細(xì)胞系中誘導(dǎo)的CHOP蛋白水平。將幾種不 同的癌細(xì)胞系(如左側(cè)所示)在塞來昔布(Cxb ；40iiM和60 uM)或DMC(30iiM和50 y M) 的存在下培養(yǎng)48小時(shí)(Co 對(duì)照，未經(jīng)處理的細(xì)胞)。制備總細(xì)胞裂解物并通過蛋白印跡分 析以CHOP特異性抗體進(jìn)行分析。作為等量內(nèi)參對(duì)照，也用肌動(dòng)蛋白抗體對(duì)所有印跡進(jìn)行分 析(底部僅顯示了一個(gè)這類對(duì)照印跡)。右側(cè)指明了各個(gè)細(xì)胞系的腫瘤類型。圖4顯示同樣通過DMC和毒胡蘿卜素誘導(dǎo)ER應(yīng)激指示物。如圖所示，在lyM毒 胡蘿卜素(Tg)或60yM DMC的存在下將U251膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)不同的時(shí)間。制備總 細(xì)胞裂解物并通過蛋白印跡以對(duì)ER應(yīng)激蛋白GRP78、CH0P和半胱天冬酶4(Casp 4)特異性 的抗體進(jìn)行分析。將肌動(dòng)蛋白用作內(nèi)參對(duì)照。前Casp 4是指無活性的半胱天冬酶4酶原， 而切割Casp 4是指該酶的活化形式；*是指在這些蛋白印跡中不一致地觀察到的快速遷移
市o圖5顯示出DMC和塞來昔布而非其它昔布類藥物或NSAID (非留體抗炎藥)誘導(dǎo) 鈣釋放入胞質(zhì)。(A)用DMC或各種昔布類藥物和NSAID處理U251細(xì)胞，并如“Materials & Methods (材料和方法)”中所述記錄細(xì)胞內(nèi)鈣水平的變化。頂部兩個(gè)系列顯示了鈣增加的 典型峰(spike)，這與響應(yīng)于DMC或塞來昔布治療所觀察到的現(xiàn)象一致。第三系列顯示了對(duì) 伐地昔布、羅非昔布、氟比洛芬、噴哚美辛和舒林酸的典型響應(yīng)(即缺乏響應(yīng))(僅顯示伐地 昔布)。箭頭指示藥物添加的時(shí)間點(diǎn)。(B)圖表顯示從數(shù)次重復(fù)所得的響應(yīng)于不同藥物治 療的平均鈣增加(平均值士SD)。用LN229細(xì)胞系也獲得了基本相似的結(jié)果。圖6顯示了 CHOP和GRP78的誘導(dǎo)對(duì)塞來昔布和DMC具特異性。在DMC、塞來昔 布、羅非昔布或伐地昔布的存在下培養(yǎng)U251膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，并通過蛋白印跡分析確定 CHOP和GRP78的蛋白水平。所示為(A)各種藥物在50 y M時(shí)的時(shí)間動(dòng)力學(xué)，和⑶溫育15 小時(shí)后的濃度依賴性。Bgr.是指所觀察到的與GRP78抗體不一致的背景信號(hào)。所有印跡平 行進(jìn)行，從而可以直接對(duì)比不同系列之間的信號(hào)強(qiáng)度。應(yīng)當(dāng)注意，DMC是最有效的刺激劑， 而羅非昔布和伐地昔布在這些條件下無活性。圖7顯示CHOP和GRP78的誘導(dǎo)對(duì)塞來昔布和DMC具特異性并且需要鈣。在DMC、 塞來昔布、羅非昔布或伐地昔布的存在下培養(yǎng)U251膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，并通過蛋白印跡分 析確定CHOP和GRP78的蛋白水平。所示為(A)各種藥物在50 y M時(shí)的時(shí)間動(dòng)力學(xué)，和(B) 溫育15小時(shí)后的濃度依賴性。Bgr.是指用所觀察到的與GRP78抗體不一致的背景信號(hào)。 在(C)中，在存在或不存在20 ii M BAPTA-AM和0. 78mM EGTA (均為有效Ca2+螯合劑)的條 件下用60iiM DMC處理細(xì)胞。A和B中的所有印跡均平行進(jìn)行，從而可以直接對(duì)比不同系列 之間的信號(hào)強(qiáng)度。圖8顯示了 CHOP和GRP78的誘導(dǎo)與細(xì)胞凋亡的增加以及細(xì)胞生長和存活的減少 相關(guān)。用不同藥物處理U251膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，并對(duì)比分析細(xì)胞生長和細(xì)胞死亡的各種參 數(shù)。將未經(jīng)處理(Co)或僅用溶劑DMS0處理的細(xì)胞作為對(duì)照。(A)用30iiM或50iiM DMC 處理細(xì)胞48小時(shí)并通過各種測(cè)試確定對(duì)細(xì)胞生長/存活和細(xì)胞死亡的影響。標(biāo)記為“集 落數(shù)”的系列顯示了來自集落形成測(cè)試的結(jié)果，其中確定了能夠產(chǎn)生新生長細(xì)胞的集落的存活細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目。標(biāo)記為“細(xì)胞生長和存活％ ”的系列顯示了在48小時(shí)藥物處理期結(jié) 束時(shí)進(jìn)行的常規(guī)MTT測(cè)試的結(jié)果。標(biāo)記為“凋亡細(xì)胞％ ”的系列顯示了由48小時(shí)藥物處理 后的TUNEL測(cè)試所顯示的經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞的百分比。在上述三個(gè)系列之下顯示了 48小時(shí) 藥物處理結(jié)束時(shí)通過特異性抗體的蛋白印跡分析所確定的ER應(yīng)激指示物CHOP、GRP78和 半胱天冬酶4的表達(dá)水平(肌動(dòng)蛋白充當(dāng)內(nèi)參對(duì)照)。(B)如圖所示，用各種濃度的不同藥 物處理細(xì)胞48小時(shí)，并用細(xì)胞死亡ELISA試劑盒測(cè)定細(xì)胞死亡。(C)如圖所示，用DMC或 各種昔布類藥物以及傳統(tǒng)NSAID處理細(xì)胞48小時(shí)，并用常規(guī)MTT測(cè)試確定細(xì)胞生長和存 活(將對(duì)照、未經(jīng)處理的細(xì)胞設(shè)定為100% )。如其它文獻(xiàn)(34)所詳細(xì)描述，在96孔板中 使用3. 0 X 103 8. 0 X 103細(xì)胞/孔進(jìn)行MTT測(cè)試。平行地通過蛋白印跡分析確定CHOP和 GRP78蛋白的表達(dá)水平。應(yīng)該注意，DMC是最有效的藥物，塞來昔布弱得多，而沒有任何其它 昔布類藥物或傳統(tǒng)NSAID在這些條件下是有活性的。圖9顯示GRP78的敲減(knock-down)提高了塞來昔布和DMC的細(xì)胞殺傷，而半 胱天冬酶4的敲減降低了塞來昔布和DMC的細(xì)胞殺傷。用指向GRP78(si-GRP78)或半胱 天冬酶4(Si-CaSp 4)的siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染U251膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞。將靶向綠色熒光蛋白 的siRNA(si-GFP)用作對(duì)照。(A)轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，在si-GRP78/si_GFP的情形中用40 y M 塞來昔布(Cxb)和30 ii M DMC處理平行培養(yǎng)物，或在si-Casp 4/si-GFP的情形中用60 y M Cxb和40 PM DMC處理平行培養(yǎng)物；在所有情形中，對(duì)照培養(yǎng)物不接受藥物處理或僅用溶劑 (DMS0)處理。藥物處理48小時(shí)后，除去藥物并通過集落形成測(cè)試確定存活細(xì)胞分?jǐn)?shù)。所 示為存活細(xì)胞百分比(其中將處在未經(jīng)藥物處理的條件下的集落數(shù)設(shè)定為100% )。所示p 值分別表示接受si_GRP78與接受對(duì)照siRNA (si-GFP)的細(xì)胞之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性存活差 異，以及接受si-Casp 4與接受對(duì)照siRNA的細(xì)胞之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性存活差異。(B)為了 驗(yàn)證siRNA的有效性，進(jìn)行了靶標(biāo)蛋白的蛋白印跡分析。應(yīng)該注意，GRP78的敲減導(dǎo)致CHOP 蛋白的水平增加，這正如由其中GRP78信號(hào)處于CHOP上游的ER應(yīng)激模型所預(yù)期的。半胱 天冬酶4siRNA還下調(diào)其靶標(biāo)(且經(jīng)切割的半胱天冬酶4變得不可檢測(cè))，但不影響響應(yīng)于 塞來昔布或DMC的GRP78誘導(dǎo)，這正如由其中半胱天冬酶4處于GRP78信號(hào)的下游的ER應(yīng) 激模型所預(yù)期的。圖10顯示DMC和塞來昔布而非羅非昔布在體內(nèi)刺激腫瘤細(xì)胞中的ER應(yīng)激響應(yīng)和 細(xì)胞凋亡。將U87膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞由皮下植入裸鼠。一旦腫瘤達(dá)到500mm3的體積，則每 兩只動(dòng)物接受36小時(shí)的DMC或羅非昔布(150mg/kg)，或不接受任何藥物。其后，將所有6 只動(dòng)物處死并通過免疫組織化學(xué)染色分析其腫瘤中的CHOP蛋白，并且通過TUNEL測(cè)試分析 其細(xì)胞死亡/凋亡。左列CH0P蛋白表達(dá)(黑色小方框表示中列所示的同一照片的放大區(qū) 域)。右列細(xì)胞死亡(箭頭指示TUNEL陽性的實(shí)例，S卩，凋亡細(xì)胞)。通過增加藥物(包括 塞來昔布)的日劑量50小時(shí)來重復(fù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)(見“Materials & Methods (材料和方法)”)， 獲得相似結(jié)果。在所有情形中，所示均為代表性部分。圖11顯示DMC而非羅非昔布在體內(nèi)抑制腫瘤生長。將U87膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞由 皮下植入裸鼠。一旦形成了可觸知的腫瘤，則動(dòng)物每日接受補(bǔ)充有DMC、羅非昔布或無藥物 的食物。每隔3天測(cè)定腫瘤尺寸。所示為每組(n = 5)的平均腫瘤體積(平均值士SD)。 星號(hào)O 第42天對(duì)照與經(jīng)DMC處理的動(dòng)物之間的p < 0. 01。圖12顯示硼替佐米、塞來昔布和DMC降低了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的存活。在遞增濃度的(A)硼替佐米(BZM)、(B)塞來昔布(CXB)或(C)2，5-二甲基塞來昔布(DMC)的存在下 培養(yǎng)48小時(shí)后通過MTT測(cè)試確定各個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的細(xì)胞生長和存活。為了與已 知的硼替佐米抗多發(fā)性骨髓瘤的效果進(jìn)行比較，在(A)中包括有RPMI/8226多發(fā)性骨髓瘤 細(xì)胞系。圖13顯示DMC和硼替佐米誘導(dǎo)了 ER應(yīng)激指示物。在遞增濃度的(A)硼替佐米 (BZM)或(B)DMC的存在下將U251膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)。用對(duì)泛素、GRP78、CH0P 和半胱天冬酶4具特異性的抗體通過蛋白印跡分析總細(xì)胞裂解物。將肌動(dòng)蛋白用作內(nèi)參對(duì) 照。Pro-casp-4表示無活性的半胱天冬酶4酶原，而切割的casp-4表示該酶的活化形式。 出于比較的目的，將用lOnM硼替佐米處理的細(xì)胞與⑶中的經(jīng)DMC處理的細(xì)胞并排進(jìn)行分 析，表明經(jīng)硼替佐米處理的細(xì)胞中的泛素化的量比經(jīng)DMC處理的細(xì)胞中的泛素化的量普遍 得多。應(yīng)該注意，在半胱天冬酶4印跡中觀察到數(shù)個(gè)非特異性背景條帶(與文獻(xiàn)中的相似 觀察一致)；使用各種對(duì)照(未顯示)并與文獻(xiàn)對(duì)比鑒定出了特異性條帶。圖14顯示塞來昔布和DMC增強(qiáng)了由硼替佐米引起的生長抑制和細(xì)胞死亡。用硼 替佐米(BZM)、塞來昔布(CXB)或DMC單獨(dú)或組合處理膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系。(A)說明藥物 處理48小時(shí)后LN229和U251細(xì)胞中的組合藥物處理效果的顯微照片。所示為代表性部 分。(B)組合藥物效果的定量分析。用上述藥物處理LN229細(xì)胞8小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)。 通過臺(tái)盼藍(lán)據(jù)染測(cè)試法確定細(xì)胞活力。用三等份樣品進(jìn)行所述測(cè)試，結(jié)果代表3次獨(dú)立實(shí) 驗(yàn)。所示為各條件下的活細(xì)胞數(shù)(平均值士SD)。(C)在所示藥物的存在下將U87MG細(xì)胞培 養(yǎng)24小時(shí)，通過細(xì)胞死亡ELISA確定細(xì)胞死亡的程度(以平均百分比表示；n = 4 ； 士SD)。 (D)用藥物處理LN229細(xì)胞48小時(shí)并在其后2周確定能產(chǎn)生集落的長期存活細(xì)胞數(shù)(集 落形成測(cè)試)。所示為來自三次實(shí)驗(yàn)的存活細(xì)胞百分比(平均值士SD)。將由未經(jīng)藥物處 理的對(duì)照獲得的集落數(shù)設(shè)定為100%。在A D中，使用了以下藥物濃度LN229 :5nM BZM, 60 uM CXB,40uM DMC ；U251 :10nM BZM, 50 u M CXB 或 30 ii M DMC ；U87MG :5nM BZM, 50 u M CXB，35yMDMC。星號(hào)表明單獨(dú)藥物處理與組合藥物處理之間的差異在統(tǒng)計(jì)上極為顯著(p < 0. 001)。圖15顯示塞來昔布和DMC增強(qiáng)了由硼替佐米引起的ER應(yīng)激指示物上調(diào)和細(xì)胞凋 亡。如圖所示，在10nM硼替佐米(BZM) ,50 uM塞來昔布(CXB)或35 y M DMC單獨(dú)或組合存 在下將(A)U87MG細(xì)胞和(B)T98G細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)。如圖所示，用對(duì)GRP78、CH0P、半胱天冬 酶-3 (Casp-3)、半胱天冬酶-4 (Casp-4)、半胱天冬酶_7 (Casp-7)、半胱天冬酶_9 (Casp-9)、 PARP和JNK具特異性的抗體通過蛋白印跡分析總細(xì)胞裂解物。將肌動(dòng)蛋白用作內(nèi)參對(duì)照。 Pro-casp表示全長(無活性)半胱天冬酶酶原，而切割的casp表示這些酶的活化形式。用 特異性識(shí)別在Thrl83/Tyrl85上被磷酸化的JNK (p-JNKl/2)的抗體來確定JNK1和JNK2的 活性。用與所有存在的JNK形式反應(yīng)的抗體確認(rèn)了等量的JNK1。圖16顯示GRP78的敲減提高了由組合藥物處理造成的細(xì)胞殺傷。用指向GRP78的 siRNA(si-GRP78)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞。將靶向綠色熒光蛋白的siRNA(si-GFP)用作對(duì)照。 (A)轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，用與25 ii M塞來昔布(CXB)或15 y M DMC組合的5nM硼替佐米(BZM) 處理平行培養(yǎng)物。平行地，轉(zhuǎn)染的對(duì)照培養(yǎng)物未接受藥物處理或僅以溶劑(DMS0)處理。48 小時(shí)后，除去藥物并通過12天 14天的集落形成測(cè)試確定存活細(xì)胞分?jǐn)?shù)。所示為能生成 集落的存活細(xì)胞的百分比(其中，將未經(jīng)藥物處理的條件下的集落數(shù)設(shè)為100%)。經(jīng)藥物處理的siGRP78轉(zhuǎn)染細(xì)胞中集落數(shù)的減少與經(jīng)藥物處理的siGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比在統(tǒng)計(jì)上顯 著(p < 0. 002)。(B)為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)染的siRNA的有效性和特異性，對(duì)經(jīng)各藥物處理的siGFP 轉(zhuǎn)染細(xì)胞和siGRP78轉(zhuǎn)染細(xì)胞的GRP78表達(dá)平行進(jìn)行蛋白印跡分析。同時(shí)處理和顯影這兩 組印跡，因此能對(duì)其直接并排比較。盡管GRP78受其siRNA的下調(diào)不是100%有效，然而與 用siGFP轉(zhuǎn)染的配比對(duì)照細(xì)胞相比，在各個(gè)條件下該蛋白水平一致下降。值得注意的是，在 該實(shí)驗(yàn)中使用了總體濃度更低的各個(gè)藥物以便能檢測(cè)由siRNA預(yù)處理引起的進(jìn)一步提高 的細(xì)胞死亡。圖17顯示DMC加強(qiáng)了硼替佐米在體內(nèi)對(duì)ER應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響。用lmg/kg 硼替佐米(BZM)和7.5mg/kg DMC單獨(dú)或組合治療帶有腫瘤的小鼠，或不對(duì)其進(jìn)行治療。50 小時(shí)后，將動(dòng)物處死并通過免疫組織化學(xué)染色對(duì)腫瘤的CHOP (ER應(yīng)激指示物)進(jìn)行分析或 通過TUNEL分析腫瘤(細(xì)胞凋亡指示物)。(A)上行顯示用CHOP抗體染色的腫瘤組織，而 中間行顯示了相同部分的放大區(qū)域(由小方框指出)。下行顯示TUNEL染色；一些選出的 TUNEL陽性細(xì)胞由箭頭指明。⑶在從各個(gè)處理組隨機(jī)選取的10個(gè)顯微區(qū)域中確定了 TUNEL 陽性細(xì)胞的百分比并以平均值士SD表示。在圖表中表明了單獨(dú)藥物治療與組合藥物治療 之間的腫瘤細(xì)胞死亡程度具統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。圖18顯示了神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療的標(biāo)準(zhǔn)物替莫唑胺(TMZ)和通過加重的ER應(yīng)激起作 用的非昔布類藥物塞來昔布類似物2，5-二甲基塞來昔布(DMC)的協(xié)同效果。結(jié)果顯示出 由TMZ(300 ii M)和20 ii M DMC組合治療48小時(shí)的腫瘤相關(guān)腦內(nèi)皮細(xì)胞(TuBEC)的細(xì)胞殺 傷增加。藥物治療后，將所述細(xì)胞在不存在藥物的條件下再溫育12天，以便確定其長期存 活；此時(shí)用臺(tái)盼藍(lán)據(jù)染技術(shù)評(píng)估細(xì)胞毒性。結(jié)果以每組的活細(xì)胞數(shù)表示。圖19顯示了本發(fā)明的實(shí)施方式的3個(gè)相關(guān)衍生物誘導(dǎo)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中細(xì) 胞凋亡的相對(duì)能力。最有效的化合物是2，5-二(三氟甲基)衍生物(DTF3C)。
具體實(shí)施例方式如發(fā)明內(nèi)容中所述，本發(fā)明基于對(duì)使用ER應(yīng)激響應(yīng)機(jī)理來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的新策 略的出乎意料的發(fā)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的策略，本發(fā)明的實(shí)施方式提供了用于實(shí)施所述策略的 方法和手段。具體而言，本發(fā)明提供了一類新的化學(xué)治療化合物，所述化合物能對(duì)誘導(dǎo)積極 增殖的癌細(xì)胞和休眠的癌細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡(細(xì)胞死亡)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ESR)進(jìn)行調(diào)節(jié)。 這些化合物還抑制腫瘤浸潤、血管發(fā)生(vasculogenesis)和血管生成(angiogenesis)。而 且，這些化合物的特征在于高生物可利用性(包括CNS)、幾乎不表現(xiàn)毒性、能通過口服施用 并且可以與標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)治療劑組合以提高抗癌效果。本發(fā)明的某些方面的治療方法旨在將癌 癥作為活實(shí)體而非畸變細(xì)胞的組合進(jìn)行治療并且可以被應(yīng)用于所有癌癥。此處提供了對(duì)ER應(yīng)激響應(yīng)機(jī)理的簡要討論以幫助全面和完整地理解本發(fā)明的策 略，但這并非旨在限定于任何特定理論。ER應(yīng)激響應(yīng)模型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激響應(yīng)(ESR)由一組能由如未折疊蛋白的積聚、脂質(zhì)或糖脂的失衡 或者ER腔的離子條件變化等正常ER功能的差別性擾動(dòng)引發(fā)的適應(yīng)性途徑組成(綜述見 (5，6))。ESR的主要目的是減輕應(yīng)激性干擾并恢復(fù)正確的ER穩(wěn)態(tài)；然而，在強(qiáng)烈或持續(xù)性 ER應(yīng)激的情況下，這些途徑將引發(fā)編程性細(xì)胞死亡/細(xì)胞凋亡。ESR的核心促存活調(diào)節(jié)物之
11一是葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78/BiP)，該蛋白在蛋白折疊和組裝、靶向錯(cuò)折疊蛋白以進(jìn)行降 解、ER Ca2+結(jié)合和控制跨膜ER應(yīng)激傳感器的激活中具有重要作用(7)。另一方面，CCAAT/ 增強(qiáng)物結(jié)合蛋白同源轉(zhuǎn)錄因子(CH0P/GADD153)和半胱天冬酶4是ESR的促凋亡功能的關(guān) 鍵執(zhí)行者(8,9) 0圖1說明了 ER應(yīng)激響應(yīng)的簡化模型。在該圖中，從上到下的排列對(duì)應(yīng)于應(yīng)激的 持續(xù)時(shí)間(9)。將不同的信號(hào)事件根據(jù)其是否對(duì)細(xì)胞有促凋亡(細(xì)胞凋亡)或抗凋亡(存 活)效果而從左至右分組。圖底部的天平表示這兩類信號(hào)之間的錯(cuò)綜復(fù)雜的平衡。在應(yīng)激 響應(yīng)的早期，發(fā)生翻譯衰減以減少ER應(yīng)激的負(fù)荷。在下一階段，數(shù)組基因被轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)以長 期適應(yīng)于ER應(yīng)激。應(yīng)激誘導(dǎo)的蛋白的新合成避開了一般性翻譯衰減。為了應(yīng)對(duì)ER中的未 折疊蛋白，首先誘導(dǎo)了 ER分子伴侶以將這些蛋白再折疊，而如果這一響應(yīng)不當(dāng)，則誘導(dǎo)ER 相關(guān)降解(ERAD)成分來消除所述未折疊蛋白。為了重建ER，還誘導(dǎo)了如氨基酸輸入基因、 谷胱甘肽生物合成基因和氧化保護(hù)基因等多種基因。為了引起免疫響應(yīng)和抗凋亡效果，將 NF k B激活。另一方面，如果嚴(yán)重ER應(yīng)激情況持續(xù)下去，則細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑被激活，包括 誘導(dǎo)CHOP和激活c-Jim N端激酶(JNK激酶)和半胱天冬酶12。存活或凋亡的轉(zhuǎn)折點(diǎn)可能 取決于存活信號(hào)和凋亡信號(hào)之間的平衡。圖2顯示了三種ER應(yīng)激情況，即無ER應(yīng)激、低ER應(yīng)激和嚴(yán)重ER應(yīng)激。本發(fā)明 描述了能夠在處于低水平ER應(yīng)激狀態(tài)中但仍能存活的細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法、化合 物和組合物。所提供的化合物將這些帶有低ER應(yīng)激的細(xì)胞“輕推”向嚴(yán)重ER應(yīng)激情況，即 使細(xì)胞的信號(hào)平衡從可存活情況轉(zhuǎn)向凋亡。所提供的化合物單純加重ER應(yīng)激的能力使得 即使其僅表現(xiàn)出中等促凋亡效力仍可以以這種方式使用，這也使通常存在于無ER應(yīng)激的 情況下的正常細(xì)胞中的凋亡誘導(dǎo)最小化。在典型的低ER應(yīng)激情況下，GRP78以通常比其在 正常細(xì)胞中的存在水平高兩倍的水平在細(xì)胞中表達(dá)，而對(duì)應(yīng)的CHOP水平不足以啟動(dòng)細(xì)胞 凋亡。然而，在使用本發(fā)明提供的化合物和組合物后，CHOP的水平增加至足以克服對(duì)應(yīng)的 GRP78水平的保護(hù)效果的水平，從而導(dǎo)致嚴(yán)重應(yīng)激情況并啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。實(shí)質(zhì)上，所提供的 化合物僅僅通過加重已處于低ER應(yīng)激狀態(tài)的細(xì)胞的ER應(yīng)激而充當(dāng)“壓垮駱駝背的稻草” 而并非能夠在任何細(xì)胞類型中啟動(dòng)ER應(yīng)激并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。所提供的化合物的該關(guān)鍵特 點(diǎn)使其具有充當(dāng)多種病癥的耐受良好的潛在治療劑的能力，所述病癥的發(fā)病機(jī)理涉及處于 低ER應(yīng)激狀態(tài)的細(xì)胞并可受益于對(duì)所述細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。這種情況在許多形式 的癌癥以及數(shù)種其它疾病中都存在。ER應(yīng)激響應(yīng)和癌癥治療盡管已經(jīng)開始認(rèn)識(shí)到ER應(yīng)激與腫瘤生長和存活的相關(guān)性，但有關(guān)其用于腫瘤治 療的潛在利用仍知之甚少。更重要的是，還沒有已知的對(duì)ER應(yīng)激響應(yīng)途徑的攻擊點(diǎn)或可為 可行的治療方案提供基礎(chǔ)的化合物。例如，一種引發(fā)ER應(yīng)激響應(yīng)的可能有效的模式是抑制肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+_ATP酶 (SERCA)，該酶是將胞漿Ca2+隔離在其胞內(nèi)ER存儲(chǔ)室內(nèi)的胞內(nèi)膜結(jié)合酶。SERCA的抑制導(dǎo) 致被釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)并造成嚴(yán)重ER應(yīng)激的激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。盡管已對(duì)數(shù)種SERCA 抑制劑進(jìn)行了描述，但這些SERCA抑制劑都沒有可用作癌癥治療用促凋亡劑的可接受的治 療概況。例如，最有效的SERCA抑制劑天然產(chǎn)物毒胡蘿卜素因其高毒性和高組胺釋放能力 而不適于作為治療劑。
發(fā)現(xiàn)的另一種SERCA抑制劑化合物是抗炎藥塞來昔布(Celebrex )，它是環(huán)氧化 酶-2(C0X-2)的抑制劑(Dannenberg，AJ 和 Subbaramaiah，K，Cancer Cell 2003:4:431)。 然而，C0X-2抑制劑的長期使用與可能威脅生命的心血管風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，這導(dǎo)致藥物羅非昔布 (Vioxx )的撤回(Funk, CD 禾口 Fitzgerald, GA, Journal of Cardiovascular Pharmacology 2007 ；50 470)。而且，通常認(rèn)為，C0X-2抑制劑(昔布類)和其它NSAID的抗癌活性的基本 生化機(jī)理是通過對(duì)催化前列腺素合成的起始步驟的環(huán)氧化酶(COX)的抑制(10)。塞來昔布 是稱作昔布類藥物的C0X-2特異性抑制劑的一員的事實(shí)使其抗癌活性可能也與C0X-2抑制 有關(guān)的可能性懸而未決。在一些近期研究中，已經(jīng)注意到用包括塞來昔布在內(nèi)的各種NSAID處理培養(yǎng)的細(xì) 胞產(chǎn)生了增加的胞內(nèi)鈣水平([Ca2Ii)和隨后的ER應(yīng)激響應(yīng)的激活(參考文獻(xiàn)11 16)。 盡管這些觀察結(jié)果暗示著NSAID作為一類可以通過ER應(yīng)激響應(yīng)途徑來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥 物的可能性，但引起這種效果所需的高水平NSAID濃度(0. lmmol/L > 1. Ommol/L)使得 這種偶然聯(lián)系極具猜測(cè)性。在這些濃度下，如C0X-2抑制等NSAID的其它效果很可能占據(jù) 主導(dǎo)，使其不太可能是具有高特異性的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)用工具的候選物。令人驚訝的是，在一系列報(bào)道中，發(fā)現(xiàn)塞來昔布在不存在任何明顯的C0X-2參與 時(shí)仍能發(fā)揮有效的抗增殖和促凋亡效果(參考文獻(xiàn)17 23)。盡管這些觀察結(jié)果表明塞來 昔布可能具有導(dǎo)致癌細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的不依賴于C0X-2的第二靶標(biāo)，但其基本機(jī)理尚未被 了解。本發(fā)明的發(fā)明人已進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來研究該未知機(jī)理并且已出乎意料地發(fā)現(xiàn)塞來昔布 的不依賴于C0X-2的抗腫瘤活性實(shí)際上是經(jīng)由ER應(yīng)激響應(yīng)途徑。而且，發(fā)現(xiàn)存在在體外和 體內(nèi)都表現(xiàn)出有效的ER應(yīng)激誘導(dǎo)活性的塞來昔布的結(jié)構(gòu)類似物(支持實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)見“實(shí)施 例”)。盡管已知NSAID能在高濃度時(shí)刺激ER應(yīng)激響應(yīng)并引發(fā)促存活GRP78和促凋亡CHOP 蛋白的表達(dá)，但顯而易見，塞來昔布的效果造成強(qiáng)ER應(yīng)激，強(qiáng)ER應(yīng)激導(dǎo)致CHOP表達(dá)升高從 而壓制了 GRP78的保護(hù)效果，而這反過來激活了半胱天冬酶4并使細(xì)胞凋亡。定義如本文所用，短語“ER應(yīng)激”總體指可能損害ER中的蛋白合成的各種生理情況和 病理情況。如本文所用，術(shù)語“SERCA”是肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶的首字母縮寫，所述酶是均 以相似方式充當(dāng)鈣跨膜泵的一小族高度保守蛋白(同種型)。如本文所用，術(shù)語“C0X-2”是指環(huán)氧化酶-2，也稱前列腺素內(nèi)過氧化酶(前列腺素 G/H合成酶和環(huán)氧化酶)。如本文所用，術(shù)語“CHOP”是指CCAAT/增強(qiáng)物結(jié)合蛋白同源轉(zhuǎn)錄因子，也稱生長停 滯和DNA損傷可誘導(dǎo)基因153 (GADD153)。如本文所用，短語“ER應(yīng)激加重劑”是指能直接或間接地誘導(dǎo)或加重ER中的應(yīng)激 的試劑。這類試劑的構(gòu)成不受特別限制，本質(zhì)上可以為化學(xué)方式或物理方式。物理劑的實(shí) 例可包括但不限于溫度、輻射和聲音?；瘜W(xué)劑的實(shí)例可包括但不限于細(xì)胞信號(hào)分子、細(xì)胞毒 性試劑、毒素或其它代謝物。另外，如缺氧、低PH、缺乏營養(yǎng)等特定細(xì)胞微環(huán)境條件也可能引 發(fā)ER應(yīng)激。如本文所用，術(shù)語“前藥”是指其中母體分子無活性或具有極小活性的藥理學(xué)物質(zhì)(藥物)。如本文所用，術(shù)語“協(xié)同”或“協(xié)同效果”是指這樣的藥物組合其中所得藥理效果 的活性比單獨(dú)使用的藥物活性大兩倍(即，組合大于其各部分的總和)。如本文所用，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解來使用烷基、烷氧基、羰基等命名。如本說明書中所用，烷基可以包括含有多達(dá)約20個(gè)碳或1 16個(gè)碳的直鏈、支化 的烷基和環(huán)烷基，且為直鏈或支化的。本文的示例性烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、異 丙基、異丁基、正丁基、仲丁基、叔丁基、異戊基、新戊基、叔戊基和異己基。如本文所用，低級(jí) 烷基是指具有約1個(gè)或約2個(gè)碳最多達(dá)約6個(gè)碳的碳鏈。合適的烷基可以為飽和的或不飽 和的。此外，烷基還可以由取代基在一個(gè)或多個(gè)碳原子上取代一次或多次，所述取代基選自 由Cl C15烷基、烯丙基、聯(lián)烯基、烯基、C3 C7雜環(huán)、芳基、鹵素、羥基、氨基、氰基、氧代、 硫代、烷氧基、甲?；Ⅳ然⒓柞０坊?、磷?；㈧⑺峄?、磷酰胺基、磺酰基、烷基磺酸基、芳 基磺酸基和磺酰胺組成的組。另外，烷基可以含有多達(dá)10個(gè)雜原子，在某些實(shí)施方式中烷 基可含1、2、3、4、5、6、7、8或9個(gè)雜原子取代基。合適的雜原子包括氮、氧、硫和磷。如本文所用，“環(huán)烷基”是指單環(huán)或多環(huán)體系，在某些實(shí)施方式中為3 10個(gè)碳原 子，在其它實(shí)施方式中為3 6個(gè)碳原子。環(huán)烷基的環(huán)體系可以由一個(gè)環(huán)或以稠合、橋聯(lián)或 螺聯(lián)方式連接起來的兩個(gè)以上的環(huán)構(gòu)成。如本文所用，“芳基”是指含有3 16個(gè)碳原子的單環(huán)或多環(huán)基團(tuán)。如本說明書中 所用，芳基是可以含有多達(dá)10個(gè)雜原子、在某些實(shí)施方式中含有1、2、3或4個(gè)雜原子的芳 基?？蛇x地，芳基還可以由芳基或低級(jí)烷基取代一次或多次、在某些實(shí)施方式中取代1 3 次或4次，并且芳基還可與其它芳基或環(huán)烷基環(huán)稠合。合適的芳基包括例如苯基、萘基、甲 苯基、咪唑基、吡啶基、吡咯基、噻吩基、嘧啶基、噻唑基和呋喃基。如本說明書中所用，環(huán)被定義為具有可包含一個(gè)或多個(gè)氮、氧、硫或磷原子的多達(dá) 20個(gè)原子，只要所述環(huán)可以具有選自由氫、烷基、烯丙基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、氯、碘、 溴、氟、羥基、烷氧基、芳氧基、羧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰氨基、甲酰氨基、氰基、 氧代、硫代、烷基硫代、芳基硫代、?；虼?、烷基磺酸基、芳基磺酸基、磷?；㈧⑺峄?、磷酰 胺基和磺?；M成的組的一個(gè)或多個(gè)取代基即可，此外只要所述環(huán)還可包含包括碳環(huán)、雜 環(huán)、芳環(huán)或雜芳環(huán)的一個(gè)或多個(gè)稠環(huán)即可。如本文所用，如果未具體指明，則烯基和炔基碳鏈含有2 20個(gè)碳或2 16個(gè)碳， 且為直鏈或支化的。在某些實(shí)施方式中，2 20個(gè)碳的烯基碳鏈含有1 8個(gè)雙鍵，在某些 實(shí)施方式中，2 16個(gè)碳的烯基碳鏈含有1 5個(gè)雙鍵。在某些實(shí)施方式中，2 20個(gè)碳 的炔基碳鏈含有1 8個(gè)三鍵，在某些實(shí)施方式中，2 16個(gè)碳的炔基碳鏈含有1 5個(gè)三 鍵。如本文所用，“雜芳基”是指在某些實(shí)施方式中為約五元 約十五元的單環(huán)或多環(huán) 的芳香環(huán)體系，其中所述環(huán)體系中的一個(gè)或多個(gè)原子、在一個(gè)實(shí)施方式中1 3個(gè)原子是包 括但不限于氮、氧或硫的雜原子(即碳以外的元素)?？蛇x地，雜芳基可以與苯環(huán)稠合。雜芳 基包括但不限于呋喃基、咪唑基、吡咯烷基、嘧啶基、四唑基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-甲 基吡咯基、喹啉基和異喹啉基。如本文所用，“雜環(huán)基”是指單環(huán)或多環(huán)的非芳香環(huán)體系，所述非芳香環(huán)體系在一 個(gè)實(shí)施方式中為三元 十元非芳香環(huán)，在另一個(gè)實(shí)施方式中為四元 七元非芳香環(huán)，在再
14一個(gè)實(shí)施方式中為五元 六元非芳香環(huán)，其中所述環(huán)體系中的一個(gè)或多個(gè)原子、在一個(gè)實(shí) 施方式中1 3個(gè)原子是包括但不限于氮、氧或硫的雜原子(即碳以外的元素)。在其中雜 原子是氮的實(shí)施方式中，氮可選地由烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、環(huán) 烷基、雜環(huán)基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)烷基、?；?、胍基取代，或所述氮可以被季胺化以形成其中 的取代基選自上述基團(tuán)的銨基。下面對(duì)本發(fā)明的示例性實(shí)施方式進(jìn)行說明。1.用于在細(xì)胞ER中誘導(dǎo)或加重應(yīng)激以引發(fā)細(xì)胞凋亡的方法在第一方面，本發(fā)明提供了在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中誘導(dǎo)或加重應(yīng)激以引發(fā)細(xì)胞 凋亡的方法。如上所述，本發(fā)明該方面的方法基于以下發(fā)現(xiàn)通過以足夠的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間誘 導(dǎo)或加重ER，升高的CHOP表達(dá)的促凋亡效果將壓倒GRP78的保護(hù)效果，導(dǎo)致如半胱天冬酶 4和/或半胱天冬酶7等半胱天冬酶的激活，從而使細(xì)胞凋亡。所述方法還基于以下發(fā)現(xiàn) 存在能特異性誘導(dǎo)或加重選中細(xì)胞中的ER應(yīng)激而不導(dǎo)致其它非靶標(biāo)細(xì)胞中的伴發(fā)副作用 的試劑。具體而言，本發(fā)明該方面的優(yōu)選實(shí)施方式通常包括以下步驟1)在所述細(xì)胞中選 擇性抑制SERCA活性而不抑制C0X-2活性；和2)提高所述細(xì)胞中的CHOP表達(dá)，其中，抑制 SERCA活性的和提高CHOP表達(dá)的組合造成了有利于啟動(dòng)細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡的情況。可以預(yù)見，可以用任何合適的被開發(fā)以抑制SERCA和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的本領(lǐng)域已知 的試劑或?qū)龛b定的試劑來通過SERCA抑制實(shí)現(xiàn)ER應(yīng)激的加重。優(yōu)選的是，所述試劑的特異性使其不抑制C0X-2活性或引發(fā)組胺的釋放。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，在足以使胞質(zhì)鈣濃度升高到顯著高于正常水平從而導(dǎo)致 細(xì)胞凋亡的持續(xù)時(shí)間內(nèi)，通過直接或間接地施用藥物有效量的能選擇性抑制SERCA的ER應(yīng) 激加重劑來實(shí)現(xiàn)SERCA活性的選擇性抑制。在該實(shí)施方式中，CHOP表達(dá)的提高可能因加重 的ER應(yīng)激而共同實(shí)現(xiàn)，或可能受CHOP表達(dá)增強(qiáng)物/誘導(dǎo)物的特異性誘導(dǎo)。示例性的CHOP 表達(dá)增強(qiáng)物/誘導(dǎo)物可以包括但不限于基于質(zhì)粒的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染或采用病毒表達(dá)構(gòu)建體 的感染。1. 1其中ER應(yīng)激加重劑是化合物或藥物組合物的實(shí)施方式在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，所述ER應(yīng)激加重劑是具有以下通式的化合物或包含具 有以下通式的化合物的藥物組合物其中，
R1是甲基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、烷基、氟烷基、二氟烷基、三氟烷基、多氟 烷基、羥烷基或羧烷基；R2是氫、氟、氯、溴；氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、烷基、氟烷基、二氟烷基、三氟烷 基、多氟烷基、羥烷基或羧烷基；R3 R7獨(dú)立地選自由以下基團(tuán)組成的組氫、氟、氯、溴、烷氧基、烷基、氟烷基、二 氟烷基、三氟烷基、多氟烷基、羥烷基或羧烷基、芳基和雜芳基；R8 R11獨(dú)立地選自由以下基團(tuán)組成的組氫、氟、氯、溴；氟甲基、二氟甲基、三氟 甲基、烷基、氟烷基、二氟烷基、三氟烷基、多氟烷基、羥烷基、羧烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜 環(huán)基、芳基或雜芳基；和R12是氫、乙?；Ⅴ；⑼榛?、氟烷基、二氟烷基、三氟烷基、多氟烷基、羥烷基、羧烷 基；氨基?；?、氨基烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基。在某些更優(yōu)選的實(shí)施方式中，R1是三氟甲基。在其它優(yōu)選實(shí)施方式中，R2、R8 R12是氫，或禮、R5和R7是氫。在一個(gè)實(shí)施方式 中，R1是三氟甲基且R2、R4、R5、R7 R12都是氫。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述加重劑是4- [5- (2，5- 二甲基苯基)_3_ (三氟甲 基)-1Η-吡唑-1-基]苯磺酰胺、4-[5-(2，5_二 (三氟甲基)苯基)-3-(三氟甲基)-IH-吡 唑-1-基]苯磺酰胺、4-[5-(2，5_ 二溴苯基)-3-(三氟甲基)-1Η-吡唑-1-基]苯磺酰胺 或其類似物。對(duì)于含有至少一個(gè)如CF3基團(tuán)等含氟官能團(tuán)的化合物而言，所提供的化合物使得 能夠通過使用核磁共振圖像形成對(duì)其體內(nèi)作用進(jìn)行監(jiān)測(cè)和圖像形成。這對(duì)于如腦癌等難以 治療且難以監(jiān)測(cè)的疾病是非常有價(jià)值的特點(diǎn)。1. 2其中加重劑是前藥的實(shí)施方式如上所述，本發(fā)明還包括了其中直接或間接抑制SERCA并因而加重ER應(yīng)激的實(shí)施 方式。在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，所述加重劑是可以通過新陳代謝或其它轉(zhuǎn)化方式轉(zhuǎn)化為 能抑制SERCA的活性化合物的前藥。例如，在其中所述加重劑為重組分子的實(shí)施方式中，可 以連接轉(zhuǎn)運(yùn)肽以允許所述試劑跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。在其它實(shí)施方式中，所提供的化合物含有在代謝 氧化、蛋白水解切割或水解時(shí)將所提供的化合物轉(zhuǎn)化為活性ER加重劑的官能團(tuán)。本領(lǐng)域技 術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到這些官能團(tuán)包括但不限于甲基或烷基、酯基、碳酸酯基、酰胺基、肽或它 們的環(huán)化或聚合型衍生物。1. 3采用加重劑組合的實(shí)施方式本發(fā)明某些實(shí)施方式的方法還可以包括施用額外的一種或多種ER應(yīng)激加重劑的 步驟。優(yōu)選的是，所述額外的一種或多種ER應(yīng)激加重劑通過不同的應(yīng)激誘導(dǎo)機(jī)理起作用。本發(fā)明的另一個(gè)出乎意料的發(fā)現(xiàn)是當(dāng)組合使用不同的ER應(yīng)激加重策略時(shí)可以獲 得協(xié)同效果。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)將藥物硼替佐米(通過抑制蛋白酶體26S誘導(dǎo)細(xì)胞凋 亡)與塞來昔布共同使用時(shí)，ER應(yīng)激水平升高且凋亡速率顯著增加(見實(shí)施例2)。于是，可以預(yù)見，可將表1中所列的任何細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)策略與本發(fā)明的策略(即通 過ER應(yīng)激加重來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡)有利地組合以在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中獲得協(xié)同效果。在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，可以將能選擇性抑制SERCA活性而不抑制C0X-2或引發(fā)
16組胺釋放的第一 ER應(yīng)激加重劑與能增加ER中的錯(cuò)折疊或受損的蛋白的濃度的第二 ER應(yīng) 激加重劑組合。適于用作第二 ER應(yīng)激加重劑的示例性試劑可以包括蛋白酶體抑制劑(例 如，硼替佐米或其類似物)或蛋白酶抑制劑(例如，奈非那韋、阿扎那韋、福沙那韋、利托那 韋、茚地那韋或其類似物)。1. 4采用細(xì)胞凋亡增強(qiáng)物的實(shí)施方式在本發(fā)明的某些其它實(shí)施方式中，可以通過進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞施用細(xì)胞凋亡增強(qiáng)物來 協(xié)助ER應(yīng)激加重劑。在本發(fā)明的背景下，細(xì)胞凋亡增強(qiáng)物是放大與細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)有關(guān)的ER 應(yīng)激的效果的增強(qiáng)物。優(yōu)選的是，細(xì)胞凋亡增強(qiáng)物是能上調(diào)CHOP表達(dá)、克服GRP78的保護(hù) 效果并激活如半胱天冬酶4和/或半胱天冬酶7等半胱天冬酶的化學(xué)試劑或生物試劑。示 例性的細(xì)胞凋亡增強(qiáng)物可以包括但不限于GRP78的siRNA或GRP78功能的抑制劑。另外， 細(xì)胞凋亡增強(qiáng)物還可以是合成的或天然的化合物，包括但不限于如ABT-737等阻斷Bcl-2 家族的抗凋亡蛋白的活性的BH3模擬物。2.可用作ER應(yīng)激加重劑的化合物的篩選、選擇或設(shè)計(jì)方法在第二方面，本發(fā)明提供了用于篩選、選擇或設(shè)計(jì)可用于誘導(dǎo)或加重細(xì)胞中的ER 應(yīng)激以誘導(dǎo)所述細(xì)胞中的凋亡的方法。本發(fā)明該方面的實(shí)施方式具有以下一般步驟1)獲取測(cè)試化合物的信息；2)如果 測(cè)試化合物是SERCA抑制劑而非C0X-2抑制劑，則將該測(cè)試化合物鑒定為潛在的ER應(yīng)激試 劑。優(yōu)選的是，所鑒定的化合物也不引發(fā)組胺的釋放。在獲取步驟中，所獲取的測(cè)試化合物 的信息可以包括該化合物的SERCA抑制活性、該化合物的C0X-2抑制活性和該化合物的組 胺釋放活性。細(xì)胞中ER應(yīng)激的證據(jù)可以通過以高于正常組織中GRP78水平的兩倍水平出現(xiàn)的 高GRP78水平的存在而確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用如實(shí)施例中所述的那些普通技術(shù)來 確定GRP78水平。測(cè)試化合物可以源自任何本領(lǐng)域已知的普通來源，包括但不限于商業(yè)化學(xué)品銷售 商、通過組合化學(xué)產(chǎn)生的化學(xué)庫或經(jīng)修飾的已知SERCA抑制劑類似物。在有關(guān)測(cè)試化合物的所需信息未知或不可用的情況下，信息獲取步驟可能涉及進(jìn) 行表征測(cè)試化合物的測(cè)試。在這種情況下，可以使用本領(lǐng)域中的任何公知測(cè)試，包括但不限 于化學(xué)測(cè)試和基于細(xì)胞的測(cè)試。優(yōu)選的是，所選測(cè)試應(yīng)該產(chǎn)生易于與其它化合物比較的可 量化的結(jié)果。由于新化合物的篩選必然是反復(fù)嘗試(trial-and-error)的過程，因而對(duì)每種測(cè) 試化合物重復(fù)進(jìn)行信息獲取步驟、鑒定來自測(cè)試化合物的有前景的候選化合物的步驟。在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，使用了大量測(cè)試化合物并以高通量模式進(jìn)行獲取、鑒定 和重復(fù)步驟。高通量藥物篩選的一般原理是本領(lǐng)域內(nèi)公知的(近期綜述見Walters等，Nat Rev Drug Discov. 2003年4月，2 (4) :259_266，此處通過參考并入其內(nèi)容)。除篩選現(xiàn)存化合物源以外，一旦測(cè)試并鑒定出足夠數(shù)量的化合物，還可以采用計(jì) 算分析來進(jìn)一步優(yōu)化或產(chǎn)生適合用作ER應(yīng)激加重劑的新候選化合物。可以將任何公知的 計(jì)算藥物發(fā)現(xiàn)方法有利地改造以用于這一任務(wù)。優(yōu)選使用基于配體的方法學(xué)(有關(guān)基于配 體的藥物設(shè)計(jì)的近期綜述見 Bacilieri 等，Current Drug Discovery Technologies，第 3 卷，第3期，2006年9月，第155-165頁(11)，此處通過參考并入其內(nèi)容)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，進(jìn)行了定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)分析(有關(guān)高通量篩選的 計(jì)算方法學(xué)的改造和引入的綜述見Davies等，Curr Opin ChemBiol. 2006年8月；10(4) 343-351. 2006年7月5日電子出版，此處通過參考并入其內(nèi)容)。3.可用作ER應(yīng)激加重劑的化合物在第三方面，本發(fā)明還提供了具有以下通式的可用作ER應(yīng)激加重劑的化合物 其中，R1是甲基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、烷基、氟烷基、二氟烷基、三氟烷基、多氟 烷基、羥烷基或羧烷基；R2是氫、氟、氯、溴；氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、烷基、氟烷基、二氟烷基、三氟烷 基、多氟烷基、羥烷基或羧烷基；R3 R7獨(dú)立地選自由以下基團(tuán)組成的組氫、氟、氯、溴、烷氧基、烷基、氟烷基、二 氟烷基、三氟烷基、多氟烷基、羥烷基或羧烷基、芳基和雜芳基；R8 R11獨(dú)立地選自由以下基團(tuán)組成的組氫、氟、氯、溴；氟甲基、二氟甲基、三氟 甲基、烷基、氟烷基、二氟烷基、三氟烷基、多氟烷基、羥烷基、羧烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜 環(huán)基、芳基或雜芳基；和R12是氫、乙酰基、酰基、烷基、氟烷基、二氟烷基、三氟烷基、多氟烷基、羥烷基、羧烷 基；氨基?；被榛?、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基。優(yōu)選實(shí)施方式是其中R1是三氟甲基的化合物，而其它優(yōu)選實(shí)施方式是其中R2、R8 和R9是氫的化合物或其中R4、R5和R7是氫的化合物，以及其中R1是三氟甲基而R2、R4、R5、 R7、R8和R9是氫的化合物。其它優(yōu)選實(shí)施方式是其中R3和R6選自由氫、氟、氯、溴；氟甲基、二氟甲基、三氟甲 基、烷基、芳基、雜芳基、氟烷基、二氟烷基、三氟烷基、多氟烷基、羥烷基或羧烷基組成的組 的化合物。優(yōu)選實(shí)施方式的一個(gè)實(shí)例是作為4- [5- (2，5- 二甲基苯基)-3-(三氟甲 基)-1Η-吡唑-1-基]苯磺酰胺的結(jié)構(gòu)類似物的化合物，如4-[5-(2，5_ 二(三氟甲基) 苯基)-3-(三氟甲基)-IH-吡唑-1-基]苯磺酰胺和4- [5- (2，5- 二溴苯基)_3_ (三氟甲 基)-IH-吡唑-1-基]苯磺酰胺。參考圖19，本發(fā)明的兩個(gè)示例性化合物已顯示出與DMC相比驚人的有效細(xì)胞殺傷 效果。在該圖中，DMC代表4-[5-(2，5_ 二甲基苯基)-3-(三氟甲基)-1Η-吡唑-1-基]苯 磺酰胺；DBrC代表4- [5- (2，5- 二溴苯基)_3_ (三氟甲基)-IH-吡唑-1-基]苯磺酰胺；而DTF3C代表4-[5-(2，5_ 二(三氟甲基)苯基)-3-(三氟甲基)-IH-吡唑-1-基]苯磺酰胺。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述化合物是可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為能充當(dāng)SERCA抑制劑 的ER應(yīng)激加重劑的前藥化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到這類化合物具有以下一般結(jié) 構(gòu)
-連接臂(例如，烷基、嫁氧基、PEG、肽等) ^ =肽、生物相容性聚合物或納米材料 I可能的體內(nèi)切割點(diǎn)其中R1 R12的至少一個(gè)基團(tuán)具有選自如上所示的連接臂基團(tuán)的側(cè)鏈。4.可用作ER應(yīng)激加重劑的藥物組合物在第四方面，本發(fā)明還提供了可用于誘導(dǎo)或加重細(xì)胞中的ER應(yīng)激以引發(fā)細(xì)胞凋 亡的藥物組合物。本發(fā)明的實(shí)施方式通常包含ER應(yīng)激加重劑和可藥用載體?？梢赃m當(dāng)配制如上所述的任何化學(xué)類ER應(yīng)激加重劑以協(xié)助活性成分的施用。在 優(yōu)選實(shí)施方式中，ER應(yīng)激加重劑是具有也如以上第一方面所述的通式的化合物或其可藥用 的穩(wěn)定鹽。對(duì)于所述載體而言，可以適當(dāng)使用與所選活性成分相容的任何公知載體。所述載 體優(yōu)選為適用于口服制劑的載體。
0137]5.治療方法在第五方面，本發(fā)明還提供了通過誘導(dǎo)或加重選定患病細(xì)胞中的ER應(yīng)激以引發(fā) 所述細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡來治療患者的疾病狀況的方法。本發(fā)明該方面的實(shí)施方式包括施用藥物有效量的本發(fā)明上述第四方面所述的藥 物組合物的一般步驟?？梢詫⒈景l(fā)明第一方面所述的實(shí)施方式中的任何用于誘導(dǎo)或加重ER 應(yīng)激的方法適當(dāng)?shù)馗脑鞆亩糜诒景l(fā)明的治療方法。在優(yōu)選實(shí)施方式中，在施用所述藥物組合物之前患病細(xì)胞處在ER應(yīng)激狀態(tài)中。本文所述的治療方法是可用于各種形式的疾病而不論其發(fā)病機(jī)理是否包括細(xì)胞凋亡失調(diào)作為起作用的機(jī)理的通用方法。在優(yōu)選實(shí)施方式中，癌癥是本發(fā)明的治療方法的 優(yōu)選疾病。可用的示例性癌癥包括但不限于多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、伯基特 氏淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、復(fù)發(fā)性癌 癥和抗藥性癌癥。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式涉及通過抑制浸潤、血管發(fā)生和血管生成來治療抗化療 腫瘤。在抗化療腫瘤細(xì)胞中，腫瘤脈管系統(tǒng)對(duì)包括最常用于多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)治 療的制劑替莫唑胺(TMZ)在內(nèi)的許多治療藥物都不響應(yīng)。腫瘤脈管系統(tǒng)提供養(yǎng)分、氧和腫 瘤生長環(huán)境。因此破壞這些細(xì)胞的試劑將對(duì)治療殘留或復(fù)發(fā)腫瘤非常有用。在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于治療癌癥的周邊壞死邊緣的方法，所述 方法涉及單獨(dú)通過ER應(yīng)激響應(yīng)調(diào)節(jié)或?qū)⑵渑c常規(guī)化學(xué)治療結(jié)合來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。更具體 而言，本發(fā)明可用于治療如多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)等對(duì)化學(xué)治療響應(yīng)較差的尤其難治 的癌癥。許多癌癥的生長快過其血液供給，其后果是發(fā)展出壞死中心。處在“壞死邊緣”的 癌細(xì)胞通常是暴露于低氧合、低PH和低葡萄糖的不利微環(huán)境下的休眠細(xì)胞。做為此應(yīng)激性 環(huán)境的后果，這些細(xì)胞具有高水平的ESR。為了在這種不利環(huán)境中成長，表達(dá)了高抗性水平 的GRP78以便存活。這些周邊壞死癌細(xì)胞對(duì)通常靶向快速增殖細(xì)胞的化學(xué)治療或放射治療 的治療尤其抵抗。本發(fā)明為無法采用常規(guī)化學(xué)治療的腦腫瘤的治療提供了獨(dú)特的益處。血腦屏障盡 管在血液-腫瘤界面處未受損，但仍然阻礙了化學(xué)治療劑自由進(jìn)入腫瘤。而且，傳統(tǒng)的細(xì)胞 毒性化學(xué)治療靶向快速增殖的癌細(xì)胞。而GBM在性質(zhì)上是異源性的。在病理學(xué)上，GBM的特 征是壞死中心、周邊壞死邊緣和侵襲性脈管化外周。在病理學(xué)上將所述周邊壞死邊緣描述 為見于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的病理標(biāo)本中的假柵欄(Brat DJ等，Cancer Res 2004,64 :920_927)。 化學(xué)治療和放射線通常靶向正常腦組織和腫瘤組織的界面中的脈管化良好的增殖腫瘤細(xì) 胞。相反，腦腫瘤的周邊壞死邊緣的惡性細(xì)胞雖然有被激活的可能性但仍進(jìn)行較少增殖并 保持休眠。一旦增殖腫瘤細(xì)胞被化學(xué)治療或放射線殺死，周邊壞死區(qū)中的休眠膠質(zhì)母細(xì)胞 瘤細(xì)胞就開始生長并再次侵襲，從而重復(fù)所述過程。所述休眠細(xì)胞激活機(jī)理與雨林中樹木 生長的概念非常相似。雨林中有不同高度的樹木。如果將最高的樹(類似于脈管化良好的 腫瘤區(qū))砍倒，則較低高度的樹木(類似于周邊壞死區(qū)細(xì)胞)將隨著其接受大量陽光而長 高。最終結(jié)果是GBM重新出現(xiàn)且對(duì)正常腦的侵襲增加。此前已對(duì)周邊壞死區(qū)的膠質(zhì)母細(xì)胞 瘤細(xì)胞進(jìn)行過表征。這些細(xì)胞響應(yīng)于周邊壞死區(qū)中存在的低氧張力而分泌更高水平的蛋白 和血管生成因子。周邊壞死細(xì)胞比處在脈管化良好的外周的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖得顯著 更少并顯示出更多的細(xì)胞死亡。而且，這些腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出遷移增加和與細(xì)胞侵襲相關(guān)的 特定酶的分泌增加(Brat DJ等，Cancer Res2004，64 :920_927，此處通過參考并入其全部內(nèi) 容)。對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了 一般性描述后，可以通過參考某些具體實(shí)施例來獲得對(duì)本發(fā)明更 進(jìn)一步的理解，除非另外指明，此處提供所述具體實(shí)施例僅出于說明的目的而并非旨在進(jìn) 行限制。實(shí)施例實(shí)施例1 由塞來昔布的非昔布類類似物2，5_ 二甲基塞來昔布(DMC)誘導(dǎo)的作為 腫瘤細(xì)胞死亡的主要成因的鈣激活ER應(yīng)激
20
材料和方法材料塞來昔布是4-[5- (4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-IH-吡唑_1基]苯磺酰胺(24)。 DMC是一種相近結(jié)構(gòu)的類似物，其中通過用2，5_ 二甲基苯基替代4-甲基苯基而改變了 5-芳基部分，從而得到4- [5- (2，5- 二甲基苯基)-3-(三氟甲基)-IH-吡唑-1基]苯磺酰 胺(20，19)。在本實(shí)驗(yàn)室中根據(jù)此前發(fā)表的方法合成了這兩種化合物(塞來昔布見參考文 獻(xiàn)24，DMC見參考文獻(xiàn)19)。將每種藥物以lOOmmol/L溶解于DMSO中(儲(chǔ)備溶液)。對(duì)于伐 地昔布(25)和羅非昔布(26)，分別將來自Bextra (Pfizer，紐約，紐約州)和Vioxx (Merck， Whitehouse Station，新澤西州)的商購藥片懸浮于H2O中以使賦形劑崩解，并將活性成分 以25mmol/L溶解于DMSO中。另外，還使用了在本實(shí)驗(yàn)室中根據(jù)已確立的方法(27)合成的 純羅非昔布粉末。所有傳統(tǒng)NSAID均以粉末形式購自Sigma(圣路易斯，密蘇里州)并以 IOOmmol/L溶解于DMSO中。毒胡蘿卜素和BAPTA-AM獲自Sigma并溶解于DMSO中。以保持 最終溶劑(DMSO)濃度<0.5%的方式將所有藥物添加至細(xì)胞培養(yǎng)基中。細(xì)胞系和培養(yǎng)條件大多數(shù)細(xì)胞系獲自美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物收藏中心(American Type CultureCollection， 馬納薩斯，弗吉尼亞洲)并在37 °C、5% CO2氛圍中的濕潤培養(yǎng)箱中的DMEM或RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island，紐約州)中繁殖，在 DMEM 或 RPMI 1640 中補(bǔ)充有 10%的胎牛血清、100單位/mL的青霉素和0. lmg/mL的鏈霉素。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251 和 LN229 由 Frank B. Furnari 和 Webster K. Cavenee (Ludwig 癌癥研究所，La Jolla，加利 福尼亞州)提供。免疫印跡和抗體通過用放射免疫沉淀測(cè)試緩沖液裂解細(xì)胞來制備總細(xì)胞裂解物(28)，并用二辛可 寧酸蛋白測(cè)試試劑(Pierce，羅克福德，伊利諾斯州)來確定蛋白濃度。對(duì)于蛋白印跡分析 而言，如(29)所述處理50Ag的各種樣品。一抗購自Cell Signaling Technologies (貝 弗利，馬薩諸塞州)、CaymanChemical (安阿伯，密歇根州)或Santa Cruz Biotechnology, Inc.(圣克魯斯，加利福尼亞州)并根據(jù)制造商建議使用。將二抗與山葵過氧化物酶偶聯(lián)并 使用來自Pierce的SuperSignal West底物通過化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)。將所有的免疫印跡重 復(fù)進(jìn)行至少一次以確認(rèn)結(jié)果。免疫組織化學(xué)使用Vectastain抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物法試劑盒(VectorLaboratories， 伯林格姆，加利福尼亞州)根據(jù)制造商說明書對(duì)腫瘤組織中的蛋白表達(dá)進(jìn)行免疫組織化學(xué) 分析。該方法采用生物素化的二抗和已被稱為抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物法技術(shù)的預(yù)先 形成的抗生物素蛋白-生物素化酶復(fù)合物。使用在2%普通山羊阻斷血清中以1 100稀 釋的抗CHOP抗體作為一抗。細(xì)胞凋亡測(cè)定采用末端脫氧核苷酸基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測(cè)試定量測(cè)定了腫瘤切 片中的細(xì)胞凋亡(30)。用于該方法的所有成分均來自ApopTag原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 (Chemicon, Temecula，加利福尼亞州)，根據(jù)制造商說明書對(duì)其進(jìn)行使用。通過根據(jù)制造商說明書使用細(xì)胞死亡檢測(cè)ELISA試劑盒(RocheDiagnostics，印
21第安納波利斯，印第安納州)來確定體外的細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞凋亡。該免疫測(cè)試特異性 檢測(cè)細(xì)胞凋亡期間釋放的單核小體和寡核小體的組蛋白區(qū)(HI、H2A、H2B、H3和H4)。以 1，000細(xì)胞/孔接種96孔板并在微孔板自動(dòng)讀數(shù)器(EL 311SX型；Bio-Tek Instruments, Inc.，Winooski，佛蒙特州)中于405nm讀數(shù)。集落形成測(cè)試用小干擾RNA(SiRNA)轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，將細(xì)胞以200細(xì)胞/孔接種至6孔板內(nèi)。細(xì) 胞完全粘附后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行藥物處理48小時(shí)。其后，除去藥物，添加新鮮的生長培養(yǎng)基，并 將細(xì)胞在培養(yǎng)物中不受干擾地保持12 14天，其間存活細(xì)胞產(chǎn)生了增殖細(xì)胞集落。通過 用亞甲藍(lán)(甲醇溶液)染色4h使集落可見然后計(jì)數(shù)。siRNA 轉(zhuǎn)染根據(jù)制造商說明書使用LipofectAMINE 2000 (Invitrogen，卡爾斯巴德，加利福 尼亞州)在6孔板中轉(zhuǎn)染細(xì)胞。不同的siRNA在南加州大學(xué)/K. Norris Jr.綜合癌癥 中心的微量化學(xué)核心實(shí)驗(yàn)室合成，且其序列如下靶向綠色熒光蛋白的SiRNA(Si-GFP)， 5 ‘ -CAAGCUGACCCUGAA⑶UCTT-3 ‘(有義)和 5 ‘ -GAACUUCAGG⑶CAGCUUGTT-3 ‘(反 義)；si-GRP78,5 ‘ -GGAGCGCAUUGAUACUAGATT-3 ‘(有義)禾口 5 ‘ -UCUAGUAUCAAUGCGCUCCTT-3 ‘(反義)；和 si-半胱天冬酶 4， 5 ‘ -AA⑶GGCCUCUUCACA⑶CAUTT-3 ‘(有義)和 5 ‘ -AAAUGACU⑶GAAGAGGCCACTT-3 ‘(反 義)。胞質(zhì)鈣圖像形成通過將細(xì)胞與4Amol/L Fura-2/AM(Invitrogen)在含有 138mmol/LNaCl、 5. 6mmol/L KC1、1. 2mmol/L MgCl2,2. 6mmol/L CaCl2、lOmmol/LHEPES 和 4mmol/L 葡萄糖的 外部溶液(PH7.4)中于室溫溫育30分鐘來對(duì)細(xì)胞加載。加載后，將細(xì)胞清洗并轉(zhuǎn)移至圖 像形成裝置。用各種藥物處理細(xì)胞10秒，使用Polychromator V(TILL Photonics GmbH, Grafelfing，德國)通過帶有 Zeiss Fluar 40X 油物鏡的 Zeiss Axiovert 100 顯微鏡 (CarlZeiss，耶拿，德國)提供光源，以在350nm與380nm之間交替的激發(fā)波長引發(fā)熒光。用 由MetaFluor軟件(Molecular Devices，桑尼維爾，加利福亞州)控制的Cascade 512B CCD 相機(jī)(Photometries，圖森，亞利桑那州)以0. 5Hz的采集頻率拍攝照片。根據(jù)Grynkiewicz 等開發(fā)的原理(31)，使用在350nm和380nm激發(fā)獲得的照片之比來表現(xiàn)胞質(zhì)鈣濃度的變化。對(duì)裸鼠的藥物治療4 6周齡雄性無胸腺nu/nu小鼠獲自Harlan (印第安納波利斯，印第安納州) 并如其它文獻(xiàn)所述(32)將5X105U87膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞植入皮下。為了確定數(shù)周持續(xù)藥 物治療期間的腫瘤生長，將DMC或羅非昔布與日常飼料混合(DMC為150mg/kg;羅非昔布 為40mg/kg)，并如(32)所述監(jiān)測(cè)并記錄腫瘤生長。為了分析藥物在體內(nèi)對(duì)CHOP表達(dá)和腫 瘤細(xì)胞死亡的短期效果，以及為了確定血漿和腫瘤組織中的藥物濃度，將帶腫瘤的動(dòng)物以 每日30mg/kg、90mg/kg、150mg/kg或180mg/kg的藥物治療50h ；通過用不銹鋼球形頭飼針 (Popper和Sons，Inc.，New Hyde Park，紐約州)直接施用至胃使每只動(dòng)物每12h接受一 半日劑量的各個(gè)藥物。在最后一次藥物施用后2h處死所有動(dòng)物，并收集腫瘤和血液用于分 析。在所有實(shí)驗(yàn)中，對(duì)動(dòng)物的體重、食物消耗和毒性臨床表現(xiàn)進(jìn)行密切監(jiān)測(cè)；沒有檢測(cè)到未 用藥物治療的對(duì)照動(dòng)物與經(jīng)藥物治療的動(dòng)物之間的差異。
提取血漿用于液相色譜質(zhì)譜分析采用對(duì)裸鼠的心臟穿刺將血液收集到肝素化注射器中。將血液在室溫放置30分 鐘，接著在4°C于2，OOOrpm離心5分鐘。將血漿從細(xì)胞中分離出來并轉(zhuǎn)移至新管。為了建立 標(biāo)準(zhǔn)參照，將25 μ L的1. 0 μ g/mL DMC或塞來昔布添加至來自未經(jīng)治療的對(duì)照動(dòng)物的50 μ L 血漿中。對(duì)于測(cè)試樣品而言，將等量DMC作為內(nèi)標(biāo)添加至來自于已用塞來昔布治療的動(dòng)物 的血漿，而將等量塞來昔布作為內(nèi)標(biāo)添加至來自于已用DMC治療的動(dòng)物的血漿。充分渦旋 后，用425 μ L乙腈使血漿蛋白沉淀并渦旋1分鐘。將全部混合物在4，500rpm離心5分鐘以 分離蛋白沉淀，并將400yL上清液轉(zhuǎn)移至新管中。用穩(wěn)定空氣流使樣品揮發(fā)，并用150yL 流動(dòng)相(由80 20(體積/體積)的甲醇10mmol/L乙酸銨構(gòu)成，pH4. 5)使干燥后的殘留 物恢復(fù)溶液狀。為除去任何未溶解的沉淀，將樣品在4，500rpm再次離心5分鐘，并將上清 液轉(zhuǎn)移至新管。通過液相色譜質(zhì)譜分析10毫升的各樣品，重復(fù)兩次。為了確定各樣品中的藥物量，使用了與Sciex API 3000三級(jí)四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 (Applied Biosystems，福斯特城，加利福尼亞州)聯(lián)用的AgilentllOO高壓液相色譜系統(tǒng) (Agilent Technologies，圣克拉拉，加利福尼亞州)。為分離分析物，采用Thermo HyPURITY C18 柱(50X4. 6mm，3 微米；Thermo Fisher Scientific，Inc.，沃爾瑟姆，馬薩諸塞州)。流 動(dòng)相由80 20 (體積/體積)甲醇10mmol/L乙酸銨組成(pH4. 5)。分離分析物的流速為 350 μ L/分鐘，其中DMC和塞來昔布的保留時(shí)間分別為3. 50分鐘和3. 10分鐘。然后將分析 物導(dǎo)入設(shè)定為負(fù)離子模式的Sciex API 3000。DMC和塞來昔布的水平分別使用了過渡離子 394. 0 — 330. 2和380. 0 — 316. 2。該測(cè)試的較低定量水平確立為5ng/mL。結(jié)果DMC是缺乏C0X-2抑制能力的塞來昔布的近似結(jié)構(gòu)類似物。為了研究該化合物是 否能誘導(dǎo)ESR，用DMC或以平行方式用塞來昔布處理各種腫瘤細(xì)胞系，并確定CHOP蛋白的表 達(dá)水平。CHOP是ESR的促凋亡成分并且密切參與ER應(yīng)激后細(xì)胞死亡的啟動(dòng)；因此，在本實(shí) 驗(yàn)體系中將其用作已良好確定的ESR指示物。如圖3所示，DMC和塞來昔布都能有效誘導(dǎo) 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、伯基特氏淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系中的CHOP。因此，兩 種藥物似乎均可刺激ESR，盡管在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和伯基特氏淋巴瘤細(xì)胞系中塞來昔布似乎 在某種程度上不如DMC有效。為了評(píng)估DMC處理后的ESR程度，對(duì)ESR的額外指示物進(jìn)行分析并將效果與用 毒胡蘿卜素所獲得的效果進(jìn)行比較，毒胡蘿卜素是常用作強(qiáng)ESR模型誘導(dǎo)物的肌漿/ER Ca2+-ATP酶抑制劑。以不同的時(shí)間用DMC或毒胡蘿卜素平行處理細(xì)胞，并分析CHOP、GRP78 和半胱天冬酶4 (ESR特異性半胱天冬酶)的表達(dá)水平。圖4顯示DMC和毒胡蘿卜素以相似 方式刺激三種選定的ESR指示物。CHOP和GRP78均顯著升高，注意到6h時(shí)間點(diǎn)及之后的增 加較顯著。由半胱天冬酶4的切割(活化)形式的出現(xiàn)指示的半胱天冬酶4的激活于藥物 處理約24h時(shí)首次出現(xiàn)并一直持續(xù)到較晚的(36h)時(shí)間點(diǎn)。因此，DMC與模型誘導(dǎo)物毒胡 蘿卜素之間的ESR刺激極為相似，表明DMC的效果在該環(huán)境下相當(dāng)有效。ESR的顯著特點(diǎn)是總體蛋白合成的一般性暫時(shí)下調(diào)，伴隨有如GRP78等ER應(yīng)激蛋 白的翻譯的選擇性增加(33，34)。因此，本發(fā)明人研究了 DMC和塞來昔布是否通過決定將 35S-蛋氨酸引入新翻譯的蛋白而損害細(xì)胞翻譯。如圖5所示，兩種藥物都以濃度依賴的 方式嚴(yán)重減小了翻譯速率，且可以注意到DMC更為有效。在處理2h時(shí)，60μπιΟ1/1 DMC和
2380ymoI/L塞來昔布與毒胡蘿卜素同樣有效，并且?guī)缀跖c有效的翻譯抑制劑環(huán)己酰亞胺同 樣有效，并將正在進(jìn)行的翻譯減少了約90%。這種抑制效果是短暫的，因?yàn)榧词笵MC或塞 來昔布持續(xù)存在，在18h時(shí)細(xì)胞仍返回至不受限制且完全活化的蛋白合成(圖5 ；塞來昔布 數(shù)據(jù)未顯示)。另外，可以在經(jīng)DMC和塞來昔布處理的細(xì)胞中檢測(cè)到GRP78翻譯的極大增加 (圖5 ；塞來昔布數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果共同顯示出DMC和塞來昔布造成了經(jīng)藥物處理的 細(xì)胞中的ESR的典型特點(diǎn)。由于DMC/塞來昔布的效果和毒胡蘿卜素的效果之間的驚人相似性，已知這會(huì)使 鈣從ER泄露并在胞質(zhì)中產(chǎn)生鈣峰(calcium spike)，因而接著確定了 DMC和與之對(duì)比的數(shù) 種昔布類藥物及NSAID是否也會(huì)誘導(dǎo)這類響應(yīng)。為此，用Fura-2/AM對(duì)細(xì)胞加載，將細(xì)胞暴 露于ΙΟΟμπιοΙ/L的各藥物并測(cè)定胞質(zhì)鈣水平的增加。如圖6所示，DMC和塞來昔布導(dǎo)致了 明顯的鈣峰，這可在各個(gè)和所有受測(cè)細(xì)胞中觀察到。相反，其它昔布類藥物(羅非昔布和伐 地昔布)和傳統(tǒng)NSAID (氟比洛芬、吲哚美辛和舒林酸)都沒能引起胞質(zhì)鈣水平的升高。因 而似乎唯獨(dú)DMC和塞來昔布能模擬毒胡蘿卜素的這一方面，并且由這些藥物引起的胞質(zhì)內(nèi) 鈣水平的有力升高與如上圖3 5所記載的ESR的產(chǎn)生完全一致。由DMC造成的平均最大 鈣峰(圖6B)在某種程度上高于對(duì)塞來昔布所測(cè)定的平均最大鈣峰，但這一差異在統(tǒng)計(jì)上 不顯著；然而DMC的總體鈣釋放(圖6A ；曲線下方面積)始終要多30% 50%。為進(jìn)一步證實(shí)DMC和塞來昔布與其它昔布類藥物和NSAID相比的獨(dú)特性，接著研 究了如何將對(duì)這兩種藥物所觀察到的效果與用其它昔布類藥物和傳統(tǒng)NSAID所觀察到的 效果進(jìn)行比較。首先，將細(xì)胞用DMC以及三種昔布類藥物塞來昔布、羅非昔布和伐地昔布處 理并確定ER應(yīng)激指示蛋白CHOP的表達(dá)水平。DMC在50 μ mol/L產(chǎn)生了對(duì)CHOP的明顯誘 導(dǎo)，這在早至藥物處理開始后4h就可被檢測(cè)到并持續(xù)增加直至24h (圖6A)。用50 μ mol/L 的塞來昔布處理細(xì)胞導(dǎo)致了相似的CHOP誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)，盡管與DMC相比整體水平明顯更低。 相反，羅非昔布和伐地昔布均未在相同濃度下造成任何可檢測(cè)的CHOP表達(dá)(圖7A)。為了研究是否有可能在羅非昔布和伐地昔布的更高濃度實(shí)現(xiàn)ESR誘導(dǎo)，用濃度進(jìn) 一步增加的各藥物處理細(xì)胞。然而，如圖7B所示，即使在75 μ mol/L或100 μ mol/L的濃度， 羅非昔布和伐地昔布均仍無法刺激任何可檢測(cè)到的CHOP或GRP78蛋白的增加。相反，DMC 和塞來昔布均有力誘導(dǎo)了上述兩種蛋白的表達(dá)。接著對(duì)ER應(yīng)激誘導(dǎo)與細(xì)胞死亡的關(guān)系進(jìn)行了研究。圖8A顯示，如CH0P、GRP78的 明顯誘導(dǎo)和半胱天冬酶4切割/激活所指示，30 μ mol/L和50 μ mol/L的DMC有效刺激了 ESR0平行地研究了三種細(xì)胞生長和細(xì)胞死亡變量。首先，進(jìn)行了集落形成測(cè)試；該測(cè)試是 揭示能夠存活并產(chǎn)生新細(xì)胞生長集落的個(gè)體細(xì)胞百分比的長期存活指標(biāo)。其次，使用傳統(tǒng) 3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑測(cè)試來確定主要由整個(gè)細(xì)胞群體的代謝 活動(dòng)所指示的短期生長和存活。第三，進(jìn)行了末端脫氧核苷酸基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末 端標(biāo)記測(cè)試以對(duì)經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞分?jǐn)?shù)進(jìn)行定量。如圖6A所示，DMC對(duì)ESR的誘導(dǎo)與集 落形成測(cè)試中極大降低的存活、3-(4，5_ 二甲基噻唑-2-基)-2，5_ 二苯基溴化四唑測(cè)試中 細(xì)胞活性的降低以及顯著增加的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。塞來昔布也能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡/凋亡(圖8B)并降低細(xì)胞培養(yǎng)物的活力(圖8C)，但 其效力明顯不如DMC(如對(duì)更高濃度的需求所指示)。然而，其它昔布類藥物(羅非昔布和伐 地昔布)或傳統(tǒng)NSAID (氟比洛芬、吲哚美辛和舒林酸)對(duì)細(xì)胞生長和存活都沒有任何可檢測(cè)到的效果并且即使在高達(dá)100 μ mol/L的濃度仍無法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(圖8B和C)。因而， 這些結(jié)果共同表明，塞來昔布因其刺激ESR和啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞死亡的優(yōu)異效力而從這些昔布 類藥物/NSAID中脫穎而出；另外，其衍生物DMC似乎更加有效，這明顯論證了實(shí)現(xiàn)上述效果 不需要對(duì)C0X-2的抑制接著對(duì)ESR響應(yīng)于DMC或塞來昔布的處理而減少腫瘤細(xì)胞生長的貢獻(xiàn)進(jìn)行了研 究。為此，應(yīng)用特定siRNA以敲減GRP78(代表ESR的保護(hù)分支)或半胱天冬酶4 (代表促 凋亡分支)的表達(dá)。將膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞用這些siRNA轉(zhuǎn)染并用藥物處理48h，并用集落 形成測(cè)試確定存活細(xì)胞百分比(圖9A)。si-GFP作為對(duì)照包括在這些實(shí)驗(yàn)中；此外，通過對(duì) 半胱天冬酶4和GRP78蛋白的蛋白印跡分析確定了各個(gè)具體siRNA對(duì)靶標(biāo)的敲減效率(圖 9B)。對(duì)于GRP78-siRNA，當(dāng)GRP78水平下降時(shí)細(xì)胞變得更敏感并且存活細(xì)胞更少。對(duì)于半 胱天冬酶-siRNA，觀察到相反的情況發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)藥物處理的敏感性顯著下降(即，當(dāng)半胱 天冬酶4的表達(dá)被siRNA減少時(shí)以塞來昔布或DMC處理后的細(xì)胞存活增加)。因而，這些 結(jié)果與現(xiàn)有ESR模型相符，其中GRP78代表保護(hù)臂，而半胱天冬酶4是促凋亡性的并且對(duì)于 ER應(yīng)激后細(xì)胞死亡的執(zhí)行是必需的；結(jié)果表明DMC和塞來昔布?jí)褐屏?GRP78的保護(hù)效果并 通過刺激半胱天冬酶4活性來誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。為了試圖確定在DMC的體內(nèi)抗腫瘤活動(dòng)期間ER應(yīng)激是否相關(guān)，采用異種移植的裸 鼠腫瘤模型并研究了來自以DMC或羅非昔布治療的動(dòng)物的腫瘤組織中的CHOP表達(dá)。如圖 10所示，在來自對(duì)照動(dòng)物(即不存在任何藥物治療)的腫瘤組織中勉強(qiáng)可檢測(cè)到CHOP蛋 白。相反，當(dāng)用DMC喂飼動(dòng)物50h時(shí)，其腫瘤組織中的CHOP蛋白表達(dá)大大增加。相比之下， 當(dāng)動(dòng)物接受羅非昔布時(shí)沒有觀察到這樣的增加(圖10)。另外，DMC處理后高度升高的CHOP 蛋白量與腫瘤組織中顯著增加的細(xì)胞凋亡相關(guān)，然而來自經(jīng)羅非昔布治療的動(dòng)物的腫瘤沒 有顯示出升高的細(xì)胞凋亡水平(圖10)。此外，對(duì)于用DMC或羅非昔布對(duì)帶有腫瘤的動(dòng)物的 長期治療，顯然，僅DMC造成腫瘤生長顯著減少(圖11)，這表明DMC對(duì)ESR和細(xì)胞凋亡的誘 導(dǎo)實(shí)際上轉(zhuǎn)化為該異種移植模型中腫瘤生長的總體減少。最后，作為對(duì)裸鼠中DMC和塞來昔布的早前藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)測(cè)定的擴(kuò)展(20)， 對(duì)來自本實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物的血液和腫瘤組織中的藥物(DMC和塞來昔布)濃度進(jìn)行了測(cè)定。以 30mg/kg 180mg/kg的日劑量的DMC或塞來昔布對(duì)帶有腫瘤的動(dòng)物治療2天，并通過液 相色譜質(zhì)譜確定各藥物的絕對(duì)水平(Cmax)。如表2中所示，血漿和腫瘤組織中的最大藥物 濃度隨著日劑量的增加而增加并在來自用180mg/kg的最高劑量治療的動(dòng)物的血漿中達(dá)到 45 μ mol/L的峰值水平。然而非常有趣的是，腫瘤組織中的濃度比相應(yīng)的血漿濃度要低兩個(gè) 數(shù)量級(jí)；在接受180mg/kg的最高日劑量的動(dòng)物中，僅達(dá)到約等于0. 25 μ mol/L的腫瘤組織 濃度。盡管如此，在所有這些腫瘤組織中都觀察到了 CHOP表達(dá)水平的增加，而來自未經(jīng)藥 物治療或由羅布昔布治療(30mg/kg 180mg/kg)的動(dòng)物的腫瘤組織則對(duì)該ER應(yīng)激指示蛋 白始終為陰性(見圖10)。通常，來自用最低劑量的DMC或塞來昔布治療的動(dòng)物的腫瘤組織 對(duì)CHOP為陽性，盡管來自暴露于高得多的濃度的這些動(dòng)物的腫瘤對(duì)該蛋白的染色更強(qiáng)烈。 重要的是，這些結(jié)果顯示，盡管體外使用的藥物濃度和體內(nèi)測(cè)得的藥物濃度之間存在巨大 差異，但在兩種情況下，都實(shí)現(xiàn)了 ER應(yīng)激和隨后的腫瘤細(xì)胞死亡。實(shí)施例2 由硼替佐米與塞來昔布或其非昔布類似物2，5-二甲基塞來昔布的組合 加重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是增強(qiáng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞殺傷的基礎(chǔ)
材料和方法材料硼替佐米以懸浮于 3. 5mL 鹽水中的 3. 5mg Velcade (Mi IlenniumPharmaceutica Is)形式獲自藥房。塞來昔布以膠囊形式獲自藥房或在本實(shí)驗(yàn)室中根據(jù)此前發(fā)表的方法 (24)合成。DMC是塞來昔布的近似結(jié)構(gòu)類似物，其中通過用2，5-二甲基苯基替代4-甲基苯 基而改變了 5-芳基部分；在本實(shí)驗(yàn)室中根據(jù)此前發(fā)表的方法(19)合成了該化合物。將塞 來昔布和DMC以lOOmmoI/L溶解于DMSO中(儲(chǔ)備溶液)并以保持溶劑最終濃度低于0. 1 % 的方式添加至細(xì)胞培養(yǎng)物中。使用純化的C0X-2蛋白在體外確認(rèn)了新合成的塞來昔布的 C0X-2抑制活性和DMC對(duì)該活性的缺乏(見例如，參考文獻(xiàn)42)。細(xì)胞系和培養(yǎng)條件所有細(xì)胞在37°C、5% CO2氛圍中的濕潤培養(yǎng)箱中的DMEM(CellGro)中繁殖， 在DMEM中補(bǔ)充有10%的胎牛血清、100單位/mL的青霉素和0. lmg/mL的鏈霉素。使用 了 4種人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(LN229、U251、T98G和U87MG)和一種多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系 (RPMI/8226)。T98G、U87MG和RPMI/8226獲自美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物收藏中心。LN229和U251獲 自Frank B. Furnari (Ludwig癌癥研究所，La Jolla，加利福尼亞州)。這些細(xì)胞中的C0X-2 表達(dá)水平和藥物對(duì)前列腺素生成的影響已在別處發(fā)表。3-(4，5- 二甲基噻唑-2-基)_2，5_ 二苯基溴化四唑測(cè)試如別處詳述(19)，采用3. OX IO3 8. OX IO3細(xì)胞/孔在96孔板上進(jìn)行了 3_(4， 5- 二甲基噻唑-2-基)-2，5- 二苯基溴化四唑測(cè)試。細(xì)胞死亡ELISA以1，000細(xì)胞/mL(100 μ L/孔)將細(xì)胞平板接種至96孔板中，一式四份。次日， 對(duì)其用藥物處理24h并用商購ELISA試劑盒(Roche Diagnostics)根據(jù)制造商說明書分析 組蛋白復(fù)合的DNA片段的存在。以特異性地對(duì)細(xì)胞凋亡而非壞死進(jìn)行定量的方式使用該試劑盒。免疫印跡和免疫組織化學(xué)染色如前所述制備總細(xì)胞裂解物并通過蛋白印跡分析進(jìn)行分析(19)。如前所述用 Vectastain抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物法試劑盒(VectorLaboratories)對(duì)腫瘤組織中 的蛋白表達(dá)進(jìn)行了免疫組織化學(xué)分析(32)。一抗購自Cell Signaling Technology或Santa Cruz Biotechnology, Inc.且根據(jù)制造商建議進(jìn)行使用。重復(fù)所有免疫印跡和染色至少一 次以驗(yàn)證結(jié)果。腫瘤組織的末端脫氧核苷酸基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記染色使用末端脫氧核苷酸基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)測(cè)試對(duì)腫瘤切 片中的細(xì)胞凋亡進(jìn)行定量測(cè)定。該方法的所有成分均來自ApopTag原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑 盒(Chemicon)，根據(jù)制造商說明書使用該試劑盒。從放大200倍時(shí)拍攝的10張隨機(jī)顯微照 片中確定各個(gè)腫瘤切片的TUNEL陽性細(xì)胞百分比。轉(zhuǎn)染和集落形成測(cè)試不同的小干擾RNA(SiRNA)合成于南加州大學(xué)/Norris綜合癌癥中心的微量化學(xué) 核心實(shí)驗(yàn)室；其序列如參考文獻(xiàn)32中所述。用這些siRNA對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和隨后通過集落形 成測(cè)試對(duì)細(xì)胞存活的分析已在別處詳細(xì)描述(32)。
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裸鼠的藥物治療4 6周齡雄性無胸腺nu/nu小鼠獲自Harlan并將5 X IO5個(gè)U87膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 細(xì)胞植入其皮下。一旦發(fā)展出約300mm3的腫瘤，則讓動(dòng)物接受藥物治療。將Velcade通過 尾部靜脈注射以單一劑量給藥。將DMC通過用不銹鋼球形頭飼針(Popper and Sons, Inc.) 直接施用至胃內(nèi)而每日給藥兩次(每12h給予一半的日劑量)。共50h后，將動(dòng)物處死，并 收集腫瘤用于分析。在所有實(shí)驗(yàn)中，對(duì)動(dòng)物的體重、食物消耗和毒性臨床表現(xiàn)進(jìn)行密切監(jiān) 測(cè)；沒有檢測(cè)到未經(jīng)藥物治療的對(duì)照動(dòng)物與經(jīng)藥物治療的動(dòng)物之間的差異。結(jié)果多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤代表預(yù)后極差的極其難治的癌癥類型。由于急需更有效的 療法，故選擇各種人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系為模型來研究所選藥物的組合效果。為了確立將 導(dǎo)致50%的細(xì)胞生長抑制的各種藥物的濃度(IC5tl),首先用硼替佐米、塞來昔布或非昔布 類塞來昔布類似物DMC單獨(dú)處理各細(xì)胞系。用硼替佐米處理48h后所得IC5tl對(duì)于U251、 U87MG和T98G膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系為約lOnmol/L，而對(duì)LN229膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系略低于 5nmol/L(圖12A)。由于硼替佐米被開發(fā)用于多發(fā)性骨髓瘤治療并且在這些腫瘤細(xì)胞系中 具有高細(xì)胞毒性，因此出于比較目的，也在代表性多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系RPMI/8226中確定 了其IC5(1。如圖12A所示，且正如預(yù)期，RPMI/8226細(xì)胞展示出對(duì)硼替佐米的高敏感性；然 而，該細(xì)胞類型并不比膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系更敏感。這一發(fā)現(xiàn)證實(shí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞對(duì)硼 替佐米非常敏感，而這支持了本發(fā)明人對(duì)該藥物作為潛在的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤療法的研究的理 論依據(jù)。此外還確定了塞來昔布和DMC在所有四種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的IC5tl (圖12A 和B)。塞來昔布在U251、U87MG和T98G細(xì)胞中顯示出約50 μ mol/L的IC50,而DMC在某種 程度上更為有效，其IC5tl略低于40 μ mol/L。LN229細(xì)胞系(顯示出對(duì)硼替佐米的最高敏感 性；圖12A)對(duì)于塞來昔布或DMC總體上敏感性略低(圖12A和B)。為了確定硼替佐米、塞來昔布和DMC誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的ESR的能力，用遞 增濃度的各個(gè)藥物處理U251細(xì)胞增加了 GRP78和CHOP的表達(dá)，表明ESR被引發(fā)。另外，該 藥物還刺激與ER應(yīng)激相關(guān)的半胱天冬酶4酶原的激活，如該酶的切割(即活化)形式的出 現(xiàn)所指示。為了驗(yàn)證硼替佐米在所用濃度發(fā)揮其已確立的功能(即對(duì)蛋白酶體的抑制)，還 研究了多泛素化蛋白的積聚。如圖13A所示，ER應(yīng)激標(biāo)記物的誘導(dǎo)與極大升高的多泛素化 蛋白水平的出現(xiàn)相一致，從而表明對(duì)蛋白酶體的抑制與對(duì)ER應(yīng)激的誘導(dǎo)相關(guān)。在用塞來昔布或DMC處理細(xì)胞后研究了同樣的靶標(biāo)。在所有實(shí)驗(yàn)中，塞來昔布和 DMC均產(chǎn)生相同結(jié)果，不同之處是DMC稍微更加有效[為此，且還由于早前已對(duì)塞來昔布對(duì) ER應(yīng)激的誘導(dǎo)進(jìn)行了報(bào)道，故主要關(guān)注由DMC獲得的結(jié)果]。如圖3B所示，DMC治療導(dǎo)致 GRP78和CHOP的強(qiáng)烈誘導(dǎo)以及半胱天冬酶4的激活，表明該藥物引發(fā)ER應(yīng)激。然而，該藥 物不造成多泛素化蛋白的顯著積聚，這與對(duì)其作用機(jī)理與硼替佐米不同的預(yù)期相一致。接著檢驗(yàn)了組合藥物治療對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長和存活的影響。為此，將硼替 佐米與塞來昔布或DMC組合，濃度采取近似IC5tl值從而使?jié)撛谠鰪?qiáng)效果變得更為顯著。圖 14A描繪了對(duì)細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)的直觀展示，而圖14B顯示了定量結(jié)果。圖14A顯示出單獨(dú)藥 物處理導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目的增加較小且有絲分裂像的存在較少；相反，組合藥物治療導(dǎo)致明顯 的細(xì)胞損失和顯著的細(xì)胞死亡。通過在藥物處理過程中(8h、24h和48h)對(duì)活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行
27計(jì)數(shù)而對(duì)這些直觀印象進(jìn)行了補(bǔ)充。如圖14B所示，單一藥物處理允許初始細(xì)胞增殖(即 在8h至24h之間細(xì)胞數(shù)目增加)然后發(fā)揮其設(shè)想的細(xì)胞抑制效果(即在24h至48h之間 總細(xì)胞數(shù)沒有變化)。相反，當(dāng)將藥物組合施用時(shí)，在24h時(shí)間點(diǎn)處細(xì)胞數(shù)目沒有增加并且 在24h至48h之間活細(xì)胞顯著損失，表現(xiàn)出有效的細(xì)胞毒性效果。通過細(xì)胞死亡ELISA和集落形成測(cè)試進(jìn)一步研究了藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和存活 的程度，其中細(xì)胞死亡ELISA對(duì)整個(gè)培養(yǎng)物中的細(xì)胞凋亡量進(jìn)行定量，而集落形成測(cè)試確 定了能長期存活于藥物處理中并產(chǎn)生克隆子代的集落的個(gè)體細(xì)胞數(shù)。圖14C顯示用單獨(dú)藥 物處理膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞造成凋亡性細(xì)胞死亡小幅增加，而用硼替佐米和塞來昔布或DMC 組合治療則造成細(xì)胞死亡極大增加。在集落形成測(cè)試中，5nmol/L的硼替佐米使出現(xiàn)的集落 數(shù)減少約50% (圖14D)。選定濃度的塞來昔布和DMC自身僅發(fā)揮較小的抑制效果(使集 落數(shù)減少約10% 15% )。相反，當(dāng)用硼替佐米和塞來昔布或DMC組合處理細(xì)胞時(shí)，集落存 活量大大減少，分別減少了 > 90%和97%。將圖14中所用的各個(gè)測(cè)試應(yīng)用于數(shù)種不同膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系并且使用了不同 濃度的藥物組合(數(shù)據(jù)未顯示)。在所有情況下，獲得了非常相似的結(jié)果，這清楚地表明這 些藥物的組合與單獨(dú)使用各藥物處理相比導(dǎo)致細(xì)胞毒性的極大增加和細(xì)胞存活的顯著減 少。此外，由常規(guī)MTT測(cè)試計(jì)算了組合指數(shù)(Cl)，其中將遞增濃度的各藥物組合(數(shù)據(jù)未顯 示)并獲得CI < 1，這揭示藥物組合效果是協(xié)同性的。接著研究了 ESR對(duì)上述組合藥物效果的可能貢獻(xiàn)。用如上所述的相同藥物組合處 理U87MG和T98G細(xì)胞，并分析ESR系統(tǒng)和細(xì)胞死亡體系的各種成分。如圖15所示，單獨(dú)藥 物處理導(dǎo)致GRP78表達(dá)增加，而組合藥物處理使該蛋白的表達(dá)增加得更多。促凋亡CHOP蛋 白的水平因單一藥物處理而略有提高，因組合處理而更強(qiáng)地升高。用特異性識(shí)別c-Jun NH2 端激酶(JNK，一種關(guān)鍵的ESR促凋亡成分)的磷酸化(即活性)形式的抗體研究了該酶的 活性。發(fā)現(xiàn)組合藥物處理而非單獨(dú)藥物處理導(dǎo)致JNK活性的極大增加(圖15A)。這些結(jié)果 共同表明當(dāng)硼替佐米與塞來昔布或DMC組合時(shí)比任一種單獨(dú)藥物造成更強(qiáng)的ESR誘導(dǎo)。使 用LN229和U251細(xì)胞也獲得了相似結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。為了確定藥物誘導(dǎo)的ER應(yīng)激和細(xì)胞凋亡僅相互關(guān)聯(lián)還是有因果關(guān)系，特別減少 了 ESR成分GRP78的表達(dá)。如果藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡由ESR控制，則可以預(yù)期充當(dāng)ESR的 主要保護(hù)成分的GRP78水平的下降會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡的進(jìn)一步增加。用針對(duì)GRP78的siRNA 轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞；作為對(duì)照，用針對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不存在的靶標(biāo)(例如，綠色熒光蛋白 (GFP))的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。siGRP78轉(zhuǎn)染細(xì)胞和siGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞均用硼替佐米和塞來昔布 或DMC的組合進(jìn)行處理，并通過集落形成測(cè)試確定存活細(xì)胞數(shù)。如圖16A所示，在帶有降低 水平的GRP78的細(xì)胞中細(xì)胞存活顯著減少(P < 0. 002)；在用siGFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中藥物處理 后的細(xì)胞存活為63 % 68 %，但在用siGRP78轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中藥物處理后的細(xì)胞存活減少至 40% 42%。通過蛋白印跡分析確認(rèn)了 siGRP78對(duì)GRP78表達(dá)的下調(diào)；然而，盡管siGRP78 的存在使GRP78的基本水平降至低于檢出限，siRNA也不能完全阻斷藥物處理對(duì)GRP78的 誘導(dǎo)，這是由于仍能檢測(cè)到較低水平的誘導(dǎo)GRP78蛋白(圖16B)。盡管如此，在所有情況 下，siGRP78轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的GRP78蛋白總量仍低于siGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的GRP78蛋白總量。同 時(shí)，siGRP78轉(zhuǎn)染細(xì)胞表現(xiàn)出顯著增加的化療敏感性，這表明ESR在引發(fā)由硼替佐米與塞來 昔布或DMC的組合誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中起著因果作用。
最后，確定了上述體外事件是否也會(huì)在體內(nèi)發(fā)生。將U87MG細(xì)胞植入裸鼠皮下， 并在形成了一定大小的腫瘤后，動(dòng)物保持不受治療或用藥物對(duì)其進(jìn)行治療。由于此前的研 究已經(jīng)顯示塞來昔布在體內(nèi)有效刺激ESR，因而本實(shí)驗(yàn)中不包括該藥物；此外，所有已知的 DMC與塞來昔布的對(duì)比實(shí)驗(yàn)已經(jīng)顯示出兩種藥物在體外和體內(nèi)都可靠地獲得了相同的腫瘤 抑制結(jié)果，不同之處在于DMC始終表現(xiàn)出某種程度上更高的凋亡誘導(dǎo)效力。因此，決定將 DMC作為更有效的藥物選擇用于在體內(nèi)與硼替佐米的組合實(shí)驗(yàn)。此前已顯示，DMC自身相當(dāng)有效地引發(fā)體內(nèi)腫瘤組織中的ER應(yīng)激(39)，并且這一 效果在大于10mg/kg的劑量時(shí)開始出現(xiàn)?？紤]到這些早期結(jié)果，對(duì)該組合實(shí)驗(yàn)選擇7. 5mg/ kg作為可能有用的劑量；其理由是次優(yōu)的DMC劑量將允許組合效果的出現(xiàn)。用DMC或硼替 佐米單獨(dú)或組合治療帶腫瘤的動(dòng)物2天(由于想要關(guān)注初始細(xì)胞死亡的早期機(jī)理而非在腫 瘤細(xì)胞瀕死或已死時(shí)起主導(dǎo)作用的后期狀況，因而選擇了相對(duì)較短的治療期)。分析腫瘤組 織的CHOP (作為ER應(yīng)激的標(biāo)記物)表達(dá)并通過TUNEL染色(以使凋亡性細(xì)胞死亡的程度 可見)。發(fā)現(xiàn)DMC在該極低劑量時(shí)既沒有導(dǎo)致大量提高的CHOP表達(dá)也未顯著增加TUNEL 染色(圖17A)。硼替佐米治療自身造成了更大的CHOP陽性細(xì)胞分?jǐn)?shù)，伴隨增加的TUNEL 染色。相比之下，當(dāng)將硼替佐米與DMC共同給藥時(shí)，出現(xiàn)可以在每個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)到的非常強(qiáng) 的CHOP誘導(dǎo)，和大得多的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)的增加(圖17A)。當(dāng)對(duì)不同治療組中的TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量時(shí)，顯而易見的是組合治療比單獨(dú)藥物治療導(dǎo)致顯著更多的細(xì)胞死亡 (圖17B)；即，響應(yīng)于硼替佐米和DMC的治療的細(xì)胞死亡比單獨(dú)用DMC或硼替佐米治療的動(dòng) 物中的細(xì)胞死亡分別高出4. 9倍和3. 0倍。因而，組合藥物治療比單獨(dú)藥物治療造成了顯 著更高的ER應(yīng)激水平和更大量的細(xì)胞死亡，并且證實(shí)在體內(nèi)也能實(shí)現(xiàn)加重的ER應(yīng)激和增 強(qiáng)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞殺傷。實(shí)施例3 加重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是由替莫唑胺與非昔布類塞來昔布類似物2，5_ 二甲 基塞來昔布(DMC)的組合增強(qiáng)的腫瘤相關(guān)腦內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞殺傷的基礎(chǔ)材料和方法用TMZ (300 μ M)和20 μ M DMC處理腫瘤相關(guān)腦內(nèi)皮細(xì)胞(TuBEC) 48小時(shí)。除去藥 物并將細(xì)胞再溫育12天；屆時(shí)用臺(tái)盼藍(lán)據(jù)染技術(shù)評(píng)估細(xì)胞毒性。結(jié)果以每組的活細(xì)胞數(shù)表
7J\ ο結(jié)果神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療標(biāo)準(zhǔn)物替莫唑胺(TMZ)對(duì)抗腫瘤細(xì)胞非常有效。然而，該藥對(duì) 腫瘤相關(guān)腦內(nèi)皮細(xì)胞(TuBEC)幾乎沒有造成細(xì)胞毒性?？偨Y(jié)于圖18中的實(shí)驗(yàn)顯示出ER加 重劑DMC增加了腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞易受TMZ影響的的易感性。因而DMC通過使這些細(xì)胞對(duì) 已知治療藥物化學(xué)增敏而充當(dāng)抗血管生成劑。盡管已經(jīng)從具體示例性實(shí)施方式和實(shí)施例方面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但可以理解 本文公開的實(shí)施方式僅用于說明性目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不背離所附權(quán)利要求所述 的本發(fā)明的主旨和范圍的情況下進(jìn)行各種修改和變化。表1.引發(fā)細(xì)胞凋亡的策略 參考文獻(xiàn)1. Kerr, J. F. , ffyllie, Α. H.禾口 Curr i e , A. R. Apop t ο s i s : a basic biologicalphenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics (細(xì)胞凋 亡在組織動(dòng)力學(xué)中有廣泛意義的基本生物現(xiàn)象).Br. J. Cancer, 26 =239-257,1972.2. Hengartner Μ. 0. The biochemistry of apoptosis( _ Ifi _ t 白勺 L 學(xué)).Nature, 407 :770~776,2000.3. Thompson C. B. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease (疾病的發(fā)病機(jī)理和治療中的細(xì)胞凋亡).Science，267 =1456-1462,1995.4. Ferreira G. C.等，Clinical Cancer Research Vol. 8，2024-2034，2002年 7 月。5.Boyce Μ, Yuan J. Cellular response to endoplasmic reticulum stress :a matter of life or death(細(xì)胞對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的響應(yīng)生或死的問題).CellDeath Differ 2006；13 363-373.6. Wu J, Kaufman RJ. From acute ER stress to physiological roles of theunfolded protein Response (從急性ER應(yīng)激到未折疊蛋白響應(yīng)的生理學(xué)作用).Cell Death Differ 2006；13 :374_384.7. Ulrich CM, Bigler J, Potter JD. Non-steroidal anti~inflammatorydrugs for cancer prevention :promise, perils, and pharmacogenetics (癌癥預(yù)防用與巨留體抗 炎藥前景、危險(xiǎn)和藥物遺傳學(xué)).Nat Rev Cancer 2006,6 130-40.8. Hitomi J, Katayama Τ, Eguchi Y 等，Involvement of caspase-4 inendoplasmic reticulum stress-induced apoptosis and Ah—induced cell death(半 胱天冬酶4參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和Ah誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡).JCell Biol 2004 ； 165 347-356.9. Oyadomari S, Mori M. Roles of CH0P/GADD153 in endoplasmicreticulum stress (CH0P/GADD153 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用).Cell DeathDiffer 2004 ；11 :381_389.10. Parente L, Perretti M. Advances in the pathophysiology ofconstitutive and inducible cyclooxygenases :two enzymes in the spotlight (組成型禾口誘導(dǎo)型環(huán)氧 化酶的病理生理學(xué)進(jìn)展兩種受到矚目的酶).BiochemPharmacol 2003 ；65 153-159.11. Yoshida H, Okada T, Haze K, Yanagi H, Yura T, Negishi M 禾口 MoriK (2001) Endoplasmic reticulum stress-induced formation of transcriptionfactor complex ERSF including NF-Y(CBF) and activating transcriptionfactors 6alpha and 6beta that activates the mammalian unfolded proteinresponse (內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的包括 NF-Y(CBF)以及激活哺乳動(dòng)物未折疊蛋白響應(yīng)的激活轉(zhuǎn)錄因子6 α和6β的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合 物 ERSF 的形成)· Mol. Cell. Biol. 21 1239-1248.12. Yoshida H, Matsui Τ, Yamamoto A, Okada T 和 Mori K(2001)XBPl mRNA is induced by ATF6and spliced by IREl in response to ERstress to produce a highly active transcription factor (XBP1 mRNA 響應(yīng)于 ER 應(yīng)激而受 ATF6 誘導(dǎo)并被 IREl 剪接從 而產(chǎn)生高活性轉(zhuǎn)錄因子).Celll07 881-891.13. Calfon Μ, Zeng H, Urano F, Till JH, Hubbard SR, Harding HP, Clark SG 禾口 Ron D (2002)IREl couples endoplasmic reticulum load tosecretory capacity by
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3權(quán)利要求
一種誘導(dǎo)或加重細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中的應(yīng)激以引發(fā)細(xì)胞凋亡的方法，所述方法包括選擇性抑制所述細(xì)胞中的SERCA活性而不抑制COX 2活性；并提高所述細(xì)胞中的CHOP表達(dá)，其中，抑制SERCA活性和提高CHOP表達(dá)的組合導(dǎo)致有利于啟動(dòng)所述細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡的情況。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，以足以將胞質(zhì)鈣濃度升高至顯著高于正常水平從 而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的持續(xù)時(shí)間，直接或間接地施用藥物有效量的能選擇性抑制SERCA的ER應(yīng) 激加重劑，由此來完成所述選擇性抑制SERCA的步驟。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述ER應(yīng)激加重劑不抑制C0X-2。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述ER應(yīng)激加重劑不引發(fā)組胺釋放。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述ER應(yīng)激加重劑包括具有下述通式的化合物 其中，隊(duì)是甲基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、烷基、氟烷基、二氟烷基、三氟烷基、多氟烷基、 羥烷基或羧烷基；R2是氫、氟、氯、溴；氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、烷基、氟烷基、二氟烷基、三氟烷基、多 氟烷基、羥烷基或羧烷基；民 &獨(dú)立地選自由以下基團(tuán)組成的組氫、氟、氯、溴、烷氧基、烷基、氟烷基、二氟烷 基、三氟烷基、多氟烷基、羥烷基或羧烷基、芳基和雜芳基；R8 Rn獨(dú)立地選自由以下基團(tuán)組成的組氧、氟、氯、溴；氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、 烷基、氟烷基、二氟烷基、三氟烷基、多氟烷基、羥烷基、羧烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、 芳基或雜芳基；和R12是氫、乙?；?、酰基、烷基、氟烷基、二氟烷基、三氟烷基、多氟烷基、羥烷基、羧烷基; 氨基?；被榛?、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，隊(duì)是三氟甲基。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，R2、R8 R12是氫。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，R4、R5和R7是氫。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，是三氟甲基，R2、R4、R5、R7 R12是氫。
10.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，民和&選自由以下基團(tuán)組成的組氫、氟、氯、溴； 氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、烷基、芳基、雜芳基、氟烷基、二氟烷基、三氟烷基、多氟烷基、 羥烷基或羧烷基。
11.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述ER應(yīng)激加重劑是4-[5-(2，5_二甲基苯基)-3_(三氟甲基)-lH-吡唑-1-基]苯磺酰胺、4-[5-(2，5_二 (三氟甲基)苯基)-3-(三 氟甲基)-lH-吡唑-1-基]苯磺酰胺和4-[5-(2，5_ 二溴苯基)-3-(三氟甲基)-lH-吡 唑-1-基]苯磺酰胺或其類似物。
12.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述ER應(yīng)激加重劑包括能代謝為SERCA抑制劑的 前藥。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括施用第二ER應(yīng)激加重劑的步驟，所述第 二 ER應(yīng)激加重劑能增加所述ER中錯(cuò)折疊或受損的蛋白質(zhì)的濃度。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述第二ER應(yīng)激加重劑包括蛋白酶體抑制劑或 蛋白酶抑制劑。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述蛋白酶體抑制劑是硼替佐米或其類似物。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述蛋白酶抑制劑是選自奈非那韋、阿扎那韋、 福沙那韋、利托那韋、茚地那韋或其類似物的HIV蛋白酶抑制劑。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括施用細(xì)胞凋亡增強(qiáng)物的步驟。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述細(xì)胞凋亡增強(qiáng)物能夠上調(diào)CHOP表達(dá)、克服 GRP78的保護(hù)功能并激活半胱天冬酶。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述細(xì)胞凋亡增強(qiáng)物是GRP78用siRNA或GRP78 功能的抑制劑。
20.一種用于篩選、選擇或設(shè)計(jì)能用于誘導(dǎo)或加重細(xì)胞中的ER應(yīng)激以引發(fā)細(xì)胞凋亡的 方法，所述方法包括下述步驟獲取測(cè)試化合物的信息，其中所述信息包括SERCA抑制活性、C0X-2抑制活性和組胺釋 放活性；和如果所述測(cè)試化合物是SERCA抑制劑而不是C0X-2抑制劑，則將所述化合物鑒定為潛 在的ER應(yīng)激加重劑。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述獲取步驟包括進(jìn)行生化測(cè)試、基于細(xì)胞的測(cè) 試或在線數(shù)據(jù)庫搜索。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，所述方法還包括對(duì)多個(gè)測(cè)試化合物重復(fù)所述獲取步驟 和鑒定步驟。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述獲取、鑒定和重復(fù)步驟以高通量篩選形式進(jìn)行。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述多個(gè)測(cè)試化合物取自化學(xué)庫。
25.如權(quán)利要求22所述的方法，所述方法還包括對(duì)一組經(jīng)鑒定為潛在的ER應(yīng)激加重劑的選定化合物進(jìn)行定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)分析；使用所述QSAR分析的結(jié)果設(shè)計(jì)一種或多種新測(cè)試化合物；和對(duì)所述新測(cè)試化合物進(jìn)行所述獲取步驟和鑒定步驟。
26.—種藥物組合物，所述藥物組合物能用于誘導(dǎo)或加重細(xì)胞中的ER應(yīng)激以引發(fā)所述 細(xì)胞的凋亡，且所述藥物組合物包含ER應(yīng)激加重劑；和可藥用載體。
27.如權(quán)利要求26所述的藥物組合物，其中，所述ER應(yīng)激加重劑選自權(quán)利要求5所述的化合物。
28.如權(quán)利要求26所述的藥物組合物，其中，所述ER應(yīng)激加重劑是能被代謝為SERCA 抑制劑的前藥。
29.如權(quán)利要求26所述的藥物組合物，其中，所述ER應(yīng)激加重劑能增加所述ER中錯(cuò)折 疊或受損的蛋白的濃度。
30.如權(quán)利要求29所述的藥物組合物，其中，所述第二ER應(yīng)激是蛋白酶體抑制劑或蛋 白酶抑制劑。
31.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含第一ER應(yīng)激加重劑和能增加所述ER中錯(cuò)折 疊或受損的蛋白的濃度的第二 ER應(yīng)激加重劑，所述第一 ER應(yīng)激加重劑是權(quán)利要求5所述 的化合物。
32.—種治療患者的疾病狀況的方法，所述方法通過誘導(dǎo)或加重選定的患病細(xì)胞中的 ER應(yīng)激以引發(fā)所述細(xì)胞的凋亡而進(jìn)行，且所述方法包括施用藥物有效量的權(quán)利要求26所述的藥物組合物。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述患病細(xì)胞在所述施用步驟之前處于ER應(yīng)激 狀態(tài)中。
34.如權(quán)利要求32所述的方法，所述方法還包括施用藥物有效量的權(quán)利要求18所述的 細(xì)胞凋亡增強(qiáng)物。
35.如權(quán)利要求32所述的方法，所述方法還包括施用藥物有效量的第二藥物組合物， 所述第二藥物組合物含有能增加所述ER中錯(cuò)折疊或受損的蛋白的濃度的不同ER應(yīng)激加重 劑。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中，所述不同ER應(yīng)激加重劑是蛋白酶體抑制劑或蛋 白酶抑制劑。
37.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述疾病狀況由細(xì)胞凋亡失調(diào)造成。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中，所述疾病是癌癥。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中，所述癌癥是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。
40.如權(quán)利要求38所述的方法，其中，所述癌癥選自乳腺癌、胰腺癌、伯基特氏淋巴瘤、 多發(fā)性骨髓瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、復(fù)發(fā)性癌癥、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、抗化療 腫瘤和抗藥性癌癥。
41.一種加重細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中的應(yīng)激以引發(fā)細(xì)胞凋亡的方法，所述細(xì)胞處于低激狀態(tài)，所述低ER應(yīng)激狀態(tài)經(jīng)高于正常細(xì)胞通常GRP78水平的GRP78水平而證實(shí)，所述方 法包括提供抑制所述細(xì)胞中的SERCA活性從而導(dǎo)致CHOP表達(dá)提高的化合物，其中，抑制SERCA活性和提高CHOP表達(dá)的組合導(dǎo)致有利于啟動(dòng)所述細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡 的情況。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中，所述化合物不是C0X-2抑制劑或組胺釋放劑。
43.如權(quán)利要求41所述的方法，其中，所述化合物根據(jù)權(quán)利要求5而選擇。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過加重ER應(yīng)激而在選中的細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法。通過抑制SERCA(肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶)以特異性方式實(shí)現(xiàn)ER應(yīng)激的加重，從而導(dǎo)致胞質(zhì)鈣濃度水平升高而不抑制COX-2(環(huán)氧化酶-2)的活性或引發(fā)組胺釋放。通過經(jīng)抑制蛋白酶體或蛋白酶來首先誘導(dǎo)或進(jìn)一步加重ER應(yīng)激可以增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。此外，本發(fā)明還提供了可用作ER應(yīng)激加重劑的化合物和組合物、用于篩選、選擇、鑒定和設(shè)計(jì)所述化合物和組合物的方法以及通過經(jīng)特異性和選擇性加重ER應(yīng)激來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而治療疾病狀況的方法。
文檔編號(hào)C12N5/00GK101918843SQ200880017561
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2008年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月26日
發(fā)明者佛羅倫斯·M.·霍夫曼, 尼科斯·A.·佩塔西斯, 托馬斯·C.·陳, 斯坦·G.·路易, 阿克賽爾·H.·舍恩塔爾 申請(qǐng)人:南加州大學(xué)