一種多模式超聲波強(qiáng)化酶解制備谷朊蛋白ace抑制肽的方法
【專利說明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及涉及農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)領(lǐng)域，特指采用逆流式多模式超聲波預(yù)處理谷朊蛋白原料，再利用酶解方法制備谷朊蛋白ACE抑制肽的一種技術(shù)。
[0002]【背景技術(shù)】:
谷朊蛋白是一種非常有潛力的制備生物活性肽的植物蛋白源，其酶解產(chǎn)物可通過顯著地抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的活性，而達(dá)到降低血壓的目的。然而，由于谷朊蛋白疏水性氨基酸含量高(主要含Pro、Gln、Leu, Ala)，溶解性較差，分散性差遇水易形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，造成谷朊蛋白不能與酶充分的結(jié)合，酶解效率較低。利用谷朊蛋白制備ACE抑制肽為深度開發(fā)小麥加工副產(chǎn)物提供了新的途徑。
[0003]超聲預(yù)處理蛋白底物可通過改變蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)、蛋白分子顆粒大小，以及分子之間結(jié)合的緊密程度而改善蛋白原料的酶解特性，提高產(chǎn)品活性。然而，超聲處理時間、超聲頻率和工作模式直接影響到蛋白結(jié)構(gòu)的變化程度，這種變化與其酶解特性的改善和生物活性的提尚密切相關(guān)。
[0004]研宄發(fā)現(xiàn)，雙頻或者多頻超聲組合福射對聲化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)額的提高具有明顯的增強(qiáng)效應(yīng)，雙頻或者多頻超聲同時輻射的合效應(yīng)均明顯大于各頻率超聲單獨(dú)輻射效應(yīng)之和。例如，28 kHz與1.7 MHz組合的雙頻超聲組合的雙頻超聲組合輻射，當(dāng)取1.7 MHz超聲強(qiáng)度大于3 W/cm2時，其合效應(yīng)約為單獨(dú)效應(yīng)之和的1.5倍；當(dāng)1.7 MHz改為1.06 MHz或0.87MHz時，其合效應(yīng)可接近單獨(dú)效應(yīng)之和的2倍。這說明雙頻超聲在蛋白質(zhì)改性方面也就用明顯的優(yōu)勢?，F(xiàn)有文獻(xiàn)對聲的研宄大多是在單頻工作模式下，或者是雙頻超聲單一工作模式下進(jìn)行的。未提及多模式超聲對底物蛋白的作用效果。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的目的是采用探頭式多模式超聲設(shè)備對谷朊蛋白進(jìn)行預(yù)處理，旨在提高谷朊蛋白的酶解產(chǎn)物的降血壓活性，縮短酶解時間。開發(fā)一種具有良好療效的，安全的，價格合理的食物蛋白源的降血壓活性肽。本發(fā)明上述目的是通過以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)的:
先對蛋白溶液進(jìn)行超聲預(yù)處理，再進(jìn)行酶解反應(yīng)。具體技術(shù)方案是:(1)谷朊蛋白用
0.003 mo I/L的稀堿溶液配成物料濃度為40 g/L的懸浮液，施加超聲處理，其中逆流式多模式超聲的工作模式為順序工作、同步工作。順序工作的超聲頻率為:20-35 kHz、雙頻超聲時間為5 s、5 s，同步工作的超聲波頻率為20-28 kHz，脈沖時間10 S，間歇時間5 S。單位體積超聲功率為200 W/L，預(yù)處理時間15 min。(2)加蛋白酶酶解:加4560 U/g堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解過程中保持PH 8.5，溫度50 °C。酶解時間30 min，100°C下滅酶10 min,1000g下離心10 min，收集上清液，即可得到蛋白降血壓肽的提取液。
[0006]本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)是:
本發(fā)明采用超聲預(yù)處理原料蛋白對超聲作用后酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性進(jìn)行了研宄。經(jīng)過順序雙頻超聲預(yù)處理后，改善了酶解效果，提高了酶解產(chǎn)物的活性。與傳統(tǒng)酶解方法相比酶解液的ACE抑制率活性提高16.4%?25.4%，與逆流式單頻超聲相比酶解液的ACE抑制率活性提高6.0%?13.7%。
[0007]下面通過附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0008]【附圖說明】:
圖1為本發(fā)明使用的順序三頻超聲預(yù)處理谷朊蛋白的設(shè)備圖。
【具體實(shí)施方式】
[0009]I為多模式超聲波智能控制面板，能控制超聲波進(jìn)行單頻工作、雙頻順序工作、雙頻同時工作。10為基礎(chǔ)頻率20 kHz的超聲波發(fā)生器。9分別為28、35、40、50 kHz的超聲波發(fā)生器，單臺超聲波發(fā)生器功率為100 W? 2為基礎(chǔ)頻率20 kHz的超聲波探頭，3為另一組合探頭。7為物料入口，5為料液出口。6為控溫水入口，8為控溫水出口。11為控溫系統(tǒng)。
[0010]人體中過多的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)是引起血壓升高的重要原因之一。因此本發(fā)明以酶解產(chǎn)物對ACE的抑制率評價其降血壓活性。酶解產(chǎn)物ACE抑制活性的測定按照文獻(xiàn) “J.Jia, H.Ma, ff.Zhao, The use of ultrasound for enzymatic preparat1nof ACE-1nhibitory peptides from wheat germ protein, Food Chemistry.119 (2010)336-342.”的方法進(jìn)行，以馬尿酰組氨酰亮氨酸(Hippury1-His-Leu，HHL)作為ACE催化的底物，研宄其吸光度的變化，利用高效液相色譜法測定。
[0011]對照例1:傳統(tǒng)酶解
用0.003 mol/L稀堿溶液配制成4% (W/W)的谷朊蛋白懸浮液1.0 L，放入帶轉(zhuǎn)子的30攝氏度恒溫水浴鍋中攪拌15 min，加入4560 U/g (E/S)堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解過程中保持pH 8.5，溫度50°C，酶解30 min，之后沸水浴滅酶10 min，1000g下離心10 min，收集上清液，稀釋4倍后測定ACE抑制活性。經(jīng)過測定，谷朊蛋白酶解產(chǎn)物稀釋液的ACE抑制率為63.9%。
[0012]對照例2:20 kHz單頻超聲預(yù)處理輔助酶解
用0.003 mol/L稀堿溶液配制成4% (W/W)的谷朊蛋白懸浮液1.0 L，采用20 kHz單頻探頭式超聲波處理谷朊蛋白懸浮液，超聲初始溫度30°C，功率200 W/L，脈沖時間10 S，間歇時間5 S，預(yù)處理時間15 min。超聲結(jié)束后加入4560 U/g (E/S)堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解過程中保持pH 8.5，溫度50°C，酶解時間30 min，之后沸水浴滅酶10 min，1000g下離心10 min，收集上清液，稀釋4倍后測定ACE抑制活性。經(jīng)過測定，谷朊蛋白酶解產(chǎn)物稀釋液的ACE抑制率為70.2%。
[0013]對照例3:28 kHz單頻超聲預(yù)處理輔助酶解
實(shí)驗(yàn)過程同對照例2，其不同為單頻頻率為28 kHz ο經(jīng)過測定，谷朊蛋白酶解產(chǎn)物稀釋液的ACE抑制率為69.3%ο
[0014]對照例4:35 kHz單頻超聲預(yù)處理輔助酶解
實(shí)驗(yàn)過程同對照例2，其不同為單頻頻率為35 kHz ο經(jīng)過測定，谷朊蛋白酶解產(chǎn)物稀釋液的ACE抑制率為71.5%。
[0015]對照例5:40 kHz單頻超聲預(yù)處理輔助酶解
實(shí)驗(yàn)過程同對照例2，其不同為單頻頻率為40 kHz ο經(jīng)過測定，谷朊蛋白酶解產(chǎn)物稀釋液的ACE抑制率為68.1%。
[0016]對照例6:50 kHz單頻超聲預(yù)處理輔助酶解
實(shí)驗(yàn)過程同對照例2，其