專利名稱：：kRas基因突變的檢測探針、液相芯片及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
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，具體的是涉及kRas基因突變的檢測探針、液相芯片及其檢測方法。背錄技術(shù)一、kRas基因突變與胰腺癌的早期診斷Ras基因是人體腫瘤中常見的致癌基因。Ras基因家族由kRas、hRas和nRas組成，基因家族的各成員相互間同源性可達(dá)859t。Ras基因編碼的蛋白質(zhì)是P21蛋白。P21蛋白位于細(xì)胞膜的內(nèi)表面，具有GTP酶活性，參于傳導(dǎo)細(xì)胞增生信號的調(diào)控系統(tǒng)。其激活狀態(tài)為GTP結(jié)合狀態(tài)，失活狀態(tài)為GDP結(jié)合狀態(tài)，其轉(zhuǎn)變?yōu)榛顒有灾掳┗虻闹饕课皇堑?2、13和61密碼子的突變。kRas基因激活在胰腺癌的發(fā)生中已有肯定的研究，其中以kRas12密碼子點突變最常見。突變的kRas蛋白p21僅有微弱的GTP酶活性，不能迅速分解GTP,因此ras信號傳導(dǎo)蛋白"鎖定"在GTP結(jié)合的激活狀態(tài)，活化狀態(tài)的ras信號蛋白通過細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑造成細(xì)胞不可控制地增殖、惡變。kRas基因的突變率在不同的腫瘤組織中并不相同。在結(jié)腸癌中，其突變頻率為43%,肺癌中為30%，甲狀腺癌中為29%,膀胱、肝、腎和子宮癌中，則該突變發(fā)生頻率為10%或低于10%。在胰腺癌中，kRas基因的突變率髙達(dá)75M-95X，突變幾乎總是發(fā)生在第12位密碼子上，突變方式也幾乎皆為CGT、GTT及GAT，而正常胰腺組織、急慢性胰腺炎、胰島素瘤、胰腺良性囊腫及胰腺其他疾病均無K-ras基因突變。同時，kRas基因突變是胰腺癌發(fā)生過程中早期即有的一種表現(xiàn)，且在腫瘤發(fā)生過程中突變率不同增生期26%，乳頭增生期46%，原位癌期76%,腺癌期80%，淋巴轉(zhuǎn)移期43%。因此，檢測kRas基因第12位密碼子有無突變，有助于臨床判斷胰腺腫塊的良惡性及胰腺癌的診斷。從胰液、膽汁、十二指腸液、糞便、外周血中檢測K-ras基因12密碼子點突變是胰腺癌診斷的一個重要輔助工具。二、kRas基因突變與非小細(xì)胞肺癌對吉非替尼、厄羅替尼等靶向治療藥物的原發(fā)性耐藥kRas基因是表皮生長因子受體(EGFR)信號傳導(dǎo)通路中的一個關(guān)鍵的下游調(diào)節(jié)分子。EGFR是一種廣泛分布于人體各組織細(xì)胞膜上的多功能糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，為ErbB家族的四個成員之一，因此又名HERl或ErbBl。EGFR被配體激活后啟動胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，經(jīng)過細(xì)胞質(zhì)中銜接蛋白、酶的級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子激活基因的轉(zhuǎn)錄，指導(dǎo)細(xì)胞遷移、黏附、增殖、分化和凋亡。研究表明，在許多實體腫瘤中存在EGFR的髙表達(dá)或異常表達(dá)，為以EGFR為耙向的腫瘤治療和針對EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)干預(yù)治療提供了理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。因此，以表皮生長因子受體(EGFR)為治療靶標(biāo)的分子靶向治療成為國內(nèi)外腫瘤界關(guān)注的焦點。其中，EGFR受體酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼(Genfitinib,Irressa)和厄洛替尼(Erlotinib,特羅凱，Tarceva)已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于治療晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。我國在2005年2月也批準(zhǔn)了吉非替尼進(jìn)入臨床。這些藥物用于其他腫瘤(如乳腺癌、結(jié)腸癌和胃癌等)的治療，目前也已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗階段。吉非替尼，厄洛替尼是一種口服的小分子EGFR拮抗劑，可與ATP競爭結(jié)合EGFR酪氨酸激酶區(qū)的ATP結(jié)合袋從而抑制EGFR的活性，已應(yīng)用于晚期和不適宜傳統(tǒng)化療方案的非小細(xì)胞肺癌患者的臨床治療，是目前對于部分NSCLC患者治療最有效的藥物。然而，患者對這種分子靶向藥物的反應(yīng)性與個體的遺傳背景相關(guān)。2004年6月，美國哈佛醫(yī)學(xué)院的研究人員Lynch等和Paez等率先報道，肺癌細(xì)胞中EGFR酪氨酸激酶編碼區(qū)基因突變是靶向治療藥物奏效的—個必要前提條件。研究結(jié)果顯示，對EGFR酪氨酸激酶基因編碼區(qū)突變型腫瘤，吉非替尼的有效率髙達(dá)80%以上，而對無突變的野生型腫瘤上述藥物基本無效。這一最新研究結(jié)果發(fā)表后受到了各國學(xué)者的高度重視，并在不足一年的時間內(nèi)相繼被美國、H本、韓國和我國(包括臺灣)學(xué)者的研究所證實(PaoW等,2004;HanSW等，2005:MitsudomiT等，2005;HuangSF等，2004;MuXL等，2005)。EGFR外顯子19的缺失突變和外顯子21的點突變使患者對吉非替尼，厄羅替尼等靶向治療藥物敏感，而另外有些突變則使患者對這些藥物耐受，或者稱耐藥性。耐藥性分原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性耐藥(獲得性耐藥)。EGFR外顯子20的T790點突變與靶向治療藥物的繼發(fā)性耐藥相關(guān)。而位于EGFR信號傳導(dǎo)通路下游的編碼GTP酶的kRas基因突變則是吉非替尼(Gefitinib)、厄羅替尼(Erlotinib)原發(fā)耐藥的原因。大約159i-30%的非小細(xì)胞肺癌患者(NSCLC)中存在kRas基因點突變，并與患者耙向治療的預(yù)后差相關(guān)。這些突變多位于第二外顯子的12和13密碼子。研究表明，有kRas基因突變的非小細(xì)胞肺癌對激酶抑制劑吉非替尼和厄羅替尼的敏感性差。這一發(fā)現(xiàn)最早由WilliamPao等人報道。研究者選擇了60位對吉非替尼或厄羅替尼治療敏感與不敏感的腺癌病人，檢測其EGFR突變與kRas突變情況。在所有對吉非替尼或厄羅替尼治療不敏感的病人中，有24%(9/38)的病人存在kRas基因的突變；而所有對這兩個耙向治療藥物敏感的病人中，沒有一個存在kKas基因突變(0/21)。2006年，BaoliQin等人則在細(xì)胞水平上研究了EGFR信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵分子與吉非替尼靶向治療耐藥性之間的關(guān)系。作者發(fā)現(xiàn)Src和Ras基因的激活可使腫瘤細(xì)胞對吉非替尼的耐藥性增強30倍至200倍。此外，韓國的Sae-WonHan等人(ClinicalCancerRes2006:12(8))選擇69位接受吉非替尼治療的非小細(xì)胞肺癌病人，檢測EGFR基因拷貝數(shù)，K-ras基因突變，HER2，EGFR外顯子18-21的突變，以及Akt的磷酸化狀況來研究與吉非替尼藥物敏感性相關(guān)的因素。分析結(jié)果顯示，kRas突變的患者均對吉非替尼治療不敏感。在EGFR野生型患者中，攜帶kRas突變或者p-Akt過表達(dá)的患者均存在較差的治療效果，且容易復(fù)發(fā)(P=0.017)。一般來講，kRas突變和EGFR突變是相互排斥的，EGFR突變主要見于不吸煙者，而kRas突變更常見于吸煙相關(guān)的癌癥。三、kRas基因突變與結(jié)直腸癌對西妥昔單抗的耐藥kRas基因的突變不僅與非小細(xì)胞肺癌對吉非替尼，厄羅替尼等EGFR酪氨酸激酶抑制劑的原發(fā)耐藥相關(guān)，最近的研究還發(fā)現(xiàn)這一基因突變還與結(jié)直腸癌對西妥西單抗的耐藥性密切相關(guān)。表皮生長因子受體(EGFR)靶向藥物西妥昔單抗對難治性結(jié)直腸癌有效，與伊立替康為主的化療方案聯(lián)合應(yīng)用時，有助于克服伊立替康耐藥。但是，僅部分患者能從西妥昔單抗治療中獲益，因此明確療效預(yù)測因素非常重要。法國巴黎笛卡爾大學(xué)Lievre等報告，采用西妥昔單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，腫瘤kRas突變可預(yù)測治療有效性和患者生存率(CancerRes2006;66:(8))。研究者發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞kRas突變與西妥昔單抗耐藥和總生存期(OS)較短相關(guān)。在30例用西妥昔單抗治療的轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者中，作者通過測序法分別檢測了kRas，BRAF以及PIK3CA基因的突變情況。研究發(fā)現(xiàn)30例患者中，西妥昔單抗對ll例患者有效，而19例患者無療效反應(yīng)。在這19例患者中，68.4W的患者存在kRas基因的突變，而11例西妥昔單抗治療有效的患者中均不存在kRas基因突變。同時，沒有kRas基因突變的患者其總生存期與存在kRas基因突變的患者相比具有顯著的差別(分別為16.3個月與6.9個月，P=0.016)。在此基礎(chǔ)上,研究者納入89例伊立替康耐藥的結(jié)直腸癌患者進(jìn)行了回顧性分析[JClinOncol2008，26(3):374]?；颊叻謩e接受伊立替康加西妥昔單抗(8挑)、西妥昔單抗加氟尿嘧啶和葉酸(10%)、單純西妥昔單抗(2%)治療。免疫組化顯示,所有患者均高表達(dá)EGFR?？傮w上，西妥昔單抗對26例患者有效。西妥昔單抗治療對24例有kRas突變的患者均無效，治療有效者均為無突變患者(26/65例，P<0.001)。無突變患者的無進(jìn)展生存期(PFS)和OS均顯著長于有突變患者(PFS:31.4周對10.1周，P=0.0001:OS:14.3個月對10.1個月,P=0.026)。該研究與其他數(shù)項已發(fā)表的研究結(jié)果一致,提示在難治性結(jié)直腸癌患者開始西妥昔單抗治療前,應(yīng)該充分考慮檢測kRas突變情況,這樣可能既有利于節(jié)約治療成本,避免無謂地使用昂貴試劑,又能使患者受益，使其免受無謂治療的毒性作用。四、kRas突變檢測試劑目前的開發(fā)狀況目前的kRas基因突變檢測產(chǎn)品多數(shù)采用實時熒光定量PCR的方法，檢測的靈敏度最低為野生型中1-2%的突變型，同時該方法存在著假陽性率偏高的問題。利用液相芯片技術(shù)平臺進(jìn)行kRas基因突變檢測的產(chǎn)品在國內(nèi)外均屬空白。另外，由于腫瘤的異質(zhì)性，游離核酸中可能僅有非常小量的突變基因，而含有大量的野生型基因，混雜的大量野生型基因會阻礙突變基因的檢出，因此如何排除野生型序列對kRas基因突變檢測的干擾是首要解決的一個關(guān)鍵問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一在于提供用于kRas基因突變檢測的探針序列。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下用于kRas基因突變檢測的探針，包括有針對kRas基因密碼子Codon12的5，GAGCTGGTGGCGTAGGCMG3，、和引入酶切位點BstOI的5'GACCTGGTGGCGTAGGCMG3'的野生型探針，以及選自堿基序列為5'GACCTCGTGGCGTAGGCAAG3'、5,GACCTAGTGGCGTAGGCAAG3'、5，GACCTTGTGGCGTAGGCAAG3,、5,GACCTGATGGCGTAGGCAAG3'、5'GACCTGCTGGCGTAGGCAAG3，、和5'GAg:TGTTGGCGTAGGCMG3'中的一種或多種的引入酶切位點BstOI的突變型探針；和/或針對kRas基因密碼子Codon13的5'AGCTGGTGGCGTAGGCMGA3'、和引入酶切位點Narl的5'AGCTGGTGGCGCCGGCAAGA3'野生型探針，以及選自堿基序列為5'AGCTGGTGACGCCGGCAAGA3'和5'AGCTGGTTGCG^QGGCAAGA3'中的一種或二種引入酶切位點Narl的突變型探針；和/或針對kRas基因密碼子Codon61的5'AGCAGGTCAAGAGGAGTACAGT3'野生型探針、引入酶切位點Bcll的5'AGCIG^TCAAGAGGAGTACAGT3'、和引入酵切位點BglII的5'AGCAGGTCAAGAig;GTACAGT3'的野生型探針，以及選自引入酶切位點Bcll的堿基序列為5'AGCIG4T在MGAGGAGTACAGT3，、5，AGCIG^TC];AGAGGAGTACAGT3'、引入酶切位點BglII5，AGCAGGTCATGATCTGTACAGT3'中的一種或多種突變型探針。本發(fā)明的另一目的是提供kRas基因突變檢測液相芯片。該液相芯片可用于檢測kRas基因密碼子Codon12、13和/或61(Codonl2、13位于Exon2，Codon61位于Exon3上)的相關(guān)突變，不但可用于胰腺癌早期診斷，而且可預(yù)測非小細(xì)胞肺癌EGFR酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼或厄羅替尼，以及結(jié)直腸癌西妥西單抗或帕尼單抗藥物治療療效。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種kRas基因突變檢測液相芯片，主要包括有A.包被探針的微球包被有氨基修飾的針對kRas基因密碼子Codon12的堿基序列為SEQIDNO.1—2的野生型探針的微球，以及包被有氨基修飾的選自堿基序列為SEQIDN0.2—8中的一種或多種突變型探針的微球；和/或包被有針對kRas基因密碼子Codon13的堿基序列為SEQIDNO.9—10的氨基修飾的野生型探針的微球，以及包被有選自堿基序列為SEQIDNO.11—12中的一種或二種氨基修飾的突變型探針的微球；和/或包被有針對kRas基因密碼子Codon61的堿基序列為SEQIDNO.13—15的氨基修飾的野生型探針的微球，以及包被有選自引入酶切位點BclI的堿基序列為SEQIDNO.16—17、和引入酶切位點BglII犯QIDN0.18中的一種或多種引入的氨基修飾的突變型探針的微球上述每種探針的堿基序列與氨基之間連接有間隔臂，且每種微球具有不同顏色編碼以及B.引物用于擴(kuò)增出富集有kRas基因密碼子Codon12、13和/或61的需檢測的相應(yīng)突變位點的目標(biāo)序列的引物，且該目標(biāo)序列的末端具有生物素標(biāo)記。優(yōu)選地，所述間隔臂為5—40個T的序列，更優(yōu)選為10個T的序列。優(yōu)選地，用于擴(kuò)增出富集有Codon12、13和/或61突變位點的目標(biāo)序列的引物包括有用于擴(kuò)增出具有kRas基因密碼子Codon12突變位點的目標(biāo)序列的堿基序列為SEQ.IDNO.19一21的引物，上述引物中至少有一條帶有末端的生物素標(biāo)記；和/或用于擴(kuò)增出富集有kRas基因密碼子Codon13突女位點的目標(biāo)序列的堿基序列為SEQIDN0.22—25的引物，所述引物中至少有一條帶有末端的生物素標(biāo)記；和/或用于擴(kuò)增出富集有kRas基因密碼子Codon61突變位點的目標(biāo)序列的堿基序列為SEQIDNO.26—32的引物，所述引物中至少有一條帶有末端的生物素標(biāo)記。本發(fā)明的另一目的還在于提供一種kRas基因突變的檢測方法，該方法具有快速、準(zhǔn)確、操作簡便等優(yōu)點。一種kRas基因突變的檢測方法，使用上述的kRas基因突變檢測液相芯片，包括以下步驟(1)用帶有酶切位點的PCR引物對野生型和突變型的標(biāo)本進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；(2)將步驟(1)中的PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行酶切；(3)以酶切后的產(chǎn)物為模板進(jìn)行對突變型的kRas基因進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；(4)第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與上述相應(yīng)的包被有探針的微球進(jìn)行雜交；(5)雜交反應(yīng)后加入鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)，然后進(jìn)行信號檢測。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)采用本發(fā)明提供的kRas基因突變檢測液相芯片，可同時對kRas基因突變相對頻率較高的位點進(jìn)行檢測，檢測時的反應(yīng)條件均一，檢測結(jié)果特異性好，靈敏度高，檢測準(zhǔn)確度達(dá)99%以上。(2)本發(fā)明的檢測方法步驟簡單，因而避免了復(fù)雜操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準(zhǔn)確率。(3)本發(fā)明所提供的檢測方法所需要的時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常用的測序技術(shù)，特別符合臨床需要。(4)本發(fā)明采用"引入酶切位點，然后酶切富集"的方法進(jìn)行目標(biāo)序列的PCR擴(kuò)增進(jìn)而用于檢測，避免了產(chǎn)物中大量野生型序列對檢測結(jié)果所造成的干擾。(5)本發(fā)明所提供的液相芯片、檢測方法不僅能檢測腫瘤組織樣本中的kRas基因突變，同時也能檢測腫瘤病人體液中的kRas基因突變，從而具有采樣方便、病人痛苦小、能夠動態(tài)監(jiān)測的優(yōu)勢。圖1是Exon2和Exon3突變區(qū)的序列信息示意圖2是BstOI的酶切富集codon12的6種突變型示意圖3是通過Narl的酶切富集codon13的2種突變型示意圖4是酶切富集codon61的3種突變型示意圖5是實施例2中酶切結(jié)果分析示意圖6是kRas基因Codon12的靈敏度實驗結(jié)果分析示意圖7是kRas基因Codon12在野生型質(zhì)粒中檢出突變型的實驗結(jié)果分析示意圖。具體實施例方式本公司已開發(fā)的EGFR項目是通過內(nèi)切先去除大量的野生型基因，然后用PCR去擴(kuò)增突變型基因。但因為kRas基因在三個突變位點處(Exon2的第12、13密碼子和Exon3的第61密碼子)都沒有相應(yīng)的酶切位點可以把野生型有目的的去除。本實驗首次采用通過PCR技術(shù)在突^區(qū)引入酶切位點的方法，然后通過酶切來去除野生型，從而達(dá)到富集突變型序列的目的。1)1"PCR引入酶切位點kRas基因轉(zhuǎn)變?yōu)榛顒有灾掳┗虻闹饕蛔優(yōu)辄c是Codon12、13和61。Codonl2、13位于Exon2(圖1),Codon61位于Exon3(參見圖1)。Codon12(kRas基因的第10569bp到10571bp)—般存在6種突變GGT-〉GAT，GGT->GCT，GGT->GTT,GGT->*GT，SGT-〉CGT，GGT->IGT。在Codon12處引入酶切位點是通過把10566bp的"G"突變?yōu)?C",從而引入BstOI(BstNI)的酶切位點(參見圖2),為了降低風(fēng)險，還設(shè)計了另一種方案，就是把10566bp的"G"突變?yōu)?A",通過引入BselI(BsrSI)的酶切位點來切除野生型。設(shè)計一對引物，擴(kuò)增約150bp的片段來富集含有Codon12的片段，通過酶切可以去除野生型，富集6種突變型。Codon13(kRas基因的第10572bp到10574bp)—般存在2種突變GlC-〉G為C，^JGC->TGC。在Codon13處引入酶切位點是通過把10576-10577bp的"TA"突變?yōu)?CC",從而引入NarI的酶切位點來切除野生型。設(shè)計一對引物，擴(kuò)增約150bp的片段來富集含有Codon13的片段，通過NarI的酶切可以去除野生型，富集2種突變型(參見圖3)Codon61(kRas基因的第28578bp到28580bp)—般存在3種突變:CM->AAA，CAA-〉CT;A,CAA->CAT。因為在Codon61處無法通過引入單個酶切位點的方法酶切富集3種突變型，要通過引入Bcll(28574bp的"A"突變?yōu)?T",28576bp的"G，，突變?yōu)?A")和BglII(28583-28585bp的"GGA"突變?yōu)?TCT")兩個酶切位點來切除野生型。設(shè)計兩對引物，分別擴(kuò)增從28558bp到28701bp共144bp的片段和擴(kuò)增從28459bp到28600bp共142bp的片段來富集含有Codon61的片段，通過BclI的酶切可以富集gAA-〉MA，CM-〉CTA兩種突變型，通過BglII的酶切可以富集CAA-〉CAT的突變型(參見圖4)。本項目需要用到的主要材料1)野生型(質(zhì)粒名稱Exon2和Exon3)及11種突變型質(zhì)粒(表1)表1本實驗銪要使用的突變型質(zhì)粒<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>溶液配方偶聯(lián)液(pH4.5):0.lmol/LMES(SigmaM-2933)洗滌液0.2ml/LTween-20(SigmaP-9416)，lg/LSDS(SigmaL-4390)TE(p朋.O)(儲存液)10咖ol/LTris(Sigma337501)，lmmol/LEDTA(SigmaE-5134)2XTm雜交緩沖液<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>過濾后貯存于4"C。實施例lkRas基因突變檢測液相芯片的制備一、探針序列設(shè)計及微球包被針對kRas基因Codon12、13和61的野生型與突變型序列，設(shè)計特異的寡核苷酸探針。每種微球包被的具體步驟如下(1)取微球母液(購自Luminex公司)vortex(漩渦展蕩)30s,超聲處理lmin:(2)取出8ul微球母液，共含0.8xi()S—1.2xl05個微球至0.5ml離心管中；(3)15,000rp邁離心10min,小心棄去上清液；(4)加入10ul偶聯(lián)液(pH4.5)，vortex30s，超聲處理lmin;(5)加入2pmol/ul探針工作液2ul;(6)加入2.5ul濃度為5mg/ml的EDC(l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亞胺鹽酸鹽)工作液，25r避光孵育30min;重復(fù)該步驟一次；(7)加入0.2ml洗滌液，vortex30s,12，000g離心5min,小心棄去上清液；重復(fù)該步驟一次；(8)加入500ulTE溶液，vortex30s，超聲處理30s;(9)12,000g離心5邁in，小心棄去上清液(10)加入20ulTE溶液，儲存于2-8℃。制備得到的kRas基因突變檢測液相芯片包括有A.包被探針的微球，每種微球包被的探針的堿基序列如下<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實施例2、kRas基因密碼子12(Codon12)通過PCR引入酶切位點及野生型的切除針對kRas基因密碼子12的序列，設(shè)計的一對帶有BstOI的酶切位點引物對野生型和突變型粒進(jìn)行擴(kuò)增，通過酶切可以有效地去除野生型，而突變型不會被嗨切，從而達(dá)到富集突變型的目的。一、PCR的擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>二、PCR產(chǎn)物BstOI酶切:反應(yīng)體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>酶切結(jié)果圖5。PAGE膠的結(jié)果表明Codon12野生型被酶切而且酶切完全，但突變型沒被酶切。這結(jié)果證明了PCR引入酶切位點去除野生型，富集突變型方法的可行性。實施例3、kRas基因Codon12的靈敏度實驗為了測定Codon12的靈敏度，取Codon12突變型質(zhì)粒1，3，9，27,81.243,729個拷貝進(jìn)行檢測，每種拷貝數(shù)重復(fù)4次。一、PCR擴(kuò)增及酶切1.第一輪PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系與實施例2相同。PCR反應(yīng)條件<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>2、PCR產(chǎn)物BstOI酶切:反應(yīng)體系同實施例2。3、第二輪PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>PCR反應(yīng)條件:<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>二、L咖inex檢測雜交及L咖inex檢測(可參照常規(guī)Luminex液相芯片的雜交檢測)(1)配制微球工作液將實施例1中的每種包被有針對kRas基因密碼子Codon12的堿基序列為SEQIDN01-8的探針(探針名稱60C12W1、60C12WE1、60C12MEE1、60C12ME2、60C12ME3、60C12ME4、60C12ME5、60C12ME6)的微球Vortex30sec,超聲處理30sec，充分混勻，隨即取出所需微球到滅菌離心管中(每反應(yīng)0.5ul，其中每種微球為2000個/ul)，加入1.5X雜交液緩沖液(每個反應(yīng)32.5ul)和TE緩沖液(每個反應(yīng)14ul),此為微球工作液；(2)根據(jù)樣品情況，使用記號筆對96孔板(雜交板)進(jìn)行標(biāo)記(陰性對照孔標(biāo)記為"N"),然后每孔加入47ul微球工作液；(3)各樣品孔加入3ul相應(yīng)的待雜交檢測樣品(第二輪PCR產(chǎn)物)；"N"孔加入3ulTE:(4)置雜交板于PCR儀中，95"C變性3min;60C雜交15min;(5)用1X雜交緩沖液配制SA-PE(鏈親和素藻紅蛋白)工作液(10ug/ml)，并置60匸水浴鍋預(yù)熱；(6)往雜交完畢的雜交板中加入已預(yù)熱至60TC的SA-PE工作液(10ug/ml)，每孔25ul;(7)置PCR儀上60"反應(yīng)5min;(8)將Luminex儀器托盤溫度設(shè)置為601C,按Luminex儀器使用方法設(shè)置儀器參數(shù)(每個樣品讀取微球100個，讀數(shù)時間25s)。將雜交板置于Luminex儀器托盤中，檢測樣品MFI值。三、結(jié)果分析雜交檢測的結(jié)果如圖6，MFI值大于100的為有效數(shù)值。3和9個拷貝的在4次檢測中只有一次被檢測出，MFI的平均值都低于IOO(SD值較高)，81個拷貝的4次檢測中均能被檢測，重復(fù)性較好(SD值較低)。結(jié)果說明了對于低拷貝數(shù)檢測的重復(fù)性較差，對于大于80個拷貝數(shù)的檢測的重復(fù)性較好。實施例4、kRas基因Codon12在野生型質(zhì)粒中檢出突變型的實驗為了在大量的野生型中檢出少量的突變型，以kRasCodon12野生型和突變型質(zhì)粒按不同比例混合為模板(總拷貝數(shù)為20000),分別進(jìn)行酶切富集，再進(jìn)行Luminex檢測，每種比例做復(fù)孔。兩輪PCR擴(kuò)增，酶切富集，微球包被，雜交及l(fā)uminex檢測的方法與實施例3的相同。檢測的結(jié)果如圖7(MFI值大于100的為有效數(shù)值)檢測的結(jié)果表明Codon12可以在20000個拷貝中檢測出80個突變型質(zhì)粒。這實驗結(jié)果說明了用PCR引入酶切位點的方法可在大量的野生型kRas基因中測出少量的突變型基因。實施例5、運用kRas基因突變檢測液相芯片對結(jié)直腸癌樣本的檢測—、待測樣本的準(zhǔn)備(血舉、血清和胸水上清游離核酸的提取均可按以下方法)參照AxyPr印全血基因組小量提取試劑盒說明，詳細(xì)步驟如下(1).取患者抗凝靜脈血或胸腔積液約2.5ml，3000rpm離心15分鐘，取300^1上清加到一個l.5ml干凈無菌的離心管中；(2)向離心管中加入500plAP1緩沖液，渦旋振蕩充分混勻；(3)加入100ji1AP2緩沖液，渦旋振蕩充分混勻；(4)室溫下12，OOOrpra離心10分鐘(5)小心吸取上清加入放在2邁l收集管上的吸附柱AxyPr印中，蓋上蓋子，以6，OOOrpm離心l分鐘(6)倒掉廢液收集管中的廢液，用800nl緩沖液Wl洗滌l次，以6,OOOrpm離心l分鐘；(7)倒掉廢液收集管中的廢液，加入800pl緩沖液W2，以12,OOOrpm離心l分鐘；倒掉廢液收集管中的廢液，加入500nl緩沖液W2，以12,OOOrpm離心l分鐘，棄掉廢液；(8)將吸附柱AxyPr印放回空收集管中，12，OOOrpm離心l分鐘；(9)將吸附柱AxyPr印置于一干凈無菌的1.5ml離心管中，加入40filTE緩沖液，室溫下放置1分鐘，12,OOOrpm離心l分鐘洗脫DNA，電泳檢測，-20"€保存。二、待測樣品的PCR擴(kuò)增與酶切富集Codon12樣本的瞎切富集PCR擴(kuò)增與實施例3相同。Codon13的II切富集PCR擴(kuò)增如下1.第一輪PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>2、PCR產(chǎn)物Narl酶切:反應(yīng)體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>3、第二輪PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>PCR反應(yīng)條件:<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>1Codon61的BclI酶切富集PCR擴(kuò)增如下1.第一輪PCR擴(kuò)增(引入BclI的酶切位點)PCR反應(yīng)體系Codon61反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>PCR反應(yīng)條件:<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>2、PCR產(chǎn)物Bell酶切:反應(yīng)體系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>3、第二輪PCR擴(kuò)增(引入BclI的酵切位點)PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>PCR反應(yīng)條件:<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>Codon61的BglII瞎切富集PCR擴(kuò)增如下第一輪PCR擴(kuò)增(引入BglII的酶切位點)PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>3、第二輪PCR擴(kuò)增(引入BglII的酶切位點)PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>二、Luminex檢測雜交友Luminex檢測(1)配制微球工作液將實施例1中的每種包被有針對kRas基因密碼子Codon12、codonl3、和codon61的堿基序列為SEQIDNO.1-18的探針的不同微球Vortex30sec,超聲處理30sec，充分混勻，隨即取出所需微球到滅菌離心管中(每反應(yīng)0.5ul,其中每種微球為2000個/ul),加入1.5X雜交液緩沖液(每個反應(yīng)32.5ul)和TE緩沖液(每個反應(yīng)14ul),此為微球工作液；(2)其余雜交檢測及Luminex檢測步驟同實施例3中雜交及Luminex檢測部分。三、檢測結(jié)果與數(shù)據(jù)分析反應(yīng)后產(chǎn)物通過Luminex序列分析儀器檢測，檢測結(jié)果如表1所示。Codon12以熒光值(MFI)大于100為cut-off值，當(dāng)Codon12突變型探針的MFI值大于100時，判定該樣本為存在Codon12的突變，否則判定該樣本為Codon12野生型。Codon13和Codon61以熒光值(MFI)大于200為cut-off值，當(dāng)Codon13或Codon61突變型探針的MFI值大于200時，判定該樣本為存在Codon13或Codon61的突變，否則判定該樣本為Codon13或Codon61野生型。根據(jù)上述判定標(biāo)準(zhǔn)，本實施例所檢測的10份樣本中，6例存在Codon12點突變(2號，3號，4號，5號，6號,9號樣本)，4例存在Codon13點突變(l號，4號，5號，10號樣本)，3例存在Codon61點突變(l號，2號，3號樣本)。表1血清樣本的檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>序列表<110>廣州益善生物技術(shù)有限公司<120〉kRas基因突變的檢測探針、液相芯片及其檢測方法<160>32<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211〉20212>DNA<213>人工序列<400>1gBgctggtggcgtBggcsag20<210>2<211>20<212>DNA<213〉人工序列<400>2gacctggtggcgtaggcaag20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3gacctcgtggcgtaggcaag20<210>4<211>20<212〉DNA<213〉人工序列<400>4g3CCt3gtggCgtaggC33g20<210〉5<2li〉20<212>DNA<213>人工序列<400〉5gaccttgtggcgtaggcaag20<210>6<2li>20〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>6gscctgatggcgtaggcsag20<210>7〈211>20<212>DNA<213>人工序列<400〉7gacctgctggcgtaggcaag〈210〉8<211>20〈212>DNA<213〉人工序列<400>8gacctgttggcgtsggcaag〈210〉9<211>20<212>DNA<213>人工序列<9agctggtggcgtaggcaaga<210〉10<211>20<212〉脆<213>人工序列<400>103gctggtggcgccggcaaga<210>11<211〉20<212〉腿<213>人工序列<400〉11agctggtgacgccggcaaga<210〉12<211>20<212〉DNA<213>人工序列<400〉12agctggttgcgccggcaaga<210>13<211>22<212〉DNA<213>人工序列<400>133gC3ggtC33g3gg3gt3Cagt22<210〉14<211>22<212〉腿<213>人工序列<400>14agctgatca8.gaggagtacagt<210>15<211>22<212>DNA〈213〉人工序列<400〉15agcaggtcasgatctgtacagt2222<210〉16<211〉22<212>隱<213>人工序列<400>168gCtgat肪8g8ggBgt8Cagt〈210>17<211>22<212>DNA<213>人工序列<400〉17agC丄g且tC主ag3gg3gt8C3gt<210>18<211>22<212>DNA〈213〉人工序列<400>18agcaggtcatgatctgtacagt2222<210〉19<211〉25<212>DNA<213>人工序列<400>198tataa3cttgtggtsgttggacct<210>20<211〉22<212〉DNA<213〉人工序列<400>20ctgtatcaaagaatggtcctgc22<210>21<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>21atggtcctgcaccagtaatatg<210>22<211〉22<212〉DNA<213>人工序列<400>22cgtcaaggcactcttgccggcg22<210>23〈211〉22<212〉DNA<213>人工序列<400>23CgtCEl3ggC8CtcttgCCggCg22<210〉24<211〉25〈212〉DM<213〉人工序列<400〉24tggagtatttgatagtgtattaacc25<210>25<211>25<212>DNA<213〉人工序列<400>25tgatagtgtattaaccttatgtgtg25<210>26<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>26ttggatattctcgacacagctgat24<210>27<211>24<212>DM<213>人工序列<400>27aatttaaacccacctataatggtg24<210>28<211>24<212>DNA<213>人工序列<400〉28ccacctataatggtgaatatcttc24<210〉29<211〉24<212〉DNA<213>人工序列<400>29gtccctcattgcactgtacagate24<210:>30<211〉24<212>DNA<213>人工序列<400>30gtccctcattgC8ctgtacagate<210>31<211>24<212〉DNA<213〉人工序列<400〉31gt8333ggtgC3Ctgt33t33tCC<210〉32<211>22<212〉DNA<213>人工序列<400>32taatccagactgtgtttctccc24242權(quán)利要求1.用于kRas基因突變檢測的探針，其特征是包括有針對kRas基因密碼子Codon12的5’GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG3’、和引入酶切位點BstOI的5’GACCTGGTGGCGTAGGCAAG3’的野生型探針，以及選自堿基序列為5’GACCTCGTGGCGTAGGCAAG3’、5’GACCTAGTGGCGTAGGCAAG3’、5’GACCTTGTGGCGTAGGCAAG3’、5’GACCTGATGGCGTAGGCAAG3’、5’GACCTGCTGGCGTAGGCAAG3’、和5’GACCTGTTGGCGTAGGCAAG3’中的一種或多種的引入酶切位點BstOI的突變型探針；和/或針對kRas基因密碼子Codon13的5’AGCTGGTGGCGTAGGCAAGA3’、和引入酶切位點NarI的5’AGCTGGTGGCGCCGGCAAGA3’野生型探針，以及選自堿基序列為5’AGCTGGTGACGCCGGCAAGA3’和5’AGCTGGTTGCGCCGGCAAGA3’中的一種或二種引入酶切位點NarI的突變型探針；和/或針對kRas基因密碼子Codon61的5’AGCAGGTCAAGAGGAGTACAGT3’野生型探針、引入酶切位點BclI的5’AGCTG<u>A</u>TCAAGAGGAGTACAGT3’、和引入酶切位點BglII的5’AGCAGGTCAAGATCTGTACAGT3’的野生型探針，以及選自引入酶切位點BclI的堿基序列為5’AGCTGATAAAGAGGAGTACAGT3’、5’AGCTGATCTAGAGGAGTACAGT3’、引入酶切位點BglII的堿基序列為5’AGCAGGTCATGATCTGTACAGT3’中的一種或多種的突變型探針。2.—種kRas基因突變檢測液相芯片，其特征是，主要包括有A.包被探針的微球包被有針對kRas基因密碼子Codon12的堿基序列為5，GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG3'、GACCTGGTGGCGTAGGCAAG3'的氨基修飾的野生型探針的微球，以及包被有氨基修飾的選自堿基序列為5'GACCTCGTGGCGTAGGCAAG3，、5，GACCTAGTGGCGTAGGCAAG3，、5'GACCTTGTGGCGTAGGCAAG3，、5'GACCTGATGGCGTAGGCMG3'、5'GACCTGCTGGCGTAGGCAAG3'、和5，GACCTGTTGGCGTAGGCAAG3，中的一種或多種突變型探針的微球；和/或包被有針對kRas基因密碼子Codonl3的堿基序列為5'AGCTGGTGGCGTAGGCAAGA3'、5'AGCTGGTGGCGCCGGCAAGA3'的氨基修飾的野生型探針的微球，以及包被有選自堿基序列為5'AGCTGGTGACGCCGGCAAGA3'和5，AGCTGGTTGCGgg;GCAAGA3'中的一種或二種氨基修飾的突變型探針的微球；和/或包被有針對kRas基因密碼子Codon61的堿基序列為5'AGCAGGTCMGAGGAGTACAGT3'、5'AGC工G4TCAAGAGGAGTACAGT3'、5'AGCAGGTCAAGATCTGTACAGT3，的氨基修飾的野生型探針的微球，以及包被有選自引入酶切位點Bell的堿基序列為5'AGCIG^T^AAGAGGAGTACAGT3，、5,AGCIGATCIAGAGGAGTACAGT3，、引入酶切位點BglII5，AGCAGGTCAIGAieiGTACAGT3'中的一種或多種氨基修飾的突變型探針的微球；上述每種探針的堿基序列與氨基之間連接有間隔臂，且每種微球具有不同顏色編碼；以及B.引物用于擴(kuò)增出富集有kRas基因密碼子Codon12、13和/或61的需檢測的相應(yīng)突變位點的目標(biāo)序列的引物，且該目標(biāo)序列的末端具有生物素標(biāo)記。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的kRas基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述引物包括有用于擴(kuò)增出富集有kRas基因密碼子Codon12突變位點的目標(biāo)序列的堿基序列為5'ATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT3'、5'CTGTATCAAAGAATGGTCCTGC3'、和5'ATGGTCCTGCACCAGTAATATG3'的引物，上述引物中至少有一條帶有末端的生物素標(biāo)記；和/或用于擴(kuò)增出富集有kRas基因密碼子Codon13突變位點的目標(biāo)序列的堿基序列為5'CGTCAAGGCACTCTTGCCGGCG3，、5，CGTCAAGGCACTCTTGCCGGCG3，、5，TGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCS，、和5，TGATAGTGTATTAACCTTATGTGTG3，的引物，所述引物中至少有一條帶有末端的生物素標(biāo)記；和/或用于擴(kuò)增出富集有kRas基因密碼子Codon61突變位點的目標(biāo)序列的堿基序列為5'TTGGATATTCTCGACACAGCTGAT3，、5，AATTTAAACCCACCTATAATGGTG3，、5，CCACCTATAATGGTGAATATCTTC3'、5'GTCCCTCATTGCACTGTACAGATC3'、5'GTCCCTCATTGCACTGTACAGATC3'、5'GTAAAAGGTGCACTGTMTAATCC3'、和5'TAATCCAGACTGTGTTTCTCCC3'的引物，所述引物中至少有一條帶有末端的生物素標(biāo)記。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的kRas基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述間隔臂為5—40個T的序列。5.—種kRas基因突變的檢測方法，其特征是，使用權(quán)利要求2所述的kRas基因突變檢測液相芯片，包括以下步驟(1)用帶有酶切位點的PCR引物對野生型和突變型的標(biāo)本進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；(2)將步驟(1)中的PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行酶切；(3)以酶切后的產(chǎn)物為模板進(jìn)行對突變型的kRas基因進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；(4)第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與權(quán)利要求2中相應(yīng)的所述的包被有探針的微球進(jìn)行雜交；(5)雜交反應(yīng)后加入鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行反應(yīng)，然后進(jìn)行信號檢測。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的kRas基因突變的檢測方法，其特征是，第一輪PCR擴(kuò)增所用引物為:針對kRas基因密碼子Codon12突變位點的5，ATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT3'、5，CTGTATCAAAGAATGGTCCTGC3—對引物；和/或針對kRas基因密碼子Codon13突變位點的5'CGTCAAGGCACTCTTGCCGGCG3、5'TGGAGTATTTGATAGTGTATTMCC3，一對引物；和/或針對kRas基因密碼子Codon61突變位點的5'TTGGATATTCTCGACACAGCTGAT3'、5'AATTTAAACCCACCTATAATGGTG3,—對引物以及5'GTCCCTCATTGCACTGTACAGATC3'、5'GTAAAAGGTGCACTGTAATMTCC3'—對引物。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的kRas基因突變的檢測方法，其特征是，第二輪PCR擴(kuò)增所用引物為針對kRas基因密碼子Codon12突變位點的5，ATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT3，、5'biotin-ATGGTCCTGCACCAGTAATATG3，一對引物；禾口/或針對kRas基因密碼子Codon13突變位點的5'biotin-CGTCAAGGCACTCTTGCCGGCG3，、5，TGATAGTGTATTAACCTTATGTGTG3'—對引物；和/或針對kRas基因密碼子Codon61突變位點的5'TTGGATATTCTCGACACAGCTGAT3'、5'biotin-CCACCTATAATGGTGAATATCTTC3'的一對引物以及5'biotin-GTCCCTCATTGCACTGTACAGATC3，、的5'TAATCCAGACTGTGTTTCTCCC3，的一對引物。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測kRas基因突變的核酸探針、液相芯片及檢測方法。所述kRas基因突變檢測液相芯片，包括有包被有氨基修飾的針對kRas基因密碼子Codon12、13和/或61的野生型和突變型探針的微球，以及用于擴(kuò)增出富集有kRas基因密碼子Codon12、13和/或61的需檢測的相應(yīng)突變位點的、末端具有生物素標(biāo)記目標(biāo)序列的引物，本發(fā)明所提供的方法快速，準(zhǔn)確，操作簡便，且可在一個孔中同步檢測多個突變位點，大大提高檢測效率。本發(fā)明所述液相芯片可用于kRas基因突變檢測，可作為胰腺癌早期診斷的輔助，并且可準(zhǔn)確預(yù)測分子靶向藥物治療的有效性，便于臨床準(zhǔn)確用藥，避免不必要治療的時效損失和經(jīng)濟(jì)損失。文檔編號C12N15/11GK101381779SQ200810218430公開日2009年3月11日申請日期2008年10月21日優(yōu)先權(quán)日2008年10月21日發(fā)明者任立芬,何嘉英,吳詩揚,楊惠夷,林一群,許嘉森申請人:廣州益善生物技術(shù)有限公司