專利名稱：轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物及其在制備時(shí)空可調(diào)性肝臟損傷模型中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物及其在制備時(shí)空可調(diào)性 肝臟損傷模型中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝器官移植是目前臨床治療急性肝功能衰竭、終末期肝病以及代謝性肝病 的主要手段。然而由于供體肝的短缺，肝器官移植的臨床應(yīng)用受到了嚴(yán)重限制。
美國(guó)每年約有14000人等待肝移植，其中50%等待超過(guò)1年，每年約1300人
由于等不到肝移植而死亡。我國(guó)要求行器官移植的等待名單也不斷增多。因此， 臨床急需其他方法來(lái)改善肝功能，延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間來(lái)等待肝移植，或取代 肝移植。
肝細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力。1988年Bumgardner等率先提出了肝細(xì)胞移 植的概念，1993年由Mito等在世界上開展了第一例人體肝細(xì)胞移植技術(shù)，當(dāng) 時(shí)實(shí)行的是自體同源性肝細(xì)胞移植。隨后肝細(xì)胞移植技術(shù)迅速發(fā)展，并成為生 物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的臨床前期試驗(yàn)顯示，肝細(xì)胞移植 在肝臟、脾臟和其他一些部位后，仍能維持其正常光鏡和電鏡結(jié)構(gòu)，并且能表 達(dá)多種肝細(xì)胞功能，如血清白蛋白分泌、糖原儲(chǔ)存和酵解、膽紅素結(jié)合、氨代 謝以及細(xì)胞色素P450酶基因表達(dá)等。有望通過(guò)肝細(xì)胞移植治療的疾病包括肝 臟本身的疾病和肝相關(guān)性疾病，如急、慢性肝功能衰竭、慢性病毒性肝炎和肝 硬化等。
我國(guó)首例肝細(xì)胞移植于2004年獲得成功。目前肝細(xì)胞移植已經(jīng)積累了豐 富的臨床經(jīng)驗(yàn)，并能部分或全部代替肝移植而應(yīng)用于臨床。但是，肝細(xì)胞移植 研究的核心仍然是肝細(xì)胞的來(lái)源問(wèn)題。臨床研究表明，自體成熟的肝細(xì)胞最適 合臨床移植，但這本身就是一個(gè)矛盾，為此，人們急于尋求其它來(lái)源。
ES細(xì)胞向肝細(xì)胞的定向分化，體細(xì)胞重編程后向肝細(xì)胞的定向分化似乎成
4為解決這一問(wèn)題的有效手段。然而，定向分化產(chǎn)生的"肝細(xì)胞"功能是否正常， 需要有好的肝損傷模型來(lái)檢測(cè)，該模型最好是時(shí)空可調(diào)節(jié)的，可隨時(shí)地且高效 地誘導(dǎo)形成肝損傷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可用于制備時(shí)空可調(diào)性肝臟損傷模型的轉(zhuǎn)基 因構(gòu)建物。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種時(shí)空可調(diào)性肝臟損傷模型及其制備方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種用于制備時(shí)空可調(diào)性肝臟損傷模型的構(gòu)建 物組合，其包括
(1) 構(gòu)建物l，從5，至3，依次包括以下可操作性相連的元件
啟動(dòng)子，LoxP序列，報(bào)告基因序列，終止子1， LoxP序列，tBid基因序 列，Bax基因序列，終止子2;和
(2) 構(gòu)建物2，從5'至3'依次包括以下可操作性相連的元件
啟動(dòng)子，突變型雌激素受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因序列，Cre重組酶基因序 列，和終止子；其中所述的突變型雌激素受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域可被雌激素類似 物激活進(jìn)而激活Cre重組酶活性，不被動(dòng)物體內(nèi)雌激素激活。
在另一優(yōu)選例中，所述的雌激素類似物選自它莫西芬(Tamoxifen),或 4-羥它莫西芬(4-OH Tamoxifen, 4-OHT)。
在另一優(yōu)選例中，所述的突變型雌激素受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域來(lái)源于小鼠雌 激素受體；較佳的是小鼠雌激素受體氨基酸序列(參見GenBank登錄號(hào) NM_007956)第281-599位，并且，其中第525位甘氨酸(G)突變?yōu)榫彼?R)。
在另一優(yōu)選例中，所述的突變型雌激素受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域來(lái)源于人雌 激素受體；較佳的是人的雌激素受體氨基酸序列(參見GenBank登錄號(hào) NM—000125)第282-594位，并且，其中第400位甘氨酸(G)突變?yōu)槔i氨酸 (V)、第543位甲硫氨酸(M)突變?yōu)楸彼?A)、第544位亮氨酸(L)變?yōu)?丙氨酸(A)。
在另一優(yōu)選例中，構(gòu)建物1中，所述的報(bào)告基因是/3-半乳糖苷酶基因。 在另一優(yōu)選例中，所述的報(bào)告基因3'端還連接有抗性基因序列；較佳的， 所述的抗性基因是新霉素(Neomycin， Neo)抗性基因。在另一優(yōu)選例中，構(gòu)建物1中，所述的啟動(dòng)子是CAG(巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子，
雞/ 肌動(dòng)蛋白和兔0球蛋白聯(lián)合啟動(dòng)子)啟動(dòng)子；或構(gòu)建物2中，所述的啟動(dòng)
子是白蛋白(Alb)啟動(dòng)子。
在另一優(yōu)選例中，構(gòu)建物1中，所述的終止子1是3X多聚A(3個(gè)PA串 聯(lián)而成)，或所述的終止子2是兔/ 球蛋白多聚A。
在另一優(yōu)選例中，構(gòu)建物2中，所述的終止子是SV40多聚A。
在另一優(yōu)選例中，構(gòu)建物2中，在所述的Cre重組酶基因和終止子之間， 還含有一突變型雌激素受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因序列。
在另一優(yōu)選例中，構(gòu)建物1中，所述的tBid基因和Bax基因之間，還含有 內(nèi)部核糖體插入位點(diǎn)(IRES)序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種細(xì)胞(非生殖細(xì)胞)，所述的細(xì)胞的基因組 中整合有所述的構(gòu)建物1和構(gòu)建物2。
在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞是肝細(xì)胞。
在另一優(yōu)選例中，正常情況下，所述的細(xì)胞表達(dá)報(bào)告基因編碼的蛋白；當(dāng) 用雌激素類似物處理后，所述的細(xì)胞表達(dá)tBid蛋白和Bax蛋白。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種制備轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物受精卵的方法， 所述的受精卵用于制備時(shí)空可調(diào)性肝臟損傷模型，所述方法包括
將所述的構(gòu)建物1引入非人哺乳動(dòng)物的受精卵，獲得轉(zhuǎn)入了所述構(gòu)建物1 的受精卵；或
將所述的構(gòu)建物2引入非人哺乳動(dòng)物的受精卵，獲得轉(zhuǎn)入了所述構(gòu)建物2 的受精卵。
在另一優(yōu)選例中，所述的非人哺乳動(dòng)物是小鼠。
在本發(fā)明的第四方面，提供一種制備時(shí)空可調(diào)性肝臟損傷模型的方法，所 述方法包括
(1) 將所述的構(gòu)建物1引入非人哺乳動(dòng)物的受精卵，將轉(zhuǎn)入了所述構(gòu)建物 的受精卵移入假孕非人哺乳動(dòng)物的輸卵管內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育，生成基因組中整 合有所述的構(gòu)建物1的非人哺乳動(dòng)物；
(2) 將所述的構(gòu)建物2引入非人哺乳動(dòng)物的受精卵，將轉(zhuǎn)入了所述構(gòu)建物200810200207.8 的受精卵移入假孕非人哺乳動(dòng)物的輸卵管內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育，生成基因組中整 合有所述的構(gòu)建物2的非人哺乳動(dòng)物；和
(3)使(1)和(2)獲得的非人哺乳動(dòng)物進(jìn)行交配，獲得基因組中整合有所述的
構(gòu)建物1和構(gòu)建物2的非人哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而 易見的。


圖1.利用FACS分析Caspase 8， Bax， tBid基因或它們的組合誘導(dǎo)肝細(xì) 胞凋亡的能力。
圖2.構(gòu)建獲得的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒pCALL2-tlB的結(jié)構(gòu)示意圖。 圖3.將攜帶Bax-IRES-tBid(tIB)、 Bax-IRES-tBid(BIt)、 tBid-IRES-EGFP (tIE) 、 Bax-IRES-EGFP(BIE) 、 IRES-EGFP(IE)或陰性對(duì)照的質(zhì)粒分別與 pAlbCreSVPA共轉(zhuǎn)入LEPC中，通過(guò)觀察浮于培養(yǎng)液中死亡的細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞的
凋亡情況。
圖4. PCR鑒定陽(yáng)性的F1代小鼠。
它們分別來(lái)自于7個(gè)首建者小鼠，M39: 141-149; M40: 151; F41: 159-162; F42: 163-168， 248-250; F43: 230-235; F44: 237-245; F46: 179-183。 M即
分子量標(biāo)記D2000(天根公司)，NC為陰性對(duì)照。 圖5. 9個(gè)小鼠品系肝臟組織RT-PCR結(jié)果。
wt是野生型陰性對(duì)照；Rosa26是Rosa26-紐al小鼠的陽(yáng)性對(duì)照。29， 149， 161， 168， 183， 234， 238分別是7個(gè)首建者小鼠的Fl代。首建者F41的161 號(hào)和首建者F42的168號(hào)后代顯示出轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。GAPDH是內(nèi)參，陽(yáng)性對(duì)照。
圖6.首建者F42的后代250號(hào)轉(zhuǎn)基因分別在肝臟、腎臟和小腸中的表達(dá) 情況。通過(guò)X-gal染色可見轉(zhuǎn)基因]8geo有表達(dá)。
圖7. pAlbMerCreMerSVPA和pCAG-loxP-mRFP-loxP-EGFP共轉(zhuǎn)入 Hepal-6中，24小時(shí)后用4-OHT誘導(dǎo)。綠色熒光表達(dá)，說(shuō)明MerCreMer發(fā)揮 了活性，將共轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒loxP中間的mRFP切掉，使下游的EGFP表達(dá)。
圖8. pAlbCreERSVPA和pCAG-loxP-mRFP-loxP-EGFP共轉(zhuǎn)入Hepal-6中，24小時(shí)后用4-OHT誘導(dǎo)。綠色熒光表達(dá)，說(shuō)明CreER發(fā)揮了活性，將共轉(zhuǎn)入 的質(zhì)粒loxP中間的mRFP切掉，使下游的EGFP表達(dá)。 圖9. PCR鑒定陽(yáng)性的F0代小鼠。
61個(gè)經(jīng)過(guò)原核注射發(fā)育而來(lái)的小鼠中，通過(guò)針對(duì)Alb啟動(dòng)子和Cre酶的引 物擴(kuò)增，鑒定出有6只小鼠基因組整合有打靶序列，分別是2、 3、 6、 8、 31、 37。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛的研究，找到了特別適合于高效誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的基 因，構(gòu)建了可選擇性表達(dá)凋亡基因的構(gòu)建物，從而建立了一種時(shí)空可調(diào)性的肝 臟損傷非人動(dòng)物模型。所述的非人動(dòng)物模型在沒有誘導(dǎo)的情況下不表達(dá)凋亡基 因，而在誘導(dǎo)的情況下可異常高效地表達(dá)凋亡基因，從而可高效地、實(shí)時(shí)地誘 導(dǎo)發(fā)生肝損傷(如肝功能衰竭)。
tBid基因和Bax基因
Bid蛋白即BH3 interacting domain death agonist,是Bcl-2家族中的成員之 一，含有一個(gè)BH3結(jié)構(gòu)域，其分子質(zhì)量(Mr)為22000Da。
tBid蛋白是截短的Bid蛋白，是Bid蛋白切去其N端約60個(gè)氨基酸而形 成的Bid蛋白片段。tBid是一種細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白，可誘導(dǎo)例如Hela細(xì)胞等 一些細(xì)胞發(fā)生凋亡。
本發(fā)明可用tBid的全長(zhǎng)蛋白或其生物活性片段。任何一種tBid蛋白的生物 活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，tBid蛋白的生物活性片段的含義是 指作為一種蛋白片段，其仍然能保持完整的tBid蛋白的全部或部分功能(如至 少80%的活性，更佳的至少90%的活性)。經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、 缺失或添加而形成的tBid的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。所述的經(jīng)過(guò)一個(gè)或 多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的tBid蛋白也具有與Bax協(xié)同促進(jìn)肝 細(xì)胞凋亡的功能。本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的tBid蛋白，比如，可采用為 了延長(zhǎng)其半衰期、改善其穩(wěn)定性而改良的tBid蛋白。
tBid的來(lái)源沒有特別限制，可以是人、小鼠、大鼠、豬或其他哺乳動(dòng)物的 tBid。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的tBid的氨基酸序列可以與GenBank登
錄號(hào)為NM—007544所示的序列第319-729位基本上相同。優(yōu)選的，可采用重組的
8tBid蛋白。在獲得蛋白的序列后，本領(lǐng)域人員很容易得知編碼所述tBid蛋白的
DNA序列。
Bax基因廣泛存在于哺乳動(dòng)物的多種組織和細(xì)胞中，屬于Bcl-2家族的成 員，其參與一些腫瘤細(xì)胞的促凋亡作用。
本發(fā)明可用Bax的全長(zhǎng)蛋白或其生物活性片段。任何一種Bax蛋白的生物活 性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，Bax蛋白的生物活性片段的含義是指 作為一種蛋白片段，其仍然能保持完整的Bax蛋白的全部或部分功能(如至少 80%的活性，更佳的至少90%的活性)。經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺 失或添加而形成的Bax的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。所述的經(jīng)過(guò)一個(gè)或多 個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的Bax蛋白也具有與tBid協(xié)同促進(jìn)肝細(xì) 胞凋亡的功能。本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的Bax蛋白，比如，可采用為了 延長(zhǎng)其半衰期、改善其穩(wěn)定性而改良的Bax蛋白。
Bax的來(lái)源沒有特別限制，可以是人、小鼠、大鼠、豬或其他哺乳動(dòng)物的 Bax。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的Bax的氨基酸序列可以與GenBank 登錄號(hào)為NM—007527所示的序列第124-702位基本上相同。優(yōu)選的，可采用重 組的Bax蛋白。在獲得蛋白的序列后，本領(lǐng)域人員很容易得知編碼所述Bax蛋 白的DNA序列。
轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物
一個(gè)好的動(dòng)物肝損傷模型必須具備如下4個(gè)方面的特性時(shí)空可誘導(dǎo)性， 操作簡(jiǎn)單，肝損傷誘導(dǎo)效率高，容易保存和擴(kuò)展。為了滿足這些要求，最終 獲得適合的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物，本發(fā)明人構(gòu)建了一對(duì)構(gòu)建物。所述的構(gòu)建物1從5' 至3'依次包括以下可操作性相連的元件啟動(dòng)子，LoxP序列，報(bào)告基因，終 止子l， LoxP序列，tBid基因，Bax基因，終止子2;所述的構(gòu)建物2包括以
下可操作性相連的元件啟動(dòng)子，突變型雌激素受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因序
列，Cre重組酶基因序列，和終止子；其中所述的突變型雌激素受體配體結(jié)合 結(jié)構(gòu)域可被雌激素類似物激活進(jìn)而激活Cre重組酶活性，且不被動(dòng)物體內(nèi)雌激
素激活。
當(dāng)兩種構(gòu)建物同時(shí)處于一個(gè)細(xì)胞系統(tǒng)中，在特定誘導(dǎo)條件下可激活Cre重 組酶，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)LoxP位點(diǎn)之間發(fā)生重組，使得tBid和Bax基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。
時(shí)空可調(diào)性的實(shí)現(xiàn)基于Cre/loxP系統(tǒng)。本發(fā)明人使用了一種雙標(biāo)記表達(dá)框 架，該框架的兩端各包含一個(gè)同向LoxP序列，兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間是可獨(dú)立表 達(dá)的報(bào)告基因和/或抗性篩選標(biāo)記基因。當(dāng)系統(tǒng)中存在Cre重組酶后，Cre重組 酶能夠識(shí)別LoxP位點(diǎn)而發(fā)生位點(diǎn)專一的重組，將兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間的序列切 除，從而下游tBid基因和Bax基因表達(dá)。
而細(xì)胞中Cre重組酶的活性是通過(guò)突變型雌激素受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域來(lái) 調(diào)控。將突變型雌激素受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與Cre融合之后，Cre的活性受 到突變型雌激素受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的調(diào)節(jié)。由于該結(jié)構(gòu)域是經(jīng)過(guò)突變改造 的，它不響應(yīng)小鼠自身激素的誘導(dǎo)，而對(duì)它莫西芬(Tamoxifen)等物質(zhì)較為敏感 (參見Logie and Stewart, 1995， Ligand-regulated site-speific recombination, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 5940-5944)。這樣，突變型雌激素受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu) 域與Cre融合蛋白便受到Tamoxifen等的調(diào)節(jié)。
可誘導(dǎo)突變型雌激素受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)而調(diào)節(jié)Cre活性的雌激素類 似物包括4-OHT、 Tamoxifen。
所述的突變型雌激素受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以是來(lái)源于多種哺乳動(dòng)物 的。作為一種優(yōu)選方式，所述的突變型雌激素受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域來(lái)源于小 鼠雌激素受體；較佳的是小鼠雌激素受體氨基酸序列(參見GenBank登錄號(hào) NM_007956)第281-599位，并且，其中第525位甘氨酸(G)突變?yōu)榫彼?(R)。
作為另一種優(yōu)選方式，所述的突變型雌激素受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域來(lái)源于人 雌激素受體；較佳的是人的雌激素受體氨基酸序列(參見GenBank登錄號(hào) NM_000125)第282-594位，并且，其中第400位甘氨酸(G)突變?yōu)槔i氨酸 (V)、第543位甲硫氨酸(M)突變?yōu)楸彼?A)、第544位亮氨酸(Leu)變?yōu)?丙氨酸(A)。
可用于本發(fā)明的啟動(dòng)子沒有特別限制，代表性的例子包括(但并不限于) MMTVLTR啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、唾液淀粉酶基因啟動(dòng)子等。作為本發(fā)明的 優(yōu)選方式，采用CAG(巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子，雞/5肌動(dòng)蛋白和兔/3球蛋白聯(lián)合啟 動(dòng)子)啟動(dòng)子作為構(gòu)建物1的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子是一種泛表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子，能 夠驅(qū)動(dòng)它的下游基因廣泛表達(dá)，經(jīng)驗(yàn)證具有良好的調(diào)控基因表達(dá)的作用。作為 本發(fā)明的優(yōu)選方式，使用Alb啟動(dòng)子指導(dǎo)突變型雌激素受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域
10與Cre融合基因的表達(dá)，這樣有利于使得該融合基因在肝臟中特異性表達(dá)。當(dāng) 所述融合基因發(fā)生表達(dá)，Cre重組酶發(fā)揮活性，從而誘導(dǎo)凋亡基因tBid和Bax 的表達(dá)，引起組織損傷。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在融合表達(dá)時(shí)，在Cre重組酶基因的5'端和3'端 分別與一個(gè)突變型雌激素受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因相連接，即構(gòu)成 MER-Cre-MER的結(jié)構(gòu)。經(jīng)過(guò)本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，MER-Cre-MER型的融 合基因具有以下特點(diǎn)在沒有誘導(dǎo)的情況下活性關(guān)閉更嚴(yán)，在有誘導(dǎo)的情況下 誘導(dǎo)效率更高。
可用于本發(fā)明的終止子沒有特別限制，任何適合的具有可終止基因表達(dá)功 能的終止子均是可用的。作為本發(fā)明的一種方式，構(gòu)建物1中，所述的終止子 1是3X多聚A，所述的終止子2是兔0球蛋白多聚A;構(gòu)建物2中，所述的終 止子是SV40多聚A。
本發(fā)明所述的各元件之間是可操作性相連的，所述的"操作性相連"或"可 操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調(diào)節(jié)或控制 同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那 么它就是可操作地連于編碼序列。
所述的各元件之間可具有適當(dāng)?shù)拈g隔序列，例如具有0-1000bp，較佳的 0-500bp的間隔序列。
如本文所用，所述的"含有"，"具有"或"包括"包括了 "包含"、"主 要由......構(gòu)成"、"基本上由......構(gòu)成"、和"由......構(gòu)成"；"主要由......
構(gòu)成"、"基本上由......構(gòu)成"和"由......構(gòu)成"屬于"含有"、"具有"或
"包括"的下位概念。
動(dòng)物模型的制備
在獲得了所述的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物之后，可用常規(guī)方法將線性化的構(gòu)建物轉(zhuǎn)入 受精卵中。待子代動(dòng)物出生后可用本領(lǐng)域已知的多種方法(包括但不限于PCR 檢測(cè)、Southern印跡法等方法)鑒定轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物是否整合入其基因組，從而 獲得轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物。
因此，本發(fā)明還提供了一種制備時(shí)空可調(diào)性肝臟損傷模型的方法，所述方 法包括(1)將權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物1引入非人哺乳動(dòng)物的受精卵，將轉(zhuǎn) 入了所述構(gòu)建物的受精卵移入假孕非人哺乳動(dòng)物的輸卵管內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育，生成基因組中整合有權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物1的非人哺乳動(dòng)物；(2)將權(quán)利 要求1所述的構(gòu)建物2引入非人哺乳動(dòng)物的受精卵，將轉(zhuǎn)入了所述構(gòu)建物的受
精卵移入假孕非人哺乳動(dòng)物的輸卵管內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育，生成基因組中整合有
權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物2的非人哺乳動(dòng)物；和(3)使(1)和(2)獲得的非人哺乳 動(dòng)物進(jìn)行交配，獲得基因組中整合有權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物1和構(gòu)建物2的 非人哺乳動(dòng)物。
為了得到遺傳穩(wěn)定的后代，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法還包括 (4)將(3)獲得的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物與(3)獲得的非人哺乳動(dòng)物交配，獲得基因 組中整合有所述的構(gòu)建物的后代非人哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明所述的非人哺乳動(dòng)物可以為鼠、羊、牛、豬、兔等。優(yōu)選的是鼠， 包括小鼠、大鼠或其它類型的鼠。
本發(fā)明的時(shí)空可調(diào)性肝臟損傷模型的主要用途包括但不限于肝損傷的預(yù)
防研究，肝細(xì)胞移植的效果分析，肝臟再殖的效果分析等。
一種利用本發(fā)明的時(shí)空可調(diào)性肝臟損傷模型來(lái)分析待測(cè)肝細(xì)胞移植效果
的方法是(l)將雌激素類似物(如Tamoxifen或4-OHT)給予前述獲得的基因 組中整合有權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物1和構(gòu)建物2的非人哺乳動(dòng)物，激活Cre 重組酶，Cre重組酶進(jìn)一步誘導(dǎo)構(gòu)建物1的LoxP位點(diǎn)之間發(fā)生重組，使得loxP 之間的序列被切掉，導(dǎo)致tBid和Bax基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而形成 動(dòng)物肝損傷模型；(2)將待測(cè)肝細(xì)胞移植到動(dòng)物的肝臟，觀察移植后肝臟的情 況，從而得知待測(cè)肝細(xì)胞移植效果。
分析待測(cè)肝細(xì)胞移植效果或肝臟再殖效果的方法是本領(lǐng)域已知的技術(shù)，例 如可通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于
(1) 本發(fā)明人找到了特別適合于誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的基因組合，其可發(fā)揮高 效的誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡作用。
(2) 本發(fā)明人構(gòu)建了可選擇性表達(dá)凋亡基因的時(shí)空可控性構(gòu)建物，從而建 立了時(shí)空可調(diào)性的肝臟損傷非人動(dòng)物模型。所述動(dòng)物模型可隨時(shí)地、高效地誘 導(dǎo)肝損傷，為肝細(xì)胞移植、肝臟再殖的研究提供了有效的途徑。因此，本發(fā)明 人建立了一種新的方法來(lái)誘導(dǎo)組織損傷。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō) 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方
法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所 建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
I.材料
1. 質(zhì)粒與菌株
轉(zhuǎn)基因載體pCALL2獲自加拿大Samuel Lunenfeld研究所； pIRES2-EGFP質(zhì)粒和pEGFP-N2購(gòu)自Clontech公司； pMD18T-simple質(zhì)粒購(gòu)自Takara公司； pET28a質(zhì)粒購(gòu)自Novagen;
pcDNA3和pcDNA3.1/Hygro(-)購(gòu)自Invitrogen公司。
2. 工具酶與試劑
限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；
dNTP、 Hifi Taq Platinum、 Trizol、 RT-PCR kit購(gòu)自Invitrogen;
TaqDNA聚合酶、蛋白酶K、 X-gal購(gòu)自天根公司；
DNA小量快速抽提試劑盒購(gòu)自博大泰克公司；
膠回收試劑盒購(gòu)自捷瑞公司；
QIAprep Maxprep Kit購(gòu)自Qiagen公司。
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I購(gòu)自BD Biosciences公司。 轉(zhuǎn)染試劑Effectene購(gòu)自Qiagen公司。
II.實(shí)施例
實(shí)施例l.確定最適合于誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的基因
已知有多種基因可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，本實(shí)施例中首先選擇最適合于誘導(dǎo)肝細(xì) 胞凋亡的基因。
用常規(guī)的FACS的方法，對(duì)三個(gè)基因Caspase8， Bax， tBid誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡 能力進(jìn)行比較，確定最適合的基因。將Caspase8， Bax，和tBid分別克隆到載體pcDNA3.1 (購(gòu)自Invitrogen)中。以小鼠肝臟cDNA作為模板，引物序列分別是(上游引物設(shè)置五coi /位點(diǎn)，下游引物設(shè)置^o/位點(diǎn))
Caspase 8 F (SEQ ID NO: 2):
CTCTGAATTCCCATGGATTTCCAGAGTTGTCTTTATGC:Caspase 8 R (SEQ ID NO: 3):
GCACCTCGAGTTAGGGAGGGAAGAAGAGCTTCTT;BaxF(SEQ ID NO: 4):
GCAGGAATTCCCATGGACGGGTCCGGGGAG;BaxR(SEQ ID NO: 5):
GTGGCTCGAGTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGG;■ F (SEQ ID NO: 6):
ATATGAATTCGCATGGGCAGCCAGGCCAGCC;tBidR(SEQ ID NO: 7):
GCGCCTCGAGTCAGTCCATCTCGTTTCTAACCAAG;
將攜帶Caspase 8， Bax或tBid的載體單獨(dú)轉(zhuǎn)染入LEPC細(xì)胞(小鼠成體雙能肝干細(xì)胞；來(lái)自上海第二軍醫(yī)大學(xué)；可參見Li WL等，2006， Isolation andcharacterization of bipotent liver progenitor cells from adult mouse. Stem Cells. 24:322-332)中，或者將攜帶Bax的載體和攜帶tBid的載體。FACS檢測(cè)結(jié)果見閣l，由結(jié)果可見，單獨(dú)轉(zhuǎn)染中，tBid促凋亡的能力最強(qiáng)，Bax次之，Caspase最弱。而共轉(zhuǎn)Bax和tBid時(shí)，促凋亡的能力最強(qiáng)。
可見，對(duì)于肝細(xì)胞而言，Bax和tBid共同表達(dá)的促凋亡作用最強(qiáng)。
實(shí)施例2.轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建
用PCR的方法從小鼠肝臟cDNA中擴(kuò)增tBid和Bax基因，并將它們連接到pMD18T-simple載體中。
引物序列如下
腕F(SEQ ID NO: 8):
5 ，-ATATAGATCTACCATGGGCAGCCAGGCCA-3';tBidR(SEQ ID NO: 7):5，-GCGCCTCGAGTCAGTCCATCTCGTTTCTAACCAAG-BaxF(SEQ ID緣9):
5 ， - AT AT AG ATCT ACC ATGG ACGGGTCCGGG-3 ，；BaxR(SEQ ID NO: 5):
5 ， -GTGGCTCG AGTC AGCCC ATCTTCTTCC AGATGG-3 ，。
PCR擴(kuò)增條件分別如下
tBid:首先94。C， 5min;然后94。C， 30s; 56°C， 30s; 72°C， 30s; 30個(gè)循環(huán)；最后72°C， lOmin。
Bax:首先94°C， 5min;然后94°C， 30s; 58°C， 30s; 72°C， 30s; 30個(gè)循環(huán)；最后72°C， lOmin。
用5g/J/和Wco /將IRES序列從pIRES2-EGFP中切下來(lái)，連接到pET28a中相應(yīng)的位點(diǎn)，得到pET28a-IRES;接著用PCR的方法，從肝臟cDNA中擴(kuò)增出Bax和tBid并分別插入pMD18T-simple載體中，得到pMD18T-Bax和pMD18T-tBid，測(cè)序結(jié)果正確后，用Wco/和/將Bax從pMD18T-Bax中切下來(lái)，連接到pET28a-IRES相應(yīng)位點(diǎn)，得到pET28a-IRES-Bax;再用萬(wàn)g/7/和Z/ o /將tBid從pMD18T-tBid中切下來(lái)，連接到pET28a-IRES-Bax的5g/ //和SaZ/之間，得到pET28a-tBid-IRES-Bax，簡(jiǎn)稱pET28a-tlB。接下來(lái)用5《///和;Ow/將tlB切下來(lái)，連接至UpCALL2中相應(yīng)位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pCALL2-tlB。 PCR產(chǎn)物回收、DNA片段回收、質(zhì)粒抽提按博大泰克說(shuō)明書操作，酶切與連接按NEB酶的操作說(shuō)明進(jìn)行。
轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒pCALL2-tlB構(gòu)建完成后，其共包含7個(gè)關(guān)鍵部分能夠驅(qū)動(dòng)基因廣泛表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子CAG， loxP序列，iSgeo基因的編碼框，3XpolyA(終止子)，與前一個(gè)loxP同向的loxP序列，基因tIB，兔/3球蛋白polyA，共9.5kb，其結(jié)構(gòu)如圖2所示。測(cè)序表明完全正確。pCALL2-tlB質(zhì)粒的全長(zhǎng)序列如SEQ IDNO: 1所示。
基于與前述類似的方法，本發(fā)明人還構(gòu)建了攜帶Bax-IRES-tBid(BIt)的pCALL2-BIt質(zhì)粒，該質(zhì)粒中Bax和tBid的串聯(lián)方式不同于pCALL2-tlB質(zhì)粒。
本發(fā)明人同時(shí)還構(gòu)建含有IRES-EGFP(IE)的質(zhì)粒，以及基于單獨(dú)的凋亡基因構(gòu)建分別含有Bax-IRES-EGFP(BIE)和tBid-IRES-EGFP(tIE)的質(zhì)粒。具體的
15構(gòu)建方法如下
對(duì)于pCALL2-BIt，用ATco/和^ of將tBid從pMD18T-tBid中切下來(lái)，連接到pET28a-IRES相應(yīng)位點(diǎn)，得到pET28a-IRES-tBid;再用^8g/ //和ZAo /將Bax從pMD18T-Bax中切下來(lái)，連接至lJpET28a-IRES-tBid的5g/ //和<&/ /之間，得到pET28a-Bax-IRES-tBid，簡(jiǎn)稱pET28a-BIt。接下來(lái)用5《///和^0 r將BIt切下來(lái)，連接到pCALL2中相應(yīng)位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pCALL2-BIt。
對(duì)于pCALL2-tlE，用5《///和^0/將{81(1從？]^018丁-181€1中切下來(lái)，連接到口11^82-￡0 載體中5《///和5^/之間，得到ptBid-IRES-EGFP，簡(jiǎn)稱ptIE,然后用^^///和^0^將《￡切下來(lái)，連接到pCALL2相應(yīng)的位點(diǎn)，即得至IJpCALL2-tlE。
對(duì)于pCALL2-BIE，用5§///和^%0/)|每8&乂從？^/1018丁-8&義中切下來(lái)，連接到pIRES2-EGFP載體中^g///和5^//之間，得至廿pBax-IRES-EGFP，簡(jiǎn)稱pBIE，然后用Sg/ //和7Vw /將BIE切下來(lái)，連接到pCALL2相應(yīng)的位點(diǎn)，即得到pCALL2-BIE。
對(duì)于pCALL2-IE,則直接用5g///和AWT將IRES-EGFP從pIRES2-EGFP中切下來(lái)，連接到pCALL2相應(yīng)的位點(diǎn)，得到pCALL2-IE。
將這些質(zhì)粒分別與pAlbCreSVPA共轉(zhuǎn)入LEPC中，通過(guò)觀察死亡細(xì)胞懸浮來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pCALL2-tlB促凋亡的能力顯著比pCALL2-BIt強(qiáng)；同時(shí)表達(dá)兩個(gè)凋亡基因的比表達(dá)一個(gè)基因的促凋亡能力強(qiáng)；表達(dá)凋亡基因的比不表達(dá)凋亡基因的促凋亡能力強(qiáng)，如圖3所示。pCALL2-tlB質(zhì)粒的全序列如SEQIDNO: l所示，共11323bp。
因此，本發(fā)明人選用了pCALL2-tlB質(zhì)粒，將其線性化，注射到小鼠受精卵中，制備了tIB轉(zhuǎn)基因小鼠，用于條件誘導(dǎo)組織細(xì)胞凋亡。
實(shí)施例3.受精卵顯微注射和轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定
用/和S/ /將前述構(gòu)建的質(zhì)粒pCALL2-tlB切開，回收包含上述7個(gè)元件的9.5kb的條帶，去除無(wú)關(guān)片段，最后將該片段稀釋至2-5ng/pL，按常規(guī)進(jìn)行受精卵顯微注射。然后將接受DNA的受精卵移植到受體假孕母鼠輸卵管內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育，最后分娩獲得子代小鼠。
通過(guò)PCR的方法對(duì)出生的后代作基因型鑒定，取出生后約30天的小鼠0.5-lcm尾尖置于1.5mL離心管中，加入組織裂解液[50^L 10% SDS，
1610)wL20mg/mL蛋白酶K， 200juL NLB(10mM Tris-HCl， pH8.2; 400mMNaCl;lmM EDTA， pH8.0)]于55。C過(guò)夜裂解。向裂解完全的樣品中加入飽和NaCl，顛倒混勻，8000rpm于4。C離心15min。上清與200/xL異丙醇混合，室溫13200rpm離心15min，沉淀用70%乙醇洗滌一次，風(fēng)干，最后用lOO^L的
TE溶解。
基因型鑒定的引物如下
紐al-F (SEQ ID NO: 10):
5，-GTGACGTCTCGTTGCTGCATAAAC-3，；
/3gal-F (SEQ ID NO: 11):
5 ， -C ACGGCGTTAAAGTTGTTCTGCT-3 ，；
Bax-F (SEQ ID NO: 12):
5 ， -G AGGTT AAA A A A ACGTCT AGGCCC-3 ，；
Bax-R (SEQ ID NO: 13):
5，-TTTGGCAGAGGGAAAAAGATCG-3，；
CD34 enh-F (SEQ ID NO: 14):
5 ，-ACGCGTGAGTGGTCTGGATCCAAACTGAGTG-3';CD34 enh-R (SEQ ID NO: 15):
5 ，-AAGCTTAGCTATAATGCAACCAGAATATAAAGCAT-3'。
PCR擴(kuò)增條件分別如下
iSgal:首先94°C， 2min;然后94°C， 30s; 58°C， 30s; 72°C， 30s;進(jìn)行28個(gè)循環(huán)；最后72X:， 10min。
Bax:首先94°C， 2min;然后94°C， 30s; 57°C， 30s; 72°C， 35s;進(jìn)行28個(gè)循環(huán)；最后72卩，10min。
CD34 enhancer:首先94。C， 2min;然后94°C， 30s; 58°C， 30s; 72°C，50s;進(jìn)行28個(gè)循環(huán)；最后72。C， 10min。
結(jié)果，共得到11個(gè)轉(zhuǎn)基因首建者(FO代)，初步鑒定它們的基因組上有整合的陽(yáng)性小鼠。將這些首建者小鼠分別與野生型小鼠交配，后代Fl攜帶轉(zhuǎn)基因(圖4)。
17實(shí)施例4.轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟表達(dá)RT-PCR檢測(cè)
11個(gè)首建者小鼠分別與野生型小鼠交配建系。繼續(xù)通過(guò)PCR的方法鑒定 基因組上攜帶轉(zhuǎn)基因的Fl代小鼠。
選取其中7個(gè)首建者后代，加上野生型的陰性對(duì)照和Rosa26-紐al陽(yáng)性對(duì) 照共9只小鼠，取其肝臟，液氮速凍小鼠新鮮肝臟，研磨成粉末，立即用Trizol 裂解細(xì)胞RNA的提取，RNA的提取，RT-PCR過(guò)程按照Invitrogen相應(yīng)的說(shuō)明 書進(jìn)行。同時(shí)取其尾尖用于抽基因組DNA。紐al的擴(kuò)增與前相同。
9個(gè)小鼠品系肝臟組織RT-PCR結(jié)果如圖5所示，RT-PCR結(jié)果顯示其中 兩個(gè)首建者后代有轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，分別是首建者F41的161號(hào)和首建者F42的 168號(hào)后代。
實(shí)施例5. X-gal檢測(cè)組織轉(zhuǎn)基因表達(dá)
取經(jīng)過(guò)RT-PCR表明轉(zhuǎn)基因有表達(dá)的首建者后代(F42的后代250號(hào))，對(duì) 其肝臟、腎臟和小腸進(jìn)行X-gal染色。將器官置于固定液中(1%甲醛，0.2%戊 二醛，0.02。/。NP-40于PBS中)4。C固定4小時(shí)，然后用PBS室溫洗滌2次，每 次20分鐘，接著將器官至于染色液中(5mM亞鐵氰化鉀，5mM鐵氰化鉀，0.0P/。 過(guò)氧膽酸鈉，0.02% NP-40， 2mM氯化鎂，lmg/mL X-gal于PBS中)，室溫染 色過(guò)夜。
X-gal染色結(jié)果見圖6，可以看到這些器官都有轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，因此可以確 定該轉(zhuǎn)基因小鼠有轉(zhuǎn)基因的正常表達(dá)，本發(fā)明人將該小鼠稱為tIB小鼠，能夠 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例6.肝臟特異表達(dá)的可誘導(dǎo)Cre酶小鼠的構(gòu)建
對(duì)于在肝臟里面特異表達(dá)的可誘導(dǎo)Cre酶小鼠的構(gòu)建，用1/ 0/和4/7//將 pIRES2-EGFP(Clontech)和pcDNA3.1/Hygro(-)(Invitrogen)切開，并將前者中約 1.6kb含polyA的片段插入后者中，得至UpcDNA3.1-SVPA/Hygro(-)。接著，用 M/w /和Z/w /將Alb啟動(dòng)子從pGEMAlbSVPA (參見Goshi Shiota等，1990， Hepatocyte growth factor inhibits growth of hepatocellular carcinoma cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 5940-5944. 89: 373-377)中切下來(lái)，插入 pcDNA3.1 -SVPA/Hygro(-)中相應(yīng)的位點(diǎn)，得到pAlb(Old)-SVPA/Hygro(-)。為 了將Alb啟動(dòng)子后面的ATG去掉，用常規(guī)PCR的方法，擴(kuò)增啟動(dòng)子最后0.5kb片斷，？01產(chǎn)物用3 附///和^/^/酶切后，替換掉pAlb(01d)-SVPA/Hygro(-)中相應(yīng)片斷，得至UpAlbSVPA/Hygro(-)。然后，用常規(guī)PCR的方法從pANMerCreMer(Zhang等，1996; Inducible site-directed recombination in mouse embryonic stemcells. Nucleic Acids Research. 24: 543-548)中將Cre的序列擴(kuò)增出來(lái)(以Cre Fl和CreR作為引物)，連接到pMD-18T simple vector中，測(cè)序正確之后，用^7 o/和iVo, /將Cre連接到pAlb-SVPA/Hygro(-)中相應(yīng)位點(diǎn)，得到pAlbCreSVPA。用Ac/和&c/將CreER從pBS-CreLBD (購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海模式動(dòng)物中心)切下來(lái)，在相同的位點(diǎn)把pAlbCreSVPA中的Cre替換下來(lái)，得到pAlbCreERSVPA。
此外，本發(fā)明人還構(gòu)建了pAlbMerCreMerSVPA，用PCR的方法將Cre從pANMerCreMer中擴(kuò)增出來(lái)(以Cre F2和Cre R作為引物)，連接到pMD-18T simplevector,得到T-Cre。接下來(lái)，將pANMerCreMer用&c/酶切，回收4.4kb的片段，然后將這4.4kb的片段用A^o/部分酶切的方法酶切，回收約3kb的片段，并將其插入T-Cre相應(yīng)位點(diǎn)，得到T-MerCreMer。用Ac/和Sac/將MerCreMer從T-MerCreMer切下來(lái)，在相同位點(diǎn)替換掉pAlbCreSVPA中的Cre，得到pAlbMerCreMerS VPA 。
由于pAlbCreERSVPA和pAlbMerCreMerSVPA中都含有可誘導(dǎo)的Cre ，本發(fā)明人比較了一下CreER和MerCreMer，看哪一個(gè)在沒有誘導(dǎo)的條件下本底活性低，而經(jīng)受誘導(dǎo)的效率更高。
本發(fā)明人將pAlbCreERSVPA和pAlbMerCreMerSVPA分別和pCAG-loxP-mRFP-loxP-EGFP共轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞系Hepal-6 (購(gòu)自中科院生化細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù))中，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，分別用lpM的4-OHT誘導(dǎo)。從綠色熒光表達(dá)來(lái)看，在沒有誘導(dǎo)的情況下，MerCreMer活性關(guān)閉的更嚴(yán)，而用4-OHT誘導(dǎo)后，MerCreMer誘導(dǎo)效率更高，見圖7和圖8。因此本發(fā)明人選擇了p AlbMerCreMerS VP A質(zhì)粒去制備轉(zhuǎn)基因小鼠。
引物序列
CreFl (SEQ ID NO: 16):
TATACTCGAGGCGCGCCACCATGCCCAAGAAGAAGAGGCreF2 (SEQ ID NO: 17):
TATACTCGAGGCGCGCCACCATGGCCAAGAAGAAGAGGCreR(SEQ ID NO: 18):
19ATATGCGGCCGCGAGCTCTAATCGCCATCTTCCAGCAGG AlbproF(SEQ ID NO: 19): ATATGGATCCATGGGGTTGATTTGGATGTAG Alb proR(SEQ ID NO: 20): CAGTCTCGAGGGAAAGGTGATCTGTGTGCA
PCR擴(kuò)增條件分別如下
Cre:首先，94°C， 2min;然后，94°C， 30s; 55°C， 30s; 72°C， lmin; 20 個(gè)循環(huán)；最后，72°C， lOmin。
Alb啟動(dòng)子首先，94°C， 2min，然后，94°C， 30s; 55°C， 30s; 72°C， 30s; 20個(gè)循環(huán)；最后，72°C, lOmin。
pC AG-loxP-mRFP-loxP-EGFP的構(gòu)建方法如下
用常規(guī)PCR的方法從pDB587 (參見M. Fischer et al.， 2004, A brilliant monomelic red fluorescent protein to visualize cytoskeleton dynamics in Dictyostelium. FEBS Letters. 577: 227—232)中將mRFP擴(kuò)增出來(lái)，PCR產(chǎn)物用C7" /和Sc/ /酶切，并替換掉pCALL2的C/fl /和/之間的序列，得到 pCAG-loxP-mRFP-loxP。然后用5aw H/和A^ f將pEGFP-N2中的EGFP序列切下 來(lái)，并插入pCAG-loxP-mRFP-loxP中5g/ //禾卩M f /之間，得到 pCAG-loxP-mRFP-loxP國(guó)EGFP 。
引物序列
mRFPF (SEQ ID NO: 21): ATCGATACCATGGCCAGCTCCGAG mRFP R (SEQ ID NO: 22): TGATCATTAGCTTCCAGCGCCTGTGC
PCR擴(kuò)增條件如下
首先，94°C， 2min;然后，94°C, 30s; 55°C， 30s; 72°C， 45s; 20個(gè)循環(huán); 最后，72°C， lOmin。
本發(fā)明人將pAlbMerCreMerSVPA用M/" /和尸me /切開，回收含有Alb啟動(dòng) 子，MerCreMer基因和SV40polyA的6.1kb的片段，用于對(duì)受精卵進(jìn)行原核注射。將注射后的受精卵移植到假孕母鼠的子宮內(nèi)，以完成胚胎發(fā)育。F0代小鼠出生
后一個(gè)月，抽鼠尾DNA進(jìn)行基因組鑒定，選擇基因組上整合了片段的陽(yáng)性小鼠。
鑒定所用的引物序列如下
Alb Enh/Pro GT-F (SEQ ID NO: 23):
GCTGATGCAGAGTGAAGAGTGTGTGA;
Alb Enh/Pro GT-R (SEQ ID NO: 24):
GGCATGGAAGCATGCCACATT;
Cre GT-F (SEQ ID NO: 25):
GAGC ATACCTGGAAAATGCTTCTGT;
Cre GT-R (SEQ ID NO: 26):
CCC AGGCTAAGTGCCTTCTCTAC A;
CD34 enh-F (SEQ ID NO: 14):
5 ， - ACGCGTG AGTGGTCTGG ATCC AAACTG AGTG-3 ，； CD34 enh-R (SEQ ID NO: 15):
5' - A AGCTT AGCT AT A ATGC A ACC AGAAT ATAA AGC AT-3'。
PCR擴(kuò)增條件如下
AlbEnh/Pro， 94°C， 2min; 94°C， 30s; 59°C， 30s; 72°C， 30s; 35個(gè)循環(huán); 72°C， 10min。 Cre， 94。C， 2min; 94°C， 30s; 58°C， 30s; 72°C， 30s; 28個(gè)循 環(huán)；72°C， lOmin。
CD34 enhancer, 94°C ， 2min; 94°C， 30s; 58°C， 30s; 72°C， 50s; 28個(gè) 循環(huán)；72。C， lOmin。
結(jié)果如圖9，結(jié)果共得到7個(gè)陽(yáng)性首建系(F0代)。
接下來(lái)，將7個(gè)首建系分別與C57野生型小鼠雜交，獲得了F1代小鼠。在F1 代小鼠中，通過(guò)抽鼠尾DNA鑒定基因組整合為陽(yáng)性的子代。
選擇陽(yáng)性的子代小鼠，通過(guò)Western blot和RT-PCR的方法，選擇表達(dá)水平 較高的首建系，培育出純合的MerCreMer轉(zhuǎn)基因小鼠，稱為MCM小鼠，與前述 制備的純合的tIB小鼠雜交，以得到雙轉(zhuǎn)基因小鼠MCM/tlB。
6-8周左右的MCM/tlB小鼠通過(guò)腹部注射4-OHT， lmg/天，連續(xù)注射5天。 從第6天開始連續(xù)取5天肝組織，通過(guò)TUNEL檢測(cè)肝臟發(fā)生凋亡的情況。確 定時(shí)空可調(diào)地誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞凋亡，有效地引發(fā)了肝損傷。本發(fā)明人從所得到的小鼠的肝中提取肝細(xì)胞，該種肝細(xì)胞的基因組中含有
MerCreMer構(gòu)建物以及tIB構(gòu)建物，該細(xì)胞可體外培養(yǎng)和繁殖。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn) 被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申 請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表
<liO〉中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院
〈120>轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物及其在制備時(shí)空可調(diào)性肝臟損傷模型中的應(yīng)用
<130> 085115
<160> 26
<170> Patentln version 3.3
<210〉 1
〈211〉 11323
<212〉 靈
<213> 人工序列
<221> 邁isc—feature
〈223> 重組^體
<柳> 1
gtcgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcata60
gccc3tatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgc120
ccaacgscccccgcccattgacgtc肌taatgacgtatgttcccatagtaacgccaatag180
ggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacUggcagtac240
atcaeigtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccg300
CCtggC3tt3tgcccagtacatgaccttatggg&ctttcctacttggcagtacatctacg360
tattagtcatcgctattaccatgggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctcccc420
atctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgca480
gcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcg540
gggcggggcgaggcgg柳ggtgcggcggcagcc33tcagagcggcgcgctccgaaagtt600
tccttttatggcgaggcggcggcggcggcggCCCt3t犯333gCg33gCgcgcggcgggc660
gggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcgccgcctcgcgccgcccgcc720
ccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctcc780
gggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttctUtctgtggctgcgtga犯g840
ccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcg900
tgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggcccgcgctgcccggcggctgtgagcgctg960
cgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcgtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggc1020
ggtgccccgcggtgcgggggggctgcgaggctgcgtgcggggtgtgtgcg1080
tgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctgtaacccccccctgcaccccU40
cctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtgcggggcgtggc1200
gcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcgggg1260
ccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggccccggagcgccggcggct1320
gtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagg1380
gacttcctttgtcccaaatctggcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctc1440
tagcgggcgcgggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggsgggcctt1500
cgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccatctccagcctcggggctgccgcaggggg1560
acggctgccttcgggggggacggggcsgggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcgi620
gctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggca1680
scgtgctggttsttgtgctgtctcatcattattcctcgat1740
aeitaacttcgtatagcatac3ttatacgsagttatattaagggttccgcaagcttcctag1800
actagtcgacggtatcgata3gC3gCttg3tgatctgtgacatggcggatcccgtcgttt1860
tacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatc1920
cccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagt1980
tgcgcagcctgaatggcgastggcgctttgcctggtttccggcaccagaagcggtgccgg2040
aaagctggctggagtgcgatcttcctgaggccgatactgtcgtcgtcccctcaaactggc2100
agatgcacggttacgatgcgcccatctacaccaacgtaacctatcccattacggtcaatc2160
cgccgtttgttcccacggag犯tccgacgggttgttactcgctcacattt3atgttgatg2220
aaagctggctacaggaaggccagacgcgaattatttttgatggcgttaactcggcgtttc2280
atctgtggtgcaacgggcgctgggtcggttacggccaggacagtcgtttgccgtctgaat2340
ttgacctgagcgcatttttacgcgccggaga犯accgcctCgCggtg3tggtgctgcgtt2400
ggagtgscggcagttatctgggi柳tceiggatatgtggcggatgagcggcattttccgtg2460
acgtctcgttgctgcatasaccg￡ict￡icacaaatcagcgatttccatgttgccactcgct2520
ttaatgatgatttcagccgcgctgtactgg3ggCtg33gttcagatgtgcggcgagttgc2580
gtgactacctacgggtaacagtttctttatggcagggtgaaacgcaggtcgccagcggca2640
ccgcgcctttcggcggtgaaattatcgatgsgcgtggtggttatgccgatcgcgtcacac2700
tacgtctgaacgtcgaaaacccgaaactgtggagcgccgaaatcccgaatctctatcgtg2760
cggtggttgaactgcacaccgccgacggcacgctgattgaagcag肌gcctgcgatgtcg2820
gtttccgcgaggtgcggattgaa犯tggtctgctgctgctgaacggcaagccgttgctga2880
23ttcgaggcgttaaccgtcacgagcatcatcctctgcatggtcaggtcatggatgagcaga2940
cgatggtgcaggatatcctgctgatgaagcagaacaactttaacgccgtg cgctgttcgc3000
attatccgaaccatccgctgtggtacacgctgtgcgaccgctacggcctg tatgtggtgg3060
atgaagccaatattgaaacccacggcatggtgccaatga^atcgtctgaccgstgatccgc3120
gctggctaccggcgatgagcg犯cgcgtaacgcgaatggtgcagcgcgatcgtaatcacc3180
cgagtgtgatcatctggtcgctggggaatgaatcaggccacggcgctaatcacgacgcgc3240
tgtatcgctggatcaaatctgtcgatccttcccgcccggtgcagtatgaaggcggcggag3300
ccgacaccacggccaccgatatt3tttgcccgatgtacgcgcgcgtggatgaagaccagc3360
ccttcccggctgtgccgaaatggtccatcaaaaaatggctttcgctacctggagagacgc3420
gcccgctgatcctttgcgaatacgcccacgcgatgggtaacagtcttggcggtttcgcta3480
wtactggcaggcgtttcgtcagtatccccgtttacagggcggcttcgtctgggactggg3540
tggatcagtcgctgattaaatatgatgaaaacggcaacccgtggtcggcttaicggcggtg3600
attttggcgatacgccgaacgatcgccagttctgtatgaacggtctggtctttgccgacc3660
gcacgccgcatccagcgctgacggaagc犯gC3gUUtccagttccgtt3720
tatccgggcaaaccatcgaagtgaccagcgaatacctgttccgtcatagcgBt犯Cg3gC3780
tcctgcactggS"tggtggCgctggatggt3agccgctggcgtgcctctgg3840
atgtcgctcccagttgattgaactgcctgaactaccgcagccggagagcg3900
ccgggcaactctggctcacagtacgcgtagtgcaaccg犯cgcgaccgcatggtcagaag3960
ccgggcacatC3gCgCCtggC3gC3gtggCgtctggcggagtgacgctcc4020
ccgccgcgtcccacgccatcccgcatctgaccaccagcgaaatggatttttgcatcgagc4080
gcgttggcaatttaaccgccagtcaggctttctUcacagatgtggattg4140
gcgataaaaaacaactgctgacgccgctgcgcgatcagttcacccgtgcaccgctggata4200
acgacattggcgtaagtg犯gcgacccgcattgaccctaacgcctgggtcgaacgctgga4260
aggcggcgggccattaccaggccg犯gcagcgttgttgcagtgcacggcagatacacttg4320
ctgatgcggtgctgattacgaccgctcacgcgtggcagcatc3gggga^3accttattta4380
tcagccggaaaacctaccggattgatggtagtggtcaaatggcgsttaccgttgatgttg4440
aagtggcgagcgatacaccgcatccggcgcggattggcctgaactgccagctggcgcagg4500
tagcagagcgggtaaactggctcggattagggccgcaagaaaactatcccgaccgcctta4560
ctgccgcctgttttgaccgctgggatctgccattgtcagacatgtataccccgtacgtct4620
tcccgagcgaaaacggtctgcgctgcgggacgcgcgaattg認(rèn)Uatggcccacaccagt4680
ggcgcggcgacttccagttcaacatcagccgctacagtcaacagcaactgatggaaacca4740
gccatcgccatctgctgcacgcgg犯gaaggcacatggctgaatatcgacggtttccata4800
tggggattggtggcgacgactcctggagcccgtcagtatcggcgga3ttccagctgagcg4860
ccggtcgctaccattacc3gttggtctggtgtcaggggatcccccgggct4920
agatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtgg3gaggctattcg柳O
gctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgUccggctgtcag5040
cgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgc5100
aggscgaggcagcgcggct3tcgtggctggCC3Cg3Cgggcgttccttgcgcsgctgtgc5160
tcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcagg5220
atctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgc5280
ggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgca5340
tcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacg犯g5400
agcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacg5460
gcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaa犯tg5520
gccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggaca5580
tagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcc5640
tcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttg5700
acgagttcttctgaggggatcaattctctaggcttgggatctttgtgaaggaaccttact5760
tctgtggtgtgacataattggaca犯ct3Cctacagagatttaaagctctaaggtaaatei5820
taaaatttttaagtgtataatgtgttaaactactgattctaattgtttgtgtattttaga5880
ttcacagtcccaaggctcatttcaggcccctcagtcctcacagtctgttcatgatcatas5940
tcagccataccacatttgt3gaggttttacttgctttaaaaaacctccceicacctccccc6000
tgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgc3gcttat36060
atggttacaaataaagcaatatttceic^ataaagcatttttttcactgc6120
attctagttgtgtttgtccaaactcatc犯tgtatcttatcatgtctggatcataatcag6函
tttgtEigaggttttacttgccttccccacacctccccctg6240
gC33ttgttgttgttaacttgttt3ttgC3gcttataatg6300
gttaca犯ta犯gcwtagcatcaca犯tttcacaaataaagcatttttttcactgcatt6360
ctagttgtggtUgtcc貼actcatcaatgtatcttatcatgtctggatcataatcagcc6420
ataccacatttgt柳ggttttacttgctttaaaaaacctcccacficctccccctgaacc6480
aatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttat犯tggtt6540
acaaataaagcaatagcatcacaaatttcaca^ta犯gcatttttttcactgcattcta6600
gttgtggtttgtccaaactc3tC肌tgtEltcttatcatgtctggatccactagttctagc6660
tagtctaggtcgatgcaggataacttcgtatagcatacattatacgaagttatagatcta6720
ccatgggcagccaggccagccgctccttcaacc站ggaagaatagagccagattctga犯6780
aatcatccac3acattgccagacatctcgcccaaat3ggcgatgagatgg6840
acceic33C3tccagcccacactggtgagacagctagccgcacagttcatgaatggcagcc6900
tgtcggagga貼ctgcctggccaaagcccttgatgaggtgaagacagcct6960
tccccEigagacEitggagaacgacaaggccatgctgataatgaccatgctgttggcca犯a7020tcacgcaccatctttgctccgtgatgtcttccacacgactgtcaacttta7080
ttaaccagaacctattctcctatgtgaggaacttggttag犯3cgagatggactgactcg7140
acggtaccgcgggcccgggatccgcccctc"tccctcccccccccctaacgttactggccg7200
aagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgcc7260
gtcttttggcCCCgg333CCtggccctgtcttcttgacg3gcattcctag7320
gggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagt7380
tcctctggaagcttcttgaagaca犯caacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcgg認(rèn)7440
ccccccacctggcgacaggtgcctctgcggcgtgtataagatacacctgc7500
a犯ggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtc犯atg7560
gctctcctcaagcgtattcascaaggggctgaaggatgcccagaeiggtaccccattgtat7620
gggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcga7680
acgtctsggccccccg犯ccacggggacgtggttttcctttgaaaaacac7740
tggccacaaccatggacgggtccggggagcagcttgggagcggcgggcccaccagctctg7800
認(rèn)cagatcatg3柳C3ggggcctttttgctacagggtttcatccaggatcgeigcaggga7860
ggatggctggggagacacctgagctgaccttggagcagccgccccaggatgcgtccacca7920
agaagctgagcgagtgtctccggcgaattggagatgaactggacagcaatatggagctgc7980
,gga_tg3ttgctgacgtggacacggactccccccgagaggtcttcttccgggtggcag8040
ctgac￡itgtttgctgatggcaacttc肌ctggggccgcgtggttgccctcttctactttg8100
ctagcaaactggtgctcaaggccctgtgcactaaagtgcccgagctgatcagaaccatca8160
tgggctggscactggacttcctccgtgagcggctgcttgtctggatccaag3ccagggtg8220
gctgggaaggcctcctctcctacttcgggacccccacatggcagacagtg&ccatctttg8280
tggctggagtcctcaccgcctcgctcaccatctgga&gaagatgggctgactcgaggcgg8340
ccgcgatctttttccctctgtggggacatcatgaagccccttgagcatct8400
gacttctggcaatttattttcattgcaatagtgtgttgg3attttUgtg8460
tctctcactcggaaggacatettggg站ggcaaatcatttaatgagtattt8520
ggtttagagtttggcaacatatgccatatgctggctgccatgaacaaaggtggctataaa8580
gaggtcatcagt3tatg犯acagccccctgctgtccattccttattccatagaaaagcct8640
tgacttgaggttagatttttUtatattttgmtgtgttatttttttctttaacatccc8700
taaaattttccttacatgttttactagccagatttttcctcctctcctgactactcccag8760
tcatagctgtccctcttctcttatgaagatccctcgacctgcagcccaagcttggcgtaa8820
tcatggtcatagctgtttcctgtgtgsaattgttatccgctcacaattcc8880
CgElgCCgg犯gcataaagtgtaaagcctggggtgcctemtgagtgagctaactcac3tta8940
attgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagcgg3tccgc9000
atctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactc9060
cgcccagttccgcccattctccgccccatggctgact犯ttttttttatttatgcagagg9120
ccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcc9180
taggcttttgcaaaaagctaacttgtttattgcagcttataatggttaca犯tsaagcaa9240
tagcatcacaaatttcacaatttttcactgcattctagttgtggtttgtc9300
caaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatccgctgcattaatgaatcggcc犯cgc9360
gcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgEictcgctg9420
cgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggtta9480
tccacagaatCgC￡lgg￡m￡lgaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggcc9540
aaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgag9600
atcgacgctcaagtcagaggtggcga犯cccgacaggactataaagatac9660
caggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttacc9720
ggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgt9780
aggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctCC33gCtgggctgtgtgcaCg33CCCCCC9840
gttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgeigtcc犯cccggtaaga9900
cacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgagg"Utg"U9960
ggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagta10020
tttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaa犯柳gttggtagctcttga10080
tccggcaaactggtagcggtggtmutgtttgcaagcagcagattacg10140
cgcagaaaaa犯gg3tCtC3agaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcag10200
tggaacgaaaactcacgtta3gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacc10260
tagatcctttatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaeiact10320
tggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctattt10380
cgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggctta10440
ccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagattta10500
tcagcwtaaaccagccagcCgg33gggCCgagcgcagaagtggtcctgcaactttatcc10560
gcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaat10620
agtttgcgc3acgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggt10680
tcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttg10740
tgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaeigttggccgca10800
gtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgta10860
agatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgsgaatagtgtatgcgg10920
cgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatsccgcgccacatagc郎犯ct10980
ttaaaagtgctcatcattgg犯aacgttcttcggggcgM犯ctctcaaggatcttaccg11040
ctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatctttt11100
actttcaccagcgUtctgggtgagC￡l￡l￡l3ac3gg犯ggcaaaatgccgca貼犯aggga11160
25ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaeita ttattgaagc 11220 atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaata犯 11280 caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctg 11323
<210〉2
<211>38
<212>隨
〈213>人工序列
<221>misc feature
<223>引物
<400>2
ctctgaattc ccatggattt<210>3
<2ii〉34
<212>醒
<213>人工序列
<221>邁isc feature
〈223>引物
<400>3
gcacctcgag ttagggaggg<210>4
<211>30
〈212〉隱
<213>人工序列
〈221〉misc feature
<223>引物
<備〉4
gcaggaattc ccatggacgg<210>5
<21i>33
<212>腿
<213>人工序列
<221>misc feature
<223>引物
<400>5
gtggctcgag tcagcccatc<210>6
<211>31
〈212〉隱
<213>人工序列
〈221>misc feature
<223〉引物
〈400>6
atatgaattc gcatgggcag<210〉
<2U>35
〈212>腿
<213>人工序列
<221>misc feature
〈223>引物""
<■>7
38
aagaagagct tctt
34
30
33
ccaggccagc c
31
gcgcctcgag tcagtccatc tcgtttctaa ccaag <210> 8
35<211〉 29
<212> DNA 〈213>人工序列
<221〉 misc_feature
〈223〉 引物
〈柳> 8
atatagatct accatgggca gccaggcca
<210〉 9
〈211> 28
<212> 廳
<213〉 人工序列
〈221> misc—feature
<223> 引物
<400〉 9
atatagatct accatggacg ggtccggg
<210> 10
<211> 24
<212〉 腿
〈213〉 人工序列
<221> misc一featu:re
<223> 引物
〈400〉 10
gtgacgtctc gttgctgcat aaac
<210> 11
<211〉 23
<212〉 DNA
<213> 人工序列
<221〉 misc_feature <223> 引物
<400〉 11
cacggcgtta aagttgttct get
23
<210〉 12
〈211〉 24
〈212〉 醒
<213〉 人工序列
<221〉 misc—feature
<223> 引物
<400〉 12
gaggttaa犯a^cgtcteig gccc
24
<210> 13
〈2H〉 22
<212> 腿
<213〉 人工序列
〈221〉 misc—feature
<223> 引物
〈400> 13
tttggcagag ggaa犯,t cg
22
〈210〉 14 <211> 31 <212> 眺〈213> 人工序列
〈221〉 <223>
misc—feature 引物
<400〉 14
acgcgtgagt ggtctggatc caaactgagt g
31
<210> <2U> <212> <213>
15 35 醒
人工序列
<221〉 misc_feature <223〉 引物
<400> 15
aagcttagct ataatgcaac cagaat&taa agcat
35
<210〉 〈211〉 <212〉 <213>
16 38 DNA
人工序列
〈221〉 misc—feature 〈223〉 引物
<400> 16
tatactcgag gcgcgccacc atgcccaaga
38
<210> <211〉 〈212〉 <213>
17 38 醒
人工序列
<221〉 raisc_feature <223〉 引物
<400〉 17
tatactcgag gcgcgccacc atggccaaga agaagagg
38
<210〉 〈211〉 <212> <213〉
18 39 DNA
人工序列
<221> misc—feature <223〉 引物
<柳> 18
atatgcggcc gcgagctcta atcgccatct tccagcagg
39
<210〉 <211> 〈212〉 <213〉
19 31 DNA
人工序列
<221〉 misc_feature <223> 引物
<■〉 19
atatggatcc atggggttga tttggatgta g
31
〈210> 20
〈21》 30
<212> 薩
<213〉 人工序列
<221〉 misc—feature
2824
200810200207. 8
<223> 引物
〈400〉 20 cagtctcgag
ggaaaggtga tctgtgtgca
〈210〉 <211〉 <212> <213>
2i 24 腿
人工序列
<221> misc—feature <223> 引物
<權(quán)〉21
atcgatacca tggccagctc cgag
<210> <211〉 〈212〉 <213〉
22 26 腿
人工序列
<221>inisc feature
<223>引物
〈400>22
tgatcattag cttccagcgc<210〉23
<211>26
<212>瞧
<213〉人工序列
〈221〉misc feature
〈223〉引物
<400〉23
gctgatgcag agtgaagagt<210>24
<211〉
〈212〉鵬
<213〉人工序列
〈221〉misc feature
〈223>引物
<400〉24
ggcatggaag catgccacat〈210〉25
<211〉25
<212>隱
<213>人工序列
<221〉misc feature
<223>引物
<400〉25
gagcatacct ggaaaatgct〈210>26
<211〉24
<212>瞧
<213>人工序列
<221>misc feature
<223>引物
〈400>26
26
26
21
25
cccaggctaa gtgccttctc taca
2權(quán)利要求
1.一種用于制備時(shí)空可調(diào)性肝臟損傷模型的構(gòu)建物組合，其特征在于，其包括(1)構(gòu)建物1，從5’至3’依次包括以下可操作性相連的元件啟動(dòng)子，LoxP序列，報(bào)告基因序列，終止子1，LoxP序列，tBid基因序列，Bax基因序列，終止子2；和(2)構(gòu)建物2，從5’至3’依次包括以下可操作性相連的元件啟動(dòng)子，突變型雌激素受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因序列，Cre重組酶基因序列，和終止子；其中所述的突變型雌激素受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域可被雌激素類似物激活進(jìn)而激活Cre重組酶活性，不被動(dòng)物體內(nèi)雌激素激活。
2. 如權(quán)利要求l所述的構(gòu)建物，其特征在于，構(gòu)建物1中，所述的報(bào)告基 因是/3-半乳糖苷酶基因。
3. 如權(quán)利要求l所述的構(gòu)建物，其特征在于，構(gòu)建物1中，所述的啟動(dòng)子 是CAG啟動(dòng)子；或構(gòu)建物2中，所述的啟動(dòng)子是白蛋白啟動(dòng)子。
4. 如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物，其特征在于，構(gòu)建物2中，在所述的Cre 重組酶基因和終止子之間，還含有一突變型雌激素受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因序 列。
5. 如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物，其特征在于，構(gòu)建物1中，所述的tBid 基因和Bax基因之間，還含有內(nèi)部核糖體插入位點(diǎn)序列。
6. —種細(xì)胞，其特征在于，所述的細(xì)胞的基因組中整合有權(quán)利要求l-5任一所述的構(gòu)建物組合。
7. 如權(quán)利要求6所述的細(xì)胞，其特征在于，所述的細(xì)胞是肝細(xì)胞。
8. —種制備轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物受精卵的方法，所述的受精卵用于制備時(shí) 空可調(diào)性肝臟損傷模型，其特征在于，所述方法包括將權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物1引入非人哺乳動(dòng)物的受精卵，獲得轉(zhuǎn)入了所 述構(gòu)建物1的受精卵；或?qū)?quán)利要求1所述的構(gòu)建物2引入非人哺乳動(dòng)物的受精卵，獲得轉(zhuǎn)入了所 述構(gòu)建物2的受精卵。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的非人哺乳動(dòng)物是小鼠。
10. —種制備時(shí)空可調(diào)性肝臟損傷模型的方法，其特征在于，所述方法包括(1)將權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物1引入非人哺乳動(dòng)物的受精卵，將轉(zhuǎn)入了 所述構(gòu)建物的受精卵移入假孕非人哺乳動(dòng)物的輸卵管內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育，生成 基因組中整合有權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物1的非人哺乳動(dòng)物；('2)將權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物2引入非人哺乳動(dòng)物的受精卵，將轉(zhuǎn)入了 所述構(gòu)建物的受精卵移入假孕非人哺乳動(dòng)物的輸卵管內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育，生成 基因組中整合有權(quán)利要求1所述的構(gòu)建物2的非人哺乳動(dòng)物；和(3)使(1)和(2)獲得的非人哺乳動(dòng)物進(jìn)行交配，獲得基因組中整合有權(quán)利要 求1所述的構(gòu)建物1和構(gòu)建物2的非人哺乳動(dòng)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物及其在制備時(shí)空可調(diào)性肝臟損傷模型中的應(yīng)用。本發(fā)明公開了一種用于制備時(shí)空可調(diào)性肝臟損傷模型的構(gòu)建物組合，包括時(shí)空可調(diào)性表達(dá)肝損傷誘導(dǎo)基因的構(gòu)建物以及表達(dá)Cre重組酶的構(gòu)建物。本發(fā)明還公開了含有所述構(gòu)建物的細(xì)胞。本發(fā)明還公開了制備時(shí)空可調(diào)性肝臟損傷模型的方法，所獲得的動(dòng)物模型可隨時(shí)地、高效地誘導(dǎo)肝損傷，為肝細(xì)胞移植、肝臟再殖的研究提供了有效的途徑。
文檔編號(hào)C12N15/85GK101684476SQ20081020020
公開日2010年3月31日 申請(qǐng)日期2008年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月22日
發(fā)明者欣 王, 曉 胡 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院