專利名稱：：同型半胱氨酸診斷/測定試劑(盒)及同型半胱氨酸濃度測定方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種同型半胱氨酸診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定同型半胱氨酸濃度的方法，屬于醫(yī)學檢驗測定
技術領域：
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背景技術：
：測定血漿中同型半胱氨酸的方法有很多種，包括高效液相色譜法(HPLC)、氨基酸分析儀測定法、離子色譜法、酶聯(lián)免疫分析法(EIA)、毛細管氣相色譜_質譜，熒光偏振免疫分析(FPIA)、電化學法及酶法等等。1.高效液相色譜法(HPLC):是經(jīng)典的參考方法，但其有操作比較復雜，試驗耗時比較長，試驗數(shù)據(jù)變異比較大的缺點，在臨床應用方面逐漸被酶聯(lián)免疫分析法、熒光偏振分析法和酶法所取代。高效液相色譜法是先使用還原劑使血樣中所有形式的同型半胱氨酸轉變成還原形式，然后與熒光劑進行衍生生成同型半胱氨酸_熒光物質復合物，將衍生后的樣品進行色譜分析。因色譜固定相對不同物質的吸附力不同，因此流動相將其洗脫下來的次序也不同，根據(jù)這一原理將樣品中的不同物質分開，以熒光檢測器檢測洗脫下同型半胱氨酸-熒光物質復合物的熒光強度，將其與標準品/內標的比值進行比較和計算，就可以測定血總同型半胱氨酸的水平。2.酶聯(lián)免疫分析法(EIA):是臨床上測定同型半胱氨酸水平的常用方法，其特點是操作比較方便、快捷，重復性好，方法穩(wěn)定可靠。缺點是大部分操作還是手工操作，比較耗時等。酶聯(lián)免疫分析法其基本分析原理先使用酶將血樣中所有形式的同型半胱氨酸轉變成S-腺苷-L-同型半胱氨酸，然后加入酶標的抗S-腺苷-L-同型半胱氨酸的單克隆或多克隆抗體，采用競爭結合的原理，將不同水平的標準品與酶標抗體競爭結合，然后以顯色試劑和終止試劑分別進行顯色和終止，制作出同型半胱氨酸濃度與發(fā)色強度的標準曲線。樣品也按相同步驟處理，在標準曲線上就可以查出其同型半胱氨酸的濃度。3.離子色譜法主要用于實驗研究，臨床上較少使用。其基本分析原理是色譜分析的一種，主要是其固定相采用離子交換物質，根據(jù)其對不同離子的吸附力不同可將同型半胱氨酸與其它物質分開進行測定。4.毛細電泳法主要用于實驗研究，有在臨床使用的報道。其特點與高效液相色譜方法相似，如其有操作比較復雜、試驗耗時較長和試驗數(shù)據(jù)變異比較大的缺點?；痉治鲈硐仁褂眠€原劑使血樣中所有形式的同型半胱氨酸轉變成還原形式，然后與熒光試劑進行衍生生成同型半胱氨酸_熒光物質復合物，將衍生后的樣品進行毛細電泳分析。將樣品放置于10千伏左右的高壓電場中，因為各種物質所帶電荷不同，其等電點也不相同，因此其在電場中的遷移速度也就不同，根據(jù)這一原理可將同型半胱氨酸與樣品中的其它物質分開，再以熒光檢測器檢測同型半胱氨酸_熒光物質復合物的熒光強度，將其與標準品/內標的比值進行比較和計算，就可以測定總同型半胱氨酸的水平。5.熒光偏振法是臨床上測定同型半胱氨酸水平的比較好的方法，該方法完全自動化儀器分析，具有快速、準確、方便的優(yōu)點。其基本分析原理樣品中游離同型半胱氨酸和抗單克隆抗體相結合的同型半胱氨酸的熒光偏振強度不同，將樣品、標準品與標抗體競爭結合，采用競爭結合的原理制作出同型半胱氨酸濃度與熒光偏振強度的標準曲線，在標準曲線上就可以查出其同型半胱氨酸的濃度。6.酶法是因應市場需求而新開發(fā)出來的測試方法，目前國內有多項專利申請CN98807531.8利用同型半胱氨酸酶來測量樣品中同型半胱氨酸含量；CN200410016789.6利用同型半胱氨酸轉甲基酶(E.C.2.1.1.10)及腺苷同型半胱氨酸酶(E.C.3.3.1.1)的循環(huán)擴增作用，再加上腺苷脫氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶等，或腺苷脫氨酶、谷氨酸脫氫酶等顯色反應測定同型半胱氨酸含量；CN200510053210.8利用L-蛋氨酸Y-裂解酶作用于同型半胱氨酸使之產(chǎn)生硫化氫后再與瑩光化合物DMPD2HC1作用產(chǎn)生熒光，該方法使用全自動熒光分析儀測試，具有快速、準確、方便的優(yōu)點。其基本分析原理用基因重組酶將同型半胱氨酸分解，所形成之硫化氫產(chǎn)物再與熒光顯色劑發(fā)生化學反應形成可測量之熒光化合物。
發(fā)明內容本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetricMethod)及酶(偶)聯(lián)法(CoupleReaction)技術，監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定同型半胱氨酸濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的同型半胱氨酸診斷/測定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行同型半胱氨酸濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。本發(fā)明同型半胱氨酸濃度測定方法如下同型半胱氨酸+水同型半胱氨酸脫巰基酶硫化氫+氨+2-氧代丁酸2-氧找丁酸+輔酶A+氧化型鐵氧化蛋白2-氧代丁酰合成酶二氧化碳+丙酰_輔酶A+還原型鐵氧還蛋白二氧化碳+還原型輔酶甲酸脫氫酶甲酸+輔酶這種方法應用同型半胱氨酸脫硫基酶(homocysteinedesulfhydrase;EC4.4.1.2)酶(偶)聯(lián)2-氧代丁酰合成酶(2-oxobutyratesynthase;EC1.2.7.2)、甲酸脫氫酶(formatedehydrogenase;EC1.2.1.2;EC1.2.1.43)酶促反應比色終點法。同型半胱氨酸脫硫基酶酶解同型半胱氨酸反應產(chǎn)生2-氧代丁酸，再通過(偶)聯(lián)合2-氧代丁酰合成酶、甲酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度，通過測量340nm處吸光度下降的程度，可以測算同型半胱氨酸的濃度大小。實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發(fā)明同型半胱氨酸診斷/測定試劑(盒)較為理想緩沖液100mmol/L穩(wěn)定劑500mmol/L還原型輔酶0.25mmol/L同型半胱氨酸脫硫基酶9000U/L52-氧代丁酰合成酶8000U/L甲酸脫氫酶10000U/L輔酶A3,1/L氧化型鐵氧還蛋白5mmol/L本發(fā)明的同型半胱氨酸診斷/測定試劑(盒)可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、同型半胱氨酸脫硫基酶、2-氧代丁酰合成酶、甲酸脫氫酶、輔酶A、氧化型鐵氧還蛋白。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、輔酶A、氧化型鐵氧還蛋白。試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、同型半胱氨酸脫硫基酶、2-氧代丁酰合成酶、甲酸脫氫酶。還原型輔酶、同型半胱氨酸脫硫基酶、2_氧代丁酰合成酶、甲酸脫氫酶、輔酶A、氧化型鐵氧還蛋白在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、輔酶A、氧化型鐵氧還蛋白。試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、2_氧代丁酰合成酶、甲酸脫氫酶。試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、同型半胱氨酸脫硫基酶。還原型輔酶、同型半胱氨酸脫硫基酶、2_氧代丁酰合成酶、甲酸脫氫酶、輔酶A、氧化型鐵氧還蛋白在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定同型半胱氨酸濃度的方法，其還原型輔酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一種。具體實施例方式下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。實施例一本實施例的同型半胱氨酸診斷/測定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L穩(wěn)定劑500mmol/L還原型輔酶0.25mmol/L同型半胱氨酸脫硫基酶9000U/L2-氧代丁酰合成酶8000U/L6甲酸脫氫酶10000U/L輔酶A3mmol/L氧化型鐵氧還蛋白5mmol/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復溶后使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起始吸光度I.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測同型半胱氨酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出同型半胱氨酸的濃度大小。實施例二本實施例的同型半胱氨酸診斷/測定試劑為雙試劑，包括試劑l三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L50mmol/L0.25,1/L3mmol/L5mmol/L穩(wěn)定劑還原型輔酶輔酶A氧化型鐵氧還蛋白試劑2三(羧甲基)氨基甲烷穩(wěn)定劑同型半胱氨酸脫硫基酶2_氧代丁酰合成酶甲酸脫氫酶鹽酸緩沖液100mmol/L500,1/L9000U/L8000U/L10000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起始吸光度I.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測同型半胱氨酸樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出同型半胱氨酸的濃度大小。實施例三本實施例的同型半胱氨酸診斷/測定試劑為三試劑，包括試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L穩(wěn)定劑50mmol/L還原型輔酶0.25mmol/L輔酶A3mmol/L氧化型鐵氧還蛋白5mmol/L7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>10000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。測定同型半胱氨酸濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測同型半胱氨酸樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出同型半胱氨酸的濃度大小。申請人:經(jīng)過實驗驗證，采用以上
發(fā)明內容中記載的其他測定方法均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉?？傊?，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.001;吸光度時間反應曲線應呈下降曲線直至終點；試劑可測有效(R>0.99)線形范圍可達600ymol/L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過±4%;試劑測試的精密度(重復性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈敏度可達O.0004±0.0002AA/iimol/L;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應用。權利要求一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的同型半胱氨酸濃度測定方法，其方法如下同型半胱氨酸+水同型半胱氨酸脫巰基酶硫化氫+氨+2-氧代丁酸2-氧代丁酸+輔酶A+氧化型鐵氧還蛋白2-氧代丁酰合成酶二氧化碳+丙酰-輔酶A+還原型鐵氧還蛋白二氧化碳+還原型輔酶甲酸脫氫酶甲酸+輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，測算出同型半胱氨酸的濃度大小測定結果。2.—種同型半胱氨酸診斷/測定試劑(盒)，主要成分包括試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內效果較好，在此范圍外，試劑仍會反應作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。3.根據(jù)權利要求2所述同型半胱氨酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、同型半胱氨酸脫硫基酶、2_氧代丁酰合成酶、甲酸脫氫酶、輔酶A、氧化型鐵氧還蛋白組成單劑試劑。4.根據(jù)權利要求2所述同型半胱氨酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、同型半胱氨酸脫硫基酶、2_氧代丁酰合成酶、甲酸脫氫酶、輔酶A、氧化型鐵氧還蛋白組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、輔酶A、氧化型鐵氧還蛋白組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、同型半胱氨酸脫硫基酶、2-氧代丁酰合成酶、甲酸脫氫酶組成。還原型輔酶、同型半胱氨酸脫硫基酶、2-氧代丁酰合成酶、甲酸脫氫酶、輔酶A、氧化型鐵氧還蛋白在試劑1或試劑2中的位置可以不限。5.根據(jù)權利要求2所述同型半胱氨酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、同型半胱氨酸脫硫基酶、2-氧代丁酰合成酶、甲酸脫氫酶、輔酶A、氧化型鐵氧還蛋白組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、輔酶A、氧化型鐵氧還蛋白組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、2-氧代丁酰合成酶、甲酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、同型半胱氨酸脫硫基酶組成。還原型輔酶、同型半胱氨酸脫硫基酶、2-氧代丁酰合成酶、甲酸脫氫酶、輔酶A、氧化型鐵氧還蛋白在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。6.根據(jù)權利要求2所述同型半胱氨酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑l-4000mmol/L或0.1%_100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(PropyleneGlycol)、乙二酉孚(Ethyleneglycol)及防二氧化碳+丙酰-輔酶A+還原型鐵氧還蛋白緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶同型半胱氨酸脫硫基酶2_氧代丁酰合成酶甲酸脫氫酶輔酶A氧化型鐵氧還蛋白腐劑中的至少一種'全文摘要本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的同型半胱氨酸診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定同型半胱氨酸濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學檢驗測定
技術領域：
。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、輔酶A、氧化型鐵氧還蛋白、同型半胱氨酸脫硫基酶、2-氧代丁酰合成酶、甲酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度，從而測算出同型半胱氨酸的濃度大小。文檔編號C12Q1/26GK101750299SQ200810235618公開日2010年6月23日申請日期2008年12月10日優(yōu)先權日2008年12月10日發(fā)明者王爾中申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司