專(zhuān)利名稱(chēng)：人g蛋白偶聯(lián)受體的內(nèi)源形式和非內(nèi)源形式的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本專(zhuān)利申請(qǐng)文件所公開(kāi)的發(fā)明涉及跨膜受體；具體地講，涉及與人G蛋白偶聯(lián)的受體，特別是內(nèi)源人GPCR；尤其強(qiáng)調(diào)的是已被改變從而具有或增強(qiáng)了受體的組成性活性的GPCR的非內(nèi)源形式。優(yōu)選將該被改變的GPCR用于作為有可能成為治療劑的受體激動(dòng)劑、反激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑的候選化合物的直接識(shí)別。
背景技術(shù)：
盡管在人體內(nèi)有很多種類(lèi)的受體，但到目前為止最豐富和最與治療有關(guān)的是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。據(jù)估計(jì)，在人類(lèi)基因組內(nèi)有大約100,000個(gè)基因，它們中的大約2％即2,000個(gè)基因被估計(jì)用來(lái)編碼GPCR。包括GPCR在內(nèi)，其內(nèi)源配體已被認(rèn)識(shí)的受體被稱(chēng)為“已知”受體，內(nèi)源配體尚不知曉的受體被稱(chēng)為“孤兒”受體。GPCR代表著藥物產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的一個(gè)重要領(lǐng)域60％的處方藥物開(kāi)發(fā)自100個(gè)已知GPCR中的大約20個(gè)。
GPCR都具有一個(gè)相同的基元(motif)。所有這些受體具有七個(gè)由22到24個(gè)疏水氨基酸組成的序列，它們組成七個(gè)α螺旋，每個(gè)α螺旋都跨過(guò)膜(每個(gè)跨度都以數(shù)字表示，例如，跨膜-1(TM-1)、跨膜-2(TM-2)等)?？缒ぢ菪ㄟ^(guò)氨基酸鏈連接，在細(xì)胞膜的外部即“細(xì)胞外”一邊的氨基酸鏈分別在跨膜-2和跨膜-3、跨膜-4和跨膜-5、跨膜-6和跨膜-7之間(這些分別被稱(chēng)為“細(xì)胞外”區(qū)1、2和3(EC-1、EC-2和EC-3))。在細(xì)胞膜內(nèi)部即“細(xì)胞內(nèi)”一邊，跨膜螺旋也通過(guò)氨基酸鏈進(jìn)行連接，這些氨基酸鏈分別在跨膜-1和跨膜-2、跨膜-3和跨膜-4、跨膜-5和跨膜-6之間(這些分別被稱(chēng)為“細(xì)胞內(nèi)”區(qū)1、2和3(IC-1、IC-2和IC-3))。受體的“羧基”(“C”)端是在細(xì)胞內(nèi)的區(qū)域，受體的“氨基”(“N”)端在細(xì)胞外的區(qū)域。
一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)內(nèi)源配體與受體結(jié)合時(shí)(經(jīng)常被稱(chēng)為受體的“活化”)，細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的構(gòu)象發(fā)生變化，以容許細(xì)胞內(nèi)區(qū)域和細(xì)胞內(nèi)“G-蛋白”進(jìn)行偶聯(lián)。據(jù)報(bào)道，GPCR對(duì)于G蛋白而言是“混雜的”，也就是說(shuō)，可與不只一個(gè)G蛋白相互作用。參見(jiàn)，Kenakin，T.，43，生命科學(xué)(LifeSciences)1095(1988)。盡管存在其他G蛋白，但當(dāng)前已被識(shí)別的G蛋白是Gq、Gs、Gi、Gz和Go。內(nèi)源配體活化的GPCR與G-蛋白的偶聯(lián)引發(fā)一個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)過(guò)程(被稱(chēng)為“信號(hào)傳導(dǎo)”)。在通常情形下，信號(hào)傳導(dǎo)最終導(dǎo)致細(xì)胞活化或細(xì)胞抑制。據(jù)認(rèn)為，受體的IC-3環(huán)與羧基端都和G蛋白相互作用。
在生理?xiàng)l件下，GPCR存在于細(xì)胞膜上，并在“非活化”狀態(tài)和“活化”狀態(tài)這兩種不同構(gòu)象之間保持平衡。在非活性狀態(tài)下的受體不能與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑相偶聯(lián)以產(chǎn)生生物學(xué)反應(yīng)。受體構(gòu)象向活性狀態(tài)的轉(zhuǎn)變就使它與傳導(dǎo)途徑相偶聯(lián)(通過(guò)G-蛋白)并產(chǎn)生生物學(xué)反應(yīng)。
可通過(guò)內(nèi)源配體或化合物如藥物將受體穩(wěn)定在其活性狀態(tài)。近來(lái)的發(fā)現(xiàn)提供了除內(nèi)源配體或藥物之外能夠促進(jìn)和穩(wěn)定受體到活性狀態(tài)構(gòu)象的方法，這包括但不限于對(duì)受體的氨基酸序列的修飾。這些方法通過(guò)模仿與受體結(jié)合的內(nèi)源配體的作用來(lái)有效地穩(wěn)定活性狀態(tài)的受體。通過(guò)如此的配體非依賴(lài)性方法形成的穩(wěn)定被稱(chēng)為“組成型受體活化”。
發(fā)明概述這里公開(kāi)的是人GPCR的內(nèi)源和非內(nèi)源形式及其應(yīng)用。
附圖的簡(jiǎn)要描述


圖1顯示了在與對(duì)照(“CMV”)相比下內(nèi)源形式的RUP12(‘RUP12’)產(chǎn)生的第二信使IP3。
圖2是基于細(xì)胞的第二信使環(huán)AMP分析結(jié)果的圖形，顯示內(nèi)源形式RUP13(“RUP13”)與對(duì)照載體(“CMV”)的組成型信號(hào)發(fā)送的比較結(jié)果。
圖3是比較CMV、內(nèi)源形式RUP13(“RUP13wt”)和非內(nèi)源形式組成型活化的RUP13(“RUP13(A268K)”)信號(hào)測(cè)量結(jié)果的圖示，其中使用以8XCRE-Luc報(bào)告質(zhì)粒。
圖4是[35S]GTPγS分析結(jié)果的示意圖，顯示RUP13Gs融合蛋白(“RUP13-Gs”)和對(duì)照載體(“CMV”)的組成型信號(hào)發(fā)送的比較結(jié)果。
圖5是比較CMV、內(nèi)源形式RUP14(“RUP14wt”)和非內(nèi)源形式組成型活化的RUP13(“RUP14(L246K)”)信號(hào)測(cè)量結(jié)果的圖示，其中使用8XCRE-Luc報(bào)告質(zhì)粒。
圖6是比較CMV、內(nèi)源形式RUP15(“RUP15wt”)和非內(nèi)源形式組成型活化的RUP15(“RUP15(A398K)”)信號(hào)測(cè)量結(jié)果的圖示，其中使用8XCRE-Luc報(bào)告質(zhì)粒。
圖7是基于細(xì)胞的第二信使環(huán)AMP分析結(jié)果的圖形，顯示內(nèi)源形式RUP15(“RUP15wt”)、非內(nèi)源形式組成型活化的RUP15(“RUP15(A398K)”)與對(duì)照載體(“CMV”)的組成型信號(hào)發(fā)送的比較結(jié)果。
圖8是[35S]GTPγS分析結(jié)果的示意圖，顯示RUP15Gs融合蛋白(“RUP15-Gs”)和對(duì)照載體(“CMV”)的組成型信號(hào)發(fā)送的比較結(jié)果。
圖9顯示與對(duì)照(“CMV”)相比之下內(nèi)源形式的RUP17(“RUP17”)中產(chǎn)生的第二信使IP3。
圖10顯示與對(duì)照(“CMV”)相比之下內(nèi)源形式的RUP21(“RUP21”)中產(chǎn)生的第二信使IP3。
圖11是比較CMV、內(nèi)源形式RUP23(“RUP23 wt”)和非內(nèi)源形式組成型活化的RUP23(“RUP23(W275K)”)信號(hào)測(cè)量結(jié)果的圖示，其中使用8XCRE-Luc報(bào)告質(zhì)粒。
圖12是幾種針對(duì)RUP13的侯選化合物的初步篩選結(jié)果示意圖；孔A2中提供了“化合物A”的結(jié)果，孔G9中提供了“化合物B”的結(jié)果。
詳細(xì)描述本科學(xué)文獻(xiàn)涉及受體并采用一些術(shù)語(yǔ)來(lái)描述對(duì)受體具有不同作用的配體。為了清楚和前后一致，在本發(fā)明文獻(xiàn)中將由始至終使用下列定義。在這些定義與這些詞語(yǔ)的其他定義沖突時(shí)，選擇下列定義激動(dòng)劑 意味著激活細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的物質(zhì)(例如，配體、候選化合物)，此時(shí)它們結(jié)合受體或促進(jìn)GTP與膜結(jié)合。
在此應(yīng)用的氨基酸縮寫(xiě)列于下表A表A
部分激動(dòng)劑 意味著這樣的物質(zhì)(例如，配體、候選化合物)，它們與受體結(jié)合時(shí)，激活細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)或者促進(jìn)GTP與膜結(jié)合的程度低于激動(dòng)劑。
拮抗劑 意味著這樣的物質(zhì)(例如，配體、候選化合物)，它和激動(dòng)劑在同一位點(diǎn)與受體競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合，但不激活由受體的活性形式引起的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，并可因此抑制由激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑促進(jìn)的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)。拮抗劑在沒(méi)有激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑的情形下并不削弱基本細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)。
候選化合物 意味著一個(gè)將經(jīng)受篩選技術(shù)檢驗(yàn)的分子(例如但不限于化學(xué)化合物)。優(yōu)選的“候選化合物”并不包括對(duì)公眾來(lái)說(shuō)已知選自受體的反激動(dòng)劑、激動(dòng)劑或拮抗劑的化合物，它們以前已通過(guò)非直接的識(shí)別方法被確定(“非直接識(shí)別的化合物”)；更優(yōu)選不包括先前已經(jīng)確定至少在一種哺乳動(dòng)物中具有治療效果的已被非直接識(shí)別的化合物；并且，最優(yōu)選不包括先前已經(jīng)確定的在人體中具有治療用途的已被非直接識(shí)別的化合物。
組合物 是指至少包含一種成分的物質(zhì)；藥物組合物即是組合物的一個(gè)例子。
化合物效應(yīng) 意味著一個(gè)化合物抑制或者刺激受體功能的能力的量度，它與受體結(jié)合親和力相對(duì)。測(cè)定化合物效應(yīng)的典型方法在本專(zhuān)利申請(qǐng)的實(shí)施例部分中進(jìn)一步公開(kāi)。
密碼子 是指三個(gè)一組的核苷酸(或與核苷酸相當(dāng)?shù)脑~)，核苷酸通常由一個(gè)核苷(腺苷(A)、鳥(niǎo)苷(G)、胞苷(C)、尿苷(U)和胸苷(T))偶聯(lián)一個(gè)磷酸基團(tuán)組成，翻譯時(shí)一個(gè)密碼子編碼一個(gè)氨基酸。
被組成型活化的受體 意味著易受組成型受體活化的受體。被組成型活化的受體可以是內(nèi)源的也可以是非內(nèi)源的。
組成型受體活化 意味著不利用它的內(nèi)源配體或其化學(xué)等價(jià)物與受體結(jié)合的方法而使在活性狀態(tài)下的受體穩(wěn)定。
接觸 意味著把至少兩部分放在一起，無(wú)論是在體外系統(tǒng)還是在體內(nèi)系統(tǒng)中。
直接識(shí)別或被直接識(shí)別，與術(shù)語(yǔ)“候選化合物”相聯(lián)系，意味著篩選針對(duì)組成型活化的受體、優(yōu)選針對(duì)組成型活化的孤兒受體、最優(yōu)選針對(duì)組成型活化的與G蛋白偶聯(lián)的細(xì)胞表面孤兒受體的候選化合物。本術(shù)語(yǔ)在任何情形下都不應(yīng)被解釋或被理解為被包括或包括術(shù)語(yǔ)“非直接地識(shí)別”或“非直接地被識(shí)別”。
內(nèi)源意味著由哺乳動(dòng)物天然產(chǎn)生的物質(zhì)。這些只作為例證但卻不是限制。與之相對(duì)比，術(shù)語(yǔ)“非內(nèi)源”在本文中意味著不是由哺乳動(dòng)物(例如但不限于人)或病毒天然產(chǎn)生的。相反，本文中術(shù)語(yǔ)“非內(nèi)源”意味著并非由哺乳動(dòng)物(例如但不限于人)或病毒天然產(chǎn)生的物質(zhì)。例如，在其內(nèi)源形式下并非組成型活化的受體，當(dāng)對(duì)之進(jìn)行操作而使之組成型活化時(shí)，此受體被最優(yōu)選地指稱(chēng)為“非內(nèi)源的被組成型活化的受體”，這只作為例證而不是限制。兩個(gè)用語(yǔ)都可被用來(lái)描述“體內(nèi)”和“體外”系統(tǒng)。例如，在篩選過(guò)程中，內(nèi)源的或非內(nèi)源的受體可被用于體外篩選系統(tǒng)，這也只作為例證而不是限制。作為進(jìn)一步的例子而不是限制，當(dāng)操作哺乳動(dòng)物的基因組以包括非內(nèi)源組成型活化受體時(shí)，可以通過(guò)體內(nèi)系統(tǒng)篩選候選化合物。
在本文的上下文中，“G蛋白偶聯(lián)受體融合蛋白”和“GPCR融合蛋白”是指包含著內(nèi)源的組成型活化的GPCR的非內(nèi)源蛋白，或與至少一個(gè)G蛋白、優(yōu)選G蛋白的α亞基(它是與GTP結(jié)合的亞基)融合的非內(nèi)源組成型活化的GPCR，其中的G蛋白的類(lèi)型優(yōu)選與在天然情況下和內(nèi)源孤兒GPCR偶聯(lián)的G蛋白的類(lèi)型是一致的。例如(但不限制)，在內(nèi)源狀態(tài)，如果G蛋白“Gsα”是與GPCR偶聯(lián)的主要的G蛋白，基于這一具體GPCR的GPCR融合蛋白就是包含與Gsα融合的GPCR的非內(nèi)源蛋白。在某些情況下，正如下文將要描述的那樣，非主要的G蛋白也可以和GPCR融合。G蛋白與組成型活化的GPCR的C末端可直接融合，也可在其兩者之間存在間隔子。
宿主細(xì)胞 意味著能在其中插入質(zhì)粒和/或載體的細(xì)胞。在原核宿主細(xì)胞情形下，當(dāng)宿主細(xì)胞復(fù)制時(shí)質(zhì)粒典型地以自主分子方式復(fù)制(在一般情況下，質(zhì)粒在復(fù)制后被分離出來(lái)以被引入真核宿主細(xì)胞中)；在真核宿主細(xì)胞情形下，質(zhì)粒被整合進(jìn)宿主細(xì)胞的細(xì)胞DNA中，因而，當(dāng)真核細(xì)胞復(fù)制時(shí)，質(zhì)粒復(fù)制。為在此公開(kāi)的本發(fā)明的目的，宿主細(xì)胞優(yōu)選是真核細(xì)胞，更優(yōu)選是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，最優(yōu)選地是從293、293T和COS-7細(xì)胞中選擇出來(lái)的細(xì)胞。
非直接地識(shí)別或非直接地被識(shí)別 意味著發(fā)現(xiàn)藥物的傳統(tǒng)方法，該方法涉及對(duì)內(nèi)源受體特異的內(nèi)源配體的識(shí)別、篩選針對(duì)受體的候選化合物、確定那些干擾或競(jìng)爭(zhēng)配體-受體相互反應(yīng)的化合物、測(cè)量化合物對(duì)至少一個(gè)與活化受體相關(guān)的第二信使途徑影響的效率。
抑制，與用語(yǔ)“反應(yīng)”相聯(lián)系，意味著在一個(gè)化合物存在時(shí)一個(gè)反應(yīng)被降低或阻止，這正好與該化合物不存在時(shí)相反。
反激動(dòng)劑 意味著這樣的物質(zhì)(例如，配體、候選化合物)，它們與內(nèi)源受體或受體的組成型活化形式結(jié)合，并且將由受體的活性形式引發(fā)的基本細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)抑制到正?；A(chǔ)水平以下，該活性水平是在沒(méi)有激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑的情況下觀察的，或者它們降低GTP與膜的結(jié)合。與在沒(méi)有反激動(dòng)劑情況下的基本反應(yīng)相比，基本細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)在反激動(dòng)劑的存在下優(yōu)選被抑制至少30％、更優(yōu)選至少50％、最優(yōu)選至少75％。。
已知受體 意味著其特異的內(nèi)源配體已被識(shí)別的內(nèi)源受體。
配體 意味著對(duì)內(nèi)源的天然產(chǎn)生的受體特異的內(nèi)源的天然產(chǎn)生的分子。
關(guān)于內(nèi)源受體的核苷酸和/或氨基酸序列的突變 意味著這些內(nèi)源序列的特定改造，從而使內(nèi)源的非組成型活化受體的突變型能造成受體的組成型活化。對(duì)于特定序列的等價(jià)物，人受體的后續(xù)突變型被認(rèn)為是人受體的首次突變的等價(jià)物，如果(a)后續(xù)突變型受體的組成型活化水平與受體的首次突變所表明的在本質(zhì)上一樣；和(b)在后續(xù)突變型受體和受體的首次突變之間的序列同源性的百分?jǐn)?shù)是至少80％，更優(yōu)選地是至少90％，最優(yōu)選地是至少95％。在理想的情況下，考慮到在此公開(kāi)的用于進(jìn)行組成型活化的最優(yōu)選的盒包括在內(nèi)源和非內(nèi)源型GPCR之間發(fā)生變化的單一氨基酸和/或密碼子，序列同源性的百分?jǐn)?shù)應(yīng)是至少98％。
非孤兒受體 是指天然存在的內(nèi)源分子，對(duì)天然存在的內(nèi)源配體表現(xiàn)出特異性，配體與受體的結(jié)合使胞內(nèi)信號(hào)途經(jīng)得以活化。
孤兒受體 意味著這樣的內(nèi)源受體，其特異的內(nèi)源配體尚未被識(shí)別或尚未知。
藥物組合物 意味著包括至少一種活性成分的組合物，借助此活性成分可以研究該組合物可在哺乳動(dòng)物(例如但不限于人體)中特定的效果。本領(lǐng)域的那些普通技術(shù)人員將能夠理解和正確評(píng)價(jià)那些適于確定活性成分是否具有基于技術(shù)人員需要的預(yù)期效果的技術(shù)。
質(zhì)粒 意味著載體和cDNA的結(jié)合體。一般，為cDNA復(fù)制和/或表達(dá)蛋白質(zhì)的目的將質(zhì)粒引進(jìn)宿主細(xì)胞。
第二信使意味著受體激活所產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)應(yīng)答。例如，第二信使包括三磷酸肌醇(IP3)，二酰甘油(DAG)，環(huán)AMP(cAMP)，和環(huán)GMP(cGMP)。對(duì)第二信使應(yīng)答的檢測(cè)可以確定是否存在受體活化。此外，對(duì)第二信使應(yīng)答的檢測(cè)可以直接識(shí)別侯選化合物，例如包括反激動(dòng)劑，激動(dòng)劑，部分激動(dòng)劑和拮抗劑。
刺激，與術(shù)語(yǔ)“反應(yīng)”相聯(lián)系，意味著當(dāng)一種化合物存在時(shí)比當(dāng)它不存在時(shí)反應(yīng)增強(qiáng)。
針對(duì)cDNA的載體 意味著能夠?qū)⒅辽僖粋€(gè)cDNA摻入其中且能導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中的環(huán)形DNA。
下面部分的順序安排是為了表達(dá)效果，而不能被解釋為對(duì)下面的公開(kāi)或權(quán)利要求的限制。
A.引言受體的傳統(tǒng)研究一直是基于這樣的前置假定(基于歷史)，即內(nèi)源配體必須首先被識(shí)別，然后才能發(fā)現(xiàn)可以作用于受體的拮抗劑和其他分子。甚至在拮抗劑被首先發(fā)現(xiàn)的情況下，搜索的目光也立即延伸到查找內(nèi)源配體上去。即使在發(fā)現(xiàn)組成型活化受體之后，這種思維模式也一直在受體研究中持續(xù)。在此之前沒(méi)有被認(rèn)識(shí)到的是，是受體的活性狀態(tài)對(duì)發(fā)現(xiàn)受體的激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑和反激動(dòng)劑是最有用的。對(duì)于那些因?yàn)槭荏w的過(guò)度活化和不夠活化而導(dǎo)致的疾病來(lái)說(shuō)，希望得到的治療藥物是能分別用來(lái)減少受體的活性狀態(tài)或增強(qiáng)受體活性的化合物，而并不需要是對(duì)抗內(nèi)源配體的拮抗劑。這是因?yàn)?，一個(gè)降低或增強(qiáng)活化態(tài)受體活性的化合物并不需要結(jié)合在和內(nèi)源配體一樣的位點(diǎn)上。因而，正如本發(fā)明的一個(gè)方法所說(shuō)的那樣，對(duì)治療性化合物的任何搜索可通過(guò)篩選針對(duì)配體非依賴(lài)性活性態(tài)的化合物而開(kāi)始。
B.人GPCR的識(shí)別人類(lèi)基因組計(jì)劃的實(shí)施導(dǎo)致位于人類(lèi)基因組內(nèi)有關(guān)核酸序列的大量信息的識(shí)別，經(jīng)過(guò)這種努力，事實(shí)上，我們無(wú)需了解或認(rèn)識(shí)任何特定的基因組序列是否包含翻譯人類(lèi)蛋白的可讀框信息，即可獲得遺傳序列信息，幾種識(shí)別人類(lèi)基因組中核酸序列的方法都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟悉的，比如(但不限定)，此處公開(kāi)的大量人類(lèi)GPCR，即是通過(guò)回顧GenBankTM數(shù)據(jù)庫(kù)而發(fā)現(xiàn)的。下面的表B，列出了幾個(gè)被我們發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源GPCR，以及與所公開(kāi)的GPCR同源的其他GPCR。
表B
受體同源性對(duì)于進(jìn)一步了解受體在人體中的作用是有用的，在本專(zhuān)利申請(qǐng)文件的下文中，我們將公開(kāi)使這些受體產(chǎn)生突變的技術(shù)，以便建立這些受體的非內(nèi)源組成型活化的形式。
此處公開(kāi)的這些技術(shù)還已經(jīng)應(yīng)用到本領(lǐng)域已知的人其他的孤兒GPCR，隨著本專(zhuān)利申請(qǐng)文件的進(jìn)一步描述，該技術(shù)會(huì)更加明顯。
C.受體篩選篩選出對(duì)應(yīng)于此處公開(kāi)的人GPCR的非內(nèi)源組成型活化形式的候選化合物，可直接識(shí)別在這個(gè)細(xì)胞表面受體上起作用的候選化合物，而不需要使用受體的內(nèi)源配體。利用常規(guī)的、經(jīng)常是商業(yè)可得的技術(shù)，可以確定此處公開(kāi)的人GPCR的內(nèi)源形式在體內(nèi)表達(dá)和/或過(guò)表達(dá)的區(qū)域。也有可能利用這些技術(shù)確定與受體表達(dá)和/或過(guò)表達(dá)關(guān)聯(lián)的相關(guān)疾病/紊亂，這種方法在本專(zhuān)利申請(qǐng)文件中得以公開(kāi)。
制造可以證明此處公開(kāi)的人GPCR組成型活化的突變的技術(shù)，是基于與脯氨酸殘基的距離，據(jù)估計(jì)此殘基位于GPCR的TM6內(nèi)部，這一算法規(guī)則公開(kāi)在2000年4月20日以WO00/22129公布的普通轉(zhuǎn)讓的審查未決的PCT申請(qǐng)PCT/US99/23938中，該申請(qǐng)和其它此處羅列的專(zhuān)利文獻(xiàn)一并引入此文作參考。該算法規(guī)則不是依據(jù)傳統(tǒng)的序列比對(duì)來(lái)預(yù)測(cè)，而是依據(jù)與上述TM6脯氨酸殘基(或也可能是這種脯氨酸殘基的內(nèi)源組成型替代物)的特定距離。通過(guò)使距該殘基(估計(jì)位于受體的IC3區(qū))16個(gè)氨基酸殘基處的氨基酸殘基發(fā)生突變，最好是突變?yōu)橘?lài)氨酸，可以獲得這種活化。其他氨基酸在此位置上的突變可用來(lái)達(dá)到此目的。
D.疾病/紊亂識(shí)別和/或選擇正如下文將要詳細(xì)描述的，最優(yōu)選用本發(fā)明的方法識(shí)別針對(duì)非內(nèi)源的組成型活化的GPCR的反激動(dòng)劑和激動(dòng)劑。如此的反激動(dòng)劑和激動(dòng)劑是治療與這些受體有關(guān)的疾病的藥物探索中先導(dǎo)化合物的理想候選者。因?yàn)榭芍苯幼R(shí)別針對(duì)這些受體的反激動(dòng)劑，因此有可能開(kāi)發(fā)和搜索針對(duì)與這些受體有關(guān)的疾病和紊亂的藥物組合物。例如，檢查患病和正常組織樣品中這些GPCR的存在，現(xiàn)在不僅僅是學(xué)術(shù)研究的問(wèn)題，也是在識(shí)別特定GPCR的內(nèi)源配體的研究道路上所致力解決的問(wèn)題?？稍诮】岛突疾〗M織的寬廣范圍內(nèi)進(jìn)行組織檢查。如此的組織檢查提供了把特異受體與疾病/紊亂相聯(lián)系的優(yōu)選第一步驟。
優(yōu)選人GPCR的DNA序列被用來(lái)制作探針，用于進(jìn)行(a)針對(duì)組織mRNA的斑點(diǎn)印跡和(b)組織樣品中所述受體表達(dá)的RT-PCR識(shí)別。在組織或疾病組織中受體的存在，或者與正常組織相比在疾病組織中受體的濃度提高，可被優(yōu)選地用來(lái)識(shí)別治療方法(包括但不限于)與那種疾病的關(guān)聯(lián)。用這種方法也可很好地把受體定位于器官的區(qū)域。基于受體被定位于其中的特定組織的已知功能，受體假想的功能性角色可被推導(dǎo)出來(lái)。
E.候選化合物的篩選1.一般的GPCR篩選測(cè)定技術(shù)當(dāng)一種G蛋白受體變?yōu)榻M成型活化時(shí)，它與G蛋白(例如，Gq、Gs、Gi、Gz、Go)偶聯(lián)并刺激GTP與G蛋白結(jié)合。接著，借助受體在正常情況下失活，G蛋白作為GTP酶慢慢地把GTP水解為GDP，然而，組成型活化的受體繼續(xù)把GDP轉(zhuǎn)化為GTP。GTP不可水解的類(lèi)似物[35S]GTPγS，可被用來(lái)監(jiān)測(cè)與表達(dá)組成型活化受體的膜的結(jié)合。據(jù)報(bào)道，[35S]GTPγS可被用來(lái)監(jiān)測(cè)在配體存在或不存在的情形下G蛋白與膜的偶聯(lián)。在本領(lǐng)域中著名和可行的其他例證中有此種監(jiān)測(cè)的一個(gè)例證，它由Traynor和Nahorski在1995年所報(bào)道。本測(cè)定系統(tǒng)的一個(gè)優(yōu)選的應(yīng)用是為了初步篩選候選化合物，因?yàn)楸鞠到y(tǒng)對(duì)所有蛋白-偶聯(lián)受體一般可行，而不考慮與受體的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相互作用的那一種特別的G蛋白。
2.特定的GPCR篩選測(cè)定技術(shù)一旦應(yīng)用“一般”G蛋白偶聯(lián)的受體測(cè)定方法(即篩選是激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑或反激動(dòng)劑的化合物的方法)識(shí)別出候選化合物，優(yōu)選進(jìn)一步篩選以確認(rèn)作用在受體位點(diǎn)的化合物。例如，應(yīng)用“一般”測(cè)定方法識(shí)別的化合物可以不與受體結(jié)合，但也可以?xún)H僅從細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與G蛋白“解偶聯(lián)”。
a.Gs，Gz和GiGs刺激腺苷酸環(huán)化酶。另一方面，Gi(和Gz和Go)抑制該酶。腺苷酸環(huán)化酶催化ATP向cAMP的轉(zhuǎn)化；因此，與Gs蛋白偶聯(lián)的組成型活化的GPCR與升高的細(xì)胞內(nèi)cAMP水平相關(guān)聯(lián)。在另一方面，與Gi(和Gz或Go)蛋白偶聯(lián)的組成型活化的GPCR與降低的細(xì)胞內(nèi)cAMP水平相關(guān)聯(lián)。一般情況參見(jiàn)“突觸傳導(dǎo)的非直接機(jī)制(IndirectMechanisms of Synaptic Transmission)”，第8章，從神經(jīng)到大腦(FromNeuron To Brain)(第三版)，Nichols，J.G.等編，Sinauer Associates，Inc.(1992)。因此，檢測(cè)cAMP的方法可被用來(lái)確定一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性的化合物是否是受體的反激動(dòng)劑(即這樣的一個(gè)化合物將能降低cAMP的水平)等。本領(lǐng)域已知的測(cè)定cAMP的不同方法可以被利用；最優(yōu)選的方法依賴(lài)于在基于ELISA的方法中應(yīng)用抗-cAMP的抗體?？杀粦?yīng)用的另一類(lèi)測(cè)定方法是一種全細(xì)胞第二信使報(bào)告基因系統(tǒng)測(cè)定法?；蛏系膯?dòng)子驅(qū)動(dòng)由一個(gè)特別的基因所編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)。環(huán)AMP通過(guò)以下步驟促進(jìn)基因的表達(dá)，即它響應(yīng)促進(jìn)cAMP的DNA結(jié)合蛋白或轉(zhuǎn)錄因子(CREB)的結(jié)合，轉(zhuǎn)錄因子接著在被稱(chēng)為cAMP效應(yīng)元件的特別位點(diǎn)與啟動(dòng)子結(jié)合并驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)。報(bào)告基因系統(tǒng)可被構(gòu)建為具有一個(gè)啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子在報(bào)告基因的前面含有多個(gè)cAMP效應(yīng)元件，例如β-半乳糖苷酶或熒光素酶。因而，一個(gè)被組成型活化的連接Gs的受體引起cAMP的積累，cAMP接著激活報(bào)告蛋白質(zhì)的基因和表達(dá)。β-半乳糖苷酶或熒光素酶等報(bào)告蛋白質(zhì)可用標(biāo)準(zhǔn)生化方法檢測(cè)到(Chen等，1995)。
b.Go和GqGo和Gq與磷脂酶C的活化相聯(lián)系，磷脂酶隨后水解磷酸酯PIP2，并釋放兩種細(xì)胞內(nèi)信使二酰甘油(DAG)和肌醇-1，4，5-三磷酸(IP3)。積累增加的IP3與Gq-和Go-關(guān)聯(lián)的受體相關(guān)聯(lián)。一般情況參見(jiàn)“突觸傳導(dǎo)的非直接機(jī)制(Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission)”，第8章，從神經(jīng)到大腦(From Neuron To Brain)(第三版)，Nichols，J.G.等編，Sinauer Associates，Inc.(1992)。測(cè)定IP3積累的方法可被用來(lái)確定一個(gè)候選化合物是否是例如針對(duì)Gq-或Go-關(guān)聯(lián)受體等的反激動(dòng)劑(即如此的化合物能降低IP3的水平)。Gq關(guān)聯(lián)受體也可用AP1報(bào)告基因測(cè)定方法來(lái)檢測(cè)，因?yàn)镚q依賴(lài)的磷脂酶C引起含有AP1元件的基因活化；因而，活化的Gq關(guān)聯(lián)受體將導(dǎo)致如此基因的表達(dá)增高，而其反激動(dòng)劑將導(dǎo)致如此表達(dá)的降低，激動(dòng)劑將導(dǎo)致如此表達(dá)的升高。進(jìn)行如此測(cè)定的商業(yè)可得的方法是可得的。
3.GPCR融合蛋白內(nèi)源組成型活化的孤兒GPCR或非內(nèi)源組成型活化的孤兒GPCR，用于篩選候選化合物，直接識(shí)別反激動(dòng)劑、激動(dòng)劑和部分激動(dòng)劑，提出了一個(gè)有意思的篩選難題，確切地說(shuō)，在沒(méi)有內(nèi)源配體結(jié)合的情況下，受體仍有活性。因此，為了區(qū)分候選化合物存在或不存在時(shí)的非內(nèi)源受體，這種區(qū)分的目的是要了解這種化合物是否是所述受體的反激動(dòng)劑、激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑或?qū)υ撌荏w根本沒(méi)有影響，最好的辦法就是加強(qiáng)這種差異，使用GPCR融合蛋白就是這樣一種方法。
一般來(lái)講，應(yīng)用上述分析技術(shù)(還有其它的技術(shù))一旦確定非內(nèi)源孤兒GPCR為組成型活化的，就可能確定與內(nèi)源GPCR偶聯(lián)的優(yōu)勢(shì)G蛋白，G蛋白與GPCR的偶聯(lián)提供了可被估計(jì)的信號(hào)途徑。因?yàn)樽詈檬鞘褂貌溉閯?dòng)物表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行篩選，就希望在這個(gè)系統(tǒng)中有內(nèi)源G蛋白存在，確切來(lái)說(shuō)，非內(nèi)源組成型活化的孤兒GPCR在這個(gè)系統(tǒng)中持續(xù)產(chǎn)生信號(hào)。從這點(diǎn)上，優(yōu)選使信號(hào)得到加強(qiáng)，從而在(例如)受體的反激動(dòng)劑存在時(shí)，很可能更方便地區(qū)分與反激動(dòng)劑接觸的不同受體，特別是在篩選的整個(gè)過(guò)程中。
GPCR融合蛋白的作用是增加G蛋白與非內(nèi)源GPCR偶聯(lián)的效應(yīng)，GPCR融合蛋白優(yōu)選用于篩選非內(nèi)源組成型活化的GPCR，因?yàn)檫@種方法增強(qiáng)對(duì)這樣的篩選技術(shù)非常有用的信號(hào)，重要的是有助于產(chǎn)生很大的“信噪”比，這種大信噪比對(duì)篩選此處公開(kāi)的候選化合物是特別優(yōu)選的。
用于GPCR融合蛋白表達(dá)的構(gòu)建體的構(gòu)建技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟悉，商業(yè)可獲得的表達(dá)載體和系統(tǒng)為實(shí)驗(yàn)者提供了各種可以滿足特殊需要的方法，這種GPCR融合蛋白構(gòu)建體重要的衡量標(biāo)準(zhǔn)，就是內(nèi)源GPCR序列與G蛋白序列都符合讀框(最好是，內(nèi)源GPCR的序列位于G蛋白序列上游)，以及必須去除或替代GPCR的“終止”密碼子，從而隨著GPCR的表達(dá)，G蛋白也能表達(dá)。GPCR可以直接連到G蛋白上，或在兩者之間存在間隔殘基(最好不超過(guò)12個(gè)，雖然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以很方便得知這一數(shù)字)。我們喜歡使用間隔子(基于方便)，表達(dá)中不被有效利用的限制位點(diǎn)組成了間隔子。在制造GPCR融合蛋白構(gòu)建體之前，優(yōu)選首先確認(rèn)與非內(nèi)源GPCR偶聯(lián)的G蛋白，因?yàn)橹挥泻苌俚腉蛋白已被識(shí)別，所以?xún)?yōu)選包含G蛋白序列(如通用G蛋白構(gòu)建體)的構(gòu)建體可在其中插入內(nèi)源GPCR序列，這樣可有效地大規(guī)模篩選大量具有不同序列的內(nèi)源GPCR。
如上所述，預(yù)計(jì)與Gi、Gz和Go偶聯(lián)的組成型活化GPCR抑制cAMP的形成，這就需要人們找到基于這些類(lèi)型GPCR的分析方法(如，cAMP信號(hào)隨活化降低，這樣使得直接識(shí)別(例如)反激動(dòng)劑(進(jìn)一步減弱這種信號(hào))更加有趣，正如本文所公開(kāi)的，我們已經(jīng)證實(shí)，對(duì)于這些類(lèi)型的受體，有可能制造不基于內(nèi)源GPCR的內(nèi)源G蛋白的GPCR融合蛋白，盡力建立可行的以環(huán)化酶為基礎(chǔ)的分析方法。舉例來(lái)說(shuō)，內(nèi)源Gi偶聯(lián)受體可以與Gs蛋白融合-我們相信這樣的融合構(gòu)建體在表達(dá)時(shí)，“驅(qū)動(dòng)”或“推動(dòng)”內(nèi)源GPCR與如Gs而不是“天然”的Gi蛋白偶聯(lián)，從而能夠建立以環(huán)化酶為基礎(chǔ)的分析方法。對(duì)與Gi、Gz、Go偶聯(lián)的受體，當(dāng)使用GPCR融合蛋白并且分析是以腺苷酸環(huán)化酶活性測(cè)定為基礎(chǔ)時(shí)，我們優(yōu)選用Gs(或刺激腺苷酸環(huán)化酶形成的G蛋白類(lèi)似物)來(lái)建立融合構(gòu)建體。
Gq蛋白與Gs、Gi、Gz或Go蛋白融合的G蛋白融合構(gòu)建體也同樣有效。更優(yōu)選的是Gq蛋白缺失G蛋白α亞單位(“Gαq”)的前六個(gè)氨基酸，并且Gαq的C末端后五個(gè)氨基酸被目的G蛋白α亞單位的相應(yīng)氨基酸替代所獲得的融合構(gòu)建體。例如，融合構(gòu)建體可能是Gq(缺失6個(gè)氨基酸)和Gi蛋白的融合，產(chǎn)生“Gq/Gi融合構(gòu)建體”。我們相信該融合構(gòu)建體可以推動(dòng)內(nèi)源Gi偶聯(lián)受體與其非內(nèi)源G蛋白-Gq偶聯(lián)，從而可對(duì)第二信使(例如，三磷酸肌醇或二酰甘油)而非cAMP的產(chǎn)生進(jìn)行檢測(cè)。
4.與靶Gi偶聯(lián)的GPCR和與信號(hào)增強(qiáng)子Gs偶聯(lián)的GPCR共轉(zhuǎn)染(基于cAMP的分析)已知Gi偶聯(lián)的受體抑制腺苷酸環(huán)化酶，并因此降低cAMP的產(chǎn)量，這導(dǎo)致難以評(píng)估cAMP的水平。檢測(cè)作為在激活時(shí)主要偶聯(lián)Gi的受體組成型活化指示的cAMP產(chǎn)量的降低可以通過(guò)偶聯(lián)GPCR的Gi與一個(gè)信號(hào)增強(qiáng)子(如在激活時(shí)主要偶聯(lián)Gs的非內(nèi)源性組成型活化受體，如以下公布的TSHR-A623I)共轉(zhuǎn)染得以實(shí)現(xiàn)。顯然，Gs偶聯(lián)受體的組成型活化可基于cAMP產(chǎn)量的增加而判定。Gi偶聯(lián)受體的組成型活化導(dǎo)致cAMP的產(chǎn)量降低。因此，這種共轉(zhuǎn)染的方法意在有效地利用這些“相對(duì)立”的效果。例如，Gs偶聯(lián)的非內(nèi)源組成型活化受體(“信號(hào)增強(qiáng)子”)和內(nèi)源性Gi偶聯(lián)受體(“靶受體”)共轉(zhuǎn)染提供了基本的cAMP信號(hào)(即，盡管Gi偶聯(lián)的受體降低cAMP的水平，但這種降低的效果與組成型活化的Gs偶聯(lián)的信號(hào)增強(qiáng)子所導(dǎo)致cAMP的顯著增加相關(guān)聯(lián))。從而，通過(guò)信號(hào)增強(qiáng)子與組成型活化的靶受體共轉(zhuǎn)染，Gi靶的活性增加(即，降低cAMP水平)，預(yù)計(jì)cAMP水平將進(jìn)一步降低(相對(duì)于基本水平)。
然后，利用基于cAMP的分析對(duì)侯選化合物進(jìn)行分析將成為可能，但有兩個(gè)限制性條件首先相對(duì)于Gi偶聯(lián)的靶受體，可產(chǎn)生“相反”的效應(yīng)，即，Gi偶聯(lián)靶受體的反激動(dòng)劑將增強(qiáng)被測(cè)定的cAMP信號(hào)，而Gi偶聯(lián)靶受體的激動(dòng)劑將降低該信號(hào)；第二，在以下也會(huì)表現(xiàn)，利用這種方法直接識(shí)別的侯選化合物應(yīng)單獨(dú)地評(píng)估，以確保其對(duì)信號(hào)增強(qiáng)性受體無(wú)靶向作用(這可在針對(duì)共轉(zhuǎn)染受體進(jìn)行篩選之前或以后進(jìn)行)。
F.藥物化學(xué)在一般但并非經(jīng)常的情況下對(duì)候選化合物直接識(shí)別與通過(guò)組合化學(xué)技術(shù)產(chǎn)生的化合物聯(lián)合使用，其中隨機(jī)制備幾千種化合物用于此分析。如此篩選的結(jié)果一般將是具有獨(dú)特中心結(jié)構(gòu)的化合物；其后，這些化合物圍繞著一個(gè)優(yōu)選的中心結(jié)構(gòu)而被優(yōu)選進(jìn)行額外的化學(xué)修飾，以進(jìn)一步加強(qiáng)其藥用性質(zhì)。這樣的技術(shù)在該領(lǐng)域中是已知的，并不需要在本專(zhuān)利文件中詳細(xì)描述。
G.藥物組合物為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)而選擇出的候選化合物可應(yīng)用本領(lǐng)域周知的技術(shù)制劑成藥物組合物。適宜的藥物可接受的載體在本領(lǐng)域中是可得的；例如，參見(jiàn)Remington’s Pharmaceuctical Sciences，第16版，1980，MackPublishing Co.(Oslo等編)。
H.其他應(yīng)用盡管公開(kāi)的非內(nèi)源人GPCR的一個(gè)優(yōu)選的應(yīng)用是為了直接識(shí)別作為反激動(dòng)劑、激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑(優(yōu)選地作為藥物使用)的候選化合物，人GPCR的這些形式也可被用于研究之用。例如，帶有GPCR的體外或體內(nèi)系統(tǒng)可被用來(lái)闡釋和理解這些受體在正常和患病的人體狀況中的作用，也可理解當(dāng)它應(yīng)用于理解信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)時(shí)組成型活化的角色。這些非內(nèi)源的人GPCR的價(jià)值由于其獨(dú)特的特點(diǎn)是它們作為研究工具的用途被強(qiáng)化，公開(kāi)的受體可被用來(lái)理解這些受體在人體中的作用，即使在其內(nèi)源配體被識(shí)別之前。公開(kāi)的受體的其他應(yīng)用對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是明顯的，特別是當(dāng)他們閱讀了本申請(qǐng)文件之后。
實(shí)施例下面提供的實(shí)施例，目的是要闡明而不是限制本發(fā)明。特異的核酸序列和氨基酸序列在此公開(kāi)時(shí)，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠?qū)@些序列進(jìn)行較小的修飾，并且得到與下面報(bào)告的相同或基本相似的結(jié)果。使用或了解一個(gè)又一個(gè)序列框(如從鼠的受體到人的受體或從人的受體A到人的受體B)的傳統(tǒng)方式一般是基于序列對(duì)比技術(shù)，通過(guò)把序列排列對(duì)比來(lái)盡量確定共同的區(qū)域。此處公開(kāi)的突變方法不依賴(lài)于這種方式，而是基于算法規(guī)則和與位于人GPCR TM6區(qū)中保守脯氨酸殘基相隔的位置距離。一但這種方式可靠，相信本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠進(jìn)行較小修飾以便得到與此處公開(kāi)的基本相同的結(jié)果(如組成型活化)。認(rèn)為這些修飾均在本公開(kāi)的范圍內(nèi)。
實(shí)施例1內(nèi)源人GPCR1人GPCR的識(shí)別在瀏覽GenBankTM數(shù)據(jù)庫(kù)信息的基礎(chǔ)上，識(shí)別了一些已公開(kāi)的內(nèi)源人GPCR。在檢索數(shù)據(jù)庫(kù)的同時(shí)，下列cDNA克隆也得以識(shí)別，列表如下(表C)。
表C
2.全長(zhǎng)克隆a.hRUP8(Seq.Id.Nos.1&2)公布的人RUP8通過(guò)使用EST數(shù)據(jù)庫(kù)信息(dbEST)得以識(shí)別。在dbEST中搜索時(shí)發(fā)現(xiàn)一個(gè)入藏號(hào)為AL121755的cDNA克隆編碼一個(gè)新的GPCR。以下的PCR引物用于以人睪丸Marathon-Ready cDNA(Clontech)為模板的RT-PCR克隆5’-CTTGCAGACATCACCATGGCAGCC-3’(SEQ.ID.NO.41；正義)和5’-GTGATGCTCTGAGTACTGGACTGG-3’(SEQ.ID.NO.42；反義)用Advantage cDNA多聚酶(Clontech；按商家說(shuō)明進(jìn)行操作)在50μl反應(yīng)液中進(jìn)行PCR，程序?yàn)?4℃30秒；94℃ 10秒；65℃ 20秒，72℃ 1.5分鐘，72℃ 7分鐘，從第二步到第四步循環(huán)35次。
分離出一個(gè)1.2kb的PCR片段，克隆到pCRII-TOPO(Invitrogen)中，并用ABI Big Dye Terminator試劑盒(P.E.Biosystem)測(cè)序。見(jiàn)SEQ.ID.NO.1，可能的RUP8氨基酸序列在SEQ.ID.NO.2中表現(xiàn)。
b.hRUP9(Seq.Id.Nos.3&4)公布的人RUP9基于GenBank的信息得以識(shí)別。搜索數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)入藏號(hào)為AC011375的cDNA克隆來(lái)自5號(hào)染色體的人基因組序列。該全長(zhǎng)RUP9通過(guò)以下引物進(jìn)行PCR克隆5’-GAAGCTGTGAAGAGTGATGC-3’(SEQ.ID.NO.43；正義)和5’-GTCAGCAATATTGATAAGCAGCAG-3’(SEQ.ID.NO.44反義)，并以人基因組DNA(Promega)作為模板。使用Taq Plus Precision多聚酶(Stratagene)在含有5％DMSO的100μl反應(yīng)液中擴(kuò)增。程序?yàn)?4℃ 1分鐘；94℃ 30秒；56℃ 30秒；72℃ 2分鐘；72℃ 5分鐘，從第二步到第四步循環(huán)35次。
從1％的瓊脂糖凝膠中分離1.3kb的PCR片段，克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中，并用ABI Big Dye Terminator試劑盒(P.E.Biosystem)完全測(cè)序。見(jiàn)SEQ.ID.NO.3，可能的RUP8氨基酸序列在SEQ.ID.NO.4中表現(xiàn)。從人基因組DNA分離的RUP9克隆的序列與從信息庫(kù)中所獲序列相符。
c.hRUP10(Seq.Id.Nos.5&6)公布的人RUP10基于GenBank的信息得以識(shí)別。搜索數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)入藏號(hào)為AC008754的cDNA克隆為來(lái)自19號(hào)染色體的人基因組序列。該全長(zhǎng)RUP10通過(guò)以下引物進(jìn)行PCR克隆5’-CCATGGGGAACGATTCTGTCAGCTACG-3’(SEQ.ID.NO.45；正義)和5’-GCTATGCCTGAAGCCAGTCTTGTG-3’(SEQ.ID.NO.46；反義)，并以人白細(xì)胞Marathon-Ready cDNA(Clontech)為模板。用Advantage cDNA多聚酶(Clontech)在50μl反應(yīng)液中進(jìn)行PCR。程序?yàn)?4℃ 30秒；94℃ 10秒；62℃ 20秒，72℃ 1.5分鐘，72℃ 7分鐘，從第二步到第四步循環(huán)35次。分離出1.0kb的PCR片段，克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中，并用ABI Big Dye Terminator試劑盒(P.E.Biosystem)測(cè)序。這種新的人受體RUP10的核酸序列在SEQ.ID.NO.5中進(jìn)行闡明，其可能的氨基酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.6。
d.hRUP11(Seq.Id.Nos.7&8)公布的人RUP11基于GenBank的信息得以識(shí)別。搜索數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)入藏號(hào)為AC013396的cDNA克隆為來(lái)自2號(hào)染色體的人基因組序列。該全長(zhǎng)RUP11克隆通過(guò)以下引物進(jìn)行PCR克隆5’-CCAGGATGTTGTGTCACCGTGGTGGC-3’(SEQ.ID.NO.47；正義)和5’-CACAGCGCTGCAGCCCTGCAGCTGGC-3’(SEQ.ID.NO.48；反義)，并以人基因組DNA(Clontech)為模板。使用TaqPlus Precision DNA多聚酶(Stratagene)在50μl反應(yīng)液中擴(kuò)增。程序?yàn)?4℃ 3分鐘；94℃ 20秒；67℃ 20秒；72℃ 1.5分鐘；72℃ 7分鐘，從第二步到第四步循環(huán)35次。分離出1.3kb的PCR片段，克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中，并用ABI Big Dye Terminator試劑盒(P.E.Biosystem)測(cè)序。這種新的人受體RUP11的核酸序列在SEQ.ID.NO.7中進(jìn)行闡明，其可能的氨基酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.8。
e.hRUP12(Seq.Id.Nos.9&10)公布的人RUP12基于GenBank的信息得以識(shí)別。搜索數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)入藏號(hào)為AP000808的cDNA克隆編碼一個(gè)新的GPCR，其具有與大鼠RTA和人mas1癌基因GPCR的顯著同源性。該全長(zhǎng)RUP12通過(guò)以下引物進(jìn)行PCR克隆5’-CTTCCTCTCGTAGGGATGAACCAGAC-3’(SEQ.ID.NO.49；正義)和5’-CTCGCACAGGTGGGAAGCACCTGTGG-3’(SEQ.ID.NO.50；反義)，并以人基因組cDNA(Clontech)為模板。使用TaqPlus PrecisionDNA多聚酶(Stratagene)擴(kuò)增。程序?yàn)?4℃ 3分鐘；94℃ 20秒；65℃ 20秒；72℃ 2分鐘；72℃ 7分鐘，從第二步到第四步循環(huán)35次。分離出1.0kb的PCR片段，克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中，并用ABI Big Dye Terminator試劑盒(P.E.Biosystem)完全測(cè)序(其核苷酸序列在SEQ.ID.NO.9中進(jìn)行闡明，其可能的氨基酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.10)。
f.hRUP13(Seq.Id.Nos.11&12)公布的人RUP13基于GenBank的信息得以識(shí)別。搜索數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)入藏號(hào)為AC011780的cDNA克隆編碼一個(gè)新的GPCR，其具有與GPCR魚(yú)GPRX-ORYLA的顯著同源性。該全長(zhǎng)RUP13通過(guò)以下引物進(jìn)行PCR克隆5’-GCCTGTGACAGGAGGTACCCTGG-3’(SEQ.ID.NO.51；正義)和5’-CATATCCCTCCGAGTGTCCAGCGGC-3’(SEQ.ID.NO.52；反義)，并以人基因組cDNA(Clontech)為模板。使用TaqPlus PrecisionDNA多聚酶(Stratagene)擴(kuò)增。程序?yàn)?4℃ 3分鐘；94℃ 20秒；65℃ 20秒；72℃ 2分鐘；72℃ 7分鐘，從第二步到第四步循環(huán)35次。分離出1.35kb的PCR片段，克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中，并用ABI Big Dye Terminator試劑盒(P.E.Biosystem)完全測(cè)序(其核苷酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.11，可能的氨基酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.12)。
g.hRUP14(Seq.Id.Nos.13&14)公布的人RUP14基于GenBank的信息得以識(shí)別。搜索數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)入藏號(hào)為AL137118的cDNA克隆為來(lái)自第13號(hào)染色體的人基因組序列。該全長(zhǎng)RUP14通過(guò)以下引物進(jìn)行PCR克隆5’-GCATGGAGAGAAAATTTATGTCCTTGCAACC-3’(SEQ.ID.NO.53；正義)和5’-CAAGAACAGGTCTCATCTAAGAGCTCC-3’(SEQ.ID.NO.54；反義)，并以人基因組DNA(Promega)為模板。使用TaqPlus Precision多聚酶(Stratagene)和5％DMSO擴(kuò)增。程序?yàn)?4℃ 3分鐘；94℃ 20秒；58℃ 2分鐘；72℃ 10分鐘，從第二步到第三步循環(huán)35次。
分離出1.1kb的PCR片段，克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中，并用ABI Big Dye Terminator試劑盒(P.E.Biosystem)測(cè)序。(其核苷酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.13，可能的氨基酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.14。)從人基因組DNA中分離的RUP14克隆序列與從信息庫(kù)中獲得的序列相符。
h.hRUP15(Seq.Id.Nos.15&16)公布的人RUP15基于GenBank的信息得以識(shí)別。搜索數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)入藏號(hào)為AC016468的cDNA克隆為人基因組序列。該全長(zhǎng)RUP15通過(guò)以下引物進(jìn)行PCR克隆5’-GCTGTTGCCATGACGTCCACCTGCAC-3’(SEQ.ID.NO.55；正義)和5’-GGACAGTTCAAGGTTTGCCTTAGAAC-3’(SEQ.ID.NO.56；反義)，并以人基因組DNA(Promega)為模板。使用TaqPlus Precision多聚酶(Stratagene)擴(kuò)增。程序?yàn)?4℃ 3分鐘；94℃ 20秒；65℃ 20秒；72℃ 2分鐘；72℃ 7分鐘，從第二步到第四步循環(huán)35次。
分離出1.5kb的PCR片段，克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中，并用ABI Big Dye Terminator試劑盒(P.E.Biosystem)完全測(cè)序。(其核苷酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.15，可能的氨基酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.16。)從人基因組DNA中分離的RUP15克隆序列與從信息庫(kù)中獲得的序列相符。
i.hRUP16(Seq.Id.Nos.17&18)公布的人RUP16基于GenBank的信息得以識(shí)別。搜索數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)入藏號(hào)為AL136106的cDNA克隆為來(lái)自第13號(hào)染色體的人基因組序列。該全長(zhǎng)RUP16通過(guò)以下引物進(jìn)行PCR克隆5’-CTTTCGATACTGCTCCTATGCTC-3’(SEQ.ID.NO.57；正義，啟始密碼子的5’端)和5’-GTAGTCCACTGAAAGTCCAGTGATCC-3’(SEQ.ID.NO.58；反義，終止密碼子的3’端)，并以人骨骼肌Marathon-Ready cDNA(Clontech)為模板。用Advantage cDNA多聚酶試劑盒在50μl反應(yīng)液中進(jìn)行PCR(Clontech)。程序?yàn)?4℃ 30秒；94℃ 5秒；69℃ 15秒；72℃ 1分鐘；72℃ 5分鐘，從第二步到第四步循環(huán)35次。
分離出1.1kb的PCR片段，克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中，并用T7測(cè)序酶試劑盒(Amsham)完全測(cè)序。(其核苷酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.17，可能的氨基酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.18)。RUP16克隆序列與AL136106的四個(gè)非順序區(qū)段相符，表明RUP16的cDNA含有4個(gè)外顯子。
j.hRUP17(Seq.Id.Nos.19&20)公布的人RUP17基于GenBank的信息得以識(shí)別。搜索數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)入藏號(hào)為AC023078的cDNA克隆為來(lái)自第11號(hào)染色體的人基因組序列。該全長(zhǎng)RUP17通過(guò)以下引物進(jìn)行PCR克隆
5’-TTTCTGAGCATGGATCCAACCATCTC-3’(SEQ.ID.NO.59；正義，含啟始密碼子)和5’-CTGTCTGACAGGGCAGAGGCTCTTC-3’(SEQ.ID.NO.60；反義鏈，終止密碼子的3’端)，并以人基因組DNA(Promega)為模板。用Advantage cDNA多聚酶混合物與5％DMSO在100μl反應(yīng)液中進(jìn)行PCR(Clontech)。程序?yàn)?4℃ 1分鐘；94℃ 15秒；67℃ 20秒；72℃ 1分鐘又30秒；72℃ 5分鐘，從第二步到第四步循環(huán)30次。
從1％瓊脂糖凝膠中分離出970bp的PCR片段，克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中，并用ABI Big Dye Termiantor試劑盒(P.E.Biosystem)測(cè)序。(其核苷酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.19，可能的氨基酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.20)。
k.hRUP18(Seq.Id.Nos.21&22)公布的人RUP18基于GenBank的信息得以識(shí)別。搜索數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)入藏號(hào)為AC008547的cDNA克隆為來(lái)自第5號(hào)染色體的人基因組序列。該全長(zhǎng)RUP18通過(guò)以下引物進(jìn)行PCR克隆5’-GGAACTCGTATAGACCCAGCGTCGCTCC-3’(SEQ.ID.NO.61；正義，啟始密碼子的5’端)和5’-GGAGGTTGCGCCTTAGCGACAGATGACC-3’(SEQ.ID.NO.62；反義，終止密碼子的3’端)，并以人基因組DNA(Promega)為模板。用TaqPlus精確DNA多聚酶(Stratagene)與5％DMSO在100μl反應(yīng)液中進(jìn)行PCR(Clontech)。程序?yàn)?5℃ 5分鐘；95℃ 30秒；65℃ 30秒；72℃ 2分鐘；72℃ 5分鐘，從第二步到第四步循環(huán)35次。
從1％瓊脂糖凝膠中分離出1.3kb的PCR片段，克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中，并用ABI Big Dye Termiantor試劑盒(P.E.Biosystem)測(cè)序。(其核苷酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.21，可能的氨基酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.22)。
1.hRUP19(Seq.Id.Nos.23&24)公布的人RUP19基于GenBank的信息得以識(shí)別。搜索數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)入藏號(hào)為AC026331的cDNA克隆為來(lái)自第12號(hào)染色體的人基因組序列。該全長(zhǎng)RUP19通過(guò)以下引物進(jìn)行PCR克隆5’-CTGCACCCGGACACTTGCTCTG-3’(SEQ.ID.NO.63；正義，啟始密碼子的5’端)和5’-GTCTGCTTGTTCAGTGCCACTCAAC-3’(SEQ.ID.NO.64；反義，含終止密碼子)，并以人基因組DNA(Promega)為模板。用TaqPlus Precision DNA多聚酶(Stratagene)與5％DMSO在100μl反應(yīng)液中進(jìn)行擴(kuò)增。程序?yàn)?4℃ 1分鐘；94℃ 15秒；70℃ 20秒；72℃ 1分鐘30秒；72℃ 5分鐘，從第二步到第四步循環(huán)35次。
從1％瓊脂糖凝膠中分離出1.1kb的PCR片段，克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中，并用ABI Big Dye Termiantor試劑盒(P.E.Biosystem)完全測(cè)序。其核苷酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.23，可能的氨基酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.24)。
m.hRUP20(Seq.Id.Nos.25&26)公布的人RUP20基于GenBank的信息得以識(shí)別。搜索數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)入藏號(hào)為AL161458的cDNA克隆為來(lái)自第1號(hào)染色體的人基因組序列。該全長(zhǎng)RUP20通過(guò)以下引物進(jìn)行PCR5’-TATCTGCAATTCTATTCTAGCTCCTG-3’(SEQ.ID.NO.65；正義，啟始密碼子5’端)和5’-TGTCCCTAATAAAGTCACATGAATGC-3’(SEQ.ID.NO.66；反義，終止密碼子3’端)，并以人基因組DNA(Promega)為模板。用Advantage cDNA多聚酶混合物(Clonetech)與5％DMSO進(jìn)行擴(kuò)增。程序?yàn)?4℃ 1分鐘；94℃ 15秒；60℃ 20秒；72℃ 1分鐘30秒；72℃ 5分鐘，從第二步到第四步循環(huán)35次。
從1％瓊脂糖凝膠中分離出1.0kb的PCR片段，克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中，并用ABI Big Dye Termiantor試劑盒(P.E.Biosystem)測(cè)序。(其核苷酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.25，可能的氨基酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.26)。
n.hRUP21(Seq.Id.Nos.27&28)公布的人RUP21基于GenBank的信息得以識(shí)別。搜索數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)入藏號(hào)為AC026756的cDNA克隆為來(lái)自第13號(hào)染色體的人基因組序列。該全長(zhǎng)RUP21通過(guò)以下引物進(jìn)行PCR克隆5’-GGAGACAACCATGAATGAGCCAC-3’(SEQ.ID.NO.67；正義)和5’-TATTTCAAGGGTTGTTTGAGTAAC-3’(SEQ.ID.NO.68；反義鏈)，并以人基因組DNA(Promega)為模板。用TaqPlus Precision多聚酶(Stratagene)與5％DMSO在100μl反應(yīng)液中進(jìn)行擴(kuò)增。程序?yàn)?4℃ 1分鐘；94℃ 15秒；55℃ 20秒；72℃ 1分鐘30秒；72℃ 5分鐘，從第二步到第四步循環(huán)30次。
從1％瓊脂糖凝膠中分離出1014bp的PCR片段，克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中，并用ABI Big Dye Termiantor試劑盒(P.E.Biosystem)測(cè)序。(其核苷酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.27，可能的氨基酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.28)。
o.hRUP 22(Seq.Id.Nos.29&30)公布的人RUP22基于GenBank的信息得以識(shí)別。搜索數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)入藏號(hào)為AC027026的cDNA克隆為來(lái)自第11號(hào)染色體的人基因組序列。該全長(zhǎng)RUP22通過(guò)以下引物進(jìn)行PCR克隆
5’-GGCACCAGTGGAGGTTTTCTGAGCATG-3’(SEQ.ID.NO.69；正義，含啟始密碼子)和5’-CTGATGGAAGTAGAGGCTGTCCATCTC-3’(SEQ.ID.NO.70；反義，終止密碼子3’端)，并以人基因組DNA(Promega)為模板。用TaqPlus Precision DNA多聚酶(Stratagene)與5％DMSO在100μl反應(yīng)液中進(jìn)行擴(kuò)增。程序?yàn)?4℃ 1分鐘；94℃ 15秒；55℃ 20秒；72℃ 1分鐘30秒；72℃ 5分鐘，從第二步到第四步循環(huán)30次。
從1％瓊脂糖凝膠中分離出970bp的PCR片段，克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中，并用ABI Big Dye Termiantor試劑盒(P.E.Biosystem)完全測(cè)序。(其核苷酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.29，可能的氨基酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.30)。
p.hRUP 23(Seq.Id.Nos.31&32)公布的人RUP23基于GenBank的信息得以識(shí)別。搜索數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)入藏號(hào)為AC007104的cDNA克隆為來(lái)自第4號(hào)染色體的人基因組序列。該全長(zhǎng)RUP23通過(guò)以下引物進(jìn)行PCR5’-CCTGGCGAGCCGCTAGCGCCATG-3’(SEQ.ID.NO.71；正義，ATG為啟始密碼子)和5’-ATGAGCCCTGCCAGGCCCTCAGT-3’(SEQ.ID.NO.72；反義，TCA為終止密碼子)，并以人胎盤(pán)Marathon-Ready cDNA(Clontech)為模板。用Advantage cDNA多聚酶(Clontech)在50μl反應(yīng)液中進(jìn)行擴(kuò)增。程序?yàn)?5℃ 30秒；95℃ 15秒；66℃ 20秒；72℃ 1分鐘20秒；72℃ 5分鐘，從第二步到第四步循環(huán)35次。
從1％瓊脂糖凝膠中分離出1.0kb的PCR片段，克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中，并用ABI Big Dye Terminator試劑盒(P.E.Biosystem)完全測(cè)序。(其核苷酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.31，可能的氨基酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.32)。
q.HRUP24(Seq.Id.Nos.33&34)公布的人RUP25基于GenBank的信息得以識(shí)別。搜索數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)入藏號(hào)為AC026331的cDNA克隆為來(lái)自第12號(hào)染色體的人基因組序列。該全長(zhǎng)RUP25通過(guò)以下引物進(jìn)行PCR克隆5’-GCTGGAGCATTCACTAGGCGAG-3’(SEQ.ID.NO.73；正義，啟始密碼子5’端)和5’-AGATCCTGGTTCTTGGTGACAATG-3’(SEQ.ID.NO.74；反義，終止密碼子3’端)，并以人基因組DNA(Promega)為模板。用Advantage cDNA多聚酶混合物(Clontech)與5％DMSO在100μl反應(yīng)液中進(jìn)行PCR。程序?yàn)?4℃ 1分鐘；94℃ 15秒；56℃ 20秒；72℃ 1分鐘30秒；72℃ 5分鐘，從第二步到第四步循環(huán)35次。
從1％瓊脂糖凝膠中分離出1.2kb的PCR片段，克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中，并用ABI Big Dye Terminator試劑盒(P.E.Biosystem)完全測(cè)序。(其核苷酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.33，可能的氨基酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.34)。
r.hRUP 25(Seq.Id.Nos.35&36)公布的人RUP25基于GenBank的信息得以識(shí)別。搜索數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)入藏號(hào)為AC026331的cDNA克隆為來(lái)自第12號(hào)染色體的人基因組序列。該全長(zhǎng)RUP25通過(guò)以下引物進(jìn)行PCR克隆5’-GCTGGAGCATTCACTAGGCGAG-3’(SEQ.ID.NO.75；正義，啟始密碼子5’端)和5’-AGATCCTGGTTCTTGGTGACAATG-3’(SEQ.ID.NO.76；反義，終止密碼子3’端)，并以人基因組DNA(Promega)為模板。用Advantage cDNA多聚酶混合物(Clontech)與5％DMSO進(jìn)行擴(kuò)增，程序?yàn)?4℃ 1分鐘；94℃ 15秒；56℃ 20秒；72℃ 1分鐘30秒；72℃ 5分鐘，從第二步到第四步循環(huán)35次。
從1％瓊脂糖凝膠中分離出1.2kb的PCR片段，克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中，并用ABI Big Dye Terminator試劑盒(P.E.Biosystem)完全測(cè)序。(其核苷酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.35，可能的氨基酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.36)。
s.hRUP 26(Seq.Id.Nos.37&38)公布的人RUP26基于GenBank的信息得以識(shí)別。搜索數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)入藏號(hào)為AC023040的cDNA克隆為來(lái)自第2號(hào)染色體的人基因組序列。該全長(zhǎng)RUP26通過(guò)RUP26特異性引物進(jìn)行RT-PCR克隆5’-AGCCATCCCTGCCAGGAAGCATGG-3’(SEQ.ID.NO.77；正義，含啟始密碼子)和5’-CCAGACTGTGGACTCAAGAACTCTAGG-3’(SEQ.ID.NO.78；反義，含終止密碼子)，并以人胰臟Marathon-Ready cDNA(Clontech)為模板。用Advantage cDNA多聚酶混合物(Clontech)與5％DMSO在100μl反應(yīng)液中進(jìn)行PCR(Clontech)。程序?yàn)?4℃ 5分鐘；95℃ 30秒；65℃ 30秒；72℃ 2分鐘；72℃ 5分鐘，從第二步到第四步循環(huán)35次。
從1％瓊脂糖凝膠中分離出1.1kb的PCR片段，克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中，并用ABI Big Dye Termiantor試劑盒(P.E.Biosystem)完全測(cè)序。(其核苷酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.37，可能的氨基酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.38)。
t.hRUP27(Seq.Id.Nos.39&40)公布的人RUP27基于GenBank的信息得以識(shí)別。搜索數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)入藏號(hào)為AC027643的cDNA克隆為來(lái)自第12號(hào)染色體的人基因組序列。該全長(zhǎng)RUP27用RUP27特異性引物進(jìn)行PC R克隆5’-AGTCCACGAACAATGAATCCATTTCATG-3’(SEQ.ID.NO.79；正義，含啟始密碼子)和5’-ATCATGTCTAGACTCATGGTGATCC-3’(SEQ.ID.NO.80；反義，終止密碼子3’端)，并以成人腦Marathon-Ready cDNA(Clontech)為模板。用Advantage cDNA多聚酶混合物(Clontech)與5％DMSO在50μl反應(yīng)液中進(jìn)行PCR。程序?yàn)?4℃ 1分鐘；94℃ 10秒；58℃ 20秒；72℃ 1分鐘30秒；72℃ 5分鐘，從第二步到第四步循環(huán)35次。
從1％瓊脂糖凝膠中分離出1.1kb的PCR片段，克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中，并用ABI Big Dye Termiantor試劑盒(P.E.Biosystem)完全測(cè)序。(其核苷酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.35，可能的氨基酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.36)。從人腦中分離的RUP27的cDNA克隆序列被判定與AC027643的五個(gè)非順序區(qū)段相符，表明RUP27的cDNA含有5個(gè)外顯子。
實(shí)施例2制備非內(nèi)源組成型活化的GPCR相信本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員有能力選擇用于核酸序列突變的技術(shù)，下面提供的就是用于制造以上所公開(kāi)的幾種人GPCR非內(nèi)源形式的方法。下面公開(kāi)的突變是基于算法規(guī)則方法，由此第16位氨基酸(位于GPCR的IC3區(qū)域)由保守的脯氨酸(或其內(nèi)源保守替代物)殘基(位于GPCR的TM6區(qū)域，接近TM6/IC3交界處)發(fā)生突變，更優(yōu)選突變?yōu)楸彼?、組氨酸、精氨酸或賴(lài)氨酸殘基，最優(yōu)選突變?yōu)橘?lài)氨酸殘基。
1.Transformer Sited-DirectedTM誘變利用Transformer Sited-DirectedTM誘變?cè)噭┖邪瓷碳艺f(shuō)明，由人GPCR制備非內(nèi)源人GPCR可得以實(shí)現(xiàn)。使用兩個(gè)誘變引物，首先優(yōu)選的是產(chǎn)生賴(lài)氨酸突變的賴(lài)氨酸誘變寡核苷酸，及一個(gè)選擇標(biāo)記寡核苷酸。出于方便的原因，摻入人GPCR中的密碼子突變用標(biāo)準(zhǔn)方式標(biāo)示出來(lái)(表D)表D
2.QuikChangeTMSite-DirectedTM誘變利用QuikChangeTMSited-DirectedTM誘變?cè)噭┖?Stratagene，按商家說(shuō)明)，制備非內(nèi)源人GPCR可得以實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選以?xún)?nèi)源GPCR為模板并使用兩個(gè)誘變引物，同樣優(yōu)選的是賴(lài)氨酸誘變寡核苷酸及一個(gè)選擇標(biāo)記寡核苷酸(試劑盒中自帶)。出于方便的原因，摻入新的人GPCR中的密碼子突變及個(gè)別的寡核苷酸用標(biāo)準(zhǔn)方式標(biāo)示出來(lái)(表E)
表E
然后對(duì)非內(nèi)源人GPCR測(cè)序，將獲得并證實(shí)的核酸和氨基酸序列列入本專(zhuān)利申請(qǐng)文件所附的“序列表”中，并以下面的表F作為概括。
表F
實(shí)施例3受體表達(dá)盡管在本領(lǐng)域中有多種細(xì)胞可用于蛋白質(zhì)的表達(dá)，但最優(yōu)選應(yīng)用的是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。據(jù)預(yù)測(cè)，其基本原因是實(shí)用性，即例如表達(dá)GPCR的酵母細(xì)胞的應(yīng)用，有可能把一種非哺乳動(dòng)物細(xì)胞引入到程序中，此細(xì)胞可能不(其實(shí)，對(duì)于酵母來(lái)說(shuō)，是不)包括偶聯(lián)受體、遺傳機(jī)制和分泌途徑，而這些是經(jīng)過(guò)進(jìn)化用于哺乳動(dòng)物系統(tǒng)的。因此，在非哺乳動(dòng)物細(xì)胞中得到的結(jié)果，盡管是可能有用的，但并不如從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中得到的結(jié)果優(yōu)選。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，COS-7、293和293T細(xì)胞是特別優(yōu)選的，盡管應(yīng)用的特定哺乳動(dòng)物細(xì)胞可按技術(shù)人員的特別需要而被判定。
a.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染第一天，將6×106個(gè)293細(xì)胞接種到10cm的培養(yǎng)板上。第二天，準(zhǔn)備兩支試管(比例是每板用于一支試管)通過(guò)混合4μgDNA(例如pCMV載體、帶有受體cDNA的pCMV載體等)在0.5ml無(wú)血清的DMEM(Gibco BRL)中來(lái)制備試管A；通過(guò)混合24μl lipofectamine(Gibco BRL)在0.5ml無(wú)血清DMEM中制備試管B。把試管A和B互傾混合(幾次)，然后在室溫下溫育30-45分鐘。組合物被稱(chēng)為“轉(zhuǎn)染組合物”。植出的293T細(xì)胞用1XPBS洗滌，然后加入5ml無(wú)血清的DMEM。把1ml轉(zhuǎn)染組合物加入到細(xì)胞中去，然后在37℃/5％CO2下溫育4小時(shí)。接著通過(guò)抽吸移去轉(zhuǎn)染組合物，然后加入10ml的DMEM/10％胎牛血清。接著細(xì)胞在37℃/5％CO2溫育。48小時(shí)后收獲細(xì)胞并用來(lái)進(jìn)行分析。
b.穩(wěn)定的細(xì)胞系Gs融合蛋白將約12X106個(gè)293細(xì)胞接種到15cm的組織培養(yǎng)平板上。在含有10％胎牛血清和1％丙酮酸鈉，L-谷氨酰胺，抗生素的DME高葡萄糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。293細(xì)胞鋪板后24小時(shí)其匯合水平達(dá)到～80％，細(xì)胞用12μg DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。該12μg DNA與60μl lipofectamine和2ml無(wú)血清的DME高葡萄糖培養(yǎng)基混合。從培養(yǎng)平板中吸去培養(yǎng)基，用無(wú)血清培養(yǎng)基潤(rùn)洗細(xì)胞一次。DNA，lipofectamine和培養(yǎng)基的混合物與10ml無(wú)血清培養(yǎng)基一同加入平板。37℃培養(yǎng)4-5小時(shí)后，吸去培養(yǎng)基，加入25ml含血清的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，又一次吸去培養(yǎng)基，加入新鮮的含血清培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，吸去培養(yǎng)基，加入含遺傳霉素(G418藥物，終濃度為500μg/ml)的培養(yǎng)基。含有G418抗性基因的陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞在這時(shí)受到選擇。選擇時(shí)每4到5小時(shí)替換一次培養(yǎng)基。選擇過(guò)程中，細(xì)胞生長(zhǎng)并產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞組，或細(xì)胞分裂進(jìn)行穩(wěn)定的克隆選擇。
實(shí)施例4確定非內(nèi)源GPCR組成型活性的分析多種方法可用來(lái)評(píng)估非內(nèi)源人GPCR的組成型活性，下面的舉例是說(shuō)明性的；本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員有能力決定那些對(duì)他們所需最有益的技術(shù)。
1.細(xì)胞膜結(jié)合分析[355S]GTPγS分析當(dāng)G蛋白偶聯(lián)受體在其活性狀態(tài)，并作為配體結(jié)合或者作為組成型活化的結(jié)果時(shí)，受體與G蛋白偶聯(lián)并刺激GDP的釋放和其后GTP與G蛋白的結(jié)合。G蛋白-受體復(fù)合物的α亞基作為GTP酶并慢慢地水解GTP為GDP，在此點(diǎn)受體通常發(fā)生失活。組成型活化受體繼續(xù)把GDP轉(zhuǎn)化為GTP。不可水解的GTP類(lèi)似物[35S]GTPγS，可被用來(lái)展示[35S]GTPγS與表達(dá)組成型活化受體的膜的增強(qiáng)的結(jié)合。應(yīng)用[35S]GTPγS結(jié)合測(cè)定組成型活化的優(yōu)點(diǎn)是(a)它對(duì)所有G蛋白偶聯(lián)受體是普遍適用的；(b)它鄰近細(xì)胞膜表面，在此處較少可能揀到遇到影響細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的分子。
此試驗(yàn)利用G蛋白偶聯(lián)受體的刺激[35S]GTPγS與表達(dá)相關(guān)受體的細(xì)胞膜結(jié)合的能力。因此本測(cè)定可用于直接識(shí)別法去篩選針對(duì)已知、孤兒和組成型活化G蛋白偶聯(lián)受體的候選化合物。本測(cè)定是普遍的并可用于針對(duì)所有G蛋白偶聯(lián)受體的藥物發(fā)現(xiàn)。GTPγS試驗(yàn)在20mM HEPES、1至大約20mM的MgCl2(盡管20mM是優(yōu)選的，但這個(gè)劑量可針對(duì)結(jié)果的最優(yōu)化進(jìn)行調(diào)整)、pH7.4、含有在0.3和1.2nM之間的[35S]GTPγS(盡管1.2是優(yōu)選的，但這個(gè)劑量可針對(duì)結(jié)果的最優(yōu)進(jìn)行調(diào)整)、12.5到75μg膜蛋白(例如，表達(dá)Gs融合蛋白的293細(xì)胞；本劑量可為最優(yōu)化進(jìn)行調(diào)整)和10μMGDP(這個(gè)劑量可針對(duì)結(jié)果的最優(yōu)化進(jìn)行改造)的結(jié)合緩沖液中溫育一小時(shí)。接著加入麥胚凝集素小珠(25μl，Amersham)，組合物在室溫下再溫育30分鐘，然后試管在1500×g、室溫下離心5分鐘，并在閃爍計(jì)數(shù)器上記數(shù)。
2.腺苷酸環(huán)化酶設(shè)計(jì)用來(lái)進(jìn)行基于細(xì)胞的測(cè)定的Flash PlateTM腺苷酸環(huán)化酶試劑盒(New England Nuclear；目錄號(hào)SMP004A)被改進(jìn)以應(yīng)用于未加工的質(zhì)膜。閃爍板的孔含有閃爍劑包被層，其中含有識(shí)別cAMP的特異抗體。在孔中產(chǎn)生的cAMP可通過(guò)直接和放射性cAMP示蹤物競(jìng)爭(zhēng)與cAMP抗體結(jié)合而被定量。下面是對(duì)測(cè)量表達(dá)受體的整個(gè)細(xì)胞中cAMP水平變化程序的簡(jiǎn)短描述。
在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后大約24小時(shí)收獲轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。小心抽吸培養(yǎng)液并棄去。向各細(xì)胞培養(yǎng)皿中輕緩加入10ml PBS，然后小心地抽吸。每板加入1ml Sigma細(xì)胞解離緩沖液和3ml PBS。將細(xì)胞從平板中吸出，將收獲的細(xì)胞懸液加入50毫升的錐型離心管，然后在室溫1100rpm離心5分鐘。以適當(dāng)量的PBS小心地重懸細(xì)胞沉淀(每板約3ml)。細(xì)胞用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，并用額外的PBS調(diào)整到適當(dāng)?shù)募?xì)胞數(shù)量(最終的體積約為每孔50μl)。
按照制造商的指令制備和維持cAMP標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)緩沖液(含有1μCi示蹤物[125I cAMP(50μl)]的11ml檢測(cè)緩沖液)。為篩選用的分析緩沖液被新鮮制備，它含有50μl刺激緩沖液，3μl的實(shí)驗(yàn)化合物(終濃度為12mM)和50μl的細(xì)胞；分析緩沖液可在冰上貯存?zhèn)溆?。首先向合適的孔中加入50μl的cAMP標(biāo)準(zhǔn)品、接著加入50μl PBSA到孔H-11和H-12。在所有的孔內(nèi)加入50μl刺激緩沖液，使用可分散3μl化合物落液的針形工具將DMSO(或選定的侯選化合物)加入適當(dāng)?shù)目字?，?shí)驗(yàn)化合物的終濃度為12mM，實(shí)驗(yàn)總體積為100μl。然后將細(xì)胞加入孔中，室溫培養(yǎng)60分鐘，然后加入100μl含示蹤cAMP的檢測(cè)混合物。培養(yǎng)板接著再溫育2小時(shí)，然后用Wallac MicroBeta液閃計(jì)數(shù)器記數(shù)。cAMP/孔的數(shù)值從標(biāo)準(zhǔn)cAMP曲線外推，該曲線包括在每個(gè)測(cè)定板之內(nèi)。
3.Gi偶聯(lián)靶GPCR的基于細(xì)胞的cAMP分析TSHR是一種Gs偶聯(lián)的GPCR，當(dāng)活化時(shí)引起cAMP的累積。將氨基酸殘基623突變(即，將丙氨酸殘基變?yōu)楫惲涟彼釟埢?可使TSHR組成型活化。預(yù)期Gi偶聯(lián)受體抑制腺苷酸環(huán)化酶，并因此降低cAMP的水平，從而使cAMP水平的評(píng)估有難度。檢測(cè)作為組成型活化Gi偶聯(lián)受體指示的cAMP產(chǎn)量的降低，一種有效手段是通過(guò)共轉(zhuǎn)染來(lái)實(shí)現(xiàn)的，更優(yōu)選的，是通過(guò)以非內(nèi)源的組成型活化TSHR(TSHR-A623I)(或一個(gè)內(nèi)源組成型活化的Gs偶聯(lián)受體)為“信號(hào)增強(qiáng)子”，和Gi偶聯(lián)的靶GPCR共轉(zhuǎn)染，確立cAMP的基準(zhǔn)水平。在產(chǎn)生非內(nèi)源性Gi偶聯(lián)受體后，非內(nèi)源的靶GPCR與信號(hào)增強(qiáng)子共轉(zhuǎn)染，并用做篩選的材料。在使用cAMP分析時(shí)，我們將利用這一方法有效地產(chǎn)生信號(hào)；該方法優(yōu)選地用于針對(duì)Gi偶聯(lián)受體的侯選化合物的直接識(shí)別。要注意的是，對(duì)于Gi偶聯(lián)GPCR，使用該方法時(shí)，該靶GPCR的反激動(dòng)劑會(huì)增加cAMP信號(hào)而激動(dòng)劑會(huì)降低cAMP信號(hào)。
第一天，293和293細(xì)胞以每孔2×104個(gè)細(xì)胞的密度植于板上。第二天，準(zhǔn)備兩支試管(比例是每板用于一支試管)通過(guò)混合總共4μgDNA的各受體DNA2μg(例如pCMV載體；帶有突變THSR的pCMV載體(TSHR-A623I)；TSHR-A623和GPCR等)在1.2ml無(wú)血清的DMEM(Irvine Scientific，Irvine，CA)中來(lái)制備試管A；通過(guò)混合120μllipofectamine(Gibco BRL)在1.2ml無(wú)血清DMEM中制備試管B。把試管A和B互傾混合(幾次)，然后在室溫下溫育30-45分鐘。組合物被稱(chēng)為“轉(zhuǎn)染組合物”。植出的293細(xì)胞用1XPBS洗滌，然后加入10ml無(wú)血清的DMEM。把2.4ml轉(zhuǎn)染組合物加入到細(xì)胞中去，然后在37℃/5％ CO2下溫育4小時(shí)。接著通過(guò)抽吸移去轉(zhuǎn)染組合物，然后加入25ml的DMEM/10％胎牛血清。接著細(xì)胞在37℃/5％ CO2溫育。24小時(shí)后收獲細(xì)胞并用來(lái)進(jìn)行分析。
設(shè)計(jì)用來(lái)基于細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定的Flash PlateTM腺苷酸環(huán)化酶試劑盒(New England Nuclear；目錄號(hào)SMP004A)，可根據(jù)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員的需要，被改進(jìn)以應(yīng)用于未加工的質(zhì)膜。閃爍板的孔含有閃爍劑包被層，其中含有識(shí)別cAMP的特異抗體。在孔中產(chǎn)生的cAMP通過(guò)直接和放射性cAMP示蹤物競(jìng)爭(zhēng)與cAMP抗體結(jié)合而被定量。下面是對(duì)測(cè)量在表達(dá)受體的全細(xì)胞中cAMP水平變化程序的簡(jiǎn)短描述。
在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后大約24小時(shí)，收獲轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。小心抽吸培養(yǎng)液并棄去。向每一細(xì)胞培養(yǎng)皿中輕緩加入10ml PBS。每板加入1ml Sigma細(xì)胞解離緩沖液和3ml PBS。將細(xì)胞從平板中吸出，將收獲的細(xì)胞懸液加入50毫升的錐型離心管，然后在室溫1100rpm離心5分鐘。以適當(dāng)量的PBS小心地重懸細(xì)胞沉淀(每板約3ml)。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，并用額外的PBS調(diào)整到適當(dāng)?shù)募?xì)胞數(shù)量(最終的體積約為每孔50μl)。
按照制造商的指令制備和維持cAMP標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)緩沖液(含有1μCi示蹤物[125I cAMP(50μl)]的11ml檢測(cè)緩沖液)。為篩選用的分析緩沖液被新鮮制備，它含有50μl刺激緩沖液，3μl的實(shí)驗(yàn)化合物(終濃度為12mM)和50μl的細(xì)胞；分析緩沖液可在冰上貯存?zhèn)溆?。首先向適當(dāng)?shù)目字屑尤?0μl的cAMP標(biāo)準(zhǔn)品、接著加入50μl PBSA到孔H-11和H-12。在所有的孔內(nèi)加入50μl刺激緩沖液，使用可分散3μl混合液的針具將選定的化合物(如TSH)加入適當(dāng)?shù)目字校瑢?shí)驗(yàn)化合物的終濃度為12μM，實(shí)驗(yàn)總體積為100μl。然后將細(xì)胞加入孔中，室溫培養(yǎng)60分鐘，然后加入100μl含示蹤cAMP的檢測(cè)混合物。培養(yǎng)板接著再溫育2小時(shí)，然后用Wallac MicroBeta液閃計(jì)數(shù)器記數(shù)。cAMP/孔的數(shù)值從標(biāo)準(zhǔn)cAMP曲線外推，該曲線包括在每個(gè)測(cè)定板之內(nèi)。
4.基于報(bào)告基因的測(cè)定a.CRE-Luc報(bào)告基因測(cè)定(Gs相關(guān)的受體)293和293T細(xì)胞以每孔2×104個(gè)細(xì)胞的密度植于96孔板上，第二天按商家說(shuō)明用Lipofectamine試劑(BRL)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每6孔轉(zhuǎn)染制備DNA/脂質(zhì)混合物如下100μl DMEM中的260ng質(zhì)粒DNA溫和地與100μl DMEM中的2μl脂質(zhì)混和(260ng質(zhì)粒DNA由以下組成，200ng8×CRE-Luc報(bào)告質(zhì)粒，50ng包含內(nèi)源受體或非內(nèi)源受體的pCMV，或單獨(dú)的pCMV，以及10ng GPRS表達(dá)質(zhì)粒(GPRS在pcDNA3(Invitrogen)中))。8×CRE-Luc報(bào)告質(zhì)粒的制備如下在pβgal-基本載體(Clontech)的BglV-HindIII位點(diǎn)克隆鼠促生長(zhǎng)素抑制素的啟動(dòng)子(-71/+51)，獲得SRIF-β-gal載體，8拷貝的cAMP應(yīng)答元件通過(guò)PCR由腺病毒模板AdpCF126CCRE8獲得(參見(jiàn)，7人基因療法(Human GeneTherapy)1883(1996))，將之克隆到SRIF-β-gal載體的Kpn-BglV位點(diǎn)中，產(chǎn)生8×CRE-β-gal報(bào)告載體，用熒光素酶基因取代8×CRE-β-gal報(bào)告載體中的β-半乳糖苷酶基因，產(chǎn)生8×CRE-Luc報(bào)告質(zhì)粒，所述熒光素酶基因取自pGL3-基本載體(Promega)的HindIII-BamHI位點(diǎn)。室溫下放置30分鐘后，DNA/脂質(zhì)混合物用400μl DMEM稀釋?zhuān)靠准尤?00μl稀釋的混合物，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)后每孔中加入100μl含10％FCS的DMEM。第二天，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞每孔換成200μl含10％FCS的DMEM，8小時(shí)后，用PBS清洗一次，各樣品孔改為100μl不含酚紅的DMEM。次日按商家說(shuō)明用LucLiteTM報(bào)告基因分析試劑盒(Packard)測(cè)定熒光素酶活性并在1450MicroBetaTM閃爍發(fā)光計(jì)數(shù)器(Wallac)上讀數(shù)。
b.AP1報(bào)告基因分析(Gq相關(guān)受體)測(cè)定Gq刺激依賴(lài)的方法依賴(lài)于Gq依賴(lài)的磷脂酶C已知的特性，即它可引起在其啟動(dòng)子含有AP1元件的基因活化。按照上述CREB報(bào)告基因測(cè)定所說(shuō)的程序，使用PathdetectTMAP-1 cis-Reporting System(Stratagene，Catalogue#219073)，其中只是將磷酸鈣沉淀的組分改為410ng pAP1-Luc、80ng pCMV-受體表達(dá)質(zhì)粒和20ng CMV-SEAP。
c.SRF-Luc報(bào)告基因分析(Gq相關(guān)受體)檢測(cè)Gq刺激的一個(gè)方法憑借Gq依賴(lài)性磷脂酶C的已知特性，引起啟動(dòng)子中包含血清應(yīng)答因子的基因活化。PathdetectTMSRF-Luc報(bào)告系統(tǒng)(Stratagene)可用來(lái)分析Gq偶聯(lián)的活性，比如在COS7細(xì)胞中分析Gq偶聯(lián)的活性。應(yīng)用Mammalian TransfectionTM試劑盒(Stratagene，Catalogue#200285)，用該系統(tǒng)中各種質(zhì)粒及標(biāo)明的編碼內(nèi)源或非內(nèi)源GPCR的表達(dá)質(zhì)粒，按商家說(shuō)明轉(zhuǎn)染細(xì)胞。簡(jiǎn)單地講，410ngSRF-Luc、80ng pCMV受體表達(dá)質(zhì)粒和20ng CMV-SEAP(分泌堿性磷酸酶的表達(dá)質(zhì)粒；測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)基中堿性磷酸酶活性以控制樣品間轉(zhuǎn)染效率的差別)，依各個(gè)商家的說(shuō)明與磷酸鈣沉淀組合在一起，一半的沉淀物等量地分配到96孔板的3個(gè)孔中，使細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中保持24小時(shí)。按要求，在最后5個(gè)小時(shí)細(xì)胞與1μM血管緊張素一起培養(yǎng)，然后溶解細(xì)胞，使用LucLiteTM試劑盒(Packard，cat#6016911)和“Trilax1450 Microbeta”液體閃爍發(fā)光計(jì)數(shù)器(Wallac)，按各個(gè)商家的說(shuō)明分析熒光素酶活性，數(shù)據(jù)用GraphPad PrismTM2.0a軟件分析(GraphPad Software Inc.)。
d.胞內(nèi)IP3積累分析(Gq相關(guān)受體)在第一天，含有該受體(內(nèi)源的和/或非內(nèi)源的)的細(xì)胞被接種于24孔培養(yǎng)板上，一般是1×105細(xì)胞/孔(雖然該數(shù)還可優(yōu)化)。在第二天轉(zhuǎn)染細(xì)胞，首先混合在50μl/孔無(wú)血清DMEM中的0.25μgDNA和在50μl/孔無(wú)血清DMEM中的2μl lipofectamine。輕輕地混合溶液并在室溫下溫育15-30分鐘。用0.5ml PBS洗滌細(xì)胞，把400μl無(wú)血清培養(yǎng)基與轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基混合并加到細(xì)胞中。然后在37℃/5％ CO2下溫育細(xì)胞3-4小時(shí)，再移去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，替換為1ml/孔常規(guī)培養(yǎng)基。在第三天，用3H-肌醇標(biāo)記細(xì)胞。簡(jiǎn)短地說(shuō)，移去培養(yǎng)基，細(xì)胞用0.5ml PBS洗滌，接著加入0.5ml/孔無(wú)肌醇/無(wú)血清培養(yǎng)基(GIBCO BRL)和0.25μCi/孔3H-肌醇，在37℃/5％ CO2下溫育細(xì)胞16-18小時(shí)。在第四天，用0.5mlPBS洗滌細(xì)胞，加入0.45ml試驗(yàn)培養(yǎng)基，其中含有無(wú)肌醇/無(wú)血清培養(yǎng)基10μM巴吉林10mM氯化鋰或0.4ml試驗(yàn)培養(yǎng)基和50μl 10×ketaserin(ket)以得到10μM的終濃度。然后在37℃溫育細(xì)胞30分鐘。用0.5ml PBS洗滌細(xì)胞，加入200μl/孔新鮮的/冰冷的終止液(1M KOH、18mM硼酸鈉、3.8mM EDTA)。溶液在冰上放置5-10分鐘或直到細(xì)胞被溶解，然后用200μl新鮮的/冰冷的中和液(7.5％HCl)中和。然后把裂解物轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，加入1ml/管氯仿/甲醇(1∶2)。然后使溶液渦旋15秒鐘，把上層上樣至Biorad AGl-X8TM陰離子交換樹(shù)脂(100-200目)。首先，樹(shù)脂以1∶1.25 W/V的比例用水洗滌，向柱中加載0.9ml的上層溶液。用10ml 5mM肌醇和10ml 5mM的硼酸鈉/60mM甲酸鈉洗滌柱子。肌醇三磷酸酯被洗提入液閃管中，其中含有10ml液閃雞尾，它有2ml0.1M甲酸/1M甲酸銨。通過(guò)用10ml0.1M甲酸/3M甲酸銨洗滌和用ddH2O洗滌兩次來(lái)再生交換柱，柱子貯存在4℃的水中。
典型的結(jié)果列入下面表G表G N/A＝未應(yīng)用如以上實(shí)施例4(1)所示，GTPγS檢測(cè)組成型活化分析的典型結(jié)果是利用人RUP13和人RUP15上的Gs融合蛋白構(gòu)建體得以實(shí)現(xiàn)的。以下表H中列出了該分析所產(chǎn)生的信號(hào)以及信號(hào)間的差異
表H 實(shí)施例5融合蛋白的制備a.GPCRGs融合構(gòu)建體組成型活化的GPCR-G蛋白融合構(gòu)建體的設(shè)計(jì)如下完成建造大鼠G蛋Gsα(長(zhǎng)式；ltoch，H.等，83 PNAS 3776(1986))的5′和3′端，使之包括HindIII(5′-AAGCTT-3′)序列。正確的序列(包括HindIII的側(cè)翼序列)確認(rèn)之后，通過(guò)利用該載體的HindIII限制性位點(diǎn)進(jìn)行亞克隆，將完整的序列插入pcDNA3.1(-)(Invitrogen，cat.no.V795-20)。亞克隆進(jìn)入pcDNA3.1(-)之后，確認(rèn)Gsα序列的正確方向，然后證實(shí)在HindIII序列上帶有大鼠Gsα基因的該經(jīng)修飾的pcDNA3.1(-)，該載體現(xiàn)在可用作“通用的”Gsα蛋白載體。pcDNA3.1(-)載在HindIII位點(diǎn)的上游含有一系列已知的限制性位點(diǎn)，這樣能夠有利地在Gs蛋白上游插入內(nèi)源組成型活化GPCR的編碼序列?？梢詰?yīng)用同樣的方法創(chuàng)造其他“通用的”G蛋白載體，當(dāng)然，可以應(yīng)用其他可買(mǎi)到的或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的載體----重要的標(biāo)準(zhǔn)是GPCR序列處G蛋白序列的上游并與G蛋白序列符合讀框。
RUP13經(jīng)Gs偶聯(lián)，對(duì)于下列典型的GPCR融合蛋白，實(shí)現(xiàn)了與Gsα的融合。
RUP13-Gsα融合蛋白構(gòu)建體的制備如下引物設(shè)計(jì)如下5′-gatc[TCTAGAAT]GGAGTCCTCACCCATCCCCCAG-3′(SEQ.ID.NO.97；有義)5′-gcta[GATATC]CGTGACTCCAGCCGGGGTGAGGCGGC-3′(SEQ.ID.NO.98，反義)小寫(xiě)的核苷酸作為間隔子包含在G蛋白與RUP13間的限制性位點(diǎn)(方括號(hào))中，有義和反義引物分別包含了XbaI和EcoRV限制性位點(diǎn)，間隔子(對(duì)限制性位點(diǎn)有貢獻(xiàn))存在于該G蛋白和RUP15之間。
然后應(yīng)用PCR得到各個(gè)受體序列，用于上面公開(kāi)的Gsα通用載體中的融合，各PCR使用以下程序100ng RUP15 cDNA加到不同的管中，其中各管含有每個(gè)引物(有義和反義)2μl，3μl 10mM dNTP，10μl10×TaqPlusTM精確緩沖液，1μl TaqPlusTM精確聚合酶(Stratagene#600211)，及80μl水。用于RUP15的反應(yīng)溫度和循環(huán)時(shí)間如下在94℃下進(jìn)行1分鐘，然后進(jìn)行94℃ 30秒；62℃ 20秒；72℃ 1分鐘40秒；72℃下進(jìn)行5分鐘，從第2步到第4步循環(huán)35次。PCR產(chǎn)物走1％瓊脂糖凝膠，然后純化(數(shù)據(jù)未顯示)，純化產(chǎn)物用XbaI的EcoRV酶切，所需的插入片段經(jīng)純化連接到Gs通用載體中各自的限制性位點(diǎn)。轉(zhuǎn)化后分離陽(yáng)性克隆并用限制性酶酶切確認(rèn)；用293細(xì)胞按下述程序?qū)崿F(xiàn)表達(dá)，對(duì)RUP15-Gs融合蛋白的每個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序以證實(shí)正確性。(核酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.99，氨基酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.100)。
RUP15經(jīng)Gs偶聯(lián)，對(duì)于下列典型的GPCR融合蛋白，實(shí)現(xiàn)了與Gsα的融合。
RUP15-Gsα融合蛋白構(gòu)建體的制備如下引物設(shè)計(jì)如下5′-TCTAGAATGACGTCCACCTGCACCAACAGC-3′(SEQ.ID.NO.101；有義)5′-gatatcGCAGGAAAAGTAGCAGAATCGTAGGAAG-3′(SEQ.ID.NO.102，反義)小寫(xiě)的核苷酸作為間隔子包含在G蛋白與RUP15間的限制性位點(diǎn)中，有義和反義引物分別包含了EcoRV和XbaI限制性位點(diǎn)，間隔子(對(duì)限制性位點(diǎn)有貢獻(xiàn))存在于該G蛋白和RUP15之間。
然后應(yīng)用PCR得到各個(gè)受體序列，用于上面公開(kāi)的Gsα通用載體中的融合，各PCR使用以下程序100ng RUP15 cDNA加到不同的管中，其中各管含有每個(gè)引物(有義和反義)2μl，3μl 10mM dNTP，10μl10×TaqPlusTM精確緩沖液，1μl TaqPlusTM精確聚合酶(Stratagene#600211)，及80μl水。用于RUP15的反應(yīng)溫度和循環(huán)時(shí)間如下在94℃下進(jìn)行1分鐘，然后進(jìn)行94℃ 30秒；62℃ 20秒；72℃1分鐘40秒；72℃下進(jìn)行5分鐘，從第2步到第4步循環(huán)35次。PCR產(chǎn)物走1％瓊脂糖凝膠，然后純化(數(shù)據(jù)未顯示)。消化經(jīng)純化的產(chǎn)物。純化產(chǎn)物用EcoRV和XbaI酶切，所需的插入片段經(jīng)純化連接到Gs通用載體中各自的限制性位點(diǎn)。轉(zhuǎn)化后分離陽(yáng)性克隆并用限制性酶酶切確認(rèn)；用293細(xì)胞按下述程序?qū)崿F(xiàn)表達(dá)，對(duì)RUP15-Gs融合蛋白的每個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序以證實(shí)正確性。(核苷酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.103，氨基酸序列見(jiàn)SEQ.ID.NO.104)。
b.Gq(6個(gè)氨基酸缺失)/Gi融合構(gòu)建體Gq(缺失)/Gi融合構(gòu)建體的設(shè)計(jì)如下Gαq亞單位的N末端6個(gè)氨基酸(從2到7位的氨基酸，序列為T(mén)LESIM(SEQ.ID.NO.129))被缺失，其C末端的5個(gè)氨基酸(序列為EYNLV，SEQ.ID.NO.130)被Gαi蛋白的相應(yīng)氨基酸(序列為DCGLF，SEQ.ID.NO.131)替代。該融合構(gòu)建體用以下引物進(jìn)行PCR克隆5′-gatcaagcttcCATGGCGTGCTGCCTGAGCGAGGAG-3′(SEQ.ID.NO.132)和5′-gatcggatccTTAGAACAGGCCGCAGTCCTTCAGGTTCAGCTGCAGGATGGTG-3′(SEQ.ID.NO.133)以及帶有血凝素標(biāo)簽的小鼠野生型Gαq的質(zhì)粒63313為模板。小寫(xiě)的核苷酸是間隔子。
使用TaqPlus精確DNA聚合酶(Stratagene)進(jìn)行以下循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)95℃ 2分鐘；95℃ 20秒；56℃ 20秒；72℃ 2分鐘；72℃下進(jìn)行7分鐘，從第2步到第4步循環(huán)35次。PCR產(chǎn)物克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中，并用ABI Big Dye Terminator試劑盒(P.E.Biosystem)測(cè)序。來(lái)自含有該融合構(gòu)建體序列的TOPO克隆的插入片段，通過(guò)兩步克隆，可被穿梭地轉(zhuǎn)移到表達(dá)載體pcDNA3.1(+)的HindIII/BamHI位點(diǎn)處。
實(shí)施例6公開(kāi)的人GPCR的組織分布RT-PCR應(yīng)用RT-PCR確證是否表達(dá)，以及幾種新的人GPCR在組織中的分布。使用的寡核苷酸是GPCR特異性的，以人多種組織cDNA作為模板(MTC，Clontech)。使用Taq DNA多聚酶(Stratagene)在40μl反應(yīng)液中進(jìn)行擴(kuò)增，依照生產(chǎn)商的說(shuō)明使用。將20μl反應(yīng)液進(jìn)行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，分析RT-PCR產(chǎn)物。以下的表J列出了受體，循環(huán)反應(yīng)條件以及使用的引物。
表J
實(shí)施例7規(guī)程直接識(shí)別反激動(dòng)劑和激動(dòng)劑A[35S]GTPγS分析雖然我們已將內(nèi)源組成型活性的GPCR用于直接識(shí)別(例如)作為如反激動(dòng)劑的候選化合物，由于不完全了解的原因，分析內(nèi)的誤差會(huì)變得加重。那么，如上公開(kāi)的GPCR融合蛋白也優(yōu)選與非內(nèi)源組成型活化的GPCR一起應(yīng)用。我們已經(jīng)確定使用這樣的蛋白，分析內(nèi)誤差看起來(lái)基本穩(wěn)定，因此獲得有效的信噪比。這有利于對(duì)候選化合物進(jìn)行更加充分的識(shí)別。因此，對(duì)于直接識(shí)別，比較好的是使用GPCR融合蛋白，并且在用時(shí)，優(yōu)選用到下面的分析規(guī)程。
1.膜制備包含目的組成型活性孤兒GPCR融合蛋白的膜和用于直接識(shí)別作為反激動(dòng)劑、激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑的候選化合物的膜，優(yōu)選按如下步驟制備如下a.材料“膜提取緩沖液”由20mM HEPES和10mM EDTA組成，pH7.4；“膜清洗緩沖液”由20mM HEPES和0.1mM EDTA組成，pH7.4；“結(jié)合緩沖液”由20mM HEPES、100mM NaCl及10mM MgCl2組成，pH7.4。
b.步驟整個(gè)過(guò)程中所有材料均置于冰上。首先，將培養(yǎng)基從匯合的單層細(xì)胞中吸去，隨后用10ml冷的PBS清洗，隨后吸掉，這之后將5ml膜提取緩沖液加到提取細(xì)胞上，隨后將細(xì)胞提取物轉(zhuǎn)移到50ml離心管中(4℃下20,000rpm離心17分鐘)，這之后吸出上清液，將沉淀重懸于30ml膜清洗緩沖液，隨后4℃下20,000rpm離心17分鐘，然后吸出上清液，沉淀重懸于結(jié)合緩沖液中，然后用Brinkman polytronTM均化器進(jìn)行均化(15-20秒劇烈振動(dòng)直到所有材料處懸浮狀態(tài))，此處稱(chēng)之為“膜蛋白”。
2.Bradford蛋白分析均化以后，這些膜的蛋白濃度用Bradford蛋白分析確定。(蛋白可以稀釋成大約1.5mg/ml，等份分裝和冷凍(-80℃)備用；冷凍狀態(tài)下，所用規(guī)程如下分析的當(dāng)天，將冷凍的膜蛋白室溫下溶化，隨后用渦旋振蕩器，然后用polytron以大約12×1000rpm均化約5～10秒；請(qǐng)注意，對(duì)于多次制備，不同制備物的均化之間應(yīng)該徹底洗凈均化器。
a.材料結(jié)合緩沖液(如上)；Bradford染色試劑，Bradford蛋白標(biāo)準(zhǔn)物，按商家說(shuō)明使用(Biorad，cat.no.500-0006)。
b.步驟準(zhǔn)備兩個(gè)試管，一個(gè)含有膜，一個(gè)作為“空白”對(duì)照。每管裝入800μl結(jié)合緩沖液，之后將10μl Bradford蛋白標(biāo)準(zhǔn)物(1mg/ml)加到每個(gè)試管中，然后10μl膜蛋白只加到一個(gè)試管中(空白管中不加)，這之后200μl Bradford染色試劑加到每個(gè)試管中，隨后每個(gè)試管經(jīng)渦旋振蕩，5分鐘后，試管再次渦旋振蕩，將其中的材料轉(zhuǎn)移到比色杯中，然后比色杯用CECIL 3041分光光度計(jì)在595波長(zhǎng)下讀數(shù)。
3.直接識(shí)別分析a.材料
GDP緩沖液由37.5ml結(jié)合緩沖液和2mg GDP(Sigma，cat.no.G.7127)組成，隨后用結(jié)合緩沖液作一系列稀釋以得到0.2μM GDP(每孔中GDP的終濃度為0.1μM GDP)；每孔含有一種候選化合物，終體積為200μl，其中有100μl GDP緩沖液(終濃度0.1μM GDP)，50μl懸浮于結(jié)合緩沖液中的膜蛋白，及50μl溶于結(jié)合緩沖液中的[35S]GTPγS(0.6nM)(每10ml結(jié)合緩沖液2.5μl[35S]GTPγS)。
b.步驟候選化合物最是用96-孔板篩選(可以在-80℃冷凍)，將膜蛋白(或帶有除了GPCR融合蛋白的表達(dá)載體的膜，作為對(duì)照)簡(jiǎn)單地均化至懸浮狀態(tài)，然后用上述的Bradford蛋白分析確定蛋白濃度。然后膜蛋白(和對(duì)照)用結(jié)合緩沖液稀釋成0.25mg/ml(最終分析濃度，12.5μg/孔)，這之后，100μl GDP緩沖液加到Wallac ScintistripTM(Wallac)的每個(gè)樣品孔中，然后用5μl針具將5μl候選化合物轉(zhuǎn)移到這些樣品孔中(5μl在200μl總分析體積中為1∶40比例因而候選化合物最終的篩選濃度10μM)。再有，為避免污染，每次轉(zhuǎn)移步驟后，針具應(yīng)該清洗三次包括水(1X)，乙醇(1X)和水(2X)----多余液體在每次清洗后甩掉，用紙和kimwipe干燥。這之后50μl膜蛋白加到每個(gè)樣品孔中(對(duì)照樣品孔含有不帶GPCR融合蛋白的膜)，室溫下預(yù)育5-10分鐘，這之后，50μl結(jié)合緩沖液中的[35S]GTPγS(0.6nM)加到每個(gè)樣品孔中，隨后室溫下于搖床上溫育60分鐘(再有，本實(shí)施例中，培養(yǎng)板用金屬箔蓋住。然后將板以4000RPM22℃下旋轉(zhuǎn)15分鐘終止分析，然后用8道支管吸凈板，用板蓋蓋住，最后板用設(shè)置在“Prot.#37”檔(依各商家說(shuō)明)的Wallac 1450讀數(shù)。
B.環(huán)AMP分析另一種直接識(shí)別侯選化合物的分析方法是基于環(huán)化酶的分析。除了直接識(shí)別以外，這種方法也可用做獨(dú)立的方法，證實(shí)上述[35S]GTPγS分析所得的結(jié)果。
最好是應(yīng)用經(jīng)改進(jìn)的Flash PlateTM腺苷酸環(huán)化酶試劑盒(NewEngland Nuclear；Cat.no.SMP004A)，按下面的規(guī)程直接識(shí)別出候選化合物為組成型活化的孤兒GPCR的反激動(dòng)劑和激動(dòng)劑。
轉(zhuǎn)染后大約三天收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在含有20mM HEPES(pH7.4)和10mM MgCl2的緩沖液中，通過(guò)將懸浮的細(xì)胞均化來(lái)制備膜，用Brinkman PolytronTM在冰上進(jìn)行均化大約10秒，產(chǎn)生的勻漿4℃下49,000×g離心15分鐘，然后產(chǎn)生的沉淀重懸于含有20mM HEPES(pH7.4)和0.1mM EDTA的緩沖液中，均化10秒，隨后4℃下49,000×g離心15分鐘，產(chǎn)生的沉淀-80℃保存?zhèn)溆?。直接識(shí)別篩選當(dāng)天，將膜沉淀于室溫下緩慢融化，并重懸于含有20mM HEPES(pH7.4)和10mMMgCl2的緩沖液中，產(chǎn)生0.6mg/ml的最終蛋白濃度(重懸的膜置于冰上備用)。
cAMP標(biāo)準(zhǔn)物和測(cè)定緩沖液(2μCi示蹤物[125I cAMP 100μl]加到11ml測(cè)定緩沖液中)，根據(jù)商家說(shuō)明制備并保管。制備新鮮的分析緩沖液用于篩選，其中包含20mM HEPES(pH7.4)，10mM MgCl2，20mM磷酸肌酸(Sigma)，0.1單位/ml肌酸磷酸激酶(Sigma)，50μM GTP(Sigma)，及0.2mM ATP(Sigma)；分析緩沖液可在冰上保存?zhèn)溆谩?br> 優(yōu)選將以上識(shí)別的候選化合物(如冷凍，室溫下融化)加到96孔板的樣品孔中(3μl/孔，12μM的分析終濃度)，與40μl膜蛋白(30μg/孔)和50μl分析緩沖液合在一起。然后將該混合物在室溫下溫育30分鐘，同時(shí)輕輕搖動(dòng)。
溫育完成后，100μl測(cè)定緩沖液加到每個(gè)樣品孔中，隨后放置2～4小時(shí)，然后板在Wallac MicroBetaTM讀板器中用“Prot.#31”檔計(jì)數(shù)(依各商家說(shuō)明操作)。
在
圖12中顯示了一個(gè)具有代表性的篩選分析平板(96孔板)。每條代表各孔中不同化合物，和以上實(shí)施例5(a)中制備的RUP13-Gsα融合蛋白構(gòu)建體的結(jié)果。
圖12中的典型結(jié)果也提供了標(biāo)準(zhǔn)偏差，其獲得是基于各平板平均值(“m”)，平均值連同兩個(gè)從初步篩選過(guò)程中隨機(jī)選取作為“先導(dǎo)”的反激動(dòng)劑，包括選擇出這樣的候選化合物，其反應(yīng)降低率至少為平均反應(yīng)值減去兩倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差。相反的，從初步篩選過(guò)程中任意優(yōu)先選取作為“先導(dǎo)”的激動(dòng)劑，包括選擇出這樣的候選化合物，其反應(yīng)增加率至少為平均反應(yīng)值加兩倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差?；谝陨系倪x擇程序，以下孔中的侯選化合物可分別作為孔A2和G9中RUP13的可能的反激動(dòng)劑(化合物A)和激動(dòng)劑(化合物B)被直接識(shí)別。參見(jiàn)
圖12。為了清楚起見(jiàn)特別說(shuō)明這些化合物在未知該GPCR內(nèi)源配體的情況下被直接識(shí)別。通過(guò)這種基于受體功能而非化合物的結(jié)合親和性的分析技術(shù)，我們可以確認(rèn)能夠降低受體功能活性的化合物(化合物A)，也能確認(rèn)可增加受體功能活性的化合物(化合物B)?；谶@些受體在肺部的定位(見(jiàn)，例如實(shí)施例6中的hRUP13和hRUP21)，可以發(fā)明對(duì)治療肺癌有潛在療效的藥劑。
本專(zhuān)利申請(qǐng)文件中提到的每個(gè)文獻(xiàn)，包括共同未決的申請(qǐng)及相關(guān)專(zhuān)利申請(qǐng)?jiān)趦?nèi)，除非有特別說(shuō)明，均以其全文引入本申請(qǐng)作參考。在本領(lǐng)域技術(shù)人員理解范圍內(nèi)的針對(duì)所公開(kāi)之發(fā)明進(jìn)行的修改和延伸均在上述公開(kāi)及所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
雖然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以得到許多不同的載體為內(nèi)源和非內(nèi)源GPCR的目的使用，但最好是用pCMV載體。按照國(guó)際承認(rèn)用于專(zhuān)利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約，該載體于1998年10月13日保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)(University Blvd，Manassas，VA20110-2209 USA7)。其DNA經(jīng)ATCC測(cè)定并經(jīng)確認(rèn)處于存活狀態(tài)，ATCC為pCMV給出了下列保藏號(hào)ATCC#203351。
序列表序列表<110>阿瑞那制藥公司(Arena pharmaceuticals，Inc.)陳若平(Ruoping CHEN)；鄧杭(Huong T.DANG)；凱文·P·洛斯(Kevin P.LOWITZ)<120>非內(nèi)源組成型活化的人G蛋白偶聯(lián)受體(Non-Endogenous，ConstitutivelyActivated Human G Protein-Coupled Receptors)<130>AREN0087<150>60/166,088<151>1999-11-17<150>60/166,369<151>1999-11-17<150>60/166,099<151>1999-11-17<150>61/171,902<151>1999-12-23<150>60/171,901<151>1999-12-23<150>60/171,900<151>1999-12-23<150>60/181,749<151>2000-02-11<150>60/189,258<151>2000-03-14<150>60/189,259<151>2000-03-14<150>60/195,899<151>2000-04-10<150>60/196,078<151>2000-04-10<150>60/195,898<151>2000-04-10<150>60/200,419<151>2000-04-28<150>60/203,630<151>2000-05-12<150>60/210,741<151>2000-06-12<150>60/210,982<151>2000-06-12<150>60/226,760<151>2000-08-21<150>60/235,779<151>2000-09-26<150>60/235,418<151>2000-09-26<150>60/242,332<151>2000-10-20<150>60/242,343<151>2000-10-20<150>60/243,019<151>2000-10-24<160>133<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1155<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1atggcagccc agaatggaaa caccagtttc acacccaact ttaatccacc ccaagaccat 60gcctcctccc tctcctttaa cttcagttat ggtgattatg acctccctat ggatgaggat120gaggacatga ccaagacccg gaccttcttc gcagccaaga tcgtcattgg cattgcactg180gcaggcatca tgctggtctg cggcatcggt aactttgtct ttatcgctgc cctcacccgc240tataagaagt tgcgcaacct caccaatctg ctcattgcca acctggccat ctccgacttc300ctggtggcca tcatctgctg ccccttcgag atggactact acgtggtacg gcagctctcc360tgggagcatg gccacgtgct ctgtgcctcc gtcaactacc tgcgcaccgt ctccctctac420gtctccacca atgccttgct ggccattgcc attgacagat atctcgccat cgttcacccc480ttgaaaccac ggatgaatta tcaaacggcc tccttcctga tcgccttggt ctggatggtg540tccattctca ttgccatccc atcggcttac tttgcaacag aaacggtcct ctttattgtc600aagagccagg agaagatctt ctgtggccag atctggcctg tggatcagca gctctactac660aagtcctact tcctcttcat ctttggtgtc gagttcgtgg gccctgtggt caccatgacc720ctgtgctatg ccaggatctc ccgggagctc tggttcaagg cagtccctgg gttccagacg780gagcagattc gcaagcggct gcgctgccgc aggaagacgg tcctggtgct catgtgcatt840ctcacggcct atgtgctgtg ctgggcaccc ttctacggtt tcaccatcgt tcgtgacttc900ttccccactg tgttcgtgaa ggaaaagcac tacctcactg ccttctacgt ggtcgagtgc960atcgccatga gcaacagcat gatcaacacc gtgtgcttcg tgacggtcaa gaacaacacc 1020atgaagtact tcaagaagat gatgctgctg cactggcgtc cctcccagcg ggggagcaag 1080tccagtgctg accttgacct cagaaccaac ggggtgccca ccacagaaga ggtggactgt 1140atcaggctga agtga1155<210>2<211>384<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Ala Ala Gln Asn Gly Asn Thr Ser Phe Thr Pro Asn Phe Asn Pro1 5 10 15Pro Gln Asp His Ala Ser Ser Leu Ser Phe Asn Phe Ser Tyr Gly Asp20 25 30Tyr Asp Leu Pro Met Asp Glu Asp Glu Asp Met Thr Lys Thr Arg Thr35 40 45Phe Phe Ala Ala Lys Ile Val Ile Gly Ile Ala Leu Ala Gly Ile Met50 55 60Leu Val Cys Gly Ile Gly Asn Phe Val Phe Ile Ala Ala Leu Thr Arg65 70 75 80Tyr Lys Lys Leu Arg Asn Leu Thr Asn Leu Leu Ile Ala Asn Leu Ala85 90 95Ile Ser Asp Phe Leu Val Ala Ile Ile Cys Cys Pro Phe Glu Met Asp100 105 110Tyr Tyr Val Val Arg Gln Leu Ser Trp Glu His Gly His Val Leu Cys115 120 125Ala Ser Val Asn Tyr Leu Arg Thr Val Ser Leu Tyr Val Ser Thr Asn130 135 140Ala Leu Leu Ala Ile Ala Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Pro145 150 155 160Leu Lys Pro Arg Met Asn Tyr Gln Thr Ala Ser Phe Leu Ile Ala Leu165 170 175Val Trp Met Val Ser Ile Leu Ile Ala Ile Pro Ser Ala Tyr Phe Ala180 185 190Thr Glu Thr Val Leu Phe Ile Val Lys Ser Gln Glu Lys Ile Phe Cys195 200 205Gly Gln Ile Trp Pro Val Asp Gln Gln Leu Tyr Tyr Lys Ser Tyr Phe210 215 220Leu Phe Ile Phe Gly Val Glu Phe Val Gly Pro Val Val Thr Met Thr225 230 235 240Leu Cys Tyr Ala Arg Ile Ser Arg Glu Leu Trp Phe Lys Ala Val Pro245 250 255Gly Phe Gln Thr Glu Gln Ile Arg Lys Arg Leu Arg Cys Arg Arg Lys260 265 270Thr Val Leu Val Leu Met Cys Ile Leu Thr Ala Tyr Val Leu Cys Trp275 280 285Ala Pro Phe Tyr Gly Phe Thr Ile Val Arg Asp Phe Phe Pro Thr Val290 295 300Phe Val Lys Glu Lys His Tyr Leu Thr Ala Phe Tyr Val Val Glu Cys305 310 315 320Ile Ala Met Ser Asn Ser Met Ile Asn Thr Val Cys Phe Val Thr Val325 330 335Lys Asn Asn Thr Met Lys Tyr Phe Lys Lys Met Met Leu Leu His Trp340 345 350Arg Pro Ser Gln Arg Gly Ser Lys Ser Ser Ala Asp Leu Asp Leu Arg355 360 365Thr Asn Gly Val Pro Thr Thr Glu Glu Val Asp Cys Ile Arg Leu Lys370 375 380<210>3<211>1260<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>3atgctggcag ctgcctttgc agactctaac tccagcagca tgaatgtgtc ctttgctcac 60ctccactttg ccggagggta cctgccctct gattcccagg actggagaac catcatcccg120gctctcttgg tggctgtctg cctggtgggc ttcgtgggaa acctgtgtgt gattggcatc180ctccttcaca atgcttggaa aggaaagcca tccatgatcc actccctgat tctgaatctc240agcctggctg atctctccct cctgctgttt tctgcaccta tccgagctac ggcgtactcc300aaaagtgttt gggatctagg ctggtttgtc tgcaagtcct ctgactggtt tatccacaca360tgcatggcag ccaagagcct gacaatcgtt gtggtggcca aagtatgctt catgtatgca420agtgacccag ccaagcaagt gagtatccac aactacacca tctggtcagt gctggtggcc480atctggactg tggctagcct gttacccctg ccggaatggt tctttagcac catcaggcat540catgaaggtg tggaaatgtg cctcgtggat gtaccagctg tggctgaaga gtttatgtcg600atgtttggta agctctaccc actcctggca tttggccttc cattattttt tgccagcttt660tatttctgga gagcttatga ccaatgtaaa aaacgaggaa ctaagactca aaatcttaga720aaccagatac gctcaaagca agtcacagtg atgctgctga gcattgccat catctctgct780ctcttgtggc tccccgaatg ggtagcttgg ctgtgggtat ggcatctgaa ggctgcaggc840ccggccccac cacaaggttt catagccctg tctcaagtct tgatgttttc catctcttca900gcaaatcctc tcatttttct tgtgatgtcg gaagagttca gggaaggctt gaaaggtgta960tggaaatgga tgataaccaa aaaacctcca actgtctcag agtctcagga aacaccagct1020ggcaactcag agggtcttcc tgacaaggtt ccatctccag aatccccagc atccatacca1080gaaaaagaga aacccagctc tccctcctct ggcaaaggga aaactgagaa ggcagagatt1140cccatccttc ctgacgtaga gcagttttgg catgagaggg acacagtccc ttctgtacag1200gacaatgacc ctatcccctg ggaacatgaa gatcaagaga caggggaagg tgttaaatag1260<210>4<211>419<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>4Met Leu Ala Ala Ala Phe Ala Asp Ser Asn Ser Ser Ser Met Asn Val1 5 10 15Ser Phe Ala His Leu His Phe Ala Gly Gly Tyr Leu Pro Ser Asp Ser20 25 30Gln Asp Trp Arg Thr Ile Ile Pro Ala Leu Leu Val Ala Val Cys Leu35 40 45Val Gly Phe Val Gly Asn Leu Cys Val Ile Gly Ile Leu Leu His Asn50 55 60Ala Trp Lys Gly Lys Pro Ser Met Ile His Ser Leu Ile Leu Asn Leu65 70 75 80Ser Leu Ala Asp Leu Ser Leu Leu Leu Phe Ser Ala Pro Ile Arg Ala85 90 95Thr Ala Tyr Ser Lys Ser Val Trp Asp Leu Gly Trp Phe Val Cys Lys100 105 110Ser Ser Asp Trp Phe Ile His Thr Cys Met Ala Ala Lys Ser Leu Thr115 120 125Ile Val Val Val Ala Lys Val Cys Phe Met Tyr Ala Ser Asp Pro Ala130 135 140Lys Gln Val Ser Ile His Asn Tyr Thr Ile Trp Ser Val Leu Val Ala145 150 155160Ile Trp Thr Val Ala Ser Leu Leu Pro Leu Pro Glu Trp Phe Phe Ser165 170 175Thr Ile Arg His His Glu Gly Val Glu Met Cys Leu Val Asp Val Pro180 185 190Ala Val Ala Glu Glu Phe Met Ser Met Phe Gly Lys Leu Tyr Pro Leu195 200 205Leu Ala Phe Gly Leu Pro Leu Phe Phe Ala Ser Phe Tyr Phe Trp Arg210 215 220Ala Tyr Asp Gln Cys Lys Lys Arg Gly Thr Lys Thr Gln Asn Leu Arg225 230 235 240Asn Gln Ile Arg Ser Lys Gln Val Thr Val Met Leu Leu Ser Ile Ala245 250 255Ile Ile Ser Ala Leu Leu Trp Leu Pro Glu Trp Val Ala Trp Leu Trp260 265 270Val Trp His Leu Lys Ala Ala Gly Pro Ala Pro Pro Gln Gly Phe Ile275 280 285Ala Leu Ser Gln Val Leu Met Phe Ser Ile Ser Ser Ala Asn Pro Leu290 295 300Ile Phe Leu Val Met Ser Glu Glu Phe Arg Glu Gly Leu Lys Gly Val305 310 315 320Trp Lys Trp Met Ile Thr Lys Lys Pro Pro Thr Val Ser Glu Ser Gln325 330 335Glu Thr Pro Ala Gly Asn Ser Glu Gly Leu Pro Asp Lys Val Pro Ser340 345 350Pro Glu Ser Pro Ala Ser Ile Pro Glu Lys Glu Lys Pro Ser Ser Pro355 360 365Ser Ser Gly Lys Gly Lys Thr Glu Lys Ala Glu Ile Pro Ile Leu Pro370 375 380Asp Val Glu Gln Phe Trp His Glu Arg Asp Thr Val Pro Ser Val Gln385 390 395 400Asp Asn Asp Pro Ile Pro Trp Glu His Glu Asp Gln Glu Thr Gly Glu405 410 415Gly Val Lys<210>5<211>1014<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>5atggggaacg attctgtcag ctacgagtat ggggattaca gcgacctctc ggaccgccct 60gtggactgcc tggatggcgc ctgcctggcc atcgacccgc tgcgcgtggc cccgctccca120ctgtatgccg ccatcttcct ggtgggggtg ccgggcaatg ccatggtggc ctgggtggct180gggaaggtgg cccgccggag ggtgggtgcc acctggttgc tccacctggc cgtggcggat240ttgctgtgct gtttgtctct gcccatcctg gcagtgccca ttgcccgtgg aggccactgg300ccgtatggtg cagtgggctg tcgggcgctg ccctccatca tcctgctgac catgtatgcc360agcgtcctgc tcctggcagc tctcagtgcc gacctctgct tcctggctct cgggcctgcc420tggtggtcta cggttcagcg ggcgtgcggg gtgcaggtgg cctgtggggc agcctggaca480ctggccttgc tgctcaccgt gccctccgcc atctaccgcc ggctgcacca ggagcacttc540ccagcccggc tgcagtgtgt ggtggactac ggcggctcct ccagcaccga gaatgcggtg600actgccatcc ggtttctttt tggcttcctg gggcccctgg tggccgtggc cagctgccac660agtgccctcc tgtgctgggc agcccgacgc tgccggccgc tgggcacagc cattgtggtg720gggttttttg tctgctgggc accctaccac ctgctggggc tggtgctcac tgtggcggcc780ccgaactccg cactcctggc cagggccctg cgggctgaac ccctcatcgt gggccttgcc840ctcgctcaca gctgcctcaa tcccatgctc ttcctgtatt ttgggagggc tcaactccgc900cggtcactgc cagctgcctg tcactgggcc ctgagggagt cccagggcca ggacgaaagt960gtggacagca agaaatccac cagccatgac ctggtctcgg agatggaggt gtag 1014<210>6<211>337<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>6Met Gly Asn Asp Ser Val Ser Tyr Glu Tyr Gly Asp Tyr Ser Asp Leu1 5 10 15Ser Asp Arg Pro Val Asp Cys Leu Asp Gly Ala Cys Leu Ala Ile Asp20 25 30Pro Leu Arg Val Ala Pro Leu Pro Leu Tyr Ala Ala Ile Phe Leu Val35 40 45Gly Val Pro Gly Asn Ala Met Val Ala Trp Val Ala Gly Lys Val Ala50 55 60Arg Arg Arg Val Gly Ala Thr Trp Leu Leu His Leu Ala Val Ala Asp65 70 75 80Leu Leu Cys Cys Leu Ser Leu Pro Ile Leu Ala Val Pro Ile Ala Arg85 90 95Gly Gly His Trp Pro Tyr Gly Ala Val Gly Cys Arg Ala Leu Pro Ser100 105 110Ile Ile Leu Leu Thr Met Tyr Ala Ser Val Leu Leu Leu Ala Ala Leu115 120 125Ser Ala Asp Leu Cys Phe Leu Ala Leu Gly Pro Ala Trp Trp Ser Thr130 135 140Val Gln Arg Ala Cys Gly Val Gln Val Ala Cys Gly Ala Ala Trp Thr145 150 155 160Leu Ala Leu Leu Leu Thr Val Pro Ser Ala Ile Tyr Arg Arg Leu His165 170 175Gln Glu His Phe Pro Ala Arg Leu Gln Cys Val Val Asp Tyr Gly Gly180 185 190Ser Ser Ser Thr Glu Asn Ala Val Thr Ala Ile Arg Phe Leu Phe Gly195 200 205Phe Leu Gly Pro Leu Val Ala Val Ala Ser Cys His Ser Ala Leu Leu210 215 220Cys Trp Ala Ala Arg Arg Cys Arg Pro Leu Gly Thr Ala Ile Val Val225 230 235 240Gly Phe Phe Val Cys Trp Ala Pro Tyr His Leu Leu Gly Leu Val Leu245 250 255Thr Val Ala Ala Pro Asn Ser Ala Leu Leu Ala Arg Ala Leu Arg Ala260 265 270Glu Pro Leu Ile Val Gly Leu Ala Leu Ala His Ser Cys Leu Asn Pro275 280 285Met Leu Phe Leu Tyr Phe Gly Arg Ala Gln Leu Arg Arg Ser Leu Pro290 295 300Ala Ala Cys His Trp Ala Leu Arg Glu Ser Gln Gly Gln Asp Glu Ser305 310 315 320Val Asp Ser Lys Lys Ser Thr Ser His Asp Leu Val Ser Glu Met Glu325 330 335Val<210>7<211>1272<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>7atgttgtgtc accgtggtgg ccagctgata gtgccaatca tcccactttg ccctgagcac 60tcctgcaggg gtagaagact ccagaacctt ctctcaggcc catggcccaa gcagcccatg120gaacttcata acctgagctc tccatctccc tctctctcct cctctgttct ccctccctcc180ttctctccct caccctcctc tgctccctct gcctttacca ctgtgggggg gtcctctgga240gggccctgcc accccacctc ttcctcgctg gtgtctgcct tcctggcacc aatcctggcc300ctggagtttg tcctgggcct ggtggggaac agtttggccc tcttcatctt ctgcatccac360acgcggccct ggacctccaa cacggtgttc ctggtcagcc tggtggccgc tgacttcctc420ctgatcagca acctgcccct ccgcgtggac tactacctcc tccatgagac ctggcgcttt480ggggctgctg cctgcaaagt caacctcttc atgctgtcca ccaaccgcac ggccagcgtt540gtcttcctca cagccatcgc actcaaccgc tacctgaagg tggtgcagcc ccaccacgtg600ctgagccgtg cttccgtggg ggcagctgcc cgggtggccg ggggactctg ggtgggcatc660ctgctcctca acgggcacct gctcctgagc accttctccg gcccctcctg cctcagctac720agggtgggca cgaagccctc ggcctcgctc cgctggcacc aggcactgta cctgctggag780ttcttcctgc cactggcgct catcctcttt gctattgtga gcattgggct caccatccgg840aaccgtggtc tgggcgggca ggcaggcccg cagagggcca tgcgtgtgct ggccatggtg900gtggccgtct acaccatctg cttcttgccc agcatcatct ttggcatggc ttccatggtg960gctttctggc tgtccgcctg ccgatccctg gacctctgca cacagctctt ccatggctcc1020ctggccttca cctacctcaa cagtgtcctg gaccccgtgc tctactgctt ctctagcccc1080aacttcctcc accagagccg ggccttgctg ggcctcacgc ggggccggca gggcccagtg1140agcgacgaga gctcctacca accctccagg cagtggcgct accgggaggc ctctaggaag1200gcggaggcca tagggaagct gaaagtgcag ggcgaggtct ctctggaaaa ggaaggctcc1260tcccagggct ga1272<210>8<211>423<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>8Met Leu Cys His Arg Gly Gly Gln Leu Ile Val Pro Ile Ile Pro Leu1 5 10 15Cys Pro Glu His Ser Cys Arg Gly Arg Arg Leu Gln Asn Leu Leu Ser
20 25 30Gly Pro Trp Pro Lys Gln Pro Met Glu Leu His Asn Leu Ser Ser Pro35 40 45Ser Pro Ser Leu Ser Ser Ser Val Leu Pro Pro Ser Phe Ser Pro Ser50 55 60Pro Ser Ser Ala Pro Ser Ala Phe Thr Thr Val Gly Gly Ser Ser Gly65 70 75 80Gly Pro Cys His Pro Thr Ser Ser Ser Leu Val Ser Ala Phe Leu Ala85 90 95Pro Ile Leu Ala Leu Glu Phe Val Leu Gly Leu Val Gly Asn Ser Leu100 105 110Ala Leu Phe Ile Phe Cys Ile His Thr Arg Pro Trp Thr Ser Asn Thr115 120 125Val Phe Leu Val Ser Leu Val Ala Ala Asp Phe Leu Leu Ile Ser Asn130 135 140Leu Pro Leu Arg Val Asp Tyr Tyr Leu Leu His Glu Thr Trp Arg Phe145 150 155 160Gly Ala Ala Ala Cys Lys Val Asn Leu Phe Met Leu Ser Thr Asn Arg165 170 175Thr Ala Ser Val Val Phe Leu Thr Ala Ile Ala Leu Asn Arg Tyr Leu180 185 190Lys Val Val Gln Pro His His Val Leu Ser Arg Ala Ser Val Gly Ala195 200 205Ala Ala Arg Val Ala Gly Gly Leu Trp Val Gly Ile Leu Leu Leu Asn210 215 220Gly His Leu Leu Leu Ser Thr Phe Ser Gly Pro Ser Cys Leu Ser Tyr225 230 235 240Arg Val Gly Thr Lys Pro Ser Ala Ser Leu Arg Trp His Gln Ala Leu245 250 255Tyr Leu Leu Glu Phe Phe Leu Pro Leu Ala Leu Ile Leu Phe Ala Ile260 265 270Val Ser Ile Gly Leu Thr Ile Arg Asn Arg Gly Leu Gly Gly Gln Ala275 280 285Gly Pro Gln Arg Ala Met Arg Val Leu Ala Met Val Val Ala Val Tyr290 295 300Thr Ile Cys Phe Leu Pro Ser Ile Ile Phe Gly Met Ala Ser Met Val305 310 315 320Ala Phe Trp Leu Ser Ala Cys Arg Ser Leu Asp Leu Cys Thr Gln Leu325 330 335Phe His Gly Ser Leu Ala Phe Thr Tyr Leu Asn Ser Val Leu Asp Pro340 345 350Val Leu Tyr Cys Phe Ser Ser Pro Asn Phe Leu His Gln Ser Arg Ala355 360 365Leu Leu Gly Leu Thr Arg Gly Arg Gln Gly Pro Val Ser Asp Glu Ser370 375 380Ser Tyr Gln Pro Ser Arg Gln Trp Arg Tyr Arg Glu Ala Ser Arg Lys385 390 395 400Ala Glu Ala Ile Gly Lys Leu Lys Val Gln Gly Glu Val Ser Leu Glu405 410 415Lys Glu Gly Ser Ser Gln Gly420<210>9<211>966<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>9atgaaccaga ctttgaatag cagtgggacc gtggagtcag ccctaaacta ttccagaggg60agcacagtgc acacggccta cctggtgctg agctccctgg ccatgttcac ctgcctgtgc120gggatggcag gcaacagcat ggtgatctgg ctgctgggct ttcgaatgca caggaacccc180ttctgcatct atatcctcaa cctggcggca gccgacctcc tcttcctctt cagcatggct240tccacgctca gcctggaaac ccagcccctg gtcaatacca ctgacaaggt ccacgagctg300atgaagagac tgatgtactt tgcctacaca gtgggcctga gcctgctgac ggccatcagc360acccagcgct gtctctctgt cctcttccct atctggttca agtgtcaccg gcccaggcac420ctgtcagcct gggtgtgtgg cctgctgtgg acactctgtc tcctgatgaa cgggttgacc480tcttccttct gcagcaagtt cttgaaattc aatgaagatc ggtgcttcag ggtggacatg540gtccaggccg ccctcatcat gggggtctta accccagtga tgactctgtc cagcctgacc600ctctttgtct gggtgcggag gagctcccag cagtggcggc ggcagcccac acggctgttc660gtggtggtcc tggcctctgt cctggtgttc ctcatctgtt ccctgcctct gagcatctac720tggtttgtgc tctactggtt gagcctgccg cccgagatgc aggtcctgtg cttcagcttg780tcacgcctct cctcgtccgt aagcagcagc gccaaccccg tcatctactt cctggtgggc840agccggagga gccacaggct gcccaccagg tccctgggga ctgtgctcca acaggcgctt900cgcgaggagc ccgagctgga aggtggggag acgcccaccg tgggcaccaa tgagatgggg960gcttga 966<210>10<211>321<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>10Met Asn Gln Thr Leu Asn Ser Ser Gly Thr Val Glu Ser Ala Leu Asn1 5 10 15Tyr Ser Arg Gly Ser Thr Val His Thr Ala Tyr Leu Val Leu Ser Ser20 25 30Leu Ala Met Phe Thr Cys Leu Cys Gly Met Ala Gly Asn Ser Met Val35 40 45Ile Trp Leu Leu Gly Phe Arg Met His Arg Asn Pro Phe Cys Ile Tyr50 55 60Ile Leu Asn Leu Ala Ala Ala Asp Leu Leu Phe Leu Phe Ser Met Ala65 70 75 80Ser Thr Leu Ser Leu Glu Thr Gln Pro Leu Val Asn Thr Thr Asp Lys85 90 95Val His Glu Leu Met Lys Arg Leu Met Tyr Phe Ala Tyr Thr Val Gly100 105 110Leu Ser Leu Leu Thr Ala Ile Ser Thr Gln Arg Cys Leu Ser Val Leu115 120 125Phe Pro Ile Trp Phe Lys Cys His Arg Pro Arg His Leu Ser Ala Trp130 135 140Val Cys Gly Leu Leu Trp Thr Leu Cys Leu Leu Met Asn Gly Leu Thr145 150 155 160Ser Ser Phe Cys Ser Lys Phe Leu Lys Phe Asn Glu Asp Arg Cys Phe165 170 175Arg Val Asp Met Val Gln Ala Ala Leu Ile Met Gly Val Leu Thr Pro180 185 190Val Met Thr Leu Ser Ser Leu Thr Leu Phe Val Trp Val Arg Arg Ser195 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885 890 895Cys Ala Val Asp Thr Glu Asn Ile Arg Arg Val Phe Asn Asp Cys Arg900 905 9l0Asp Ile Ile Gln Arg Met His Leu Arg Gln Tyr Glu Leu Leu915 920 925<210>105<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc feature<223>新序列<400>105catgtatgcc agcgtcctgc tcc 23<210>106<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>106gctatgcctg aagccagtct tgtg24<210>107<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>107gcacctgctc ctgagcacct tctcc 25<210>108<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>108cacagcgctg cagccctgca gctggc 26<210>109<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>109ccagtgatga ctctgtccag cctg24<210>110<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>110cagacacttg gcagggacga ggtg24<210>111<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>111cttgtggtct actgcagcat gttccg 26<210>112<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>112catatccctc cgagtgtcca gcggc 25<210>113<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>113atggatcctt atcatggctt cctc 24<210>114<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>114caagaacagg tctcatctaa gagctcc 27<210>115<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>115ctctgatgcc atctgctgga ttcctg 26<210>116<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>116gtagtccact gaaagtccag tgatcc 26<210>117<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>117tggtggcgat ggccaacagc gctc24<210>118<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>118gttgcgcctt agcgacagat gacc24<210>119<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>119tcaacctgta tagcagcatc ctc 23<210>120<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>120aaggagtagc agaatggtta gcc 23<210>121<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>121gacacctgtc agcggtcgtg tgtg24<210>122<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>122ctgatggaag tagaggctgt ccatctc 27<210>123<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>123gcgctgagcg cagaccagtg gctg24<210>124<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>124cacggtgacg aagggcacga gctc24<210>125<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>125agccatccct gccaggaagc atgg24<210>126<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>126ccaggtaggt gtgcagcaca atggc 25<210>127<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>127ctgttcaaca gggctggttg gcaac25<210>128<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>128atcatgtcta gactcatggt gatcc25<210>129<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>129Thr Leu Glu Ser Ile Met1 5<210>130<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>130Glu Tyr Asn Leu Val1 5<210>131<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>131Asp Cys Gly Leu Phe1 5<210>132<211>36<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>132Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly Cys Thr Thr Cys Cys Ala Thr Gly Gly1 5 10 15Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Gly Ala20 25 30Gly Gly Ala Gly35<210>133<211>53<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>新序列<400>133Gly Ala Thr Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Thr Thr Ala Gly Ala Ala1 5 10 15Cys Ala Gly Gly Cys Cys Gly Cys Ala Gly Thr Cys Cys Thr Thr Cys20 25 30Ala Gly Gly Thr Thr Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Ala35 40 45Thr Gly Gly Thr Gly50
權(quán)利要求
1.由氨基酸序列SEQ.ID.NO.2編碼的G蛋白偶聯(lián)受體。
2.權(quán)利要求1所述的G蛋白偶聯(lián)受體的非內(nèi)源組成型活化形式。
3.一種質(zhì)粒，其包含一種載體和SEQ.ID.NO.1所示的cDNA。
4.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求3所述的質(zhì)粒。
5.由氨基酸序列SEQ.ID.NO.4編碼的G蛋白偶聯(lián)受體。
6.權(quán)利要求5所述的G蛋白偶聯(lián)受體的非內(nèi)源組成型活化形式。
7.一種質(zhì)粒，其包含一種載體和SEQ.ID.NO.3所示的cDNA。
8.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求7所述的質(zhì)粒。
9.由氨基酸序列SEQ.ID.NO.6編碼的G蛋白偶聯(lián)受體。
10.權(quán)利要求9所述的G蛋白偶聯(lián)受體的非內(nèi)源組成型活化形式。
11.一種質(zhì)粒，其包含一種載體和SEQ.ID.NO.5所示的cDNA。
12.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求11所述的質(zhì)粒。
13.由氨基酸序列SEQ.ID.NO.8編碼的G蛋白偶聯(lián)受體。
14.權(quán)利要求13所述的G蛋白偶聯(lián)受體的非內(nèi)源組成型活化形式。
15.一種質(zhì)粒，其包含一種載體和SEQ.ID.NO.7所示的cDNA。
16.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求15所述的質(zhì)粒。
17.由氨基酸序列SEQ.ID.NO.10編碼的G蛋白偶聯(lián)受體。
18.權(quán)利要求17所述的G蛋白偶聯(lián)受體的非內(nèi)源組成型活化形式。
19.一種質(zhì)粒，其包含一種載體和SEQ.ID.NO.9所示的cDNA。
20.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求19所述的質(zhì)粒。
21.由氨基酸序列SEQ.ID.NO.12編碼的G蛋白偶聯(lián)受體。
22.權(quán)利要求21所述的G蛋白偶聯(lián)受體的非內(nèi)源組成型活化形式，其含有氨基酸序列SEQ.ID.NO.84。
23.一種質(zhì)粒，其包含一種載體和SEQ.ID.NO.11所示的cDNA。
24.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求23所述的質(zhì)粒。
25.由氨基酸序列SEQ.ID.NO.14編碼的G蛋白偶聯(lián)受體。
26.權(quán)利要求25所述的G蛋白偶聯(lián)受體的非內(nèi)源組成型活化形式，其含有氨基酸序列SEQ.ID.NO.88。
27.一種質(zhì)粒，其包含一種載體和SEQ.ID.NO.13所示的cDNA。
28.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求27所述的質(zhì)粒。
29.由氨基酸序列SEQ.ID.NO.16編碼的G蛋白偶聯(lián)受體。
30.權(quán)利要求29所述的G蛋白偶聯(lián)受體的非內(nèi)源組成型活化形式，其含有氨基酸序列SEQ.ID.NO.92。
31.一種質(zhì)粒，其包含一種載體和SEQ.ID.NO.15所示的cDNA。
32.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求31所述的質(zhì)粒。
33.由氨基酸序列SEQ.ID.NO.18編碼的G蛋白偶聯(lián)受體。
34.權(quán)利要求33所述的G蛋白偶聯(lián)受體的非內(nèi)源組成型活化形式。
35.一種質(zhì)粒，其包含一種載體和SEQ.ID.NO.17所示的cDNA。
36.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求35所述的質(zhì)粒。
37.由氨基酸序列SEQ.ID.NO.20編碼的G蛋白偶聯(lián)受體。
38.權(quán)利要求37所述的G蛋白偶聯(lián)受體的非內(nèi)源組成型活化形式。
39.一種質(zhì)粒，其包含一種載體和SEQ.ID.NO.19所示的cDNA。
40.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求39所述的質(zhì)粒。
41.由氨基酸序列SEQ.ID.NO.22編碼的G蛋白偶聯(lián)受體。
42.權(quán)利要求41所述的G蛋白偶聯(lián)受體的非內(nèi)源組成型活化形式。
43.一種質(zhì)粒，其包含一種載體和SEQ.ID.NO.21所示的cDNA。
44.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求43所述的質(zhì)粒。
45.由氨基酸序列SEQ.ID.NO.24編碼的G蛋白偶聯(lián)受體。
46.權(quán)利要求45所述的G蛋白偶聯(lián)受體的非內(nèi)源組成型活化形式。
47.一種質(zhì)粒，其包含一種載體和SEQ.ID.NO.23所示的cDNA。
48.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求47所述的質(zhì)粒。
49.由氨基酸序列SEQ.ID.NO.26編碼的G蛋白偶聯(lián)受體。
50.權(quán)利要求49所述的G蛋白偶聯(lián)受體的非內(nèi)源組成型活化形式。
51.一種質(zhì)粒，其包含一種載體和SEQ.ID.NO.25所示的cDNA。
52.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求51所述的質(zhì)粒。
53.由氨基酸序列SEQ.ID.NO.28編碼的G蛋白偶聯(lián)受體。
54.權(quán)利要求53所述的G蛋白偶聯(lián)受體的非內(nèi)源組成型活化形式。
55.一種質(zhì)粒，其包含一種載體和SEQ.ID.NO.27所示的cDNA。
56.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求55所述的質(zhì)粒。
57.由氨基酸序列SEQ.ID.NO.30編碼的G蛋白偶聯(lián)受體。
58.權(quán)利要求57所述的G蛋白偶聯(lián)受體的非內(nèi)源組成型活化形式。
59.一種質(zhì)粒，其包含一種載體和SEQ.ID.NO.29所示的cDNA。
60.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求59所述的質(zhì)粒。
61.由氨基酸序列SEQ.ID.NO.32編碼的G蛋白偶聯(lián)受體。
62.權(quán)利要求61所述的G蛋白偶聯(lián)受體的非內(nèi)源組成型活化形式，其含有氨基酸序列SEQ.ID.NO.96。
63.一種質(zhì)粒，其包含一種載體和SEQ.ID.NO.95所示的cDNA。
64.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求63所述的質(zhì)粒。
65.由氨基酸序列SEQ.ID.NO.34編碼的G蛋白偶聯(lián)受體。
66.權(quán)利要求65所述的G蛋白偶聯(lián)受體的非內(nèi)源組成型活化形式。
67.一種質(zhì)粒，其包含一種載體和SEQ.ID.NO.33所示的cDNA。
68.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求67所述的質(zhì)粒。
69.由氨基酸序列SEQ.ID.NO.36編碼的G蛋白偶聯(lián)受體。
70.權(quán)利要求69所述的G蛋白偶聯(lián)受體的非內(nèi)源組成型活化形式。
71.一種質(zhì)粒，其包含一種載體和SEQ.ID.NO.35所示的cDNA。
72.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求71所述的質(zhì)粒。
73.由氨基酸序列SEQ.ID.NO.38編碼的G蛋白偶聯(lián)受體。
74.權(quán)利要求73所述的G蛋白偶聯(lián)受體的非內(nèi)源組成型活化形式。
75.一種質(zhì)粒，其包含一種載體和SEQ.ID.NO.37所示的cDNA。
76.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求75所述的質(zhì)粒。
77.由氨基酸序列SEQ.ID.NO.40編碼的G蛋白偶聯(lián)受體。
78.權(quán)利要求77所述的G蛋白偶聯(lián)受體的非內(nèi)源組成型活化形式。
79.一種質(zhì)粒，其包含一種載體和SEQ.ID.NO.39所示的cDNA。
80.一種宿主細(xì)胞，其含有權(quán)利要求79所述的質(zhì)粒。
全文摘要
本專(zhuān)利申請(qǐng)文件所公開(kāi)的發(fā)明涉及跨膜受體；具體地講，涉及人G蛋白偶聯(lián)受體，其內(nèi)源配體是未知的(孤兒GPCR受體)；進(jìn)一步具體地講，涉及用于提供組成型活性證據(jù)的人GPCR的突變(非內(nèi)源性)形式。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1391581SQ00815869
公開(kāi)日2003年1月15日 申請(qǐng)日期2000年11月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月17日
發(fā)明者陳若平, 鄧杭, 凱文·P·洛斯 申請(qǐng)人:阿瑞那制藥公司