專利名稱：氨基酸診斷/測定試劑(盒)及氨基酸濃度測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種氨基酸診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定氨基酸濃度
的方法，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術領域。
背景技術：
氨基酸含量的測定在醫(yī)學/食品/工業(yè)/農業(yè)/環(huán)境中都是比較重要的測定項目。 現有的測定方法有色譜法、電化學法、儀器分析法(氨基酸分析儀)、分光光度計等方法，這 些方法或是操作方法較為繁雜、特異性差、或儀器設備成本較高等缺點。 氨基酸不是單純的一種物質，用氨基酸分析儀可直接測定出17種氨基酸(儀器價 格昂貴，不能普遍使用)，對于醫(yī)學/食品/工業(yè)/農業(yè)/環(huán)境中來說，多數情況下，都是很 多種氨基酸同時存在，所以需要測定總的氨基酸含量，它們不能以氨基酸百分率來表示，只 能以氨基酸中所含的氮(氨基酸氮)的百分率表示。 大量食肉或饑餓時尿中氨基酸氮增加，孕婦及新生兒尿液氨基酸氮也增加。氨基 酸代謝異常，造成某些氨基酸在體內積累過多，使尿中氨基酸氮增高；急性肝萎縮、肝功能 衰竭、Reye綜合征、或某些因素造成蛋白質分解加速的疾病，遺傳性疾病所導致的代謝異常 均可使尿中氨基酸氮增加。 酶法測定血、尿、體液、食品、土壤、工業(yè)產品中氨基酸氮含量具有特異性高、方法 簡便、成本低的特點。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶) 在340nm波長處吸光度的變化，得以測定氨基酸濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實 現該方法的氨基酸診斷/測定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或 半、全自動生化分析儀上進行氨基酸濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到 切實的推廣應用。 本發(fā)明氨基酸濃度測定方法如下<formula>formula see original document page 4</formula>這種方法應用氨基酸氧化酶(amino-acid oxidase ;EC 1. 4. 3. 2 ;EC 1.4.3.3)
酶(偶)聯丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase EC 1. 2. 3. 3) 、 N_甲基丙氨酸脫氫酶
(N-methylalanine dehydrogenase ;EC 1.4. 1. 17)酶促反應比色法。氨基酸氧化酶酶解氨
基酸反應產生過氧化氫，再通過(偶)聯合丙酮酸氧化酶J-甲基丙氨酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得 以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度，通過測量340nm處吸光度下降的程度，可 以測算氨基酸的濃度大小。 實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單
劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發(fā)明氨基酸診斷/測定試劑(盒)較為理想 緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 還原型輔酶 0. 25mmol/L 氨基酸氧化酶 6000U/L 丙酮酸氧化酶 8000U/L N-甲基丙氨酸脫氫酶10000U/L 碳酸氫鈉 6mmol/L 乙酰磷酸 12mmol/L 甲胺 12mmol/L 本發(fā)明的氨基酸診斷/測定試劑(盒)可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、N-甲基丙氨酸脫氫 酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰磷酸、甲胺。 試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰磷酸、甲胺。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、N-甲基丙氨酸脫氫酶。 還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、N-甲基丙氨酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二
氧化碳)、乙酰磷酸、甲胺在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀
態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰磷酸、甲胺。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定齊11、丙酮酸氧化酶』-甲基丙氨酸脫氫酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶。 還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、N-甲基丙氨酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二 氧化碳)、乙酰磷酸、甲胺在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是 干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定氨基酸濃度的方法，其還原型輔酶可以是 NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
5丙酮酸氧化酶 N-
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的氨基酸診斷/測定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 還原型輔酶 0. 25mmol/L
' 6000U/L 8000U/L
10000U/L 6mmol/L 12mmol/L 12mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復溶后使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7，
測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方
向為負反應(下降反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。 實施例二










乙酰磷酸 甲胺














本實施例的氨基酸診斷 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
乙酰磷酸
甲胺
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑
測定試劑為雙試劑，包括
鹽酸緩沖液100mmol/L 50mmol/L 0. 25,1/L 6mmol/L 12mmol/L 12mmol/L
鹽酸緩沖液lOOmmol/L 500,1/L 6000U/L 丙酮酸氧化酶 8000U/L N-甲基丙氨酸脫氫酶10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7，
l試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑1、試劑2的體積比例為
62/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右,
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。
實施例三

















本實施例的氨基酸診斷 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
乙酰磷酸
甲胺
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷
穩(wěn)定劑
內酮酸氧化酶
N-甲基丙氨酸脫氫酶
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑
測定試劑為三試劑，包括
鹽酸緩沖液100mmol/L 50mmol/L 0. 25,1/L 6mmol/L 12mmol/L 12mmol/L
鹽酸緩沖液lOOmmol/L 500,1/L 8000U/L 10000U/L
鹽酸緩沖液lOOmmol/L 500,1/L 6000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定氨基酸濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起 始吸光度1. 8±0. 7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨基酸樣品與試劑1、試劑 2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約0分鐘左 右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。 申請人:經過實驗驗證，采用以上發(fā)明內容中記載的其他測定方法均能達到本發(fā)明 的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。 總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0008 ;吸光度時間反應曲線應呈 下降曲線直至終點；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達40mmol/L ;試劑測試的不準 確度，其相對偏差不超過±4% ;試劑測試的精密度(重復性)的變異系數(CV)《2% ;試 劑的靈敏度可達O. 0025±0. 0015TTTAA/mmol/L ;試劑在2-8°C下保存，活性可以穩(wěn)定一 年；——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應用。
權利要求
一種利用酶比色法及酶聯法技術的氨基酸濃度測定方法，其方法如下氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨+過氧化氫過氧化氫+二氧化碳+乙酰磷酸丙酮酸氧化酶磷酸根+ 丙酮酸+氧+水丙酮酸+甲胺+還原型輔酶N-甲基丙氨酸脫氫酶 N-甲基丙氨酸+水+輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，測算出氨基酸的濃度大小測定結果。
2. —種氨基酸診斷/測定試劑(盒)，主要成分包括試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內效果較好，在此范圍外，試劑仍會 反應作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、N-甲基丙氨酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰磷酸、甲胺組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、N-甲基丙氨酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰磷酸、甲胺組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型 輔酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰磷酸、甲胺組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化 酶、丙酮酸氧化酶^_甲基丙氨酸脫氫酶組成。還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、 N-甲基丙氨酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰磷酸、甲胺在試劑1或試劑2中的位置 可以不限。
5. 根據權利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、N-甲基丙氨酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰磷酸、甲胺組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔 酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰磷酸、甲胺組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、 N-甲基丙氨酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶組成。還原型輔酶、氨 基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、N-甲基丙氨酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰磷酸、甲胺 在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6.根據權利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑l-4000mmol/L或0. 1% _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(A,niaSulfate)、甘油 (Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐齊U中的至少一 種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的氨基酸診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定氨基酸濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰磷酸、甲胺、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、N-甲基丙氨酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度，從而測算出氨基酸的濃度大小。
文檔編號C12Q1/26GK101750294SQ200810235609
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月10日 優(yōu)先權日2008年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司