專利名稱：抗牛成熟朊蛋白的單克隆抗體mab-mPrP-N59及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用基因工程制備一種單克隆抗體(以下簡稱為單抗)及其制備方法和用途。
技術(shù)背景"唯蛋白"理論認(rèn)為瘋牛病、癢病、人變異性克雅氏病等傳染性海綿狀腦病 是由一種不含有核酸的蛋白質(zhì)…-朊病毒(Scrapie Prion Protein, PrPSc，癢病型 朊蛋白)引起的。PrPSc是由牛、羊、人等宿主體內(nèi)一種正常存在的朊蛋白(Cellular Prion Protein, PrPC，細胞型朊蛋白)構(gòu)像轉(zhuǎn)變后生成的。PrPSc與PrPc在自然 界是不可分割存在的，PrPc堪稱是PrPSc形成的原料，存在的載體。PrPc廣泛 存在于哺乳動物體內(nèi)，主要分布在腦組織、脊髓、淋巴組織中。大量的研究證 實了瘋牛病的主要傳播途徑是通過食用被PrPSc污染的肉骨粉詞料蛋白引起的。 肉骨粉是以牛、羊等動物的下腳料為原料，加工成的一種動物蛋白詞料。由于 肉骨粉價格低廉，蛋白含量高，所以，在上個世紀(jì)的80年代和90年代被一些 西方國家廣泛采納，這導(dǎo)致了瘋牛病的大暴發(fā)。最初，通過食用被癢病因子污 染的肉骨粉，使得英國等一些歐洲國家的牛感染上了瘋牛病，人通過食用用病 牛加工的食品而感染上變異性克雅氏病。而今，肉骨粉在許多國家被禁止用于 動物飼料。控制動物詞料，禁止PrPC風(fēng)險成分進入動物和人的食物鏈?zhǔn)欠乐汞?牛病侵入和傳播，保證人身安全的關(guān)鍵措施。我國頒布了有關(guān)公告和禁令，但 是能否很好地執(zhí)行這些規(guī)定在很大程度上取決于檢測進口詞料和食品中PrPC的存在。檢測飼料和食品中PrPC存在的方法除了 DNA雜交、PCR擴增等DNA 方法外，還有蛋白質(zhì)分析和組織鑒定兩大類方法。在這兩大類分析方法中，以 酶聯(lián)免疫吸附分析(Enzyme Linked Immunosorbant Assay, ELISA)、免疫印跡 (Western Blotting)和生物傳感器技術(shù)為主要內(nèi)容的免疫學(xué)方法是其主體技術(shù)。檢 測飼料和食品中PrPC存在的各種免疫學(xué)方法的關(guān)鍵試劑就是針對PrPC的多抗和單抗，由于PrPC蛋白在哺乳動物中非常保守，氨基酸變化小，所以，以單抗 作為診斷試劑比多抗更優(yōu)越。PrPC是一種糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定的膜蛋白，由氨基端的信號肽、 中間的成熟蛋白和羧基端的GPI錨結(jié)合區(qū)三部分組成。PrPC經(jīng)過翻譯后修飾， 最終是以被GPI錨定的成熟蛋白形式展現(xiàn)在細胞表面。所以，制備出針對成熟 PrPC (mature prion protein, mPrP)的單抗，在此基礎(chǔ)上開發(fā)出免疫印跡、雙抗 體夾心ELISA、免疫實時PCR等各種免疫診斷試劑盒，可以用于檢測食品和飼 料中是否存在PrPC。此外，這些單抗還可以作為研究PrPC蛋白結(jié)構(gòu)與功能的 有力工具。各種單抗的制備目前仍然以淋巴細胞雜交瘤技術(shù)為主，因為該技術(shù) 成熟、穩(wěn)定、制作成本較為低廉。而今，用于動物免疫的免疫原越來越趨向于 以重組蛋白取代天然蛋白，這樣易化了材料來源。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供一種抗牛mPrP的單抗，同時給出該單抗的輕鏈和 重鏈可變區(qū)編碼基因；本發(fā)明的目的之二是提供這種單抗的一種制備方法；本 發(fā)明的目的之三是提供該單抗的用途。本發(fā)明所涉及的抗牛成熟朊蛋白mPrP的單抗被命名為"mab-mPrP-N59"， 其輕鏈可變區(qū)基因見后附的序列表<400>2，其重鏈可變區(qū)基因見后附的序列表 <400>3。Mab-mPrP-N59的制備方法如下是以牛mPrP編碼基因為目的產(chǎn)物選擇模 板與引物，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增出牛mPrP編碼基因，用五coRI和 Iol雙酶切擴增產(chǎn)物和原核表達載體，回收酶切產(chǎn)物，在連接酶的作用下將酶 切后的mPrP編碼基因和原核表達載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入JM109感 受態(tài)細胞中進行培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)菌液涂布于含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)， 挑取單菌落經(jīng)鑒定后擴大培養(yǎng)，提取含有牛mPrP編碼基因的重組表達質(zhì)粒，將 此重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入五.Cb//JM109(DE3)中，經(jīng)鑒定正確后，進行誘導(dǎo)表達，純 化、復(fù)性表達產(chǎn)物，以經(jīng)純化復(fù)性的表達產(chǎn)物為免疫原免疫小鼠，取免疫鼠的 脾細胞與鼠骨髓瘤細胞融合，篩選出雜交瘤細胞株，并克隆出陽性雜交瘤細胞5株，在鼠體內(nèi)接種雜交瘤細胞生產(chǎn)腹水抗體，取出腹水進行純化得到抗牛成熟 朊蛋白的單抗。本發(fā)明的mab-mPrP-N59的制備方法中還可以是下述方法即采用含有牛 PrP編碼基因ORF的克隆質(zhì)粒boPrP-T為模板(克隆質(zhì)粒boPrP-T為公開于張 杰，劉永生，陳豪泰，姜海霞，路偉，朱小玲，謝慶閣等在《中國獸醫(yī)科 學(xué)》.2006,36(30):193-198發(fā)表的"三種哺乳動物朊蛋白基因/V叩的分析比較" 一文中的bopmp-T)，采用的上游引物F-NEPrP為5-ccgg^i^aagaagcgaccaaaacctg-3 (下畫線表示E"coRI酉每切^立點) 采用的下游引物R-bnPrP3為5-ccg5l^gacttgcccctcgttggta-3 (下畫線表示酶切j立點) 用EcoRI和iol雙酶切克隆的mPrP編碼基因和pET-30a(+)表達載體，連接雙 酶切產(chǎn)物，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至ECo// JM109感受態(tài)細胞中，然后將轉(zhuǎn)化后菌液 涂布于含卡那霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單菌落后擴大培養(yǎng)，得到含有牛mPrP 編碼基因的重組表達質(zhì)粒pET-PrP(25-242aa)的￡.Co// JM109菌株 pET-mPrP-JM109。從菌株pET-mPrP-JM109中提出質(zhì)粒pET-PrP(25-242aa)，再 轉(zhuǎn)化至表達用菌株五.Co" JM109(DE3)感受態(tài)細胞中，用轉(zhuǎn)化后菌液涂布于含卡 那霉素的LB瓊脂粉平板培養(yǎng)，獲得含有質(zhì)粒pET-PrP(25-242aa)的ECo// JM109(DE3)菌株----pET-mPrP-JDE3，再將此菌株接種至含有50 jig/mL卡那霉素 的LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，使重組牛mPrP被JM109(DE3)在IPTG誘導(dǎo)下 進行高效表達，用Ni-NTA樹脂親和層析法純化表達產(chǎn)物，以此純化的重組牛 mPrP蛋白為免疫原免疫小鼠，取免疫鼠的脾細胞與鼠骨髓瘤細胞融合，采用間 接ELISA方法篩選融合的雜交瘤細胞株，再用有限稀釋法克隆篩選的陽性雜交 瘤細胞株，獲得了能夠穩(wěn)定分泌抗重組牛mPrP的陽性雜交瘤細胞株 …-csPrP—N59，在鼠體內(nèi)接種雜交瘤細胞csPrP-N59，生產(chǎn)腹水抗體，抽取腹水， 離心收集上清液，進行純化得到抗牛成熟朊蛋白mPrP的mab-mPrP-N59。本發(fā)明的上述抗牛mPrP的mab-mPrP-N59的制備方法中得到的重組質(zhì)粒 pET-PrP(25-242aa)，其基因序列見后附基因表的<400>1 。本發(fā)明的mab-mPrP-N59可用于制備檢測飼料和食品中PrPC的診斷試劑， 也可用于檢測研究成熟朊蛋白結(jié)構(gòu)與功能的實驗試劑。本發(fā)明是以大腸桿菌表達的重組mPrP為免疫原，以清潔級Balb/C小鼠為 免疫對象，采用淋巴細胞雜交瘤技術(shù)和間接ELISA篩選方法獲得穩(wěn)定分泌抗 mPrP的陽性雜交瘤細胞株，純化制備出腹水單抗boPrP-N59。(制備方法參見"秦 川黃牛成熟朊蛋白單克隆抗體的制備及鑒定"朱小玲，劉永生，張杰，吳潤，陳 豪泰，姜海霞，路偉，謝慶閣.《中國人畜共患病雜志》.2006,22(9): 851-854.)。 進一步采用PCR擴增法，擴增出編碼單抗boPrP-N59輕、重鏈可變區(qū)編碼基因 的序列，在此基礎(chǔ)上可以進一步制備出相應(yīng)的單鏈抗體。單鏈抗體由于一些獨 特的優(yōu)勢，在診斷、治療以及基礎(chǔ)科學(xué)研究方面越來越發(fā)揮重要作用。本發(fā)明獲得的mab-mPrP-N59的輕鏈和重鏈可變區(qū)編碼基因為制備相應(yīng)的單鏈抗體提供了材料。單鏈抗體在替代單抗作為診斷試劑方面具有較廣闊的前旦 豕。


圖l為重組表達質(zhì)粒pET-PrP(25-242aa)的雙酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖譜， 圖中l(wèi)為DL-2000 Marker, 2為PCR擴增的mPrP片段，3為線性化的表達載體 pET-30a(+)， 4為五coRI和^2oI雙酶切重組表達質(zhì)粒。圖2為牛mPrP重組表達產(chǎn)物的SDS-PAGE圖譜，圖中l(wèi)為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo) 準(zhǔn)，2為IPTG誘導(dǎo)的含有pET-30a ( + )空載體的ECo// BL21(DE3)對照菌液，3 為IPTG誘導(dǎo)表達的未純化的重組牛mPrP， 4為純化的重組牛mPrP。圖3為以SAF-70為檢測抗體，Western Blot分析牛重組mPrP及其蛋白酶K 消化產(chǎn)物，圖中1為含有pET-30a ( + )空載體的ECo/ZBL21(DE3)菌體蛋白；2 為牛的重組mPrP; 3為蛋白酶K消化的牛重組mPrP。圖4為mab-mPrP-N59與重組牛、羊、人成熟PrP和成熟疊朊以及與pET-30a(+)空載體的￡.。//菌體蛋白反應(yīng)的Western blotting圖譜，l為空載體的ECo//菌體蛋白，2， 4， 6分別為純化的重組牛、羊、人成熟PrP， 3， 5， 7分別為重組牛、羊、人成熟疊朊蛋白。圖5為mab-mPrP-N59與從正常牛腦組織中提取的PrP反應(yīng)的Western blotting圖譜，M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，l為牛腦組織裂解液上清，2為蛋白酶K消化的牛腦組織裂解液上清。具體實施方實施例<一> 抗牛mPrP的單抗mab-mPrP-N59的制備及其特性鑒定 1.牛mPrP的ECo/Z表達及表達產(chǎn)物純化 1.1構(gòu)建牛mPrP重組表達質(zhì)粒pET-PrP(25-242aa) l丄l PCR擴增牛mPrP編碼基因PCR擴增的模板是本發(fā)明申請單位保存的含有牛PrP編碼基因ORF的克隆質(zhì) 粒boPrP-T。牛mPrP的氨基酸殘基序列是從第25位氨基酸殘基至第242位氨基酸 殘基，根據(jù)其編碼基因序列設(shè)計表達引物，并在上游引物引入五coRI酶切位點， 在下游引物引入屈o頂每切位點，前面添加相應(yīng)的酶切保護堿基，引物由上海生 工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。利用公司合成的上、下游引物和boPrP-T質(zhì) 粒模板，進行PCR擴增。PCR擴增程序如下95"C預(yù)變性5min后，進行如下循環(huán): 94。Clmins、 55°C lmin、 72°C lmin， 30個循環(huán)之后，72。C延伸8min結(jié)束。 上游引物F-NEPrP:5-ccgg^^aagaagcgaccaaaacctg -3 (下畫線表不五coRI酉每切位點) 下游引物R-bnPrP3:5-ccg5teg^gacttgcccctcgttggta-3 (下畫線表示酶切{立點) 1.1.2重組表達質(zhì)粒pET-PrP(25-242aa)的構(gòu)建將實施例<一>1.1.1的PCR產(chǎn)物用PCR清潔試劑盒純化后進行&oRI禾[U7zoI雙 酶切，同時也用這兩個酶雙切商品化的pET-30a(+)表達載體，然后用DNA凝膠回 收試劑盒回收雙酶切產(chǎn)物，之后在T4DNA連接酶的作用下16'C連接。將連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)入Takara公司生產(chǎn)的ECo/z'JM109感受態(tài)細胞中，37"C震蕩培養(yǎng)50分鐘，然 后將菌液涂布于含100嗎/mL卡那霉素的LB瓊脂粉平板上，37X:過夜培養(yǎng)。挑取單菌落擴大培養(yǎng)，提取其質(zhì)粒進行雙酶切和測序分析。質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果如 附圖1所示，結(jié)果表明從單菌落提取的質(zhì)粒經(jīng)五coRI和屈oI雙酶切后釋放出同預(yù) 計片段654bp大小相符的DNA片段。進一步的質(zhì)粒測序結(jié)果表明，實驗獲得的質(zhì) 粒為含有牛PrP27-30編碼基因的重組質(zhì)粒，測序結(jié)果如后附的序列表l。將該質(zhì) 粒命名為pET-PrP(25-242aa)，將含有該質(zhì)粒的Co// JM109菌株命名為 pET-mPrP-JM109。1.2牛1^^的￡.0 //高效表達1.2.1表達菌株pET-mPrP-JDE3的篩選將實施例<一>中1.1.2獲得的質(zhì)粒pET-PrP(25-242aa)轉(zhuǎn)化至Takara公司生產(chǎn) 的ECo/fJM109(DE3)感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化后菌液涂布于含卡那霉素的LB瓊脂粉平 板上，挑選生長好的單菌落，提取其質(zhì)粒進行五coRI和屈oI雙酶切鑒定，雙酶切 鑒定結(jié)果與附圖1相一致，這表明？6丁- ^(25-2423&)質(zhì)粒被轉(zhuǎn)入￡.0^^^4109 (DE 3)中，將獲得該質(zhì)粒的菌株命名為pET-mPrP-JDE3。1.2.2重組菌株pET-mPrP-JDE3的表達將pET-mPrP-JDE3菌株和含有pET-30a(+)空載體的五.Co// BL21(DE3)菌株分 別同時接種至含有50嗎/mL卡那霉素的5mL LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩過夜培養(yǎng)。 取過夜培養(yǎng)物5mL接種到500mL的含有50嗎/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37。C振 蕩培養(yǎng)至OD柳nm值約0.6時，加入IPTG，使其終濃度為1.0mM，繼續(xù)振搖，37°C 誘導(dǎo)6h后，離心收獲菌體，用10mL去離子水懸浮沉淀，冰浴超聲。取少量(200jiL 左右)超聲后的勻漿物離心，收集沉淀，將沉淀再用20(VL去離亍水懸浮，然后 按等體積加入2倍蛋白質(zhì)上樣緩沖液，煮沸5分鐘后12000轉(zhuǎn)/分鐘離心，取上清液 進行12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，結(jié)果如附圖2第3條泳 道所示。電泳結(jié)果表明，重組牛mPrP被五.O /fJM109(DE3)在IPTG誘導(dǎo)下高效表 達，表達產(chǎn)物以包涵體形式存在，其分子量大小為27KDa，與預(yù)計大小相一致。1.3牛mPrP的ECo//表達產(chǎn)物純化和復(fù)性因為構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒在氨基端和羧基端都含有組氨酸標(biāo)簽，所以，可 以采用Ni-NTA樹脂親和層析法純化表達產(chǎn)物。Ni-NTA樹脂購自Novagen公司， 按照公司說明書關(guān)于EO^表達的以包涵體形式存在的表達產(chǎn)物純化歩驟純化 重組牛mPrP，并進一步按照Novagen公司的復(fù)性試劑盒對包涵體進行復(fù)性。取少 許樣品進行SDS-PAGE分析，并用分光光度法測定濃縮后的目的蛋白濃度。 SDS-PAGE結(jié)果如附圖2第4泳道所示。1.4重組牛mPrP的反應(yīng)原性和抗蛋白酶K消化能力分析 將重組牛mPrP及其蛋白酶K (PK使用的終濃度為50嗎/ml)消化產(chǎn)物用 SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜表面，以Cayman公司生產(chǎn)的針對癢病 相關(guān)纖維(SAF)的單抗SAF-70為檢測抗體，對重組mPrP及其PK消化產(chǎn)物進行 Western Blotting,確定其反應(yīng)原性和抗PK消化能力，結(jié)果如附圖3所示。結(jié)果顯示，重組牛mPrP(包括單體和二聚體)都能與SAF-70抗體發(fā)生反應(yīng)，但是其 PK消化產(chǎn)物不與抗體發(fā)生反應(yīng)，這表明獲得的重組牛mPrP具有很好的反應(yīng)原 性，而不具有朊病毒PrPSc的抗PK消化的抗性，可以作為免疫原制備針對PrP 的抗體。2. Mab-mPrP-N59的制備2.1動物免疫、細胞融合及陽性雜交瘤細胞株的間接ELISA篩選 實驗組是以前述親和層析純化的復(fù)性重組牛mPrP蛋白為免疫原，免疫 Balb/C小鼠，100)ig/只。首次以弗氏完全佐劑(Sigma公司)乳化，背部皮下3-4 點注射，分別間隔15天以后進行第二、三次免疫，此時采用弗氏不完全佐劑 (Sigma公司)乳化，第三次免疫結(jié)束15天后進行加強免疫，直接腹腔注射重組 牛mPrP蛋白。同時設(shè)立對照組，即將免疫原由重組牛mPrP改換為pET-30a(+)空 載體菌體蛋白，免疫程序同實驗組。加強免疫三天后，收集實驗組Balb/C鼠的脾 細胞，在50%聚乙二醇1500 (Rochi公司)的作用下與鼠骨髓瘤細胞SP2/0以5: 1 進行室溫融合。以間接ELISA方法篩選出能夠穩(wěn)定分泌針對重組mPrP的單抗的 陽性雜交瘤細胞株。間接ELISA篩選方法的建立以及陽性雜交瘤判斷標(biāo)準(zhǔn)同"秦 川黃牛成熟朊蛋白單克隆抗體的制備及鑒定"文中的1.2.2所述。通過三次有限稀 釋法的亞克隆和間接ELISA篩選，獲得了能夠穩(wěn)定分泌抗重組牛mPrP的陽性雜 交瘤細胞株----csPrP-N59。2.2 Mab-mPrP-N59的大量生產(chǎn)及純化采用腹水制備法大量生產(chǎn)mab-mPrP-N59,采用葡萄球菌蛋白A親和層析法 純化腹水抗體。先腹腔注射0.5mL無菌礦物油于Fl代小鼠，1 2周后向其腹腔注射lx106 個csPrP-N59雜交瘤細胞(用生理鹽水稀釋，體積為0.2mL左右)，接種雜交瘤 細胞7 10天后，產(chǎn)生腹水，當(dāng)小鼠頻于死亡之前，拉頸處死小鼠，打開腹腔， 用滴管將腹水吸入離心管中，離心收集上清夜，即獲得腹水抗體。采用 CALBIOCHEM公司生產(chǎn)的葡萄球菌蛋白A純化收集的腹水抗體，按照公司提 供的說明書操作。3. Mab-mPrP-N59的生物學(xué)特性鑒定Mab-mPrP-N59的生物學(xué)特性鑒定包括免疫球蛋白(Ig)類與亞類、效價特異性、交叉反應(yīng)性、抗原表位以及與牛腦組織PrPC的Westem-Blot反應(yīng)。(1) Ig類與亞類的鑒定采用Sigma公司鼠源單抗亞類鑒定試劑盒對純化的 腹水mab-mPrP-N59進行測定，測定方法采用抗體雙夾心ELISA法,操作按Sigma 公司的說明書進行。結(jié)果顯示mab-mPrP-N59屬于IgG2a。(2) 效價測定采用間接ELISA法測定腹水mab-mPrP-N59的效價。以純化 的重組牛mPrP為包被抗原，將腹水抗體從1:10倍開始稀釋，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG，讀取OD4w光吸收值，當(dāng)OD492nm值接近0.8時的稀釋倍數(shù)為此單抗的效價。結(jié)果表明腹水mab-mPrP-N59的效價為lxl(T6。(3) 特異性分析因為本專利申請的mab-mPrP-N59制備的免疫原是E Co" 表達的重組蛋白，所以，首先考慮是否與含有pET-30a(+)空載體的五.co/iJM109(DE3)菌體蛋白發(fā)生反應(yīng)。此外，由于成熟朊蛋白mPrpC與Dopple (疊朊) 的結(jié)構(gòu)接近，而且兩者關(guān)系密切，所以還檢測了獲得的mab-mPrP-N59與重組牛、 羊、人成熟疊朊(重組成熟疊朊蛋白由本專利申請單位的實驗室制備保存)的 反應(yīng)性。檢測方法采用Western Blotting。 Western Blotting的操作過程如《分子 克隆實驗指南》所述，首先將含有pET-30a(+)空載體的五.Co"菌體蛋白、重組 mPrP、重組成熟疊朊進行12。/。SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，以純化的 mab-mPrP-N59為檢測抗體進行Western Blotting分析，結(jié)果如附圖4所示。分析 結(jié)果表明mab-mPrP-N59僅與重組mPrP的單體和二聚體發(fā)生反應(yīng)，而不與重組 成熟疊朊和空載體菌體蛋白反應(yīng)，這顯示本發(fā)明獲得的mab-mPrP-N59能夠特異 地識別和結(jié)合mPrP。(4) 交叉反應(yīng)性通過Western Blotting確定mab-mPrP-N59與重組羊、人 的mPrP(由本專利申請單位的實驗室制備保存)的反應(yīng)性，以確定獲得單抗的交 叉反應(yīng)性。實驗結(jié)果如附圖4所示，結(jié)果表明mab-mPrP-N59能夠識別和結(jié)合重 組羊、人的mPrP (包括單體和二聚體)，與其發(fā)生了交叉反應(yīng)，這為擴大 mab-mPrP-N59的應(yīng)用范圍奠定了基礎(chǔ)。(5) 抗原表位分析采用基因片段表達作圖法分析mab-mPrP-N59針對的抗 原表位所在的區(qū)段。將牛mPrP的氨基酸殘基序列分成3個區(qū)段進行表達，即 PrP25-145,PrP146-242,PrP102-241 (3個不同的PrP片段表達物由本專利申請單 位制備保存)，然后以3個不同的表達產(chǎn)物作為抗原，包被ELISA板，以11mab-mPrP-N59作為抗體進行間接ELISA反應(yīng)。結(jié)果表明，mab-mPrP-N59不與 分段表達的PrP反應(yīng)，這意味著mab-mPrP-N59識別的可能是成熟PrP的空間構(gòu) 象表位。(6) Mab-mPrP-N59與牛腦組織PrP的Western Blotting反應(yīng) 以制備的健康黃牛腦組織為檢測對象，以mab-mPrP-N59為檢測抗體進行 Western Blotting,目的是檢測制備的單抗在腦組織Western Blotting中的應(yīng)用。腦 組織的取材部位在腦閂區(qū),以預(yù)冷的裂解液(10 mM Tris-HCl pH7.4， 100 mM NaCl， 0.5%NP-40， 0.5%脫氧膽酸鈉，10mMEDTA)將腦組織制成10% (wt/vol) 的勻漿，經(jīng)過二次凍溶和超聲波冰浴破碎后12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10min，去除細胞 碎片。取部分上清液，按5(^g/mL加入蛋白酶K(PK)， 37。C消化lh后，立刻加入 5 mM苯甲基磺酰(PMSF)終止反應(yīng)。經(jīng)12% SDS-PAGE后進行Westem Blotting, 結(jié)果如附圖5所示。圖譜顯示，mab-mPrP-N59與牛腦組織中的PrP發(fā)生了反應(yīng)， 而不與腦組織PrP的PK消化產(chǎn)物反應(yīng)。實施例<二> Mab-PrP102-6輕、重鏈可變區(qū)編碼基因克隆測序與分析 本發(fā)明通過對GenbanK登錄的鼠源單抗輕、重鏈可變區(qū)編碼基因序列的分析 和比較，設(shè)計了兩對克隆引物，通過PCR擴增獲得了mab-mPrP-N59輕鏈和重鏈 可變區(qū)編碼基因。具體操作過程如下1. RNA提取細胞RNA的提取采用Qiagen公司的RNA提取試劑盒進行提取。首先培養(yǎng) 分泌mab-mPrP-N59的雜交瘤細胞csPrP-N59，采用1640培養(yǎng)基(日水公司)， 20%胎牛血清(杭州四季青公司產(chǎn)品)，在5%C02， 37。C條件下培養(yǎng)。離心收 集細胞，用PBS緩沖液洗滌細胞沉淀2次，之后按照RNA提取試劑盒操作說明 書進行。2. 合成cDNA第一鏈采用Qiagen公司的cDNA第一鏈合成試劑盒進行。在上述提取的RNA基 礎(chǔ)上，以oligadT(15)為引物，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成了 cDNA第一鏈，具體操作按照說明書進行。3. PCR擴增輕鏈和重鏈可變區(qū)編碼基因以合成的cDNA第一鏈為模板，擴增輕鏈可變區(qū)編碼基因時以自行設(shè)計的VKLfor3和VKLbackl為上、下游引物，擴增重鏈可變區(qū)編碼基因時以VHlFor和 VHlBack為上、下游引物(直接采用文章中VHlFor和VHlBack的引物序列 "Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction" Proc Natl Acad Sci， 1989,86:3833-3837.)，在7b《DNA聚合酶(Takara 公司)的作用進行PCR擴增。擴增程序為95"C變性5min;之后進行如下循環(huán) 94°C lmin,55。C lmin,72。C 40Sec,30個循環(huán)；最后72。C延伸8分鐘。PCR結(jié)束后進 行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明獲得了預(yù)計大小的DNA片段。VKLfor3: 5-GACATTGTGATGACCCAGTC-3VKLbackl: 5-GATGGATACAGTTGGTGCAG-3VH1 FOR: 5-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3 VH舊ACK: 5-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3 S = C or G, M = A or C， R= A or G， and W = A or T 4.測序PCR擴增的輕鏈和重鏈可變區(qū)編碼基因分別采用凝膠回收試劑盒(V-gene公司)純化PCR擴增的mab- mPrP-N59 輕鏈和重鏈的DNA片段，然后與pMD-18T載體(Takara公司)連接，Cac^法 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入￡. Co/HM109感受態(tài)細胞(Takara公司)中，轉(zhuǎn)化結(jié)束后37°C 震搖50分鐘，然后取適量菌液均勻地涂布在含有200pg/mL氨芐青霉素的LB 瓊脂粉平板上，37'C過夜培養(yǎng)，挑取單菌落進行PCR鑒定并擴大培養(yǎng)，提取相 應(yīng)質(zhì)粒，送至公司進行測序，測序結(jié)果的輕鏈可變區(qū)基因見后附的序列表 <400>2,重鏈可變區(qū)基因見后附的序列表<400〉3。對測定序列運用Blast軟件進 行分析比對，結(jié)果表明，采用PCR擴增法獲得了mab-mPrP-N59輕、重鏈可變 區(qū)編碼基因，其中mab-mPrP-N59的輕鏈可變區(qū)編碼基因與Genbank登錄的單 抗輕鏈可變區(qū)序列最高同源性為99%， mab-mPrP-N59的重鏈可變區(qū)編碼基因與 Genbank登錄的單抗重鏈可變區(qū)序列最高同源性為96°/。。實施例<三> Mab-mPrP-N59及其輕、重鏈可變區(qū)編碼基因的用途 本發(fā)明制備的抗mPrP的mab-mPrP-N59可以作為檢測牛、羊和人等哺乳動 物的全長PrP和成熟PrP被大腸桿菌、酵母菌或者其它真核細胞表達的檢測試劑； 可以作為研究哺乳動物全長PrP和成熟PrP與其自身或者與PrP"或者與37Kda /67Kda層粘連蛋白受體、脂筏蛋白等相關(guān)因子相互作用關(guān)系的試劑；可以作為檢測牛、羊、人等一些哺乳動物健康腦組織中成熟Prpe存在的檢測試劑；有可 能作為檢測動物蛋白詞料中存在PrPl勺檢測試劑?？傊琺ab-mPrP-N59可以作 為成熟PrP的研究試劑和診斷試劑，可以應(yīng)用于Western Blotting、 ELISA和免 疫組化等免疫學(xué)研究和診斷方法中。在本發(fā)明獲得的mab-mPrP-N59輕、重鏈可變區(qū)編碼基因基礎(chǔ)上，通過添加 合適的酶切位點和短的連接肽，可以將兩者連接起來，插入表達載體，導(dǎo)入大 腸桿菌、酵母菌或者其它真核細胞中，進行誘導(dǎo)表達，從而獲得相應(yīng)的單鏈抗 體。這些單鏈抗體可以代替mab-mPrP-N59作為哺乳動物成熟PrP的研究和診斷 試劑。附基因序列表 重組質(zhì)粒pET-PrP(25-242aa)編碼序列〈4QO 1g33ttG3柳agGg3GGa83acctggaggaggatggaacactggggggag50ccgataccc3ggacagggcagtGGtggaggcaacGgttatccacGtcagg100gagggggtggGtggggtC3gGGGcatggaggtggctggggccagcctcat150卿ggtggctggggccaacctcatggaggtggctggggtc3gGCGC3tgg200tggtggctggggacagccacatggtggtggaggctggggtcaaggtggta250GGGaGggtC3atgga3ca8aGGG3gta3gCcatg卿cat300gtggcaggagctgctgcagctggagcagtggt3gggggCGttggtggct3350G3tgGtggg3agtgGG3tgagG3ggCCtGttatacattttggcagtgact400atgaggaccgttactatcgtg333acatgcaGGgttacccG38GG33gtg450t3Ct3C3ggCcagtggatcagtatagtaaccagaacaattttgtgcttga500ctgtgtG3acatcacagtcaaggaacacac3gtG3CC3CC3ccaccaagg550gggagaacttcaccgaa3ctgacacc卿3tgatggagcgagtggtggag600caaatgtgcattaccc3gtaCG3g3g3g33tGGcaggctt3ttaccaacg650aggggcaagtCtCg3g666mab-mPrP-N59的輕鏈可變區(qū)編碼基因序列<400> 2 gac3ttgtg3 tg3ccc3gtc tcctgcttcc ttagctgt3t ctctggggca 50 g3gggGG3cc atctG3t3C3 gggccagc33 a3gtgtc3gt 3catctggct 100at3gttatatgcactggaacC33C3g333GC3ggacagccacccagactc150ctcatctatcttgtatccaacctag3atctggggtccctgccaggttcag200tggcagtgggtCtggg3C3gacttcaccctcaacatccatcctgtggagg250aggaggatgctgcaacct3ttactgtcagcacattagggagcttacacgt300tcggagggggg3CC33gCtggaaataaaacgggctgatgctgcaccaact350gtatccatc359mab-mPrP-N59的重鏈可變區(qū)編碼基因序列<400> 3tgaggagacggtgaccgtggtcccttggccccagtagtcggtcccctctc50ttgcacagtaatagaccgcagagtcctcagatgtcagactgctgaggtgc100atgtaggctgtgttggaggattcgtctacagtcaatgtggccttgccctt150gaacttttg3ttgtagtttgC3t33tt3tCagaagtatcaatcgctccga200tccactcaaggCCttgtCC3ggGCtctgGttC3CGC3gtgcatccagtag250tcagtgaatgtgtagcc柳agccttgcagg3G3tcttC3ctgaagcccc3003ggcatcaca3CCtC3gCCCcggactcctgcagctccacct34權(quán)利要求
1、抗牛成熟朊蛋白mPrP的單克隆抗體mab-mPrP-N59，其特征在于其輕鏈可變區(qū)基因為序列表&lt;400&gt;2，其重鏈可變區(qū)基因為序列表&lt;400&gt;3。
2、 權(quán)利要求1所述的抗牛成熟朊蛋白mPrP的單克隆抗體mab-mPrP-N59 的制備方法，其特征是以牛mPrP編碼基因為目的產(chǎn)物選擇模板與引物，用聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增出牛mPrP編碼基因，用￡CORI和屈ol雙酶切擴增產(chǎn)物和原核 表達載體，回收酶切產(chǎn)物，在連接酶的作用下將酶切后的mPrP編碼基因和原核 表達載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入￡.Co// JM109感受態(tài)細胞中進行培養(yǎng)，然后將 培養(yǎng)菌液涂布于含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單菌落經(jīng)鑒定后擴大培養(yǎng)， 提取獲得含有牛mPrP編碼基因的重組表達質(zhì)粒，將此重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入ECb// JM109(DE3)中，經(jīng)鑒定正確后，進行誘導(dǎo)表達，純化、復(fù)性表達產(chǎn)物，以經(jīng)純 化復(fù)性的表達產(chǎn)物為免疫原免疫小鼠，取免疫鼠的脾細胞與鼠骨髓瘤細胞融合， 篩選出雜交瘤細胞株，并克隆出陽性雜交瘤細胞株，在鼠體內(nèi)接種雜交瘤細胞 生產(chǎn)腹水抗體，取出腹水進行純化得到抗牛成熟朊蛋白的單抗。
3、 權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是采用含有牛PrP編碼基因ORF 的克隆質(zhì)粒boPrP-T為模板，采用的上游引物F-NEPrP為 5-ccggaattcaagaagcgaccaaaacctg-3 采用的下游引物R-bnPrP3為 5-ccgctcgagacttgcccctcgttggta-3 用￡coRI和lol雙酶切克隆的mPrP編碼基因和pET-30a(+)表達載體，連接雙 酶切產(chǎn)物，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至ECo// JM109感受態(tài)細胞中，然后將轉(zhuǎn)化后菌液 涂布于含卡那霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單菌落后擴大培養(yǎng)，得到含有牛mPrP 編碼基因的重組表達質(zhì)粒pET-PrP(25-242aa)的五.Co// JM109菌株pET-mPrP -JM109,從菌株pET-mPrP-JM109中提出質(zhì)粒pET-PrP(25-242aa)，再轉(zhuǎn)化至表 達用菌株五.Co// JM109(DE3)感受態(tài)細胞中，用轉(zhuǎn)化后菌液涂布于含卡那霉素的 LB瓊脂粉平板培養(yǎng)，獲得含有質(zhì)粒pET-PrP(25-242aa)的Co//JM109(DE3)菌 株——pET-mPrP-JDE3，再將此菌株接種至含有50嗎/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基 中震蕩培養(yǎng)，使重組牛mPrP被E Co// JM109(DE3)在IPTG誘導(dǎo)下進行高效表 達，純化表達產(chǎn)物，以此純化的重組牛mPrP蛋白為免疫原免疫小鼠，取免疫鼠的脾細胞與鼠骨髓瘤細胞融合，采用間接ELISA方法篩選融合的雜交瘤細胞株，再用有限稀釋法克隆篩選的陽性雜交瘤細胞株，獲得了能夠穩(wěn)定分泌抗重組牛mPrP的陽性雜交瘤細胞株-一-csPrP-N59，在鼠體內(nèi)接種雜交瘤細胞csPrP-N59， 生產(chǎn)腹水抗體，抽取腹水，離心收集上清液，進行純化得到抗牛成熟朊蛋白mPrP 的mab-mPrP-N59。
4、 權(quán)利要求3所述的方法制備的重組質(zhì)粒pET-PrP(25-242aa)，其基因序列 為序列表<400>1。
5、 權(quán)利要求1所述的抗牛成熟朊蛋白mPrP的單克隆抗體mab-mPrP-N59 用于制備檢測動物蛋白詞料中存在的PrPC或者動物腦組織中存在的PrPC的診 斷試劑。
6、 權(quán)利要求1所述的抗牛成熟朊蛋白mPrP的單克隆抗體mab-mPrP-N59 的輕鏈和重鏈的編碼基因用來制備抗牛朊蛋白PrP27-30的單鏈抗體。
7、 權(quán)利要求1所述的抗牛成熟朊蛋白mPrP的單克隆抗體mab-mPrP-N59 制備的單鏈抗體用于制備檢測動物蛋白飼料中存在的PrPC或者動物腦組織中存 在的PrPC的診斷試劑。
全文摘要
本發(fā)明公開抗牛成熟朊蛋白的單克隆抗體mab-mPrP-N59及其應(yīng)用。本發(fā)明的單抗是mab-mPrP-N59；其制備方法是以牛mPrP編碼基因為目的產(chǎn)物選擇模板與引物，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增出牛mPrP編碼基因，經(jīng)酶切后將酶切產(chǎn)物與原核表達載體連接，再轉(zhuǎn)入E.Coli JM109感受態(tài)細胞中培養(yǎng)，提取含有牛mPrP編碼基因的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.Coli JM109(DE3)中誘導(dǎo)表達，以經(jīng)純化復(fù)性的表達產(chǎn)物為免疫原免疫小鼠，取免疫鼠的脾細胞與鼠骨髓瘤細胞融合，篩選出雜交瘤細胞株，并克隆出陽性雜交瘤細胞株，在鼠體內(nèi)接種雜交瘤細胞生產(chǎn)腹水抗體，取出腹水進行純化得到抗牛成熟朊蛋白的單抗。
文檔編號G01N33/577GK101260155SQ200810090550
公開日2008年9月10日 申請日期2008年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月28日
發(fā)明者劉永生, 孫德惠, 杰 張, 陳豪泰, 馬麗娜 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所