專利名稱：氨基酸診斷/測(cè)定試劑(盒)及氨基酸濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氨基酸診斷/測(cè)定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定氨基酸濃度
的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氨基酸含量的測(cè)定在醫(yī)學(xué)/食品/工業(yè)/農(nóng)業(yè)/環(huán)境中都是比較重要的測(cè)定項(xiàng)目?，F(xiàn)有的測(cè)定方法有色譜法、電化學(xué)法、儀器分析法(氨基酸分析儀)、分光光度計(jì)等方法，這些方法或是操作方法較為繁雜、特異性差、或儀器設(shè)備成本較高等缺點(diǎn)。 氨基酸不是單純的一種物質(zhì)，用氨基酸分析儀可直接測(cè)定出17種氨基酸(儀器價(jià)格昂貴，不能普遍使用)，對(duì)于醫(yī)學(xué)/食品/工業(yè)/農(nóng)業(yè)/環(huán)境中來說，多數(shù)情況下，都是很多種氨基酸同時(shí)存在，所以需要測(cè)定總的氨基酸含量，它們不能以氨基酸百分率來表示，只能以氨基酸中所含的氮(氨基酸氮)的百分率表示。 大量食肉或饑餓時(shí)尿中氨基酸氮增加，孕婦及新生兒尿液氨基酸氮也增加。氨基酸代謝異常，造成某些氨基酸在體內(nèi)積累過多，使尿中氨基酸氮增高；急性肝萎縮、肝功能衰竭、Reye綜合征、或某些因素造成蛋白質(zhì)分解加速的疾病，遺傳性疾病所導(dǎo)致的代謝異常均可使尿中氨基酸氮增加。 酶法測(cè)定血、尿、體液、食品、土壤、工業(yè)產(chǎn)品中氨基酸氮含量具有特異性高、方法簡(jiǎn)便、成本低的特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetricMethod)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定氨基酸濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的氨基酸診斷/測(cè)定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行氨基酸濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明氨基酸濃度測(cè)定方法如下 氨基酸+水+氧氨某酸氧化酶氧代酸+氨+過氧化氫 過氧化氫+ 二氧化碳+乙酰輔酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸+ 輔酶A+氧 丙酮酸+ 二氧化碳+還原型輔酶蘋果酸脫,ft酶(脫,羧化) 蘋果酸+輔酶這種方法應(yīng)用氨基酸氧化酶(amino-acid oxidase ;EC 1. 4. 3. 2 ;EC
1. 4.3.3)酶(偶)聯(lián)丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase ;EC 1. 2. 3. 6)、蘋果酸脫氫酶
(malatedehydrogenase ;EC 1. 1. 1. 38 ;EC 1. 1. 1. 39 ;EC 1. 1. 1. 40 ;EC 1. 1. 1. 83)酶促反
應(yīng)比色法。氨基酸氧化酶酶解氨基酸反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫，再通過(偶)聯(lián)合丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度，通過測(cè)量340nm處吸光度下降的程度，可以測(cè)算氨基酸的濃度大小。 實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明氨基酸診斷/測(cè)定試劑(盒)較為理想緩沖液100,1/L穩(wěn)定劑500,1/L還原型輔酶0. 25,1/L氨基酸氧化酶6000U/L丙酮酸氧化酶8000U/L蘋果酸脫氫酶10000U/L碳酸氫鈉6mmol/L乙酰輔酶A12mmol/L本發(fā)明的氨基酸診斷/;則定試劑(盒)可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶。 還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶。 還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定氨基酸濃度的方法，其還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例一 本實(shí)施例的氨基酸診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括 [OO44]三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
還原型輔酶 0. 25mmol/L 氨基酸氧化酶 6000U/L
丙酮酸氧化酶 8000U/L
蘋果酸脫氫酶 10000U/L
碳酸氫鈉 6mmol/L
乙酰輔酶A 12mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復(fù)溶后使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7，
測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)氨基酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方
向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)
主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度，從而測(cè)算出氨基酸的濃度大小。 實(shí)施例二 本實(shí)施例的氨基酸診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
還原型輔酶 0. 25mmol/L 碳酸氫鈉 6mmol/L
乙酰輔酶A 12mmol/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 氨基酸氧化酶 6000U/L 丙酮酸氧化酶 8000U/L 蘋果酸脫氫酶 10000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7，
測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)氨基酸樣品與試劑1、試劑2的體積比例為
2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約O分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)
主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度，從而測(cè)算出氨基酸的濃度大小。


















實(shí)施例三
本實(shí)施例的氨基酸診斷 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
J定試劑為三試劑，包括
鹽酸緩沖液
乙酰輔酶A 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑
丙酮酸氧化酶 蘋果酸脫氫酶 試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑
鹽酸緩沖液
100,1/ 50mmol/L 0. 25,1/L 6mmol/L 12mmol/L
100,1/ 500,1/L 8000U/L 10000U/L
鹽酸緩沖液
100,1/L 500,1/L 6000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測(cè)定氨基酸濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起 始吸光度1. 8±0. 7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)氨基酸樣品與試劑1、試劑 2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左 右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè) 主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度，從而測(cè)算出氨基酸的濃度大小。 申請(qǐng)人:經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測(cè)定方法均能達(dá)到本發(fā)明 的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。 總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0008 ;吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈 下降曲線直至終點(diǎn)；試劑可測(cè)有效(R > 0. 99)線形范圍可達(dá)40mmol/L ;試劑測(cè)試的不準(zhǔn) 確度，其相對(duì)偏差不超過±4% ;試劑測(cè)試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2% ;試 劑的靈敏度可達(dá)O. 0025±0. 0015TTTAA/mmol/L ;試劑在2-8°C下保存，活性可以穩(wěn)定一 年；——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長(zhǎng)，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨基酸濃度測(cè)定方法，其方法如下氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨+過氧化氫過氧化氫+二氧化碳+乙酰輔酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸+輔酶A+氧丙酮酸+二氧化碳+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶(脫羧化)蘋果酸+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度，測(cè)算出氨基酸的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種氨基酸診斷緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶J定試劑(盒)，主要成分包括丙酮酸氧化酶蘋果酸脫氫酶1--50mmol/L—50mmol/L乙酰輔酶A試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶組成。還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶組成。還原型輔酶、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑l-4000mmol/L或0. 1% _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(A,niaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨基酸診斷/測(cè)定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定氨基酸濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、碳酸氫鈉(二氧化碳)、乙酰輔酶A、氨基酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、蘋果酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度下降的程度，從而測(cè)算出氨基酸的濃度大小。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101762500SQ20081023599
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司