專利名稱：在生物樣品中診斷由非傳統(tǒng)性可傳播性因子導(dǎo)致的可傳播性亞急性海綿狀腦病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過檢測PrP-res診斷由非傳統(tǒng)性可傳播性因子(UTA)毒株所引起的可傳播性亞急性海綿狀腦病(TSSE)的方法，也涉及它在生物樣品中對不同的非傳統(tǒng)性可傳播性因子(UTA)毒株進行鑒別診斷的用途。
可傳播性亞急性海綿狀腦病(TSSEs)是由非傳統(tǒng)性可傳遞因子(UTAs)即朊病毒所引起的，迄今為止，朊病毒的準確性質(zhì)尚難確定?；旧峡蓚鞑バ詠喖毙院＞d狀腦病可包括人克-雅病(CJD)，綿羊和山羊的瘙癢病，牛海綿狀腦病(BSE)。其他腦病已經(jīng)被證明存在于貓科動物、水貂、以及某些野生動物如鹿或駝鹿中。
這些疾病總是致命的，并且現(xiàn)在無有效的治療方法。
在可傳播性亞急性海綿狀腦病中，宿主蛋白質(zhì)PrP(或朊病毒蛋白)以異常形式(PrP-res)主要蓄積在中樞神經(jīng)系統(tǒng)。PrP-res與感染性共純化，它的蓄積出現(xiàn)于組織學(xué)損害之前。體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，PrP-res對神經(jīng)細胞的培養(yǎng)具有毒性作用。
朊病毒蛋白的二種同工型具有相同的氨基酸序列(見


圖1)，但它們的二級結(jié)構(gòu)不同。PrP-res具有更多的β-折疊片層，而正常PrP(PrP-sen)含有更多的α-螺旋。
一般可以利用兩種生化性質(zhì)識別這二種同工型。
—PrP-res對蛋白酶有部分抗性，蛋白酶K可引起其N-末端的裂解。使用蛋白酶K處理之后，PrP-res通常根據(jù)其雙糖基化形式的表觀分子量而被稱作PrP27-30。一般公認對于傳統(tǒng)毒株，切割位點位于89和90氨基酸之間(Prusiner等，Cell，1984)。
-PrP-res不溶于非離子去污劑，例如Triton X100和Triton 114。
正常形式的朊病毒蛋白(PrP-sen)原則上可被蛋白酶完全降解，而且完全溶于非離子去污劑。
倉鼠、人、牛及羊的PrP-sen多肽序列如
圖1所示。它們都特別地具有一種八肽基序(P(H/Q)GGG(-/T)WGQ)，根據(jù)物種的不同，分別重復(fù)出現(xiàn)4或5次。八肽基序重復(fù)對應(yīng)于PrP-sen的第51位至91位氨基酸(按人的PrP序列編號)(B.Oesch等，1991)。
為了檢測感染性因子的存在，最新的方法是通過利用其對蛋白酶的部分抗性，根據(jù)對連接到感染性因子的異常PrP(PrP-res)進行選擇性檢測而進行的。
以下方法可能用于識別—Western印跡它基于對組織提取物中的PrP-res進行免疫學(xué)檢測。在用蛋白酶處理提取物以破壞朊病毒蛋白的正常同工型(PrP-sen)之后，電泳分離提取物中的蛋白質(zhì)，將其轉(zhuǎn)移到聚合物膜上，使用能夠識別朊病毒蛋白的特異抗體進行檢測(Schaller O.等，1999)。
—ELISA類試驗也需使用蛋白酶處理提取物。
在這些不同的試驗中，需使用蛋白酶處理組織提取物的試驗，可以提及—Serban等人(Neurology，1990，40，110)描述的方法，他發(fā)展了檢測PrP-res的方法，包括在硝酸纖維素膜上固定蛋白質(zhì)，繼而用蛋白酶消化，變性及用單克隆抗體進行免疫檢測。
—Oesch等人(Biochemistry，1994，33，5926-5931)描述的方法，他提出對PrP-res進行定量，用免疫過濾法(ELIFA或酶聯(lián)免疫過濾試驗)純化PrP-res。
—Gratwohl等人1997年描述的方法，他們提出使用ELISA型試驗。用蛋白酶K處理樣品之后，用離心沉淀法純化PrP-res，將純化的蛋白吸附在微量滴定板上，使用兔多克隆抗體進行檢測。
—Safar等人1998年描述的方法，他不使用蛋白酶K處理樣品，但基于其是否遭受變性處理比較了固定在固相支持物上的PrP-res的免疫反應(yīng)性。
總的來說，上述這些各種不同的方法具有缺乏敏感性和因此造成假陰性的缺點。
其它方法建議使用變性物質(zhì)處理樣品(Oesch等，1994和1999；WO 00/22438，加利福尼亞大學(xué)制劑)用蛋白酶K有限處理樣品(WO 00/29850，Wallac Oy等)和用金屬肽酶處理樣品(WO 00/22438)，使隱蔽的抗原位點暴露，這些位點可以用單克隆抗體3F4進行檢測，它識別朊病毒蛋白109-112區(qū)域(WO 00/29850或WO 00/22438)。
Wallac Oy等在WO 00/2985描述的方法的主要缺點是缺乏特異性，特別是由于推薦條件下不能完全清除PrP-sen而導(dǎo)致檢測方法缺乏特異性。而WO 00/22438中描述的方法，使用的是加州大學(xué)試劑，由于檢測抗體3F4(WO 00/22438)僅能結(jié)合蛋白上的一個基序而缺乏敏感性。
本項專利申請人最近提供PrP-res的定量檢測方法。此種方法使用了可明顯提高檢測敏感度的純化步驟，代表了醫(yī)學(xué)監(jiān)控和在屠宰場中的分析PrP-res技術(shù)的巨大進步。該方法特別描述于PCT國際專利申請書WO 99/41280和歐洲委員會第XXIV次董事會全體會議的初步報告中(消費者政策和消費者健康保護；http//europa.eu.int/comm/dg24/health/)。
然而，由于需要特別可靠的可傳播性亞急性海綿狀腦病的診斷實驗，本申請者繼續(xù)進行了研究。
為了創(chuàng)立檢測試驗，特別建立了以下幾個方面的標準(i)敏感性也就是要求具有能夠正確鑒定非感染動物的能力。
(ii)特異性也就是要求具有能夠正確鑒定表現(xiàn)出臨床癥狀的感染動物的能力。
(iii)盡可能低的檢測下限也就是能夠允許對少量的PrP-res進行檢測(在臨床癥狀出現(xiàn)之前檢測PrP-res)，和(iv)可重復(fù)性待分析生物樣品必須在能夠保留所有或一些PrP-res專有的八肽基序的條件下進行處理。
我們特別發(fā)現(xiàn)要有效地滿足上述(i)-(iv)四個條件，必需精確地定義處理待分析樣品的條件，在定義條件下可以完全去除樣品中的PrP-sen，而同時能夠特異捕捉PrP-res。
本發(fā)明一個主題是通過檢測生物樣品中的PrP-res，診斷由非傳統(tǒng)性可傳播性因子毒株引起的可傳播性亞急性海綿狀腦病或朊病毒疾病的方法(方法A)，其特征在于該方法包括(1) 用至少一種蛋白酶K處理所說的樣品，使得可以完全降解PrP-sen，同時保留PrP-res的全部或一些八肽基序重復(fù)，而無論何種非傳統(tǒng)性可傳播性因子毒株；所說的蛋白酶K處理優(yōu)選在下列條件下完成蛋白酶K濃度在30μg/ml-200μg/ml之間，37℃處理10％的組織勻漿物(生物樣品在適宜的緩沖液中以勻漿物的形式存在)10分鐘，或在等同于用蛋白酶K濃度30μg/ml-200μg/ml，37℃處理10％的組織勻漿物10分鐘的反應(yīng)濃度和時間的反應(yīng)條件下完成。(2) 將上述的處理過的樣品與上述八肽基序的配體進行接觸，特別是與針對八肽基序重復(fù)的抗體接觸，以及(3) 檢測八肽基序重復(fù)/配體復(fù)合物的可能的存在。
根據(jù)本方法的有利的具體方案，用上述濃度的所說蛋白酶K處理樣品，時間為30秒至2小時，溫度低于80℃，優(yōu)選在37℃用上述濃度處理10-30分鐘。甚至更優(yōu)選蛋白酶K濃度為30μg/ml-200μg/ml，處理10％的組織勻漿物(終濃度)10分鐘；或者蛋白酶K濃度為10μg/ml-70μg/ml，處理10％的組織勻漿物(終濃度)30分鐘；或蛋白酶K濃度為25μg/ml-175μg/ml，處理組織勻漿物的濃度為25％(終濃度)30分鐘。
需要注意的是某些參數(shù)是相互緊密關(guān)聯(lián)的。蛋白酶K的濃度直接依賴于樣品的處理時間(孵育時間)，可以認為，例如在37℃，用30μg/ml-200μg/ml的蛋白酶K孵育10％的組織勻漿10分鐘等價于用10μg/ml-70μg/ml蛋白酶K孵育10％的組織勻漿30分鐘。例如用25μg/ml蛋白酶K孵育30分鐘等價于用75μg/ml蛋白酶K孵育10分鐘。
無論蛋白酶K濃度和處理時間如何，處理過的樣品應(yīng)該不再含有未降解的PrP-sen，而假如存在PrP-res，則PrP-res保留了全部或一些八肽基序。
其它參數(shù)也在較小程度上影響蛋白酶K的活性濃度的確定，其特別包括溶解所說的蛋白酶K的緩沖液。當(dāng)?shù)鞍酌窴溶解于樣品勻漿緩沖液時，蛋白酶K的最小濃度根據(jù)所使用的樣品勻漿緩沖液的不同而在上述指明的濃度范圍之內(nèi)改變- 在葡萄糖或胍類緩沖液(或它們的鹽)中，蛋白酶K的優(yōu)選最小濃度為25μg/ml(孵育30分鐘)或75μg/ml(孵育10分鐘)；- 對于PBS緩沖液，蛋白酶K的優(yōu)選最小濃度為50μg/ml(孵育30分鐘)或150μg/ml(孵育10分鐘)。
有利的是，蛋白酶K也可在不同于勻漿緩沖液的溶液中使用，這種溶液有利地包括至少一種表面活性劑和/或至少一種離液劑和/或至少一種鹽。
同樣有利的是，在用蛋白酶K處理(或孵育)完樣品后，所獲得的懸浮液可以有利地在國際申請99/41280所定義的條件下進行處理，即- 加入國際申請99/41280所定義的緩沖液B至懸浮液中，特別是C3-C6醇和醇的混合物，其平均理論介電常數(shù)在10-25之間。- 離心所獲得的懸浮液，和- 在上述國際申請99/41280所定義的條件下，用包括至少一種表面活性劑和/或至少一種離液劑的緩沖溶液溶解沉淀物。
這樣的試驗具有的優(yōu)勢是它特別適宜用于在同一宿主中對不同的非傳統(tǒng)性可傳播性因子毒株所引起的可傳播性亞急性海綿狀腦病進行鑒別診斷，特別是比較牛海綿狀腦病毒株和綿羊瘙癢病傳統(tǒng)毒株的鑒別診斷。
例如，通過分析PrP-res電泳圖譜，有報道表明在英國，牛海綿狀腦病已經(jīng)感染人類，PrP-res電泳圖譜根據(jù)非傳統(tǒng)性可傳播性因子毒株的不同而在遷移率上有差異性；在發(fā)展出克-雅病新變種(vCJD)的患者中發(fā)現(xiàn)了特征性圖譜(4型)，其看來與通過被牛海綿狀腦病因子感染的牛而進入人類食物的過程有關(guān)(Collinge等，Nature，1996)。另外，在被牛海綿狀腦病因子感染的短尾猿(Lasmezas等，1996)和可能被這種因子感染的貓(Priola等，Nature Med.，1996)中也發(fā)現(xiàn)了相似的圖譜。
然而，這是有深遠影響的方法，如果期望獲得重復(fù)性結(jié)果，就需要謹慎實施；關(guān)于各種PrP-res的分類和這種方法的用途，它可能會成為爭論的要素(Parchi等，Nature，1997)。
對于綿羊被牛海綿狀腦病因子所感染也有強烈的質(zhì)疑(Butler，Nature，1998)。事實上，這些動物對這種因子是敏感的，盡管在綿羊中也存在另一種可傳播性亞急性海綿狀腦病，稱做羊瘙癢病。羊瘙癢病和牛海綿狀腦病具有接近的和難以區(qū)別的臨床及組織學(xué)特征。唯一的鑒別羊瘙癢病因子和牛海綿狀腦病因子的診斷參考方法是將感染因子分別接種于小鼠，研究其損傷表現(xiàn)，這需等待大約2年。在英國目前僅對9例綿羊進行了這樣的實驗，而綿羊群體多達千萬頭。
人們首先努力設(shè)法分辨樣品中不同的非傳統(tǒng)性可傳播性因子毒株。1999年，Kuczius T.等認為使用糖分型(glycotyping)技術(shù)觀察到的在不同的可傳播性亞急性海綿狀腦病毒株(瘙癢病、牛海綿狀腦病和克-雅病)的差異性，并不足以分辨每個毒株，他們使用了能夠更清楚地識別各種朊病毒毒株的PrP-res生化和生物標志物。他們使用以下分析參數(shù)對蛋白酶K的長期抗性，PrP-res的分子量，PrP-res的拓撲結(jié)構(gòu)和沉積量。獲得的結(jié)果表明羊瘙癢病和牛海綿狀腦病各種毒株的PrP-res對蛋白酶K的長期抗性有顯著差異。對蛋白酶K的抗性根據(jù)羊瘙癢病毒株的不同而改變低抗性株有Chandler株，中等抗性有22A株；相對穩(wěn)定株有87V株。在同樣條件下，牛海綿狀腦病毒株表現(xiàn)為中等抗性。雖然糖分型法不能分辨羊癢病87V毒株和牛海綿狀腦病毒株，但當(dāng)用蛋白酶K長期處理后，這兩類毒株就可以明確分辨出來。然而，并沒有充分可靠的、并可以大規(guī)模地使用和在野外使用的操作方案。
在此背景下，在使用生物樣品——例如組織樣品——時，擁有可靠、敏感的檢測PrP-res的方法就顯得非常重要，并且該方法同時還要允許進行鑒別診斷、相對廉價并容易執(zhí)行。
因此，本發(fā)明的主題也是通過檢測與各種非傳統(tǒng)性可傳播性因子毒株有關(guān)的PrP-res在生物樣品中鑒別診斷由非傳統(tǒng)性可傳播性因子毒株引起的可傳播性亞急性海綿狀腦病的方法(方法B)，其特征在于該方法包括(a)按照上述定義過的診斷非傳統(tǒng)性可傳播性因子毒株的方法(方法A)的步驟(1)到(3)，在所說的樣品的第一部分中檢測PrP-res，然后(b)對在步驟(a)中檢測出存在八肽基序重復(fù)/配體復(fù)合物的每個樣品- 用至少一種蛋白酶K(PK)處理上述樣品的第二部分，以使得對于與至少一個感興趣的毒株——特別是牛海綿狀腦病毒株——有關(guān)的PrP-res來說，大多數(shù)八肽基序重復(fù)被除去，并在上述條件下，使得與其他的非傳統(tǒng)性可傳播性因子毒株有關(guān)的所有PrP-res保留了所有或一些所述的八肽基序重復(fù)；上述的處理優(yōu)選在與那些在步驟(1)或(a)中定義過的條件相同的條件下完成，但是蛋白酶K的濃度要比在步驟(1)或(a)中使用的濃度高。- 將上述處理過的樣品的上述第二部分與能夠特異地識別所述八肽基序重復(fù)的配體進行接觸，和- 檢測八肽基序重復(fù)/配體復(fù)合物的可能的存在。
本發(fā)明的主題也是在認為包含PrP-res的生物樣品(檢測試驗可以通過任何方法完成)中，對由非傳統(tǒng)性可傳播性因子毒株引起的可傳播性亞急性海綿狀腦病進行鑒別診斷的方法(方法B的變種)，其特征在于該方法包括對每個已經(jīng)檢測出存在PrP-res的樣品- 依照上面定義過的步驟(b)處理所說的生物樣品的另外一個部分，- 將上述處理過的樣品的上述第二部分與能夠特異地識別所述八肽基序重復(fù)的配體接觸，和- 檢測八肽基序重復(fù)/配體復(fù)合物的可能的存在。
在鑒別診斷(方法B)中，除了蛋白酶K的濃度以外，根據(jù)毒株的不同，其他條件可能對八肽基序的降解有影響，特別是當(dāng)?shù)鞍酌窴在不同于勻漿緩沖液的緩沖液——例如有利地包含至少一種表面活性劑和/或至少一種離液劑和/或至少一種鹽的緩沖液——中使用的時候，被降解的八肽基序的量可能根據(jù)上述的緩沖液組成和各種試劑的濃度而改變。
術(shù)語″感興趣的毒株″意指非傳統(tǒng)性可傳播性因子毒株，特別是牛海綿狀腦病毒株，例如目的是要除去八肽基序重復(fù)。
方法A和B的主要特征之一是充分利用執(zhí)行蛋白酶處理的條件，以控制八肽基序重復(fù)的降解。根據(jù)設(shè)想的用途實施該方法，以使得這些基序被保存(方法A)或者被破壞(方法B)- 在方法A中，這種控制的目的將會是保留全部或一些八肽基序重復(fù)，以促進對PrP-res進行非常敏感的檢測；- 在方法B中，控制由蛋白酶引起的降解的目的將會是降解對應(yīng)于感興趣的毒株的PrP-res的大多數(shù)——任選全部——八肽基序重復(fù)，無論它(它們)在什么物種中表達，條件是對應(yīng)于所有其他的可傳播性亞急性海綿狀腦病毒株的PrP-res的全部或一些八肽基序重復(fù)被保留下來。在這種情況下，本發(fā)明的優(yōu)點是允許相對于其他的非傳統(tǒng)性可傳播性因子株對感興趣的毒株進行鑒別診斷。
具體地令人驚訝的是，在依照步驟(1)或者步驟(a)的條件下，蛋白酶K沒有導(dǎo)致與所有非傳統(tǒng)性可傳播性因子毒株或者朊病毒相關(guān)的PrP-res的所有或一些八肽基序重復(fù)的切割，然而步驟(b)的條件卻導(dǎo)致與感興趣毒株相關(guān)的PrP-res八肽基序重復(fù)的切割，而所有與其他非傳統(tǒng)性可傳播性因子毒株相關(guān)的PrP-res都保留了所有或一些上述的八肽基序重復(fù)。
同樣令人驚訝的是，這樣的試驗，尤其當(dāng)配體是抗體的時候，有下列各項優(yōu)點- 高度的檢測敏感性，因為針對這些八肽基序重復(fù)的抗體比針對PrP-res 27-30的其他區(qū)域的抗體有強得多的親和性，并且對使用的緩沖液有更強的抵抗性；具體地，重復(fù)基序的識別提高了高親和力的相互作用，并且提供了幾個抗體分子粘附到單個朊病毒蛋白分子上的可能性；- 鑒別診斷非傳統(tǒng)性可傳播性因子毒株或者朊病毒的可能性，因為根據(jù)所使用的條件，可能獲得或者不獲得對這些基序的消化；特別有可能在與感興趣毒株例如牛海綿狀腦病因子相關(guān)的所有疾病中消除它們，然而在其他的“朊病毒”病中有可能保留它們。結(jié)果是相對于其它毒株，本發(fā)明的方法提供了簡單的試驗來鑒別診斷牛海綿狀腦病和/或其他感興趣毒株，其中這種方法使用兩種不同的條件(步驟(1)或(a)及步驟(b))，步驟(1)或(a)的條件(保留與所有非傳統(tǒng)性可傳播性因子毒株相關(guān)的PrP-res八肽基序重復(fù))允許檢測所有的毒株，步驟(b)的條件(僅消除與感興趣毒株相關(guān)的PrP-res的這些基序)僅僅揭示其它毒株。
因此這些實驗尤其適用于調(diào)查感染了牛海綿狀腦病毒株的綿羊，而這種毒株通常不能與傳統(tǒng)的瘙癢病毒株相互區(qū)別。
根據(jù)所說方法的一個有利的實施方案，蛋白酶K溶解在優(yōu)選包含下列成分的緩沖液中a.至少一種表面活性劑，選自- 陰離子表面活性劑，例如SDS(十二烷基硫酸鈉)，十二烷基肌氨酸鈉(sarkosyl)(月桂基肌氨酸鈉，lauroylsarcosine)，膽酸鈉，脫氧膽酸鈉，或?；悄懰徕c；- 兼性離子表面活性劑，例如SB 3-10(癸基磺基甜菜堿)，SB 3-12(十二烷基磺基甜菜堿)，SB 3-14，SB 3-16(十六烷基磺基甜菜堿)，CHAPS和脫氧CHAPS；- 非離子型表面活性劑，如C12E8(十二烷基八乙二醇(dodecyloctaethylene glycol))，Triton X 100，Triton X 114，Tween20，Tween 80，MPEG 9(壬酰甲基葡萄糖胺)，辛基葡糖苷，LDAO(十二烷基二甲胺氧化物)或NP40，或- 表面活性劑的混合物，例如離子型表面活性劑和非離子型表面活性劑的混合物，二種離子型表面活性劑的混合物或離子型表面活性劑和兼性離子表面活性劑的混合物，和/或b.至少一種離液劑，選自尿素和胍，或它們的混合物，和/或c.至少一種鹽，選自金屬的鹽，金屬可以是或不是堿金屬。
依照這個實施方案的有利的排列，上述的緩沖液包含至少5％的陰離子表面活性劑，優(yōu)選十二烷基肌氨酸鈉，可選地與SDS聯(lián)合使用。
依照上述方法另外的有利的實施方案，配體選自能與八肽基序重復(fù)區(qū)域特異結(jié)合的aptamers和抗體。
本發(fā)明的一個主題是能實現(xiàn)本發(fā)明的方法的診斷試劑盒，其特征在于該方法包括如上所定義的至少一種表面活性劑和/或至少一種離液劑和/或至少一種鹽和蛋白酶。
(當(dāng)配體是抗體時)可應(yīng)用標準的免疫學(xué)方法檢測八肽基序重復(fù)/抗體復(fù)合物。
除了上面的排列，本發(fā)明也包括見于下列描述的一些其他排列，這些描述提到了也是本發(fā)明的主題的本發(fā)明方法的實施例及附圖，其中-
圖1代表各種朊病毒蛋白序列人的，羊的，牛的，鼠和Cricetidae的；-圖2代表通過Western印跡法對PrP-res的檢測；-圖3到6對應(yīng)于不同的條件，依照第一，步驟(1)或(a)，和第二，步驟(b)，在人(圖3和4)和反芻動物(圖5和6)中，應(yīng)用雙位點法檢測八肽基序重復(fù)的存在。-圖7-12舉例說明緩沖液在對牛海綿狀腦病和綿羊瘙癢病的鑒別診斷中的影響。-
圖13和14舉例說明緩沖液的組成和蛋白酶K(PK)的濃度對不同類型克-雅病檢測的影響。-
圖15舉例說明使用蛋白酶K對腦組織勻漿直接消化后所得的結(jié)果。-
圖16舉例說明不同類型克-雅病的PrP-res對蛋白酶K的抵抗力的差異。-
圖17舉例說明通過Western印跡法，對經(jīng)蛋白酶K消化并純化為瘙癢病相關(guān)纖維(Scrapie-associated fibrils，SAFs)形式的PrP-res的檢測。
然而，應(yīng)該清楚的認識到這些實施例僅僅是說明本發(fā)明主題的舉例說明，而不以任何方式限制本發(fā)明。實施例1對八肽基序重復(fù)具有特異性的單克隆抗體的生產(chǎn)和表征---多肽的合成和標記朊病毒蛋白八肽基序重復(fù)的多肽代表，如G-G-W-G-Q-P-H-G-G-G-W-G-Q-G-(NH2)基序，是與人類朊病毒蛋白的79-92序列相一致的，它是用自動合成儀(Milligen 9050，Waters，Milford，MI)合成的。同前面描述過的其它多肽和蛋白質(zhì)一樣(McLaughlin等，1987，Grassi等，1989)，該多肽通過異雙功能試劑共價連接到乙酰膽堿酯酶(AchE)上，此試劑是4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺基酯(SMCC，Calbiochem，法國)。此方法包括將被引入到多肽中的巰基與順丁烯二酰亞胺官能團進行反應(yīng)，順丁烯二酰亞胺官能團是通過與SMCC反應(yīng)而連接到AchE上的。如前所述(McLaughlin等，1987)的，巰基是通過與S-乙酰硫代乙酸N-琥珀酰亞胺基酯(SATA)發(fā)生反應(yīng)而引入多肽的。AchE-SMCC與過量的硫醇化肽反應(yīng)可完成連接。---單克隆抗體的免疫和制備按以前曾經(jīng)報道的(Lasmezas等，1997)從感染的倉鼠腦(263K瘙癢病毒株)中獲得瘙癢病相關(guān)纖維(SAFs，PrP-res制劑)的制備物。此制劑在免疫老鼠之前被蟻酸滅活。用這些瘙癢病相關(guān)纖維制劑免疫PrP敲除小鼠(此鼠朊病毒蛋白基因被除去)(PrP0/0小鼠)，雜交瘤細胞用前面所述方法(Grassi等，1988，1989)制備。培養(yǎng)物的上清用上述方法篩選?？勺R別和穩(wěn)定57個雜交瘤，它們被命名為SAF-1到SAF-90。所有的抗體都證明能識別固定在微量滴定板上的瘙癢病相關(guān)纖維，而它們中的少數(shù)能夠識別多肽-乙酰膽堿酯酶結(jié)合物。在后者中，有七種能明顯地識別八肽基序重復(fù)(多肽79-92)，它們是抗體SAF-15，SAF-31，SAF-32，SAF-33，SAF-34，SAF-35和SAF-37。下表列出了所得到的抗體及其主要特征。在腹水中克隆和擴增后，單克隆抗體經(jīng)過蛋白A-Sepharose柱親和層析純化并保存于-20℃直到使用。抗體的同種型依據(jù)奧脫洛尼技術(shù)用放射免疫擴散法來確定。---雜交瘤培養(yǎng)物上清的篩選有兩種方式可證明雜交瘤培養(yǎng)物上清中朊病毒蛋白特異抗體的存在，即檢測它們與多肽-乙酰膽堿酯酶結(jié)合物或者倉鼠瘙癢病相關(guān)纖維結(jié)合的能力。在第一種情況下，篩選是在含有抗鼠IgG抗體的反應(yīng)板中進行，此抗體是使用前述方法固定在反應(yīng)板上的(Créminon等，1993，F(xiàn)robert等，1991)。簡而言之，100μl培養(yǎng)物上清和100μl多肽-乙酰膽堿酯酶結(jié)合物在固定有羊抗鼠IgG抗體的反應(yīng)板中于+4℃反應(yīng)過夜。為了檢測結(jié)合在固相上的乙酰膽堿酯酶，洗滌反應(yīng)板之后，向每孔中加入200μlEllman試劑(Ellman等，1996)。在第二種情況下，固定有瘙癢病相關(guān)纖維制劑的反應(yīng)板是通過在0.05M磷酸鹽緩沖液，pH7.4，中用50μl 2μg/ml的溶液室溫下過夜反應(yīng)而制備的，清洗反應(yīng)板后，再用ETA緩沖液(100mM磷酸緩沖液，pH7.4，含150mM NaCl，0.1％牛血清白蛋白(BSA)及0.01％疊氮鈉)飽和，+4℃過夜，并于使用前在此溫度下保存。如前所述(Negroni等，1998)，單克隆抗體與固定的瘙癢病相關(guān)纖維的結(jié)合可應(yīng)用乙酰膽堿酯酶標記的羊抗鼠IgG抗體顯示出來。
表針對倉鼠瘙癢病相關(guān)纖維制劑的單克隆抗體79-92識別肽79-92的抗體。142-160識別肽142-160的抗體。表位X不能識別固定瘙癢病相關(guān)纖維的抗體。表位A能夠識別肽126-164但不能結(jié)合肽142-160的抗體。*在免疫測定法中能夠識別實驗物種(人、牛、羊、小鼠、大鼠)中至少一個物種的PrP-sen的單克隆抗體。實施例2用Western印跡法檢測PrP-resI樣品處理(i)從不同的生物樣品制備組織勻漿-- 牛海綿狀腦病，羊瘙癢病，人克-雅病變種(4型)，人散發(fā)性克-雅病(1型)及相應(yīng)的陰性對照取350mg牛腦組織磨碎，用5％的葡萄糖溶液制成20％勻漿(w/v)為了進行勻漿，將腦樣品(350mg)及1.4ml葡萄糖溶液加入到含有陶瓷珠的試管中，劇烈振搖(Hybaid Ribolyser)將陽性樣品在來自相應(yīng)物種健康腦的勻漿中稀釋羊到1/100牛到1/50人1型或4型到1/40；3型到1/80；2型到1/20。(ii)步驟(I)的條件在(i)中獲得的20％勻漿的第一部分(500μl)在500μl含有10％十二烷基肌氨酸鈉(SK10)，10％ Triton X100(T10)，2M尿素(U2)，濃度為60μg/ml(PK1)的蛋白酶K(PK)的緩沖液中孵育，37℃，10分鐘(對應(yīng)于10％的勻漿，其終濃度為30μg/ml)。
在圖3-6中，PK3對應(yīng)濃度是180μg/ml蛋白酶K的緩沖液，PK6對應(yīng)濃度是360μg/ml蛋白酶K的緩沖液。(iii)加入500μl包括1-丁醇的緩沖液(對應(yīng)于緩沖液B，如國際申請WO 99/41280所描述)，混合物于15000rpm離心5分鐘(大約17000g)。(iv)將包含PrP-res的離心沉淀物溶解于80-100μl的緩沖液C中(緩沖液C如國際申請WO 99/41280所描述)，優(yōu)選包含4％的SDS的Laemmli緩沖液，在100℃加熱5分鐘，以便進行Western印跡實驗，或者相繼地在包含6M尿素和0.5％的十二烷基肌氨酸鈉的緩沖液C1中溶解沉淀，接著在100℃加熱5分鐘，然后溶解在包含2M胍的緩沖液C2中，之后在100℃加熱5分鐘，以便進行免疫測定。(v)步驟(b)的條件在(i)中獲得的20％勻漿的第二部分(500μl)z在500μl含5％十二烷基肌氨酸鈉(SK5)，5％ SDS(SDS5)，1M尿素(U1)，濃度為180μg/ml的蛋白酶K(PK)(PK6)的緩沖液中在37℃孵育10分鐘，然后實施上述的步驟(iii)和(iv)。II.Western印跡獲得的樣品用于進行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，在實施例1和上述國際申請WO 99/41280的實施例3所展示的條件下進行。
PrP-res的免疫檢測用上述實施例1所描述的單克隆抗體SAF70和SAF37，以及與過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔Igs(1/2500)來完成。如圖2所示，免疫反應(yīng)性通過化學(xué)發(fā)光法(ECL，Amersham)顯示、定量并在自放射自顯影膠片上顯現(xiàn)。
在此圖中*泳道1-5相應(yīng)于根據(jù)步驟(1)或(a)的條件(SK10+T10+U2+PK1)。泳道1陰性對照泳道2牛海綿狀腦病泳道3羊瘙癢病泳道4人克-雅病變種(4型)泳道5人克-雅病(1型)，和*泳道6-10對應(yīng)于步驟(b)的條件(SK10+SDS5+U1+PK6)泳道1陰性對照泳道2牛海綿狀腦病泳道3羊瘙癢病泳道4人克-雅病變種(4型)泳道5人克-雅病(1型)獲得的結(jié)果顯示—在步驟(1)或(a)中(泳道1到泳道5)，PrP-sen被有系統(tǒng)地破壞，然而用針對八肽基序重復(fù)的抗體從PrP-res獲得的信號，與用針對朊病毒蛋白的94-230區(qū)的抗體從同樣的樣品中所獲得的信號相比，卻系統(tǒng)地增強；—在步驟(b)(泳道6到10)中，PrP-sen被有系統(tǒng)地破壞，從泳道8和泳道10(在存在針對八肽基序重復(fù)的抗體的情況下)中獲得的信號與在相同的樣品中用針對朊病毒蛋白的94-230區(qū)的抗體獲得的信號相類似或更強，然而泳道7和9(牛海綿狀腦病的PrP-res)的信號很少甚至幾乎不能被檢測到。實施例3用一個能識別八肽基序重復(fù)的單克隆抗體作為捕獲抗體，用雙位點免疫檢測法檢測PrP-res為了進行雙位點免疫測定法(two-site immunometric assay)，將在實施例2的步驟(iv)中所得到的沉淀物溶解到例如含有十二烷基肌氨酸鈉(0.25-1％)和尿素(0.25-8M)或含有SDS(0.25-1％)和尿素(0.25-1M)的緩沖液中，所得的樣品經(jīng)過加熱后，優(yōu)選用含有白蛋白的緩沖液稀釋(到1/4或1/2)，白蛋白的終濃度在0.1到1％(w/v)，也可用含有1％去氧膽酸鹽的緩沖液稀釋。
雙位點免疫測定法在含有抗體的微量滴定板中進行，抗體的固定是在已經(jīng)在前面描述其它蛋白時所提到過的條件下進行的(Grassi，等，1989)。其原理如下分析的朊病毒蛋白被一種固定在固相支持物上的抗體(捕獲抗體)和第二種抗體所識別，第二種抗體識別此分子的另一部位，并被5個Ellman單位/ml的酶所標記(在本例中，乙酰膽堿酯酶，示蹤抗體)。
本發(fā)明中，捕獲抗體是針對八肽基序重復(fù)的，示蹤抗體識別包含在朊病毒蛋白94-230區(qū)域中的序列，例如朊病毒蛋白的142-160區(qū)域。清洗固相后，結(jié)合到板上的酶的活性與樣品中初始含有八肽基序重復(fù)的PrP-res的量成正比。
實際上，此測定方法是按照下列方式進行的將100μl待分析的朊病毒蛋白溶液加入含有能識別八肽基序重復(fù)的抗體的微量滴定板孔中。室溫下反應(yīng)3小時后，清洗該板，再加入100μl示蹤抗體(5個Ellman單位/ml)。+4℃反應(yīng)過夜，將該板再清洗一次，加入200μl底物溶液(Ellman試劑，Grassi等，1989)，該試劑能夠檢測結(jié)合到固相上的乙酰膽堿酯酶的活性。經(jīng)過30分鐘酶反應(yīng)后，測定每個孔的吸光度(N.D.，414nm)。實施例4不同條件的比較研究步驟(1)或(a)和步驟(b)樣品按實施例2所描述的方法制備。
組織勻漿按實施例2所描述的方法制備。-- 在人體中圖3和4舉例說明用不同的緩沖液獲得的結(jié)果* 依照本發(fā)明方法的步驟(1)或(a)的條件I20％組織勻漿+SK10+T10+U2+PK1。III’10％組織勻漿+SK5+T5+U1+PK 0.5(圖4)。* 依照本發(fā)明方法的步驟(b)的條件II20％組織勻漿+SK10+T10+U2+PK3。III20％組織勻漿+SK10+T10+U2+PK6。III″10％組織勻漿+SK5+T5+U1+PK6(圖4)。IV20％組織勻漿+SK20+PK3。V20％組織勻漿+SK20+U1+PK3。VI20％組織勻漿+SK20+U2+PK3。VII10％組織勻漿+SK20+PK3。VIII10％組織勻漿+SK20+U1+PK3。IX10％組織勻漿+SK20+U2+PK3。X10％組織勻漿+SK5+SDS5+U1+PK6。X’10％組織勻漿+SK2.5+SDS2.5+U2+PK6(圖4)。XI20％組織勻漿+SK20+PK6。XII20％組織勻漿+SK20+U1+PK6。XIII20％組織勻漿+SK20+U2+PK6。XIV10％組織勻漿+SK20+PK6。XV10％組織勻漿+SK20+U1+PK6。XVI10％組織勻漿+SK20+U2+PK6。
使用雙位點免疫測定法測量保留了八肽基序重復(fù)的PrP-res的量(414nm的吸收值或O.D.，見實施例3；測量黃色外觀，Ellman試劑)陰性對照(□)，散發(fā)性1型克-雅病(□)和4型克-雅病變種(■)--在反芻動物中圖5和6舉例說明用不同的緩沖液獲得的結(jié)果*依照本發(fā)明方法的步驟(1)的條件I20％組織勻漿+SK10+T10+U2+PK1。III’10％組織勻漿+SK5+T5+U1+PK0.5(圖6)。*依照本發(fā)明方法的步驟(4)的條件II20％組織勻漿+SK10+T10+U2+PK3。III20％組織勻漿+SK10+T10+U2+PK6。III″10％組織勻漿+SK5+T5+U1+PK3(圖6)。IV20％組織勻漿+SK20+PK3。V20％組織勻漿+SK20+U1+PK3。VI20％組織勻漿+SK20+U2+PK3。VII10％組織勻漿+SK20+PK3。VIII10％組織勻漿+SK20+U1+PK3。IX10％組織勻漿+SK20+U2+PK3。X10％組織勻漿+SK5+SDS5+U1+PK6。X’10％組織勻漿+SK5+SDS5+U1+PK3(圖5)。XI20％組織勻漿+SK20+PK6。XII20％組織勻漿+SK20+U1+PK6。XIII20％組織勻漿+SK20+U2+PK6。XIV10％組織勻漿+SK20+PK6。XV10％組織勻漿+SK20+U1+PK6。XVI10％組織勻漿+SK20+U2+PK6。
使用雙位點免疫測定法測量保留了八肽基序重復(fù)的PrP-res的量(414nm的吸收值或O.D.，見實施例3)陰性對照(□)，牛的非傳統(tǒng)性可傳播性因子(□)和羊的非傳統(tǒng)性可傳播性因子(■)。--圖7(Western印跡)和8(雙位點免疫測定法)·使用來自健康的羊、罹患瘙癢病的羊和罹患牛海綿狀腦病的牛的20％腦勻漿進行比較，這些勻漿是在實施例2中陳述過的條件下獲得的?！悠返奶幚鞟10％十二烷基肌氨酸鈉A+10％ Triton+2M尿素+60μg/ml蛋白酶K，10分鐘。B10％十二烷基肌氨酸鈉+2M尿素+240μg/ml蛋白酶K，10分鐘。C10％十二烷基肌氨酸鈉+240μg/ml蛋白酶K，10分鐘。.檢測通過Western印跡(圖7)抗體Saf37和Saf84(見實施例1)；通過免疫測定分析(圖8)用Saf37抗體捕獲，用針對朊病毒蛋白94-230區(qū)的抗體顯示。-圖9(Western印跡)和10(雙位點免疫測定法).使用來自健康的羊、罹患瘙癢病的羊和罹患牛海綿狀腦病的牛的20％腦組織勻漿進行比較，這些勻漿是在實施例2中陳述過的條件下獲得的。.樣品的處理A10％十二烷基肌氨酸鈉+10％ Triton+2M尿素+60μg/ml蛋白酶K，10分鐘B10％ SDS+5％ Triton+2M尿素+180μg/ml蛋白酶K，10分鐘.檢測在上述同樣條件下進行。
僅僅增加蛋白酶K的劑量就能夠在綿羊中揭示羊瘙癢病和牛海綿狀腦病之間的八肽基序重復(fù)區(qū)域的差別敏感性，但在人類中則不行(在1型和4型之間)。
另一方面，通過還改變表面活性劑和離液劑的組成，可以在所有的情況下揭示八肽基序重復(fù)區(qū)域的差別敏感性。實施例5緩沖液成分對牛海綿狀腦病和羊瘙癢病的鑒別檢測的影響--
圖11(Western印跡)和12(雙位點免疫測定法). 使用來自健康的小鼠或者實驗性感染C506M3毒株(羊瘙癢病)或者6PBI毒株(牛海綿狀腦病)的小鼠的10％腦組織勻漿進行比較，這些勻漿是在實施例2中陳述過的條件下獲得的。.樣品的處理A10％十二烷基肌氨酸鈉+10％ Triton+2 M尿素+30μg/ml蛋白K，10分鐘B10％十二烷基肌氨酸鈉+10％ Triton+2M尿素+60μg/ml蛋白K，10分鐘C10％十二烷基肌氨酸鈉+10％ Triton+2 M尿素+180μg/ml蛋白K，10分鐘D10％十二烷基肌氨酸鈉+10％ Triton+2 M尿素+360μg/ml蛋白K，10分鐘E10％十二烷基肌氨酸鈉+2M尿素+180μg/ml蛋白K，10分鐘。.檢測通過Western印跡(
圖11)抗體Saf37和Saf70(見實施例1)；通過免疫測定分析(
圖12)用Saf37抗體捕獲，用針對朊病毒蛋白94-230區(qū)的抗體顯示。
獲得的結(jié)果顯示在小鼠中，僅僅增加蛋白酶K的劑量就能揭示出在牛海綿狀腦病和羊瘙癢病之間的八肽基序重復(fù)區(qū)域的差別敏感性。實施例6緩沖液和蛋白酶K濃度對不同的克-雅病的檢測的影響-
圖13(Western印跡)和14(雙位點免疫測定法).使用來自健康人和來自患有克-雅病(1，2，3和4型)的人的10％腦組織勻漿進行比較，這些勻漿是在實施例2中陳述過的條件下獲得的。.樣品的處理A10％十二烷基肌氨酸鈉+10％ Triton+2 M尿素+30μg/ml蛋白K，10分鐘B10％十二烷基肌氨酸鈉+10％ Triton+2M尿素+180μg/ml蛋白K，10分鐘C10％十二烷基肌氨酸鈉+30μg/ml蛋白K，10分鐘D10％十二烷基肌氨酸鈉+60μg/ml蛋白K，10分鐘E10％十二烷基肌氨酸鈉+180μg/ml蛋白K，10分鐘F10％十二烷基肌氨酸鈉+360μg/ml蛋白K，10分鐘。.檢測通過Western印跡(
圖13)抗體Saf37和Saf70(見實施例1)；通過免疫測定分析(
圖14)用Saf37抗體捕獲，用針對朊病毒蛋白94-230區(qū)的抗體顯示。-
圖15(Western印跡)和16(免疫測定分析).使用來自健康人和來自患有克-雅病(1，2，3和4型)的人的10％腦組織勻漿進行比較，這些勻漿是在實施例2中陳述過的條件下獲得的。.樣品的處理
圖15用蛋白酶K(150μg/ml)消化，10分鐘。
圖1610％十二烷基肌氨酸鈉+2M尿素+蛋白酶K(從30到360μg/ml)，10分鐘。.檢測通過Western印跡(
圖15)Saf37抗體和針對朊病毒蛋白中的94-230區(qū)的抗體(見實施例1)；通過免疫測定分析(
圖16)用Saf37抗體捕獲，用針對朊病毒蛋白94-230區(qū)的抗體顯示。
獲得的結(jié)果顯示蛋白酶K的劑量增加能夠在不同類型的克-雅病中顯示八肽基序重復(fù)區(qū)域的差別敏感性。在這些條件下，在1型和4型之間不存在顯著性差異；表面活性劑和離液劑組成的改變，在蛋白酶K(E，
圖13和14)的劑量相同的情況下，可能在4型中破壞八肽而同時在1型中保存它們。
除此之外，
圖16可能表明對于相同的緩沖液，對來自不同毒株的PrP-res，隨著蛋白酶K的劑量不同可顯示敏感性的差異。
而且，
圖15顯示，用蛋白酶K直接處理組織勻漿揭示了PrP-res對降解的另外類型的敏感性。實施例7用Western印跡檢測以瘙癢病相關(guān)纖維形式純化的被消化的PrP-res依照實施例2的條件而獲得的組織勻漿，被下列方法處理20％組織勻漿(500μl)+20％ NaCl(500μl)+[20％十二烷基肌氨酸鈉+2％ SB314](500μl)+蛋白酶K(終濃度20μg/ml)，處理1小時。
圖17舉例說明結(jié)果b和d泳道1-7在小鼠中用羊瘙癢病C506M3毒株的不同稀釋度所獲得的結(jié)果(稀釋度1/20，1/50，1/250，1/500，1/1000和1/2000)泳道8分子量泳道9-15在小鼠中用牛海綿狀腦病的不同稀釋度所獲得的結(jié)果。(稀釋度從1/1000到1/10)能完全地除去牛海綿狀腦病信號。a和c獲得的結(jié)果證實，在針對八肽基序重復(fù)的抗體存在的情況下，信號有顯著性增加。e該圖表明在猴子和在人中都可能獲得牛海綿狀腦病的信號的減少(泳道4和7)。參考文獻.Butler D.，Nature，1998，395，6-7..Collinge J.等，Nature，1996，393，685-690..Créminon，C.等，J.Immunol.Methods，1993，162，179-192..Ellman，G.等，Biochem.Pharmacol.，1961，7，88-95..Frobert，Y等，Methods Mol.Biol.，1991，80，57-68..Grassi，J.等，Anal.Biochem.，1988，168，436-450..Grassi J.等，J.Immunol.Methods，1989，123，193-210..Grathwohl K.U.等，J.Virol.Methods，1997，64，205-216..Kuczius T.等，Mol.Med.，1999，5，406-418..Lasmezas C.等，Nature，1996，381，743-744..Lasmezas C.等，Science，1997，275，402-405..McLaughlin L.L.等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1987，144，469-476..Oesch B.等，Curr.Topics Microbiol.and Immunol.，1991，172，109-124.Oesch B.等，Biochemistry，1994，33，5926-5931..Parchi P.等，Nature，1997，386，232-234..Priola S.A.，Nature Med.，1996，2，12，1303-1304..Prusiner S.B.等，Cell，1984，38，127-134..Safar J.等，Nature Med.，1988，10，1157-1165..Schaller O.等Acta Neuropathol.1999，98，437-443..Serban D.等，Neurology，1990，40，110。
正如上述顯示的那樣，本發(fā)明不以任何方式限制其實施、制備和應(yīng)用的方法，這些方法僅僅是更清楚地被描述；相反，它包含那些本領(lǐng)域技術(shù)人員可能想到的、不脫離本發(fā)明的范圍或范疇的所有的變體。
權(quán)利要求
1.通過在生物樣品中檢測異常朊病毒蛋白(PrP-res)而診斷由非傳統(tǒng)性可傳播性因子毒株引起的可傳播性亞急性海綿狀腦病或朊病毒疾病的方法，其特征在于該方法包括(1)用至少一種蛋白酶K處理所說的樣品，使得可以完全降解正常朊病毒蛋白(PrP-sen)，同時保存PrP-res的全部或一些八肽基序重復(fù)，而無論何種非傳統(tǒng)性可傳播性因子，(2)將所述處理過的樣品與所述八肽基序的配體進行接觸，和(3)檢測八肽基序重復(fù)/配體復(fù)合物的可能的存在。
2.通過檢測與各種非傳統(tǒng)性可傳播性因子有關(guān)的PrP-res，而在生物樣品中鑒別診斷由非傳統(tǒng)性可傳播性因子引起的可傳播性亞急性海綿狀腦病的方法，其特征在于該方法包括(a)根據(jù)權(quán)利要求1的診斷非傳統(tǒng)性可傳播性因子毒株的方法的步驟(1)到(3)，在所說的樣品的第一部分中檢測PrP-res，然后，(b)對于在步驟(a)中檢測到存在八肽基序重復(fù)/配體復(fù)合物的每個樣品- 用至少一種蛋白酶K處理所述樣品的第二部分，使得對于與至少一個感興趣的毒株——特別是牛海綿狀腦病毒株——有關(guān)的PrP-res來說，大多數(shù)八肽基序重復(fù)被除去了，并且使得所有與其他非傳統(tǒng)性可傳播性因子毒株有關(guān)的PrP-res保存了全部或一些所述八肽基序重復(fù)，- 將所述處理過的樣品的所述第二部分與能夠特異地識別所述八肽基序重復(fù)的配體接觸，和- 檢測八肽基序重復(fù)/配體復(fù)合物的可能的存在。
3.在被認為包含PrP-res的生物樣品中鑒別診斷由非傳統(tǒng)性可傳播性因子毒株引起的可傳播性亞急性海綿狀腦病的方法，其特征在于該方法包括對每個已經(jīng)檢測到存在PrP-res的樣品，實施權(quán)利要求2的步驟(b)，- 將所述處理過的樣品的所述第二部分與能夠特異地識別所述八肽基序重復(fù)的配體接觸，和- 檢測八肽基序重復(fù)/配體復(fù)合物的可能的存在。
4.權(quán)利要求1到3任何一項的方法，其特征在于依照步驟(1)、(a)或(b)的用所述蛋白酶K處理，在低于80℃的溫度下進行30秒到2小時，優(yōu)選10分鐘到30分鐘。
5.權(quán)利要求4的方法，其特征在于用所述蛋白酶K進行的處理是以30μg/ml到200μg/ml的濃度對10％的勻漿物在37℃下進行10分鐘，或以等同于上述條件下30μg/ml到200μg/ml濃度的時間和濃度進行，并優(yōu)選以30μg/ml到200μg/ml的濃度對10％的勻漿物進行10分鐘，或以10μg/ml到70μg/ml的濃度對10％的勻漿物進行30分鐘。
6.權(quán)利要求1到5任何一項的方法，其特征在于，蛋白酶K溶解在選自生物樣品勻漿緩沖液和含有至少一種下列成分的緩沖液的緩沖液中至少一種表面活性劑和/或至少一種離液劑和/或至少一種鹽。
7.權(quán)利要求6的方法，其特征在于所述緩沖液優(yōu)選包含a.至少一種表面活性劑，其選自- 陰離子表面活性劑，例如SDS(十二烷基硫酸鈉)，十二烷基肌氨酸鈉(月桂基肌氨酸鈉)，膽酸鈉，脫氧膽酸鈉，或牛璜膽酸鈉；- 兼性離子表面活性劑，例如SB 3-10(癸基磺基甜菜堿)，SB 3-12(十二烷基磺基甜菜堿)，SB 3-14，SB 3-16(十六烷基磺基甜菜堿)，CHAPS和脫氧CHAPS；- 非離子型表面活性劑，例如C12E8(十二烷基八乙二醇)，Triton X 100，Triton X 114，Tween 20，Tween 80，MEGA 9(壬酰甲基葡萄糖胺)，辛基糖苷，LDAO(十二烷基二甲胺氧化物)或NP40，或- 表面活性劑的混合物，例如離子型表面活性劑和非離子型表面活性劑的混合物，二種離子型表面活性劑的混合物或離子型表面活性劑和兼性離子表面活性劑的混合物，和/或b.至少一種離液劑，其選自尿素和胍，或它們的混合物，和/或c.至少一種鹽，其選自金屬鹽，金屬可以是或不是堿金屬。
8.權(quán)利要求7的方法，其特征在于所述緩沖液包含至少5％的陰離子表面活性劑，優(yōu)選十二烷基肌氨酸鈉，可選地聯(lián)合SDS。
9.權(quán)利要求1到8任何一項的方法，其特征在于配體選自能夠特異性結(jié)合八肽基序重復(fù)區(qū)域的aptamers和抗體。
10.權(quán)利要求2、權(quán)利要求4或權(quán)利要求5的方法，其特征在于步驟(b)的處理是在與步驟(1)或(a)中定義的那些條件相同的條件下，以高于步驟(1)或(a)中使用的蛋白酶K濃度的蛋白酶K濃度進行的。
11.用于實施權(quán)利要求1-10任何一項的方法的診斷試劑盒，其特征在于它聯(lián)合地包含以上定義的至少一種表面活性劑和/或至少一種離液劑和/或至少一種鹽和蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及診斷由非傳統(tǒng)性可傳播性因子毒株引起的可傳播性亞急性海綿狀腦病的方法，該方法包括(1)用至少一種蛋白酶K處理所述樣品，以完全降解PrP－sen，同時保存PrP－res的八肽基序重復(fù)的全部或部分，而無論何種毒株；(2)用能特異鑒定所述八肽基序重復(fù)的配體接觸所處理的樣品，和(3)檢測配體/八肽基序重復(fù)復(fù)合物的可能存在。本發(fā)明還涉及鑒別診斷方法。
文檔編號C12Q1/37GK1391652SQ0081599
公開日2003年1月15日 申請日期2000年11月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月12日
發(fā)明者J-P·戴斯里斯, E·克默伊, J·格拉希 申請人:原子能委員會