專利名稱：：抗除草劑的大蒜的制備方法及由其制備的抗除草劑的大蒜的制作方法抗除草劑的大蒜的制備方法及由其制備的抗除草劑的大蒜
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗除草劑的大蒜植物體的制備方法以及由該方法制備的抗除草劑的大蒜植物體。
背景技術(shù)：
：大蒜與洋蔥及蔥同為百合科作物，在經(jīng)過漫長的栽培以及體細(xì)胞突變后，在全世界范圍內(nèi)選擇性地分化為多個(gè)地域種(Pooler，M.R.andP.W.Simon.1993.Euphytica68:121-130)。但其遺傳變異非常有限。特別是由于不能有性繁殖，因此不能通過基因重組和雜交來培育品種。再者，作為營養(yǎng)繁殖作物，大蒜因感染病毒數(shù)量驟降，根據(jù)報(bào)道，因感染OYDV而減少的大蒜數(shù)量達(dá)到36-60%(Lotetal.，1994.PlantPathol.43:537-546)。大蒜栽培中存在的問題之一是，除草費(fèi)功夫，并且在高溫期沒有適當(dāng)?shù)某輨榱碎_發(fā)大蒜的培育方法、挖掘大蒜的功能性基因，需要開發(fā)轉(zhuǎn)化的方法。為了成功地進(jìn)行轉(zhuǎn)化需要開發(fā)出將外部基因?qū)胧[屬植物的基因組的詳細(xì)方法。根據(jù)報(bào)道，蔥屬植物轉(zhuǎn)化困難，蔥屬植物的轉(zhuǎn)化中最常用的方法是利用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)禾卩基因槍法。Dommisse等(Dommisseetal.,1990.PlantScience69:249-257)利用根癌農(nóng)桿菌(11種)、懸鉤子土壤桿菌(A.rubi)(1種)、發(fā)根土壤桿菌(A.rhizogenes)(6種)從洋蔥中確認(rèn)了根瘤反應(yīng)和冠瘦瘤生產(chǎn)，因此提示了轉(zhuǎn)化的可能性。最近Eady(Eady，C.C.1995.NewZealandJ.ofCropandHorticulturalScience23:239-250，Eadyetal.，2000.PlantCellRep.19:376-381)禾口Zheng(Zhengetal,,2001.MolecularBreeding7，101-115)確認(rèn)了利用農(nóng)桿菌在洋蔥的合子胚和未成熟胚上進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并且gusA基因可以穩(wěn)定表達(dá)，而Zheng利用墳丘形洋蔥即冬蔥(shallot)實(shí)現(xiàn)了1.95。/。的轉(zhuǎn)化率。報(bào)道轉(zhuǎn)化大蒜的事例已有三件:kondo等(KondoT，H.Hasegawa,andM.Suzuki.2000.PlantCellRep.19(10):989-993)對從原生質(zhì)體中誘導(dǎo)出的愈傷組織進(jìn)行農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化，確認(rèn)了gusA的表達(dá);Park等(Park，M.Y.2000.PhDDiss.,SeoulNationalUniversity)利用基因槍法導(dǎo)入了對除草劑具有抗性的乙酸乳酸合成酶基因；Zheng等(Zhengetal.，2001.MolecularBreeding7,101-115)利用根癌農(nóng)桿菌導(dǎo)入BT抗性基因，但是轉(zhuǎn)化效率不高。到現(xiàn)在為止，己開發(fā)的除草劑抗性基因有bar、aroA、bxn(Powlesetal.，1997.In:sparksDL(ed)AdvAgron58:57-93)基因。目前，己從吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)中分離出對除草劑具有抗性的bar基因，并用于開發(fā)(Thompsonetal.，1987EMBOJ.6(9):25:2516-2523)除草劑抗性作物。據(jù)報(bào)道，在世界范圍內(nèi)用于商業(yè)目的的抗除草劑作物有大豆、玉米、棉花、油菜等，占世界轉(zhuǎn)化作物栽培面積(1億200萬公頃)的68%(JamesC.2006.ISAAAbriefs35-2006.www.isaaa.org)，且以后還會急劇增加。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是為了滿足上述的要求而提出的。本發(fā)明利用農(nóng)桿菌把除草劑抗性基因?qū)氲酱笏饫?，以制備抗除草劑的大蒜。為了解決上述課題，本發(fā)明提供了制備抗除草劑的大蒜植物體的方法以及用這種方法制備的抗除草劑的大蒜植物體。具體方法如下(1)在添加有0.5-1.5mg/L的2，4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)和0.05-0.25mg/L的卩引哚基乙酸(IAA)的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)7-9周，以誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的階段；(2)將上述經(jīng)過誘導(dǎo)產(chǎn)生的大蒜愈傷組織和具有重組植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌在共同培養(yǎng)基上共同培養(yǎng)，以進(jìn)行轉(zhuǎn)化的階段，所述重組植物表達(dá)載體中插入有抗除草劑基因；(3)將上述經(jīng)過共同培養(yǎng)的大蒜細(xì)胞接種到添加有抗生素的選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)11-13周，以進(jìn)行篩選的階段；以及(4)將上述經(jīng)過篩選的大蒜細(xì)胞接種到再分化培養(yǎng)基上，以進(jìn)行再分化的階段。根據(jù)本發(fā)明，可以提供抗除草劑的大蒜以解決大蒜栽培中存在的除草問題，從而提高農(nóng)民的收獲。圖1是轉(zhuǎn)化載體pBmP35sGFPHYR的示意圖。圖2是轉(zhuǎn)化的大蒜組織表達(dá)GFP的圖片(A:GFP的瞬時(shí)表達(dá)；B，C:GFP在愈傷組織12周后的表達(dá))。圖3是轉(zhuǎn)化的大蒜的再分化植株。圖4是確認(rèn)轉(zhuǎn)化體中潮霉素基因的PCR分析圖(泳道M:lkbDNA梯度分子量標(biāo)記；泳道P:質(zhì)粒pBmP35sGFPHYR;泳道N:沒有轉(zhuǎn)化的個(gè)體；泳道1-13:轉(zhuǎn)化的個(gè)體)。圖5是使用限制酶//^^///對轉(zhuǎn)化的植物體進(jìn)行DNA分析的結(jié)果圖(泳道N:沒有轉(zhuǎn)化的個(gè)體；泳道1-13:轉(zhuǎn)化的個(gè)體)。圖6是在轉(zhuǎn)化的植物體中GFP表達(dá)的圖(A:轉(zhuǎn)化的植物體；B:沒有轉(zhuǎn)化的植物體的幼胚；C:轉(zhuǎn)化的植物體的幼胚)。圖7是對噴施0.5%的草銨磷表現(xiàn)出的除草劑抗性結(jié)果(A:沒有轉(zhuǎn)化的個(gè)體；B:轉(zhuǎn)化的植物體)。具體實(shí)施方式、為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了采用4個(gè)如下階段制備抗除草劑的大蒜植物體的方法(1)在添加有0.5-1.5mg/L的2,4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)和0.05-0.25mg/L的IAA的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)7-9周，以誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的階段；(2)將上述經(jīng)過誘導(dǎo)產(chǎn)生的大蒜愈傷組織和具有重組植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌在共同培養(yǎng)基上共同培養(yǎng)，以進(jìn)行轉(zhuǎn)化的階段，所述重組植物表達(dá)載體中插入有抗除草劑基因；(3)將上述經(jīng)過共同培養(yǎng)的大蒜細(xì)胞接種到添加有抗生素的選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)11-13周，以進(jìn)行篩選的階段；以及(4)將上述經(jīng)過篩選的大蒜細(xì)胞接種到再分化培養(yǎng)基上，以進(jìn)行再分化的階段。首先，為了得到植物體細(xì)胞胚的愈傷組織，把大蒜的根接種到添加有植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的MS(Murashige&Skoog,MS)培養(yǎng)基上進(jìn)行植物體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)。這時(shí)的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)有2，4-D和IAA，如在本發(fā)明的誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的第(1)階段中，最好在MS培養(yǎng)基中添加0.5-2mg/L的2，4-D和0.05-0.25mg/L的IAA，其中，2，4-D和IAA的最適的濃度分別是lmg/L和0.2mg/。在所述的第(2)階段中，植物表達(dá)載體是插入有抗除草劑基因的載體，其中抗除草劑基因可以是bar、aroA、bxn等等，優(yōu)選為bar基因。導(dǎo)入bar基因的大蒜可以通過草銨磷篩選。上述植物表達(dá)載體最好是圖1中的pBmP35sGFPHYR載體。上述載體中插入了連接有綠色熒光蛋白(GFP)基因和潮霉素基因的bar基因，該bar基因連接Pnos啟動子和Tnos終止子。在所述的(2)階段中，所述共同培養(yǎng)的時(shí)間可以是5-7天，優(yōu)選為6天。在這里所講的共同培養(yǎng)的時(shí)間是指把大蒜愈傷組織和具有重組植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行共同培養(yǎng)以將載體導(dǎo)入到大蒜愈傷組織中的時(shí)間。在所述的(2)階段中，所述共同培養(yǎng)的培養(yǎng)基是添加有0.5-2mM的2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)和150-250mg/L的半胱氨酸的1/2楚氏(chu)培養(yǎng)基，或者是添加有0.5-2mM的MES和150-250mg/L的半胱氨酸以及50-150mg/L的二硫蘇糖醇(DTT)的l/2chu培養(yǎng)基；其中，優(yōu)選的培養(yǎng)基是添加有ImM的MES和200mg/L的半胱氨酸的1/2chu培養(yǎng)基或者是添加有ImM的MES和200mg/L的半胱氨酸以及100mg/L的DTT的1/2chu的培養(yǎng)基。最優(yōu)選的培養(yǎng)基是添加有l(wèi)mM的MES和200mg/L的半胱氨酸的1/2chu培養(yǎng)基。在所述的第(3)階段中，在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)大蒜細(xì)胞11-13周，其中，最優(yōu)選為12周。所使用的抗生素可以是用于植物重組表達(dá)載體抗性基因的潮霉素和卡那霉素等。在所述的第(4)階段中，所使用的再分化培養(yǎng)基中添加有4-6mg/L的激動素和0.5-2mg/L的萘乙酸(NAA);其中，最優(yōu)選添加有5mg/L的激動素和lmg/L的NAA。本發(fā)明還提供了上述方法制備的抗除草劑的大蒜植物體。因?qū)氲目钩輨┗虿煌笏鈱τ诓煌某輨┚哂邢鄳?yīng)的抗性。比如，當(dāng)導(dǎo)入抗除草劑基因?yàn)閎ar時(shí)，則對于除草劑草銨磷具有抗性。因此，用本發(fā)明的方法制備的抗除草劑的大蒜有效地解決了大蒜栽培中的除草問題。以下利用實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明。但是，實(shí)施例的目的只是用于說明本發(fā)明，本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。實(shí)驗(yàn)方法1、在培養(yǎng)的植物體中誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織以及對植物體進(jìn)行再分化產(chǎn)生植物體是通過誘導(dǎo)培養(yǎng)在培養(yǎng)基中的大蒜的根所產(chǎn)生的愈傷組織而實(shí)現(xiàn)的。為了從根組織中誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，選擇適當(dāng)濃度的2，4-D、IAA和NAA的組合(表l)，培養(yǎng)8周后，從根組織中誘導(dǎo)出愈傷組織。且為了從愈傷組織再分化成植物體，可以選擇適當(dāng)?shù)募铀睾蚇AA的組合(表3)。2、轉(zhuǎn)化以及篩選轉(zhuǎn)化載體是連接有綠色熒光蛋白(GFP)基因和潮霉素基因的bar基因插入在pBm43GW中所形成的pBmP35sGFPHYR載體，所述bar基因連接Pnos啟動子和Tnos終止子(圖1)。EHA101是農(nóng)桿菌菌株，且在LB培養(yǎng)基(10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、5g/L的NaCl)上培養(yǎng)2天后，轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，將在600nm處的吸光值調(diào)整到1.0。將愈傷組織接種到添加有IOO)liM的乙酰丁香酮的共同培養(yǎng)基上培養(yǎng)10分鐘以上。為了觀察不同條件的共同培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)化效率的影響，如表2所示，使用了N6(Chuetal.，1975.Sci.Sinica18:659-668)、1/2N6、MS(MurashigeT，RSkoog.1962.PhysiolPlant15:473-479)、B5(Gamborgetal.,1968.Exp.CellRes.18:434-437)等培養(yǎng)基。且為了觀察硫氧化物的影響，在各種培養(yǎng)基中添加以下物質(zhì)以觀察組合的效果，如表2所示，在MS培養(yǎng)基中添加MES(lmM)、半胱氨酸(200mg/L)和DTT(100mg/L);在N6培養(yǎng)基中添加MES(lmM)、半胱氨酸(200mg/L)和DTT(100mg/L);在B5培養(yǎng)基中添加MES(lmM)、半胱氨酸(200mg/L)和DTT(100mg/L);在1/2N6培養(yǎng)基中添加MES(lmM)、半胱氨酸(200mg/L)、DTT(100mg/L)。共同培養(yǎng)一般是在22。C下暗培養(yǎng)3-6天。在添加25mg/L的潮霉素、100mg/L的萬古霉素、200mg/L的頭噻孢肟、lmg/L的2，4-D和0.2mg/L的IAA的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)12周。為了有效篩選轉(zhuǎn)化的組織，在顯微鏡下篩選穩(wěn)定表達(dá)GFP的組織。再分化的植物體在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后通過馴化移栽到溫室。3、轉(zhuǎn)化體的分析取0.5g植物體的葉片，用DNAQIAamp試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)提取植物體的DNA，然后以潮霉素基因的5'端啟動子5'陽GCTGCGCCGATGGTTTCTACAA-3，(如SEQIDNo.:l)和3'端終止子5'-GCGCGTCTGCTGCTCCATACAA-3，(如SEQIDNo.:2)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增所需的潮霉素基因片段。PCR條件包括在95t:下加熱2分鐘，然后在以下條件下進(jìn)行30個(gè)循環(huán)在92。C下加熱30秒，62。C下加熱30秒，以及72。C下加熱60秒。通過在顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)來篩選在共同培養(yǎng)期間和繼代培養(yǎng)期間轉(zhuǎn)化的愈傷組織和轉(zhuǎn)化的植物體。在馴化10周左右后，在植物體上噴施0.5%的草銨磷來進(jìn)行生物鑒定，并且對轉(zhuǎn)化的大蒜還進(jìn)行了DNA分析。首先提取大蒜的基因組DNA，提取方法是取溫室里的大蒜植物體的葉子2-3g，以Dellaporta等(Dellaportaetal.，1983.AplantDNAminipreparation:version2.PlantMolecularBiologyReporter1,19-22)的方法提取DNA，然后用Nanodr叩分光光度計(jì)ND-1000)測定它的濃度，接著把25昭/L的各種DNA樣品用100單位的///^////進(jìn)行消化，然后把消化的DNA在1%濃度的瓊脂糖凝膠中電泳17個(gè)小時(shí)(0.5倍的TBE，25V)。DNA通過毛細(xì)管作用轉(zhuǎn)移到尼龍HyboncTM-W膜(AmershamLifescience,英國)上以進(jìn)行雜交。使用RedyprimellRandomPrimeLabelingSystem(AmershamLifescience,英國)對通過PCR從30ng的bar基因中得到的產(chǎn)物DNA進(jìn)行標(biāo)記。雜交和印跡的洗滌按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。為了識別標(biāo)志，使用了BAS-1800IIBio-Imaging分析儀(FUJIFILM)。實(shí)施例1、從培養(yǎng)的植物體的根組織中誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織以及對植物體進(jìn)行再分化從培養(yǎng)的大蒜植物體的根組織誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，在MS培養(yǎng)基中添加2，4-D和IAA比添加2,4-D和2ip(異戊烯基腺苷)誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的誘導(dǎo)率高83%。添加的2，4-D和IAA的最適的濃度分別是lmg/L和0.2mg/L(表1)。如果2,4-D和IAA的濃度偏高時(shí)，將影響植物體的再分化。在添加5mg/L激動素和lmg/LNAA的培養(yǎng)基中進(jìn)行植物體的再分化時(shí)，再分化率達(dá)到51%,但是，只添加激動素時(shí)植物體不能進(jìn)行再分化(表3)。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)化以及篩選研究表明在大蒜基因轉(zhuǎn)化中，農(nóng)桿菌和愈傷組織共同培養(yǎng)6天時(shí)愈傷組織的GFP表達(dá)比較多；當(dāng)在添加有ImM的MES和200mg/L的半胱氨酸的1/2N6培養(yǎng)基中，或在添加有l(wèi)mM的MES和200mg/L的半胱氨酸以及100mg/L的DTT的1/2N6培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)培養(yǎng)6天左右時(shí)，可以提高轉(zhuǎn)換效率；其中，最好的組合是在1/2N6培養(yǎng)基中添加lmM的MES和200mg/L的半胱氨酸(表2)。在這種條件下比別的方法更有效地提高了轉(zhuǎn)化的效率。轉(zhuǎn)化體的篩選是通過把細(xì)胞體接種到添加有25mg/L的潮霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行的；培養(yǎng)12周后，將在顯微鏡下鑒定為表達(dá)GFP的組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)(圖2和圖3)。以前是以gusA為標(biāo)記基因，在觀察組織后，被觀察的組織不能被再利用；但是，本發(fā)明的方法是以GFP為標(biāo)記基因，因此可以隨時(shí)觀察GFP的表達(dá)部位，且可以對篩選出的表達(dá)GFP的愈傷組織的部位進(jìn)行培養(yǎng)，所以對轉(zhuǎn)化體的篩選有更好的效果。當(dāng)表達(dá)GFP的愈傷組織大小達(dá)到3mm時(shí)，接種到再分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)8周，以對植物體進(jìn)行再分化。把再分化的植物體接種到MS培養(yǎng)基上進(jìn)行4周的馴化過程，然后移栽到溫室栽培。實(shí)施例3、對轉(zhuǎn)化體的分析為了篩選轉(zhuǎn)化的組織，共同培養(yǎng)6天后在顯微鏡下觀察瞬時(shí)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在再分化植物體的根，莖，葉中也顯著表達(dá)GFP(圖6)。采用以潮霉素基因?yàn)橐镞M(jìn)行PCR的方法分析轉(zhuǎn)化體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的植物體中擴(kuò)增出大量的895bp大小的DNA片段，而沒有轉(zhuǎn)化的植物體中沒有觀察到擴(kuò)增的DNA片段(圖4)。此外，用限制酶酶切轉(zhuǎn)化體的基因組DNA，進(jìn)行DNA雜交，分析出除草劑抗性基因是否轉(zhuǎn)到植物體中(圖5)。為了確認(rèn)除草劑抗性基因是否轉(zhuǎn)到植物體中，還進(jìn)行了生物鑒定。把0.5%的草銨磷噴施到溫室栽培的大蒜植物體上，6天后觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的植物體正常，而沒有轉(zhuǎn)化的植物體已經(jīng)死亡(圖7)。表l、大蒜的愈傷組織的形成率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>1)形成的愈傷組織的數(shù)目/取的根組織的數(shù)目表2、在不同的共同培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)表達(dá)的GFP數(shù)目<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>l)MES:lmM;半胱氨酸200mg/L;DTT:100mg/L表3、植物體的愈傷組織的再分化率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>1)植物體的再分化的愈傷組織的數(shù)目/選取的愈傷組織的數(shù)目序列表<110>韓國農(nóng)村振興廳<120>抗除草劑的大蒜的制備方法及由其制備的抗除草劑的大蒜<160>2<170>Kopatentln1.71<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1gctgcgccgatggtttctacaa<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>2gcgcgtctgctgctccatacaa權(quán)利要求1、一種抗除草劑的大蒜植物體的制備方法，其特征在于，該方法包括以下階段(1)在添加有0.5-1.5mg/L的2，4-二氯苯氧基乙酸和0.05-0.25mg/L的吲哚基乙酸的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)7-9周，以誘導(dǎo)產(chǎn)生大蒜愈傷組織的階段；(2)將上述經(jīng)過誘導(dǎo)產(chǎn)生的大蒜愈傷組織和具有重組植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌在共同培養(yǎng)基上共同培養(yǎng)，以進(jìn)行轉(zhuǎn)化的階段，所述重組植物表達(dá)載體中插入有抗除草劑基因；(3)將上述經(jīng)過共同培養(yǎng)的大蒜細(xì)胞接種到添加有抗生素的選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)11-13周，以進(jìn)行篩選的階段；以及(4)將上述經(jīng)過篩選的大蒜細(xì)胞接種到再分化培養(yǎng)基上，以進(jìn)行再分化的階段。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在所述第(2)階段中，所述抗除草劑基因?yàn)閎ar基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述植物表達(dá)載體為圖1中的pBmP35sGFPHYR載體。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在所述第(1)階段中，所述MS培養(yǎng)基中添加有l(wèi)mg/L的2，4-二氯苯氧基乙酸和0.2mg/L的吲哚基乙酸。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在所述第(2)階段中，所述共同培養(yǎng)的時(shí)間為5-7天。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在所述第(2)階段中，所述共同培養(yǎng)基為添加有0.5-2mM的2-(N-嗎啉代)乙磺酸和150-250mg/L的半胱氨酸的1/2楚氏培養(yǎng)基，或者為添加有0.5-2mM的2-(N-嗎啉代)乙磺酸、150-250mg/L的半胱氨酸以及50-150mg/L的二硫蘇糖醇的1/2楚氏培養(yǎng)基。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，在所述第(2)階段中，所述共同培養(yǎng)基為添加有l(wèi)mM的2-(N-嗎啉代)乙磺酸和200mg/L的半胱氨酸的1/2楚氏培養(yǎng)基，或者為添加有l(wèi)mM的2-(N-嗎啉代)乙磺酸、200mg/L的半胱氨酸以及100mg/L的二硫蘇糖醇的1/2楚氏培養(yǎng)基。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，在所述第(2)階段中，所述共同培養(yǎng)基為添加有l(wèi)mM的2-(N-嗎啉代)乙磺酸和200mg/L的半胱氨酸的1/2楚氏培養(yǎng)基。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在所述第(3)階段中，在所述添加有抗生素的選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)12周。10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在所述第(4)階段中，在所述再分化培養(yǎng)基中添加有4-6mg/L的激動素和0.5-2mg/L的萘乙酸。11、根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，在所述第(4)階段中，在所述再分化培養(yǎng)基中添加有5mg/L的激動素和lmg/L的萘乙酸。12、一種抗除草劑的大蒜植物體，其特征在于，該抗除草劑的大蒜植物體是根據(jù)權(quán)利要求1-11中的任意一項(xiàng)所述的方法制備的。全文摘要本發(fā)明是關(guān)于抗除草劑的大蒜植物體的制備方法以及由該方法制備的抗除草劑的大蒜植物體。具體地說，所述抗除草劑的大蒜植物體的制備方法包括以下階段(1)在添加有0.5-1.5mg/L的2，4-二氯苯氧基乙酸和0.05-0.25mg/L的吲哚基乙酸的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)7-9周，以誘導(dǎo)產(chǎn)生大蒜愈傷組織的階段；(2)將上述經(jīng)過誘導(dǎo)產(chǎn)生的大蒜愈傷組織和具有重組植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌在共同培養(yǎng)基上共同培養(yǎng)，以進(jìn)行轉(zhuǎn)化的階段，所述重組植物表達(dá)載體中插入有抗除草劑基因；(3)將上述經(jīng)過共同培養(yǎng)的大蒜細(xì)胞接種到添加有抗生素的選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)11-13周，以進(jìn)行篩選的階段；以及(4)將上述經(jīng)過選擇的大蒜細(xì)胞接種到再分化培養(yǎng)基上，以進(jìn)行再分化的階段。文檔編號C12N15/29GK101451139SQ200810178430公開日2009年6月10日申請日期2008年11月26日優(yōu)先權(quán)日2007年12月3日發(fā)明者安栗均,尹武卿,郭正浩,高官達(dá)申請人:韓國農(nóng)村振興廳