專利名稱：因子Ⅸ/因子lxa－抗體和抗體衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及因子IX/因子Ixa-抗體和抗體衍生物。
血塊(血栓)是由一系列稱作凝血級聯(lián)的酶原激活作用形成的。在這一酶級聯(lián)過程中，每種所述酶原(稱作因子)的活化形式催化下一酶原的激活作用。血塊是血液組分在血管表面的沉積物，主要由凝集的血小板和交聯(lián)的纖維蛋白組成。纖維蛋白的形成是通過纖維蛋白原有限的蛋白水解形成血栓而完成的。血栓是凝血級聯(lián)的最終產(chǎn)物。(K.G.Mann，血液，1990，76卷，1-16頁)由活化的因子IX(FIXa)和活化的因子VIII(FVIIIa)形成的復(fù)合物對因子X的激活作用是凝血作用的關(guān)鍵步驟。這一復(fù)合物中的組分缺乏或它們的功能失調(diào)與被稱作血友病的凝血疾病相關(guān)(J.E.Sadler &E.W.Davie血友病A，血友病B和威勒布蘭特病，在G.Stamatoyannopoulos等(編)血液疾病的分子基礎(chǔ)W.B.SaundersCo.，費(fèi)城，1987，576-602頁)。血友病A是指因子VIII活性(功能性的)缺失，而血友病B以因子IX活性缺失為特征。目前通過施用因子VIII濃縮物的置換療法對血友病A進(jìn)行治療。但約20％到30％的血友病A病人產(chǎn)生因子VIII的抑制因子(即針對因子VIII的抗體)，因此施用因子VIII制劑的效果受到抑制。治療產(chǎn)生因子VIII抑制劑的病人十分困難而且具有危險(xiǎn)性，目前針對這種病人只有有限的治療手段。
對于因子VIII抑制劑水平較低的病人，可以通過施用高劑量的因子VIII來中和針對因子VIII抗體，但這是非常昂貴的。當(dāng)所施用的因子VIII的量高于中和所述的抑制劑抗體所需的量時才產(chǎn)生止血作用。在許多情況下，可以先進(jìn)行脫敏作用，然后再次進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的因子VIII治療。這種高劑量的因子VIII治療需要大量的因子VIII，即耗時又有嚴(yán)重的過敏性副作用。供選擇地，這種治療也可以用豬的因子VIII分子進(jìn)行。
一種更高投入的方法是利用凝集素通過體外免疫吸附去除因子VIII抑制劑，所述的凝集素與免疫球蛋白(蛋白A，蛋白G)或固定的因子VIII相結(jié)合。因?yàn)樵谶@種治療過程中病人必須與單采血成分的機(jī)器相連，所以這種治療也給病人造成沉重的負(fù)擔(dān)。用這種方式也不可能治療急性出血。
目前，可取的治療手段是施用活化的凝血酶原濃縮復(fù)合物(APCC)例如FEIBA和AUTOPLEX，其適用于治療急性出血的病人，甚至是病人存在高因子VIII抑制劑滴度的情況下(DE 3127318)。
在凝血的血管內(nèi)系統(tǒng)中，最后的步驟是活化因子X。這一反應(yīng)是通過將因子VIIIa結(jié)合到因子IXa以形成由因子IXa、VIIIa和X和磷脂組成的“tenase”-復(fù)合物來激活的。沒有結(jié)合FVIIIa，F(xiàn)IXa則不表現(xiàn)或僅表現(xiàn)出微弱的對FX的酶活性。
在最近的幾年中，鑒定了一些可能的因子VIIIa與因子IXa結(jié)合位點(diǎn)，并且表明結(jié)合于這些區(qū)域的抗體或多肽抑制FIXa的活性(Fay等，生物化學(xué)雜志，1994，269卷，20522-20527頁，Lenting等，生物化學(xué)雜志，1996，271卷，1935-1940頁，Jorquera等，循環(huán)，1992，86卷，摘要2725)。以抑制血栓形成為目的通過使用單克隆抗體可以實(shí)現(xiàn)對凝集因子，如因子IX，的抑制(WO97/26010)。相反的效應(yīng)，即由因子IXa介導(dǎo)的因子X激活作用的升高如Liles D.K.等所述(血液，1997，90卷，增刊1，2054)，其是通過VIII肽(氨基酸698-712)與因子IX結(jié)合。然而這種效果僅在缺乏因子VIIIa時出現(xiàn)，而當(dāng)因子VIIIa存在時，因子IXa/因子VIIIa-介導(dǎo)的因子X的裂解被這種肽所抑制。發(fā)明簡述鑒于在治療血友病人時可能出現(xiàn)的危險(xiǎn)和副作用，需要一種有效地治療FVIII抑制病人的療法。因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種治療凝血疾病的制劑，其對因子VIII抑制病人特別有益。
依照本發(fā)明，這一目的是通過使用針對因子IX/因子IXa的抗體或抗體衍生物來實(shí)現(xiàn)的，其具有因子VIIIa-輔因子活性或因子IXa-激活活性并導(dǎo)致因子IXa促凝血活性提高。令人驚訝的是，本發(fā)明的因子IX/因子IXa-激活抗體和抗體衍生物的作用不受所存在的抑制物，如針對因子VIII/因子VIIIa的負(fù)面影響，相反，在這種情況下因子IXa的促凝血活性還有所提高。
本發(fā)明進(jìn)一步的有益之處在于施用如本發(fā)明所述的制劑，在因子VIII或因子VIIIa不存在時，甚至在FVIII抑制病人中也可以迅速凝血。令人驚訝的是，這些試劑在因子VIIIa存在下也有效。
如本發(fā)明所述的抗體和抗體衍生物具有FVIII-輔因子樣活性，在溫育2h后進(jìn)行的FVIII分析(例如，COATEST分析或免疫層析檢測)中表現(xiàn)出背景(背靜值)和測定值之間的比率至少是3。對這一比率的計(jì)算可以是，例如依照下述方案完成溫育兩小時后，抗體測定值(OD405)-試劑的空白值≥3小鼠-IgG測定值(OD405)-試劑空白值依照本發(fā)明的抗體優(yōu)選具有體外半壽期為至少5天，更優(yōu)選為至少10天，更優(yōu)選至少20天。
依照本發(fā)明的另一方面提供包含針對因子XI/因子IXa的抗體和抗體衍生物和藥物學(xué)上可接受的載體物質(zhì)的制劑。而且，本發(fā)明的制劑還可以包括因子IX和/或因子IXa。
本發(fā)明的另一方面是應(yīng)用所述的抗體和抗體衍生物提高因子IXa的酰胺裂解活性。


圖1篩選雜交瘤培養(yǎng)物上清液FVIII-樣活性的結(jié)果。對由融合實(shí)驗(yàn)#193，#195，#196所得的預(yù)選克隆進(jìn)行產(chǎn)色分析檢測。
圖2在主平板的雜交瘤培養(yǎng)物上清液中篩選IgG介導(dǎo)的因子VIII樣活性的結(jié)果。
圖3克隆193/C0的亞克隆，即第一輪克隆的結(jié)果。
圖4起始克隆193/C0的雜交瘤培養(yǎng)物的產(chǎn)色的FVIII樣活性和因子IX-ELISA反應(yīng)性之間的比較。
圖5對一些主克隆和亞克隆的產(chǎn)色活性測定結(jié)果。
圖6A與人FVIII，TBS緩沖液，細(xì)胞培養(yǎng)基相比，抗FIX/FIXa抗體193/AD3和196/AF2的FVIII樣活性。由升高的光密度可以判斷出在遲滯期后，兩抗體均引起產(chǎn)色底物裂解。
圖6B因子VIII，196/AF1，198/AC1/1和小鼠IgG的產(chǎn)色活性比較。
圖7A比較在添加或不添加因子Xa特異抑制劑的情況下，因子VIII和196/AF2的因子Xa產(chǎn)生動力學(xué)。
圖7B比較在添加或不添加Xa特異抑制物Pefabloc Xa的情況下，因子VIII，小鼠-IgG和抗因子IX/IXa-抗體198/AM1和196/AF2的因子Xa產(chǎn)生動力學(xué)。
圖8A在磷脂，F(xiàn)IXa/FX和鈣離子存在和不存在的情況下，純化的抗因子IX/IXa-抗體198/AC1/1的因子VIII-樣活性依賴性測定。
圖8B在磷脂，Ca2+，F(xiàn)IXa/FX存在下，抗-FIXa-抗體196/AF1對Fxa產(chǎn)生的依賴性測定結(jié)果。
圖8C由非特異性的小鼠IgG抗體產(chǎn)生Fxa的結(jié)果。
圖9用圖示表示在使用不同濃度的抗因子IX/IXa-抗體193/AD3進(jìn)行APTT分析中，因子VIII-缺陷血漿的凝集時間。
圖10A在因子IXa存在下，抗體193/AD3導(dǎo)致因子VIII缺陷血漿凝集時間縮短。
圖10B在因子IXa-和因子VIII-抑制劑存在下，由抗體193/AD3引起的劑量依賴的凝固時間縮短。
圖11在人FIXαβ存在或不存在下，抗體198/A1，198/B1和198/AP1的產(chǎn)色活性。
圖12擴(kuò)增小鼠抗體可變的重鏈基因所用的引物序列。
圖13擴(kuò)增小鼠抗體可變的輕鏈(kappa)基因所用的引物序列。
圖14雜交瘤細(xì)胞系193/AD3(SEQ.ID.NOs.81和82)的scFv的DNA和衍生的蛋白序列。
圖15雜交瘤細(xì)胞系193/K2(SEQ.ID.NOs.83和84)的scFv的DNA和衍生的蛋白序列。
圖16雜交瘤細(xì)胞系198/AB2(SEQ.ID.NOs.85和86)的scFv的DNA和衍生的蛋白序列。
圖17雜交瘤細(xì)胞系198/A1(SEQ.ID.NOs.87和88)的scFv的DNA和衍生的蛋白序列。
圖18在2.9nM人FIXa存在下，肽A1/3產(chǎn)色的FVIII-樣活性。肽A1/3的雜亂變型肽A1/5不引起任何Fxa產(chǎn)生。
圖19肽A1/3的產(chǎn)色FVIII-樣活性對人FIXa存在的依賴性。在缺乏人FIXa時，肽A1/3不引起任何Fxa產(chǎn)生。緩沖液對照，普通咪唑緩沖液稱為IZ。
圖20顯示精氨酸殘基的偏光力不在肽A1/3-rd和A1/3-Rd-srmb的產(chǎn)色活性中起重要作用。
圖21表示向反應(yīng)混合物中添加2.4μM肽B1/7導(dǎo)致可測定出的Fxa產(chǎn)生。
圖22表示添加FX-特異性抑制劑導(dǎo)致反應(yīng)的顯著縮減。
圖23表示載體pBax-IgG1。
圖24表示在抗體198/B1(圖24A)和IgM抗體198/AF1(圖24B)存在下，F(xiàn)IXa的酰胺裂解活性的提高。
圖25表示23nM人FIXa存在下，抗體198/A1 Fab片段產(chǎn)色的FVIII-樣活性。完整抗體198/A1和7.5pM FVIII用作陽性對照。緩沖液對照(IZ)用作陰性對照。
圖26表示198AB2 scFv-堿性磷酸酶融合蛋白(表達(dá)載體pDAP2-198AB2#100的ORF)的核酸和氨基酸序列，(SEQ.ID.NOs.89和90)。
抗體198/AB2(198/AB2是與198/B1完全相同的亞克隆)的VL和VH結(jié)構(gòu)域基因來自在實(shí)施例10中描述的相應(yīng)雜交瘤細(xì)胞。VH-基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)SfiI-AscI消化，VL基因的PCR產(chǎn)物由AscI和NotI消化。VH和VL基因通過AscI位點(diǎn)連接并插入經(jīng)SfiI-NotI消化的載體pDAP2中(Kerschbaumer R.J.等，免疫學(xué)技術(shù)2，145-150，1996；GeneBank登記號U35316)。PelB前導(dǎo)序列胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovora)果膠酸酯裂解酶B的前導(dǎo)序列，His-標(biāo)記，用于金屬離子層析的組氨酸標(biāo)記。
圖27表示在2.3nM人FIXa存在下，兩抗體198/B1(亞克隆AB2)scFv片段-堿性磷酸酶融合蛋白(198AB2#1和198AB2#100)產(chǎn)色的FVIII-樣活性。7.5pM FVIII用作陽性對照。
圖28 pZip198AB2#102(SEQ.ID.NOs.91和92)的氨基酸和核苷酸序列。
圖29mAB#8860 scFv-堿性磷酸酶融合蛋白(載體pDAP2-8860scFv#11，(SEQ.ID.NOs.93和94)和核苷酸序列和氨基酸序列?？贵w#8860的VL和VH結(jié)構(gòu)域基因來自在實(shí)施例10中描述的相應(yīng)雜交瘤細(xì)胞。VH-基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)SfiI-AscI消化，VL基因的PCR產(chǎn)物由AscI和NotI消化。VH和VL基因通過AscI位點(diǎn)連接并插入經(jīng)SfiI-NotI消化的載體pDAP2中(Kerschbaumer R.J.等，免疫學(xué)技術(shù)2，145-150，1996；GeneBank登記號U35316)。
圖30是mAB#8860 scFv-亮氨酸拉鏈融合蛋白(小抗體；載體p8860-Zip#1.2，(SEQ.ID.NOs.95和96)的核苷酸序列和氨基酸序列。scFv片段基因來自mAB#8860，并從載體pDAP2-8860scFv#11轉(zhuǎn)換到經(jīng)SfiI-NotI消化的質(zhì)粒pZipl上(Kerschbaumer R.J.等，分析生物化學(xué)249，219-227，1997；GeneBank登記號U94951)。
圖31示出在2.3nM人FIXa存在下，198/B1(亞克隆AB2)小抗體198AB-Zip#102的產(chǎn)色的FVIII-樣活性。4.8pM FVIII用作陽性對照，無關(guān)的小抗體(8860-Zip#1.2)和plain反應(yīng)緩沖液(IZ)用作陰性對照。
圖32是質(zhì)粒pMycHis6的示意圖。
圖33是質(zhì)粒pMycHis6與載體pCOCK(SEQ.ID.NOs.97和98)不同的部分的核苷酸和氨基酸序列。載體pMycHis6是通過用NotI和EcoRI切割載體pCOCK(Engelhardt等，1994，生物技術(shù)，1744-46)并插入下述寡核苷酸序列mychis6-co5′ggccgcagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatggggcggcacatcaccatcaccatcactaataag 3′(SEQ ID.No.79)和mycchis-ic5′aattcttattagtgatggtgatggtgatgtgccgccccattcagatcctcttct gagatgagtttttgttctgc(SEQ.ID.No.80)構(gòu)建的。
圖34的198AB2 scFv(與c-myc-標(biāo)記和His6-標(biāo)記連接)表達(dá)載體pMycHis6198AB2#102的ORF的核苷酸序列和氨基酸序列。載體pMycHis6是通過用NotI-EcoRI切割載體pCOCK(Engelhardt O.等，生物技術(shù)17，4446，1994)并插入下列退火的寡核苷酸(5′-GGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCGGCACATCACCATCACCATCACTAATAAG-3′(SEQ.ID.No.103)和5′-TTATTAGTGATGGTGATGGTGATGTGCCGCCCCATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCTGC3′(SEQ.ID.NO.104))而構(gòu)建的。所得的載體命名為pMycHis6，經(jīng)SfiI-NotI切割，scFv198AB2基因由載體pDAP2198AB2#100轉(zhuǎn)換到這一載體中。
圖35是與c-myc-標(biāo)記和His6-標(biāo)記相連接的mAB#8860 scFv(載體p8860-M/H#4c，SEQ.ID.NOs.101和102)的核苷酸序列和氨基酸序列。質(zhì)粒pMycHis6是經(jīng)SfiI和NotI切割，再將pDAP2-8860scFv#11(參見圖29)中編碼scFv8860#11蛋白的DNA序列插入其中，從而獲得質(zhì)粒p8860-M/H#4c。
圖36是在2.3nM人FIXa存在下，198/B1(亞克隆AB2)scFv片段(MycHis-198AB2#102)產(chǎn)色的FVIII-樣活性。4.8pM FVIII用作陽性對照，無關(guān)的scFv(8860-M/H#4c)和普通反應(yīng)緩沖液(IZ)用作陰性對照。
抗體和抗體衍生物本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明的抗體和抗體衍生物的核酸，表達(dá)載體，雜交瘤細(xì)胞系和相關(guān)的生產(chǎn)方法?？贵w是具有特異氨基酸序列的免疫球蛋白分子，其僅與誘導(dǎo)其合成的抗原(或各自的免疫原)相結(jié)合，或者與上述抗原相似的抗原(或免疫原)相結(jié)合。每一免疫球蛋白分子由兩種類型的多肽鏈組成。每個分子由大的，相同的重鏈(H鏈)和兩條也相同的輕鏈(L鏈)組成。多肽由二硫橋和非共價(jià)鍵相連。在體內(nèi)，所述的重鏈和輕鏈由不同的核糖體合成，在細(xì)胞內(nèi)裝配，再作為完整的球蛋白分子分泌(Roitt I.等，免疫學(xué)，第二版1989)。
本發(fā)明的抗體和抗體衍生物及由其衍生的有機(jī)化合物包括人和動物單克隆抗體或其片段，單鏈抗體和其片段，小抗體，雙特異性抗體，雙抗體(diabodies)，三抗體(triabodies)，或其二聚體，寡聚體或多聚體。還包括肽模擬物(peptidomimetics)或由本發(fā)明的抗體所衍生的肽，例如它們包括一個或多個CDR區(qū)，優(yōu)選CDR3區(qū)。
還包括基于結(jié)構(gòu)活性連接的人單克隆抗體和肽序列，它們是通過人工模式化程序生產(chǎn)的(Greer J.等，醫(yī)藥化學(xué)雜志，1994，37卷，1035-1054頁)。
所用的術(shù)語，因子IX/IXa激活的抗體和抗體衍生物還可以包括由宿主細(xì)胞中改變了的免疫球蛋白編碼區(qū)表達(dá)的蛋白，例如“專門修飾的抗體”如合成抗體，嵌合抗體，人源化抗體，或其混合物或抗體片段，其部分或全部缺失所謂的恒定區(qū)，例如Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab′或F(ab)′2等。在這些專門修飾的抗體中，例如部分輕鏈和/或重鏈可以被替代。這樣的分子可以例如包含由人源化的重鏈和未經(jīng)修飾的輕鏈(或嵌合輕鏈)組成的抗體，反之亦然。所用術(shù)語Fv，F(xiàn)c，F(xiàn)d，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab′或F(ab)2依本領(lǐng)域所公知的描述(Harlow E.和Lane D.，在″抗體，實(shí)驗(yàn)操作手冊″，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1988)。
本發(fā)明還包括來自直接針對因子IX/因子IXa并可引起因子IXa促凝血活性提高的單克隆抗體(mAb)的Fab片段或F(ab)2片段的應(yīng)用。優(yōu)選地，異源構(gòu)架區(qū)和恒定區(qū)選自人免疫球蛋白類型和同種型，例如IgG(亞型1到4)，IgM，IgA和IgE。在免疫反應(yīng)過程中，可能發(fā)生免疫球蛋白種類的改變，例如由IgM到IgG的轉(zhuǎn)變；其中恒定區(qū)發(fā)生了交換，例如由μ轉(zhuǎn)變?yōu)棣谩ｎ愋偷霓D(zhuǎn)變也可以由本領(lǐng)域所公知的遺傳工程的方法通過定向的方式引起(“定向類型轉(zhuǎn)變重組”)(Esser C.和Radbruch A.，免疫學(xué)年評，1990，8卷，717-735頁)。但是，本發(fā)明的抗體和抗體衍生物并不需要包括獨(dú)有的人免疫球蛋白序列。
在一特定的實(shí)施方案中，人源化的抗體包括小鼠單克隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，其插入到所選擇的人抗體序列構(gòu)架區(qū)內(nèi)。但是也可以用人CDR區(qū)。優(yōu)選地，將人重鏈和輕鏈中的可變區(qū)域通過一個或多個CDR的交換進(jìn)行專門的改變。也可以用全部六個CDRs或少于六個CDRs的不同組合。
本發(fā)明的人源化抗體優(yōu)選具有人抗體或其片段的結(jié)構(gòu)，并且包括治療用途所需特性的組合，例如對于治療病人凝血疾病，優(yōu)選因子VIII抑制劑病人。
嵌合抗體不同于人源化抗體是由于其包括完整的可變區(qū)，該可變區(qū)含非人源的重鏈和輕鏈構(gòu)架區(qū)，并與人免疫球蛋白兩條鏈的恒定區(qū)相結(jié)合。例如可以生產(chǎn)由鼠和人序列組成的嵌合抗體。依照本發(fā)明，所述的抗體和抗體衍生物可以是單鏈抗體或小抗體(例如，與富含脯氨酸和寡聚結(jié)構(gòu)域，例如Pluckthun A.和Pack P相結(jié)合的scFv片段，免疫學(xué)技術(shù)，1997，3卷，83-105頁)或單鏈Fv(sFv)其在一個單一的多肽鏈中整合全部的抗體結(jié)合區(qū)。例如，單鏈抗體可由下述方式構(gòu)成，即將V-基因與作為接頭序列構(gòu)建的寡核苷酸相連，然后將第一個V區(qū)的C末端與第二個V區(qū)的N末端相連接，例如以VH-接頭-VL或VL-結(jié)頭-VH的方式，其中VH和VL都代表N末端結(jié)構(gòu)域(Huston JS等，Int.免疫學(xué)綜述，1993，10卷，195-217頁；Raag R.和Whitlow M.，F(xiàn)ASEB J.，1995，9卷，73-80頁)?？梢杂米鹘宇^序列的蛋白，例如長度達(dá)150，優(yōu)選長度達(dá)80更優(yōu)選長度達(dá)40?？紤]到氨基酸的柔性，特別優(yōu)選包含甘氨酸和絲氨酸的接頭序列，考慮到可溶性優(yōu)選包含谷氨酸和賴氨酸的接頭序列。氨基酸的選擇一方面依照免疫原性和穩(wěn)定性的標(biāo)準(zhǔn)，同時也根據(jù)這些單鏈抗體是否適合于生理或工業(yè)上應(yīng)用(例如免疫親和層析)。所述單鏈抗體也可以聚合物的形式存在，如三聚體，寡聚體或多聚體。所述的接頭序列也可以缺失，所述的VH和VL鏈直接相連。
雙特異性抗體是大分子，異源雙功能交聯(lián)體，在一個分子內(nèi)有兩種不同的結(jié)合特異性。這類抗體包括，例如，雙特異性(bs)IgGs，bs IgM IgAs，bsIgA-二聚體，bs(Fab′)2，bs(scFv)2，雙抗體，和bs bis Fab Fc(Cao Y.和Suresh M.R.，生物偶聯(lián)化學(xué)(Bioconjugate Chem.)，1998，9卷，635-644頁)。
通過肽模擬物(peptidomimetics)了解低分子量蛋白組分，其模擬天然肽組分的結(jié)構(gòu)或在鄰近的肽序列中誘導(dǎo)特異結(jié)構(gòu)形成的模板的結(jié)構(gòu)(Kemp DS，生物技術(shù)導(dǎo)向，1990，249-255頁)。所述的肽模擬物可以，例如來自CDR3結(jié)構(gòu)域。對一個給定的肽序列進(jìn)行系統(tǒng)的突變分析，即通過丙氨酸或谷氨酸掃描突變分析，鑒定對凝血活性至關(guān)重要的肽殘基。另一種可能提高特定肽序列活性的方法是應(yīng)用肽文庫并結(jié)合高產(chǎn)率的篩選。
所用的術(shù)語抗體和抗體衍生物也包括通過分析有關(guān)結(jié)構(gòu)-活性相關(guān)性的數(shù)據(jù)所獲得的試劑。這些化合物也可以用作肽模擬物(Grassy G.等，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnol)，1998，16卷，748-752頁；Greer J.等，醫(yī)藥化學(xué)雜志，1994，37卷，1035-1054頁)。
本發(fā)明中表達(dá)抗體或抗體衍生物的雜交瘤細(xì)胞的實(shí)例依照布達(dá)佩斯條約提交了保藏，于1999年9月9日提交的保藏獲得的編號為90924(#198/A1)，99090925(#198/B1)和99090926(#198/BB1)，于1999年12月16日提交的保藏，保藏號為99121614(#193/AO)，99121615(#196/C4)，99121616(#198/D1)，99121617(198/T2)，99121618(#198/G2)，99121619(#198/AC1)和99121620(#198/U2)。生產(chǎn)方法本發(fā)明的抗體可由本領(lǐng)域所公知的方法制備，例如通過常規(guī)的雜交瘤技術(shù)，或通過噬菌體顯示文庫的方法，免疫球蛋白鏈混排或人源化技術(shù)(Harlow E.和Lane D.，抗體，實(shí)驗(yàn)操作手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1988)。本發(fā)明的抗體或抗體衍生物可以，例如通過傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)(抗體，實(shí)驗(yàn)操作手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1988，編.Harlow和Lane，148-242頁)。依照本發(fā)明，可以利用人或非人種動物，例如牛，豬，猴，雞和嚙齒動物(小鼠，大鼠)。通常可以利用例如，具有免疫活性的Balb/c小鼠或FIX-缺陷小鼠，(因子IX-缺陷小鼠可由Chapel Hill，北卡羅來納州大學(xué)，DarrelStafford博士處獲得)?？梢杂美纾蜃覫X，因子IXaa或充分活化的因子IXap，或其片段進(jìn)行免疫。
以在所述雜交瘤上清液中的抗體或抗體衍生物可結(jié)合因子IX/因子IXa并提高因子IXa促凝血活性為目的篩選雜交瘤。通過本領(lǐng)域已知的方法測定因子VIII-樣活性，例如.顯色分析，來證明所述促凝血活性的提高。
或者，也可以通過重組生產(chǎn)方法生產(chǎn)本發(fā)明的抗體和抗體衍生物。其中，本發(fā)明的抗體的DNA序列可由公知的技術(shù)確定，全部的抗體DNA或其中的一部分可在合適的系統(tǒng)中表達(dá)。可應(yīng)用的重組生產(chǎn)方法包括噬菌體顯示，合成的或天然文庫，在已知的表達(dá)系統(tǒng)中或轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá)抗體蛋白(Jones等，自然，1986，321卷，522-525頁；肽和蛋白的噬菌體顯示，實(shí)驗(yàn)操作手冊，1996，.Kay等編，127-139頁；美國專利號4,873,316；Vaughan T.J.等，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)1998，535-539頁；Persic L.等，基因，1997，918頁；Ames R.S.等，免疫學(xué)方法雜志，1995，177-186頁)。
通過重組方式產(chǎn)生的抗體的表達(dá)，可以利用傳統(tǒng)的表達(dá)載體，例如細(xì)菌載體，如pBr322及其衍生物，pSKF或真核載體，例如pMSG和SV40載體。這些編碼抗體的序列可以帶有調(diào)節(jié)序列，所述調(diào)節(jié)序列調(diào)節(jié)復(fù)制，表達(dá)和從宿主細(xì)胞中分泌。這些調(diào)節(jié)序列包括啟動子，例如CMV或SV40和信號序列。
所述的表達(dá)載體還可以包括篩選和擴(kuò)增標(biāo)記，例如二氫葉酸還原酶基因(DHFR)，潮霉素-B-磷酸轉(zhuǎn)移酶，胸腺嘧啶核苷-激酶等。
所用的載體組分，例如篩選標(biāo)記，復(fù)制子，增強(qiáng)子等可以是商購的也可以是通過常規(guī)方法制備的。構(gòu)建所述載體用于在各種細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)例如，哺乳動物細(xì)胞，如CHO，COS，成纖維細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，酵母或細(xì)菌，如大腸桿菌。優(yōu)選地，在這些細(xì)胞中，所表達(dá)的蛋白可以進(jìn)行理想的糖基化。特別優(yōu)選的是在CHO細(xì)胞或SK-Hep中表達(dá)的載體pBax(參見
圖17)。
可通過本領(lǐng)域公知的方法生產(chǎn)Fab片段或F(ab)2片段，例如，通過蛋白水解酶，如木瓜蛋白酶和/或胃蛋白酶切割單克隆抗體，或通過重組方法。這些Fab和F(ab)2片段也可以通過噬菌體顯示文庫制備(Winter等，1994，免疫學(xué)年評，12433-455)。
所述的抗體衍生物也通過本領(lǐng)域已知的方法制備，例如通過分子模擬，例如from Grassy G.等，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnol.)，1998，16卷，748-752頁，或Greer J.等，醫(yī)藥化學(xué)雜志，37卷，1035-1054頁，或Rees A.等，″蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測實(shí)用方法″，Sternberg M.J.E.編，IRL出版社，1996，7-10章，141-261頁。
所述抗體和抗體衍生物的純化也可以通過本領(lǐng)域所公知的方法進(jìn)行，例如，通過硫酸銨沉淀，親和純化(蛋白G Sepharose)，離子交換層析，或凝膠層析。下述的方法可以用作檢測方法，以說明本發(fā)明的抗體或抗體衍生物與因子IX/因子IXa結(jié)合，提高因子IXa的促凝血活性或具有因子VIII-樣活性。一步凝血檢測(Mikaelsson和Oswaldson，Scand.血液學(xué)雜志，增刊.，33，79-86頁，1984)或顯色試驗(yàn)，例如COATEST VIIIC，(Chromogenix)或免疫著色(Immunochrom)(IMMUNO)。原則上，所有用于確定因子VIII活性的方法均可使用。作為檢測的空白值對照例如，可以用非特異性小鼠-IgG抗體。
本發(fā)明的抗體和抗體衍生物適合應(yīng)用于治療凝血疾病，例如在對血友病A，因子VIII抑制劑病人等的治療中。可以通過任何適當(dāng)?shù)姆椒▽Σ∪耸┯糜行У尼t(yī)療制劑進(jìn)行治療，例如通過口服，皮下的，肌內(nèi)的，靜脈內(nèi)的或鼻內(nèi)的方式。
本發(fā)明的醫(yī)療制劑可以作為制劑生產(chǎn)，所述的制劑包含作為活性成分的足量的抗體或抗體衍生物及藥學(xué)上可接受的載體。這些制劑可以是液體形式也可以是粉末形式。而且，本發(fā)明的制劑也可以包括不同抗體，其衍生物和/或其所產(chǎn)生的有機(jī)化合物的混合物，和由抗體和因子IX和/或因子Ixa所組成的混合物。因子IXa可以因子IXaα和/或因子IXaβ的形式存在。液體載體物質(zhì)的例子如，生理鹽水。所述的溶液是無菌的，可通過常規(guī)的方法進(jìn)行滅菌。
本發(fā)明的抗體和抗體衍生物可以冷凍干燥的形式儲藏，施用前懸浮于適當(dāng)?shù)娜軇┲小Ｒ炎C明這種方法對常規(guī)的免疫球蛋白是有益的，已知冷凍干燥和重建的方法適用于這種情況。
而且，本發(fā)明的抗體和抗體衍生物也適合于工業(yè)應(yīng)用，通過親和層析對因子IX/因子IXa進(jìn)行純化，或作為檢測方法(例如ELISA分析)的組分，或作為與靶蛋白功能結(jié)構(gòu)域相互作用或?qū)ζ溥M(jìn)行鑒定的試劑。
通過下述的實(shí)施例和附圖對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，其不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例實(shí)施例1對免疫活性小鼠的免疫和分泌抗-FIX/IXa抗體的雜交瘤細(xì)胞的產(chǎn)生以腹膜內(nèi)(i.p.)途徑，用100μg抗原免疫1-3組正常的5-8周齡的免疫活性小鼠Balb/c小鼠(100μl劑量)。在典型的實(shí)驗(yàn)中，小鼠與重組的人凝集因子(F)IX(BenefixTM)，活化的人FIXaα(酶學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室，批次FIXaa 1190L)或人FIXaβ(酶學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室，批次HFIXAap 1332 AL，)輔以Al(OH)3或KFA。
用100μg抗原(100μl劑量，i.p)在不同的時間對個體小鼠加強(qiáng)免疫，并在兩天后將小鼠處死。分離脾細(xì)胞，基本上依照Lane等，1985(免疫學(xué)方法雜志，81卷，223-228頁)將其與P3 X63-Ag8 6.5.3骨髓瘤細(xì)胞融合。每一次融合實(shí)驗(yàn)都單獨(dú)編號，即#193，195，196或198。
雜交瘤細(xì)胞在96孔培養(yǎng)板巨噬細(xì)胞飼育層(app.105細(xì)胞/ml)生長，然后在HAT-培養(yǎng)基上篩選(RPMI-1640培養(yǎng)基，添加了抗生素10％ FCS，丙酮酸鈉，L-谷氨酸鹽，2-巰基乙醇和HAT(HAT 100x1.0×10-2M次黃嘌呤溶于H2O(136.1mg/100ml H2O)，4.0×10-5M氨基蝶呤溶于H2O(1.76mg/100ml H2O)和1.6×10-3M胸腺嘧啶核苷溶于H2O(38.7mg/100mlH2O)。6天后第一次更換培養(yǎng)基，此后每周更換兩次。兩到三周后將HAT培養(yǎng)基換成HT培養(yǎng)基(RpMI-1640添加抗生素，10％FCS，丙酮酸鈉，L-谷氨酸鹽，2-巰基乙醇和HT)，其后(1-2周后)轉(zhuǎn)到正常生長培養(yǎng)基中(RPMI-1640培養(yǎng)基添加10％FCS，丙酮酸鈉，L-谷氨酸鹽和2-巰基乙醇)(參見雜交瘤技術(shù)，EMBO，SKMB Course 1980，巴塞爾)。
在另一組實(shí)驗(yàn)中用FIX缺陷C57B16小鼠(Lin等，1997，血液，903962)進(jìn)行免疫和接下來的雜交瘤生產(chǎn)。正常的Balb/c小鼠相比，由于FIX剔除(k.o.)小鼠不表達(dá)內(nèi)源的FIX，其所得的抗(a)-FIX抗體光譜也有所不同(由于缺乏耐力)。實(shí)施例2在分泌抗-FIX/FIXa抗體的雜交瘤細(xì)胞上清液中分析FVIII-樣活性用可商購的檢測試劑盒COATEST VIIIC/4(Chromogenix)分析由雜交瘤細(xì)胞分泌的抗-FIX/FIXa抗體的FVIII-樣活性。所述的分析基本上依照供應(yīng)商所描述的進(jìn)行，僅作出下述修改為進(jìn)行高產(chǎn)率篩選，所述分析縮小到微滴定平皿形式。簡要地說，25μl等分雜交瘤上清液轉(zhuǎn)移到微滴定板(Costar，#3598)的孔中，升溫到37℃。依照供應(yīng)商所述方法將顯色底物(S-2222)，合成的凝血酶抑制劑(I-2581)，因子(F)IXa和FX在無菌水中重建，F(xiàn)IXa/FX與磷脂混合。每個反應(yīng)，50μl磷脂/FIXa/FX溶液和25μl CaCl2(25mM)及50μl底物/抑制劑合劑。為起始反應(yīng)，將125μl預(yù)混合液加入微滴定板中的雜交瘤上清液中，在37℃溫育。在不同的時間(30min到12h)于Labsystems iEMS ReaderMFTM微滴定板讀數(shù)儀上測定樣品相對于試劑(MLW，用細(xì)胞培養(yǎng)基代替雜交瘤上清液)空白對照在405nm和490nm下的吸光度。用GENESISTM軟件，通過將樣品的吸光度與經(jīng)稀釋的FVIII參照標(biāo)準(zhǔn)(IMMUNO AG#5T4AR00)的吸光度相比較，計(jì)算所測樣品的FVIII-樣活性。
在雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中篩選FVIII-樣活性的結(jié)果如
圖1所示。在上述的顯色FVIII分析中檢測由融合實(shí)驗(yàn)#193，#195和#196(見上)所得的預(yù)選克隆?？寺?93/M1，193/N1和193/P1是主克隆193/CO(見下)衍生的亞克隆。主克隆195/10源于融合實(shí)驗(yàn)#195，克隆196/AO，196/BO和196/CO源于融合實(shí)驗(yàn)#196。在典型的篩選實(shí)驗(yàn)中，一次預(yù)篩選FVIII-樣活性的融合實(shí)驗(yàn)獲得約1000克隆(在96孔中)。接下來，所篩選的克隆更大規(guī)模(3-5ml上清液)培養(yǎng)，并經(jīng)再次顯色分析實(shí)驗(yàn)分析。作為陰性對照，細(xì)胞培養(yǎng)基在每一平板上分析(MLW)。
表現(xiàn)高FVIII-樣活性或基本FVIII-樣活性的孔用于亞克隆程序。以IgG細(xì)胞系(即193/CO)的篩選和亞克隆過程為例說明篩選和亞克隆過程，對產(chǎn)生IgM的克隆(即196/CO，見下，圖5)也是通過同樣的方式進(jìn)行的。
所述的篩選過程首先將所有源于單一的融合實(shí)驗(yàn)的雜交瘤克隆置于10個96孔培養(yǎng)板上，由此形成所謂的″主平板″。在主平板上單數(shù)位置(孔)通常包含不止一個雜交瘤克隆(通常3到15不同克隆)。接下來，檢測由幾千細(xì)胞分泌的抗體。這些細(xì)胞在抗體產(chǎn)生的次最優(yōu)條件下生長，已知所述的條件對染色細(xì)胞是最優(yōu)的。因此在上清液中預(yù)期的特異抗-FIX抗體的濃度在10-12到10-14M的范圍內(nèi)。這解釋了為什么與標(biāo)準(zhǔn)的FVIII分析相比，孵育期要延長。
在主平板的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中篩選IgG介導(dǎo)的FVIII′樣活性的結(jié)果如圖2所示。將上清液進(jìn)行顯色FVIII分析。顯示的是源于#193號融合實(shí)驗(yàn)(用FIXaa免疫的Balb/c小鼠)的第五塊主平板的結(jié)果。在37℃下溫育4小時后測定吸光度。ES位顯示出明顯高于空白(MLW)的FVIII樣活性。這一細(xì)胞庫命名為193/CO并進(jìn)行進(jìn)一步亞克隆(圖3)。由于主平板上的每個孔均包含不止一個雜交瘤細(xì)胞克隆，因此將一個陽性的孔中的細(xì)胞擴(kuò)大并以經(jīng)計(jì)算所得的2-0.2細(xì)胞/孔的密度置于96孔培養(yǎng)板上。再次測定上清液的FVIII樣活性，對陽性的位置進(jìn)行下一輪亞克隆。典型地，每一表現(xiàn)高FVIII樣活性的克隆要經(jīng)過3到4輪亞克隆才能獲得同源的細(xì)胞群。這里顯示了所述的193/CO亞克隆的顯色分析結(jié)果。溫育4小時后測定吸光度。A6和D5位表現(xiàn)出基本FVIII樣活性，將其分別命名為193/M1和193/P1。將這兩個克隆進(jìn)行下一輪的亞克隆。每板(MLW(H1))上均對空白培養(yǎng)基進(jìn)行分析作為陰性對照。
小量(3ml)雜交瘤培養(yǎng)物的顯色FVIII-樣活性和FIX-ELISA反應(yīng)性的比較如圖4所示。在確定主克隆(或亞克隆)是否進(jìn)行進(jìn)一步亞克隆之前，培養(yǎng)3-5ml量的克隆并再次檢測上清液。此圖表明主克隆193/CO及其所有的經(jīng)鑒定為陽性并經(jīng)再次檢測的亞克隆的FIX特異ELISA結(jié)果和FVIII-樣顯色活性。此處所描述的顯色分析和ELISA測定的結(jié)果均已去除了空白值(顯色試劑本身的吸光度)?？寺?93/M1經(jīng)亞克隆后得到克隆193/V2，193/M2和193/U2。對其它的來自193/P1，193/AB2和193/P2的第二輪克隆進(jìn)行了亞克隆。193/AF3，193/AB3和193/AE3是193/AB2的亞克隆。其它的第三輪的克隆來自193/P2。最終對193/AF3(→193/AF4)，AE3(→193/AE4，193/AL4，193/AN4和193/AO4)和193/AD3(→193/AG4，193/AH4，193/AD4，193/AI4，193/AK4)進(jìn)行了亞克隆。
將來自每一融合實(shí)驗(yàn)的幾個(5-15)主克隆(選自主平板)進(jìn)行鑒定并亞克隆。三輪亞克隆后，經(jīng)ELISA，顯色分析(參見圖4)及cDNA序列測定大多數(shù)的細(xì)胞系是同源的。一個特定的主克隆和其所有的亞克隆均產(chǎn)生相同的FIX/FIXa結(jié)合抗體。但是來自不同主克隆的抗體蛋白序列存在很大的差異(參見實(shí)施例11)。大多數(shù)的雜交瘤細(xì)胞系表達(dá)源于IgG亞類的抗體(即克隆#193，#198，如198/A1，198/B1，198/BB1)。但是我們可以挑選出一些表達(dá)IgM的抗體。
測定了一些主要的主克隆和亞克隆雜交瘤上清液的顯色活性。在37℃下溫育1h 30min和3h 30min后測定吸光度(圖5)。與所有來自第193號融合的克隆相比，196/CO和其亞克隆196/AP2產(chǎn)生FIX/FIXa-特異性IgM抗體，該抗體即使在短期的溫育后也可以給出強(qiáng)的顯色活性。
下述的細(xì)胞系已依照布達(dá)佩斯條約保藏于歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)98/B1(ECACC No.99090925)；198/A1(ECACC No.99090924)；198/BB1(ECACC No.99090926)；193/A0(ECACC No.99121614)；196/C4(ECACC No.99121615)；198/D1(ECACC No.99121616)；198/T2(ECACCNo.99121617)；198/G2(ECACC No.99121618)；198/AC1(ECACC No.99121619)；和198/U2(ECACC No.99121620)。
為對特定抗體的生化性質(zhì)作更深入地分析，將表達(dá)具有FVIII樣活性抗體的同源雜交瘤細(xì)胞系擴(kuò)大，并用于更大量(100-1000ml)地表達(dá)所研究的抗體。這些抗體在用于進(jìn)一步研究之前經(jīng)親和純化(參見實(shí)施例3)。實(shí)施例3因子IX/FIXa(α，β)與表現(xiàn)FIX/FIXa激活活性的抗體結(jié)合性質(zhì)在TBS(25mM Tris HCl，150mMNaCl，pH 7.5)中，將因子IX和FIX的兩種活化形式，F(xiàn)IXaα和FIXaβ(FIX/FIXa(α，β))稀釋到終濃度為2μg/ml。依照常規(guī)方法用100μl FIX/FIXa(α，β)溶液包被Nunc MaxisorpELISA平板(4℃，過夜)，用TBST(TBS，0.1％(v/v)Tween 20)洗幾次。用50μl TBST/2％ BSA以1∶1的比例稀釋50μl雜交瘤上清液，加入經(jīng)包被的ELISA平板。在室溫(RT)下溫育2h后，用TBST洗四次，與100μl/孔1∶25000稀釋的(在TBST/1％ BSA中)抗-小鼠IgG(Fc-特異)過氧化物酶連接的抗體(Sigma，#A-0168)一起溫育(2h，RT)。用TBST洗滌5次，用100μl新配制的染色溶液(10ml 50mM檸檬酸鈉，pH 5添加100μlOPD(60mg OPD/ml)和10μl 30％H2O2)染色。加入50ml H2SO4終止反應(yīng)后應(yīng)用基因SISTM軟件在Labsystems iEMS Reader MFTM微滴定板讀數(shù)儀上記錄492nm和620nm下的光密度值。
在特定的情況下，可以用抗-小鼠IgM ELISA代替抗-小鼠IgGELISA。
從雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中純化小鼠-IgG向雜交瘤上清液(100-500ml)中添加200mM Tris/HCl緩沖液(pH7.0)和固體NaCl至終濃度分別為20mM Tris和3M NaCl。上清液經(jīng)5500xg離心10min澄清。用15ml 20mM Tris/Cl pH 7.0清洗一只1ml蛋白G親和層析拄(蛋白G Sepharose Fast Flow，Amersham-Pharmacia)，其后用10ml含3M NaCl的pH 7.0的20mM Tris/Cl緩沖液平衡。含有3M NaCl的雜交瘤上清液通過重力加到柱。上述柱用15ml含3M NaCl的pH 7.0的20mM Tris/Cl緩沖液洗。結(jié)合的IgG用12ml pH 2.8的甘氨酸/HCl緩沖液洗脫，收集1ml/份餾分。每份加入100μl pH 9.0的1M Tris進(jìn)行中和。在微滴定板的孔中將50μl包含IgG的餾分與150μl染色溶液(BioRad；濃縮液，用水以1∶5的比例稀釋)相混合鑒定含有IgG的餾分。收集陽性餾分，依制造商的說明在超濾濃縮器(Centricon Plus 20，Amicon)中濃縮為1ml。濃縮物用19ml TBS(20mM Tris/Cl緩沖液pH 7.0含150mM NaCl)稀釋，然后再次濃縮為1ml。稀釋-濃縮步驟重復(fù)2次以上以使IgG進(jìn)入TBS。
從雜交瘤細(xì)胞上清液中純化小鼠-IgM將100-500ml雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物上清液依制造商的說明通過超濾濃縮器(Centricon Plus 20，Amicon)或通過硫酸胺(40％飽和度，0℃)沉淀法濃縮至5-10ml，將沉淀再用5-10ml TBS再溶解。將通過任何一種方法得到的濃縮物在含1.25M NaCl的pH 7.4的20mM Tris Cl緩沖液中透析后再在Centricon Plus 20，(Amicon)超濾儀上濃縮至1ml。依照制造商的說明用免疫純化IgM純化試劑盒(Pierce)從濃縮物中純化IgM。檢測在從麥芽糖結(jié)合蛋白-柱上洗脫的過程中收集的餾分中的IgM，依照關(guān)于IgG的的描述，進(jìn)行收集，濃縮，并將其引入TBS。
在純化的沉淀中鑒定IgG濃度測定了總IgG內(nèi)含物適當(dāng)稀釋后在280nm下的消光值。E280＝1.4相當(dāng)于1mg/ml蛋白。
因子IXa特異性IgG(定量ELISA)2μg/ml在TBS(25mM Tris/HCl pH 7.5含150mM NaCl)中稀釋的因子IXa在微滴定板(Nunc Maxisorp)中4℃溫育過夜。用TBST(25mMTris/HCl pH 7.5含150mM NaCl和0.1％(v/v)Tween 20)洗滌四次。將HIX1抗-FIX(精確的)作為標(biāo)準(zhǔn)的單克隆抗體。用含2％(w/v)BSA的TBST稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。室溫下在ELISA-平板上將標(biāo)準(zhǔn)稀釋液系列和樣品的適當(dāng)稀釋液溫育2h。用TBST洗板四次，與100μl/孔1∶25000稀釋的(在TBST/1％BSA中)抗-小鼠IgG(Fc-特異)過氧化物酶連接的抗體(Sigma，#A-0168)一起溫育(2h，RT)。用TBST洗孔5次，用100μl新配制的染色溶液(10ml 50mM檸檬酸鈉，pH 5添加100μl OPD(60mgOPD/ml)和10μl 30％H2O2)染色。加入50ml H2SO4終止反應(yīng)30min后應(yīng)用基因SISTM軟件在Labsystems iEMS Reader MFTM微滴定板讀數(shù)儀上記錄492nm和620nm下的光密度值。實(shí)施例4在顯色FVIII分析中的表現(xiàn)FVIII-樣活性的抗-FIX/FIXa抗體將幾個產(chǎn)生抗-FIX/FIXa抗體的雜交瘤克隆亞克隆達(dá)四次，然后所得的單克隆雜交瘤細(xì)胞系用于生產(chǎn)含單克隆抗體的上清液。源于這些上清液的IgG同種型抗體經(jīng)親和柱純化和TBS透析(見上)。IgM用作非純化的上清液餾分。下述的實(shí)驗(yàn)在兩組代表性的抗體中進(jìn)行193/AD3和198/AC1/1(IgG同種型，抗體198/AC1/1是由親代198/AC1雜交瘤克隆制備的，即用含198/AC1細(xì)胞的小瓶(冷凍的)培養(yǎng)并產(chǎn)生抗體。其上清液用于這些實(shí)驗(yàn))和196/AF2及196/AF1(IgM同種型)(圖6A和圖6B)。簡要地說，每份25μl包含樣品的單克隆抗體(未純化的雜交瘤上清液，或者如果溫育的話，一定量的FIX特異抗體)加入到微滴定板的孔中并升溫到37℃。顯色底物(S-2222)，合成的凝血酶抑制劑(I-2581)，因子(F)IXa和FX與在無菌水中重建且依供應(yīng)商的說明與磷脂相混合。每個反應(yīng)，包含50μl磷脂/FIXa/FX溶液和25μl CaCl2(25mM)和50μl底物/抑制劑的混合物。為起始反應(yīng)，將125μl預(yù)混合液加到在微滴定板中的雜交瘤上清液，37℃下溫育。在不同的時間(5min到6h)用GENESISTM軟件于Labsystems iEMS Reader MFTM微滴定板讀數(shù)儀上測定樣品相對于試劑(MLW，用細(xì)胞培養(yǎng)基代替雜交瘤上清液)空白對照，在405nm和490nm下的吸光度。通過將樣品的吸光度與經(jīng)稀釋的FVIII參照標(biāo)準(zhǔn)(IMMUNO AG#5T4AR00)的吸光度相比較，計(jì)算所測樣品的FVIII-樣活性。
與人FVIII(12和16mU/ml)，TBS和細(xì)胞培養(yǎng)基相比由單克隆抗體193/AD3(IgG同種型)和196/AF2(IgM同種型)所顯示的FVIII-樣活性的時間過程如圖6A所示。在遲滯期后，根據(jù)所測定的在405nm波長處的光密度的升高可知兩抗體均引起顯色底物裂解。
與人FVIII(16mU/ml)和10μg/ml小鼠IgG相比由單克隆抗體198/AC1/1(IgG同種型，10tg/ml)和196/AF1(IgM同種型，未純化的上清液)所顯示的FVIII-樣活性的時間過程如圖6B所示。在遲滯期后，根據(jù)所測定的在405nm波長處光密度的升高可知兩抗體均引起顯色底物裂解。實(shí)施例5通過抗FIX/FIXa-抗體表現(xiàn)的FVIII-樣活性產(chǎn)生因子Xa，并且是磷脂，F(xiàn)IXa/FX和Ca2+依賴性的因子VIII活性通常是由顯色分析和/或基于APTT的凝固分析測定的。兩種類型的分析依賴FVIIIa/FIXa-介導(dǎo)的因子Xa的產(chǎn)生。在顯色FVIII分析的情況下，所產(chǎn)生的因子Xa將接下來與顯色底物反應(yīng)，其可通過光譜學(xué)分析監(jiān)控，例如，在ELISA讀數(shù)儀中。在基于APTT的凝固分析中，游離的因子Xa與所謂的凝血酶原酶復(fù)合物的磷脂表面的Fva組配并激活凝血酶原成為凝血酶。凝血酶進(jìn)而引起纖維蛋白的產(chǎn)生并最終形成凝集物。兩種分析方法的關(guān)鍵均在于由因子FVIIIa/FIXa生成Xa。
為證明通過抗-FIX/FIXa-抗體表現(xiàn)的FVIII-樣活性的確產(chǎn)生因子Xa，進(jìn)行了下列的實(shí)驗(yàn)。將幾份25μl的未純化的雜交瘤上清液196/AF2(IgM同種型)加到微滴定板的孔中，升溫到37℃。作為陽性對照，用雜交瘤培養(yǎng)基(196 HM 007/99)稀釋16mU的RecombinateTM將其與雜交瘤上清液同樣處理。用空白雜交瘤培養(yǎng)基作為陰性對照。依照供應(yīng)商所述方法將顯色底物(S-2222)，合成的凝血酶抑制劑(I-2581)，在無菌水中重建因子(F)IXa并將FX FIXa/FX與磷脂混合。用水重建Pefabloc Xa，因子Xa特異性蛋白酶(Pentapharm，LTD)至終濃度為1mM/l。每個反應(yīng)，50μl磷脂/FIXa/FX溶液與25μl CaCl2(25mM)和50μl底物/凝血酶抑制劑合劑混合。為起始反應(yīng)，將125μl預(yù)混合液加入微滴定板中的雜交瘤上清液中，在37℃溫育。此時指出，加入35μM Pefabloc Xa。在不同的時間(每5min到6h)用GENESISTM軟件在Labsystems iEMS Reader MFTM微滴定板讀數(shù)儀上，以試劑(細(xì)胞培養(yǎng)基)為空白對照測定405nm和490nm下樣品的吸光度。
圖7A顯示了通過易于測定的顯色底物S-2222(比較″16mU FVIII″和″196/AF2″)的裂解確定的，通過IgM抗-FIX/FIXa抗體196/AF2表現(xiàn)的FVIII-樣活性在產(chǎn)生反應(yīng)物Xa中的因子IXa刺激作用的結(jié)果。因子Xa的活性被Fxa特異性抑制劑″Pefabloc Xa″(比較″196/AF2″對″196/AF235μM Pefabloc Xa″有效地封閉，這說明的確產(chǎn)生了FXa。
用純化的克隆198/AM1的IgG制劑進(jìn)行了相同的實(shí)驗(yàn)(圖7B)。純化的IgG用TBS稀釋到最終濃度為0.4mg/ml和25μl(即總共10μg)，將其移至微滴定板的孔中，升溫到37℃。用6mU來自血漿的FVIII作為陽性對照。10μg非特異性小鼠IgG(Sigma，1-5381)用作陰性對照。依照上述進(jìn)行分析。
進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示因子根據(jù)易于測定的顯色底物S-2222裂解判斷顯示FVIII-樣活性的IgG抗FIX/FIXa-抗體198/AM1刺激因子IXa產(chǎn)生因子Xa(圖7B)。再由因子VIII和抗體198/AM1產(chǎn)生可由Fxa特異性抑制劑″Pefabloc Xa″有效封閉的Fxa。非特異性小鼠IgG(Signa，1-5381)用作陰性對照進(jìn)行分析。
在另外一組實(shí)驗(yàn)中，證明了在磷脂(PL)，F(xiàn)IXa/FX和Ca2+存在下，純化的抗FIX/FIXa-抗體(IgM，圖8A)或來自細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的非純化抗體(IgG，圖8B)對FVIII-樣活性的依賴性。小鼠IgG用作對照(圖8C)。因子VIII-樣活性基本上按上述描述進(jìn)行分析。可從反應(yīng)中去除FIXa/FX混合物，PL或Ca2+。在Labsystems iEMS Reader MFTM微滴定板讀數(shù)儀上讀出不同的時間樣品相對于試劑空白(緩沖液代替純化的抗體)在405nm和490nm下吸光度。結(jié)果如圖8A，圖8B和圖8C所示。
在磷脂(PL)，F(xiàn)IXa/FX和Ca2+存在下，純化的FIXa-抗體198/AC1/1(IgG同種型，在分析過程中濃縮為10μg/ml)對FVIII-樣活性的依賴性進(jìn)一步如圖8A所示。顯然，只有包括抗體，PL，Ca2+，和FIXa/FX的完整分析才能引起適當(dāng)?shù)腇Xa產(chǎn)生。在磷脂，F(xiàn)IXa/FX和Ca2+存在下，含未純化的IgM同種型抗-FIX/FIXa-抗體(196/AF1)的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液對FVIII-樣活性的依賴性如圖8B所示。
再次如上述對純化的IgG制劑，抗體198/AC1/1進(jìn)行分析(圖8A)，只有包括抗體，PL，Ca2+，和FIXa/FX的完整分析才能引起適當(dāng)?shù)腇Xa產(chǎn)生。為了表明所述反應(yīng)的特異性，在與上述完全相同的條件下分析從正常小鼠血漿中制備的全部IgG。結(jié)果如圖8C所示。沒有檢測到FVIII-樣活性。如所預(yù)料的那樣，在磷脂，F(xiàn)IXa/FX和Ca2+存在下，沒有可檢測的活性。所有的實(shí)驗(yàn)均在微滴定板上進(jìn)行，每5min測定一次OD405，共進(jìn)行6h。實(shí)施例6某些抗-FIX/FIXa-抗體在FIXa存在下是促凝血的在通常的止血過程中，F(xiàn)IX是由組織因子(TF)/因子VIIa途徑進(jìn)行初始活化的，或者后來由因子XI(FXIa)活化的。其活化后，F(xiàn)IXa在膜結(jié)合復(fù)合物的血小板表面上與活化的FVIII結(jié)合。因子IXa本身對FX幾乎或完全沒有酶活性，但在FVIIIa存在下具有很高的活性。為證明某些抗-FIX/FIXa抗體具有FVIII-樣活性并從而在FVIII缺陷的病人血漿中是促凝血的，進(jìn)行了下述的實(shí)驗(yàn)。不同量的抗體193/AD3或小鼠IgG(作為對照)用于標(biāo)準(zhǔn)的基于aPTT的單步驟凝集試驗(yàn)。簡要地說，100μl含抗體的樣品與100μl FVIII缺陷血漿(DP)和100μl DAPTTIN(PTT試劑以確定活化的凝血激酶時間；IMMUNO AG)試劑在KC10A凝集試驗(yàn)器中溫育?？蓪⒖偭繛?0ng活化的FIX摻入反應(yīng)混合物中。溫育4分鐘后，加入100μl CaCl2(25mM)開始反應(yīng)。結(jié)果如表1和圖9所示。
凝集時間(sec)μgAB193/AD3 小鼠IgG50ng FIXa 50ngFIXa9101.6 102.54.5 95.6 103.22.25 93.1 103.21.8 93.7 101.91.35 91.4 103.40.9 94.4 102.20.45 98.1 101.90.34 97.1 103.90.23 99.3 103.7表1在50ng活化的FIX(0.01UFIX)存在下，應(yīng)用不同量的促凝血(193/AD3)的FVIII缺陷血漿和對照抗體(小鼠IgG)在基于APTT的凝集試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中的凝集時間。反應(yīng)中抗體和活化的FIX的摩爾比為10∶1?？贵w和總FIX(FIX和FIXa，假定人FVIII缺陷血漿包含1U(5g)FIX)之間的摩爾比在6∶1(9g抗體反應(yīng)中)和1∶6(0.23g抗體在反應(yīng)中)之間變化。在最佳的縮短的凝集時間處，抗體和總FIX之間的摩爾比為1∶1。未加入FIXa的凝集時間在120sec的范圍內(nèi)。
圖9是表示在50ng活化的FIX(0.01UFIX)存在下，應(yīng)用不同量的促凝血(193/AD3)的FVIII缺陷血漿和對照抗體(mouse IgG)在基于APTT的凝集試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中的凝集時間的曲線圖。結(jié)果表明抗體在FIXa存在下是促凝血的。實(shí)施例7抗-FIX/FIXa-抗體在FVIII抑制劑和FIXa存在下是促凝血的標(biāo)準(zhǔn)的FVIII替代治療的嚴(yán)重并發(fā)癥是產(chǎn)生直接針對FVIII的同種抗體，導(dǎo)致FVIII中和與病人血液不能凝集的病癥。
為證明某些抗-FIXa-抗體即使在FVIII抑制劑存在下也具有FVIII-樣活性，進(jìn)行了下述的實(shí)驗(yàn)。將不同量的抗體193/AD3和作為對照的小鼠IgG用于標(biāo)準(zhǔn)的基于aPTT的單步驟凝集試驗(yàn)。簡要地說，將100μl抗體樣品與100μl FVIII缺陷血漿(
圖10A)或FVIII抑制血漿(抑制劑效力400BU/ml)，
圖10B)以及100μl DAPTTIN試劑一起在KC10A凝集試驗(yàn)器中溫育。另外，將總量為50ng的活化的FIX摻入反應(yīng)混合物中。溫育4分鐘后，加入100μl CaCl2(25mM)開始反應(yīng)。為確保相同條件，平行地進(jìn)行使用FVIII缺陷血漿和FVIII抑制血漿的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如
圖10A和10B所示。如已在實(shí)施例6中所示的，在FVIII抑制劑存在下，加入抗體193/AD3的樣品的凝集時間有明顯的劑量依賴性減小。實(shí)施例8抗-FIX/FIXa-抗體在缺陷的FVIII和FIXa存在下是促凝血的為證明抗-FIX/FIXa-抗體在缺陷的FVIII和FIXa存在下是促凝血的，進(jìn)行了下述實(shí)驗(yàn)。
將用量逐漸提高的抗體193/AD3或作為對照的小鼠IgG用于標(biāo)準(zhǔn)的基于aPTT的單步驟凝集試驗(yàn)。在這一凝集試驗(yàn)中應(yīng)用了由于存在缺陷FVIII(DF8)而具有低凝集活性的血友病A病人的血漿。簡要地說，將100μl抗體樣品與100μl DAPTTIN試劑及100μl DF8血漿或FVIII缺陷血漿一起在KC10A凝集試驗(yàn)器中溫育。另外，反應(yīng)混合物中包含總量為50ng的活化的FIXa。短暫的溫育后，加入100μl CaCl2(25mM)開始反應(yīng)。為確保同等條件，平行地進(jìn)行使用FVIII缺陷血漿和DF8血漿的試驗(yàn)。實(shí)施例9在FIXa存在下具有促凝血活性的抗-FIX/FIXa-抗體在人和牛之間的區(qū)別從各雜交瘤上清液中純化選自第198號融合實(shí)驗(yàn)的FIX/FIXa特異性單克隆抗體，并依照實(shí)施例3所述進(jìn)行定量。在改進(jìn)的單步驟凝集試驗(yàn)(如實(shí)施例6所述)中分析這些抗體，其中一些抗體表現(xiàn)出促凝血活性。
在以下的FXa產(chǎn)生動力學(xué)分析中測定這些抗體制劑的顯色活性將10μg單克隆抗體(25μl)移至微滴定板的孔中并升溫到37℃。在無菌水中重建顯色底物(S-2222)，合成的凝血酶抑制劑(I-2581)，因子IXa和FX，并依供應(yīng)商的說明將FIXa/FX(均來自牛)與磷脂相混合。在每一反應(yīng)中，將50μl磷脂/FIXa/FX溶液和25μlCaCl2(25mM)和50μl底物/抑制劑合劑混合。為起始反應(yīng)，將125μl預(yù)混合液加到微滴定板的雜交瘤上清液中，在37℃下溫育。在不同的時間(5min到2h)用GENESISTM軟件在Labsystems iEMS Reader MFTM微滴定板讀數(shù)儀上以試劑(用25mlTBS單克隆抗體)為空白對照，測定405nm和490nm下樣品的吸光度。作為平行實(shí)驗(yàn)，每一反應(yīng)加入50ng人FIXa進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)，表現(xiàn)促凝血活性的抗體相對牛FIX沒有顯色活性，而在人FIXa存在時具有高顯色活性。
圖11顯示在(+)加入或(-)不加入50ng人FIXaα的情況下，單克隆抗體198/A1，198/B1和198/AP1表現(xiàn)出的FVIII-樣活性的時間過程。非特異性小鼠IgG作為對照。198/A1和198/B1表現(xiàn)促凝血活性(與實(shí)施例6中的193/AD3相似)而198/AP1則不表現(xiàn)?？贵w198/BB1具有相同的活性圖案(數(shù)據(jù)未示出)。
由198號融合實(shí)驗(yàn)篩選出的其它單克隆抗體包括198/D1(ECACCNO.99121616)，198/T2(ECACC No.99121617)，198/G2(ECACC No.9912118)，198/U2(ECACC No.99121620)。實(shí)施例10由抗-FIX/FIXa抗體衍生的抗體的結(jié)構(gòu)和促凝血活性；源于雜交瘤細(xì)胞系193/AD3，193/K2，198/A1和198/B1(克隆AB2)的亞克隆抗體可變結(jié)構(gòu)域克隆方法依制造商的說明，用″QuickPrep微量mRNA純化試劑盒″(Pharmacia)從(193/AD3，193/K2，198/A1或198/B1(克隆AB2))1×106的各細(xì)胞系的雜交瘤細(xì)胞中制備信使RNA。依制造商的說明，用″Ready-To-Go-You-Prime-First-Strand Beads試劑盒″(Pharmacia)通過反轉(zhuǎn)錄mRNA制備相應(yīng)的cDNA。用一系列的引物將重鏈和輕鏈的編碼序列轉(zhuǎn)換到相應(yīng)的cDNA上。為反轉(zhuǎn)錄重鏈特異性mRNA(VH)，應(yīng)用等摩爾的寡核苷酸混合物MOCG1-2FOR(5′CTC AAT TTT CTT GTC CAC CTT GGTGC 3′)(SEQ.ID.NO.1)，MOCG3FOR(5′CTC GAT TCT CTT GAT CAACTC AGT CT 3′)(SEQ.ID.NO.2)和MOCMFOR(5′TGG AAT GGG CACATG CAG ATC TCT 3′)(SEQ.ID.NO.3)(RTmixl)。在同一反應(yīng)管中，用引物MOCKFOR-(5′CTC ATT CCT GTT GAA GCT CTT.GAC 3′)(SEQ.ID.NO.4)合成輕鏈特異性cDNA(VL)。
采用
圖12中描述的引物對和來自上述反轉(zhuǎn)錄混合物(RTmixl)的特異性cDNA作為模板，對VH的編碼序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由
圖13中描述的引物對，并同樣用Rtmixl作為模板擴(kuò)增VK鏈基因。VH-PCR產(chǎn)物經(jīng)SfiI-AscI切割后插入到經(jīng)SfiI-AscI消化的載體pDAP2(GeneBank登記號U35316)上。將如此得到的pDAP2-VH構(gòu)建體分別命名為pDAP2-193AD3/VH，pDAP2-198A1/VH，pDAP2-198AB2/VH(源于抗體198/B1)和pDAP2-193/K2/VH。所述質(zhì)粒接下來經(jīng)AscI-NotI切割，插入相應(yīng)的經(jīng)AscI-NotI消化的VK-基因PCR產(chǎn)物。所得的載體命名為pDAP2193/AD3scFv，pDAP2-198/AlscFv，pDAP2-198/AB2scFv(源于抗體198/B1)pDAP2-193/K2scFv編碼單克隆抗體193/AD3，198/A1，198/AB2(源于抗體198/B1)和193/K2VH-基因和VL-基因。重鏈和輕鏈由人工可變接頭(G4SGGRASG4S；Engelhardt等，1994)編碼序列連接并可以表達(dá)各抗體的scFv變異體。
在
圖14中描述了源于雜交瘤細(xì)胞系193/AD3的scFv的DNA和推定的蛋白序列。核苷酸1到357編碼重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域，核苷酸358到402編碼人工可變接頭，核苷酸403到726編碼輕鏈可變區(qū)。重鏈CDR3區(qū)域的蛋白序列具有YGNSPKGFAY(SEQ.ID.NO.5)序列，并用粗體字母給出。人工接頭序列為(G4SGGRASG4S)。
在
圖15中，描述了源于雜交瘤細(xì)胞系193/K2的scFv的DNA和推定的蛋白序列。核苷酸1到366編碼重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域，核苷酸367到411編碼人工可變接頭，核苷酸412到747編碼輕鏈可變區(qū)。重鏈CDR3區(qū)域的蛋白序列具有DGGHGYGSSFDY(SEQ.ID.NO.6)序列，用粗體字母給出。人工接頭序列為(G4SGGRASG4S)。
在
圖16中，描述了源于雜交瘤細(xì)胞系198/AB2的scFv的DNA推定的蛋白序列。核苷酸1到366編碼重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域，核苷酸367到411編碼人工可變接頭，核苷酸412到747編碼輕鏈可變區(qū)。重鏈CDR3區(qū)域的蛋白序列具有EGGGFTVNWYFDV(SEQ.ID.NO.7)序列，用粗體字母給出。人工接頭序列為(G4SGGRASG4S)。
在
圖17中，描述了源于雜交瘤細(xì)胞系198/A1的scFv的DNA推定的蛋白序列。核苷酸1到366編碼重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域，核苷酸367到411編碼人工可變接頭，核苷酸412到747編碼輕鏈可變區(qū)。重鏈CDR3區(qū)域的蛋白序列具有EGGGYYVNWYFDV(SEQ.ID.NO.8)序列，用粗體字母給出。人工接頭序列為(G4SGGRASG4S)。實(shí)施例11源于抗-FIX/FIXa-抗體CDR3區(qū)域的肽的促凝血活性原則上，抗體分子可以想象成在三維空間呈遞肽元件組合陣列的生物器件(參見Gao等，1999，PNAS，966025)。因此，抗體(或抗體衍生物例如scFv，F(xiàn)ab，等)可用作檢測靶蛋白中功能重要的結(jié)構(gòu)域的工具，或者在另一方面用作描述特異性地介導(dǎo)某種相互作用，即激活或加強(qiáng)FIXa對生理上的底物FX的活性的氨基酸序列的工具。后一過程導(dǎo)致大量重鏈CDR3區(qū)域(CDR3H)衍生的肽序列作為FIXa增強(qiáng)試劑。
增強(qiáng)表現(xiàn)此種活性肽的促凝血活性可通過在所述肽中介導(dǎo)FIXa活性增強(qiáng)至關(guān)重要的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行序列變換來完成。作為得到具有增強(qiáng)的促凝血活性的肽序列的可能步驟，抗體即198/A1或198/B1的結(jié)合位點(diǎn)，用序列比較分析，競爭結(jié)合分析，Western blot分析和競爭ELISA分析進(jìn)行作圖。由于FIX的晶體結(jié)構(gòu)已知，其分子模型用于提高198/B1衍生的肽在人FIXa上的198/B1結(jié)合位點(diǎn)的合適程度。
另一方面，通過例如，″丙氨酸掃描突變分析″對給定的肽序列例如198/A1或198/B1 CDR3H衍生的肽序列的系統(tǒng)突變分析可以鑒定對促凝血活性至關(guān)重要的肽殘基。另一種提高給定肽序列活性的方法用肽文庫結(jié)合高得率的篩選。
抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)是由在VL-HL二聚體(或Fv區(qū)域)N-末端并列的六個“互補(bǔ)決定區(qū)(CDR′s)”衍生的。單獨(dú)的CDR對所述抗體對給定抗原的特異性的貢獻(xiàn)變化很大，但一般一般認(rèn)為重鏈的CDR3區(qū)域(CDR3H)具有特別的影響，即CDR3H區(qū)域特定的蛋白序列對抗原識別具有特別重要的意義。據(jù)報(bào)道CDR3H區(qū)域的長度變化很大，一般在4-25個氨基酸的范圍內(nèi)(Borrebaeck，16頁)。下面是一個肽序列系統(tǒng)突變分析的例子。為提高抗FIX/FIXa抗體的CD3-區(qū)域衍生的肽的溶解度/促凝血效力，改變了N末端和C末端的氨基酸序列。另外，構(gòu)建并分析了一系列的突變的肽。
這一研究的原理由抗體198/A1和198/B1衍生的CDR3H區(qū)域衍生的一系列的肽作為示例。起始的肽A1(參見表2)是由抗體198/A1的CDR3H區(qū)域衍生的，肽B1是由抗體198/B1的CDR3H區(qū)域衍生的。術(shù)語“雜亂變型”是指一種肽具有相同的氨基酸序列但以隨機(jī)的順序排列。
表2列出一系列由抗體198/A1衍生的肽。所列出的是肽的長度(aa，氨基酸#)，計(jì)算出的分子量(MW，以道爾頓(D)表示)和統(tǒng)計(jì)的等電點(diǎn)(pI)。D-Arg縮寫為Rd。
在第一系列的實(shí)驗(yàn)中我們通過去除C末端的Val殘基并在肽的N末端和C末端添加幾個帶電的殘基，提高了起始CDR3H肽序列(A1；EGGGYYVNWYFDV)的溶解度。所得的肽A1/2(酸性pI)，A1/3(堿性pI)和其各自的雜亂變型A1/4，A1/5和A1/3scr3在生理pH下的多種緩沖液系統(tǒng)中均易于溶解。為分析所述肽的FVIII-樣(FIXa激活)活性，發(fā)展了基于可商購的FVIII分析的一種分析系統(tǒng)。(參見實(shí)施例2和4)。其基本原理是，沒有輔因子的情況下，F(xiàn)IXa對其天然底物FX只有非常有限的活性。只有在具有FVIII激活特性的底物存在時，即FVIII或表現(xiàn)FVIII樣活性的物質(zhì)，才能通過FIXa/激活劑復(fù)合物切割FX產(chǎn)生大量的FIXa。所產(chǎn)生的Fxa的量通過顯色底物的裂解來監(jiān)控。修訂的顯色分析的原理通過兩個代表性的肽A1/3和A1/5(表2)進(jìn)行描述。簡要地說，每份25μl貯存溶液(在咪唑緩沖液(IZ)50mM咪唑，100mM NaCl，pH7.2)加到微滴定板升溫到37℃。顯色的FXa底物(S-2222)，合成的凝血酶抑制劑(I-2581)，牛FIXa和牛FX在無菌水中重建，F(xiàn)IXa/FX依照供應(yīng)商的說明與磷脂混合。由于所述的肽不與牛FIXa反應(yīng)，(其在檢測試劑盒中作為與牛FX的混合物出現(xiàn))加入2.9nM(大多數(shù)情況下是2.3nM)人FIXa(ERL)(參見實(shí)施例11，
圖19)。每反應(yīng)50μl磷脂/FIXa/FX溶液與25μlCaCl2(25mM)和50μl底物/抑制劑合劑。為起始反應(yīng)，將125μl預(yù)混合液加入微滴定板中的雜交瘤上清液中，在37℃溫育。在不同的時間(5min到2h)用GENESISTM軟件在Labsystems iEMS Reader MFTM微滴定板讀數(shù)儀上以試劑為空白對照，測定405nm和490nm下樣品的吸光度。這一實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如實(shí)施例11和
圖18所示。在2.9nM人FIXa存在下肽A1/3誘導(dǎo)易于測定的Fxa產(chǎn)生，而雜亂變體A1/5是非活性的。另外，在可比較的條件下測定時酸性肽A1/2和雜亂變型A1/4、A1/3-scr3不表現(xiàn)任何顯著的顯色活性(數(shù)據(jù)未公布)。為證明肽A1/3類似于親本抗體198/A1不與牛FIXa和FX反應(yīng)，進(jìn)行了如
圖19所示的實(shí)驗(yàn)。所述的肽A1/3如上所述與(A1/3(24μM)，+hFIXa)或不與(A1/3(24μM)，w/ohFIXa)2.3nM人FIXa(hFIXa)一起溫育。在對照實(shí)驗(yàn)中，我們加入空白稀釋緩沖液(IZ)添加2.3nM hFIXa到反應(yīng)混合物中。如
圖19所示，反應(yīng)僅在人FIXa存在下才能發(fā)生。
圖18顯示在2.9nM人FIXa(hFIXa)存在下，肽A1/3的顯色FVIII-樣活性。肽A1/3的雜亂變型A1/5不引起任何Fxa產(chǎn)生。
圖19顯示肽A1/3的FVIII-樣活性對人FIXa(hFIXa)存在的依賴性。缺乏人FIXa時肽A1/3不引起任何Fxa產(chǎn)生。所述的緩沖液對照，空白咪唑緩沖液稱為IZ。
還分析了所述的肽在FVIII缺陷血漿中縮短凝集時間的潛在能力。基于aPTT的一階段凝集試驗(yàn)基本上按照上述描述進(jìn)行(參見實(shí)施例6)。凝集時間(從起始反應(yīng)到“凝集”形成的時間)與FVIII，緩沖液對照(IZ)或控制肽(雜亂變型)。用不同的aPTT試劑(DAPTTIN和Pathromtin SL)進(jìn)行的兩種典型的凝集試驗(yàn)結(jié)果如表3A和表3B所示。
表3A.在2.2nM人FIXa存在或不存在(w/o)下，肽A1/3和A1/3-scr(肽A1/3的雜亂變型)在FVIII缺陷血漿中的凝集活性。所示的是兩個獨(dú)立的代表性實(shí)驗(yàn)(Exp1和Exp2)。所有的凝集試驗(yàn)均進(jìn)行兩次。給出各次實(shí)驗(yàn)的凝集時間和平均凝集時間，以秒計(jì)(sec)。表3A中所示的實(shí)驗(yàn)是用aPTT試劑DAPTTIN(Baxter Hyland Immuno)進(jìn)行的。與緩沖液對照(IZ，咪唑緩沖液)相比較，所述的肽A1/3所引起的凝集時間縮短與劑量無關(guān)。通過添加2.2nM活性的人FIX到反應(yīng)混合物中使凝集時間縮短變得更加明顯。肽A1/3的雜亂變型A1/3-scr3不引起任何凝集時間的縮短。實(shí)際上，濃度在2.5M以上，所述的雜亂肽變成了抑制劑并延長了凝集時間。肽A1/1，A1/2，A1/4和A1/5不引起任何凝集時間縮短，說明其缺乏促凝血活性(數(shù)據(jù)未公布)。
表3B.當(dāng)Pathromtin SL(DADE Behring)用作aPTT試劑時，F(xiàn)VIII缺陷血漿中肽A1/3的凝集活性。這些實(shí)驗(yàn)在2.2nM人FIXa存在或不存在(w/o)下進(jìn)行。給出各次實(shí)驗(yàn)的凝集時間和平均凝集時間，以秒計(jì)(sec)。其中包括因子VIII和咪唑緩沖液(IZ)分別作為陽性和陰性對照。
與表3A中所示的實(shí)驗(yàn)相比，使用aPTT試劑Pathromtin SL進(jìn)行表3B中所示的實(shí)驗(yàn)。在FIXa存在下，肽A1/3引起的凝集時間縮短是不依賴劑量的，而缺乏FIXa時不能檢測到凝集時間縮短。
我們進(jìn)行的另一套實(shí)驗(yàn)是為提高肽A1/3在血漿中的穩(wěn)定性(防止例如，由蛋白水解裂解)。一種方法是用D-Arg殘基(以肽A1/3-rd和A1/3-Rd-srmb為例)替換N-和C-末端的L-Arg殘基。然后在顯色試驗(yàn)和基于aPTT的凝集試驗(yàn)中分析肽A1/3-rd和A1/3-Rd-srmb(所述肽的雜亂變型)。通過這些實(shí)驗(yàn)揭示出將末端的L-Arg殘基變?yōu)镈-Arg殘基不改變FVIII-樣活性，如顯色分析中所測定的那樣，這說明Arg-殘基的偏光力不對顯色活性起主要作用(圖20)。另外，基于aPTT的單步驟凝集活性盡管在一定程度上減弱了，但仍易于檢測出來。(表4)。
表4肽A1/3，A1/3-Rd和A1/3-Rd-srmb單步驟凝集活性(序列參見表2)。圖20證明肽A1/3-Rd未改變的顯色活性。終濃度為12M的肽或緩沖液對照(IZ)在2.3nM人FIXa(+)存在下溫育。發(fā)現(xiàn)肽A1/3和A1/3-Rd的顯色活性基本上沒有改變，且在顯色分析中給出幾乎相同的結(jié)果。肽A1/3，A1/5的雜亂變型和緩沖液沒有明顯產(chǎn)生Fxa。
我們另一組實(shí)驗(yàn)是通過將每一殘基替換為丙氨酸以測定肽的核心序列中任意氨基酸各自的作用(表5)。
表5.列出為闡明肽核心序列(E1G2G3G4Y5Y6V7N8W9Y10F11D12)內(nèi)任意氨基酸的功能而設(shè)計(jì)的肽。下標(biāo)的數(shù)字表示所述肽中氨基酸的位置。丙氨酸，不帶電荷的小氨基酸，用以替代任何氨基酸(″丙氨酸掃描″)。同時列出的還有所述肽的長度(氨基酸#)，所計(jì)算出的分子量(MW，道爾頓(D)和統(tǒng)計(jì)的等電點(diǎn)(pI)。每一種肽分別溶解在咪唑緩沖液(50mM咪唑，100mM NaCl，pH7.2)中，接下來在凝集緩沖液(50mM咪唑，100mM NaCl，1％人白蛋白，pH7.4)中稀釋到所需的終濃度。分析了所述的肽的顯色活性和在FVIII缺陷血漿中縮短凝集時間的潛力。單步驟凝集試驗(yàn)基本上按照所述的進(jìn)行(參見實(shí)施例6)。將凝集時間(從起始反應(yīng)到“凝集”形成的時間)與FVIII，緩沖液對照(IZ)或控制肽(雜亂變型)進(jìn)行比較。已給出對肽A1/3-2和A1/3-3進(jìn)行″丙氨酸掃描″的一些結(jié)果。
例如，肽A1/3-2中G3-A3的改變獲得高顯色活性，并使在2.2nM人FIXa存在下的單步驟凝集時間(在濃度為12.5μM時為34sec)大大縮短。肽A1/3-3(G4-A4)在終濃度12μM附近表現(xiàn)最佳的顯色活性，在較高或較低濃度時，活性下降。在單步驟凝集試驗(yàn)中，所述的肽在較高濃度(12.5μM)和不存在FIXa情況下，在單步驟凝集試驗(yàn)中是受一定程度抑制的，而在2.2nM FIXa(31秒，12.5μM)存在下表現(xiàn)很強(qiáng)的活性。
我們進(jìn)行的下面一系列實(shí)驗(yàn)通過將所述的氨基酸替換為谷氨酸來測定所述肽核心序列的任意氨基酸(E)各自的作用(參見表6)。
表6.列出為闡明肽核心序列(E1G2G3G4Y5Y6V7N8W9Y10F11D12)內(nèi)任意氨基酸的功能而設(shè)計(jì)的肽。下標(biāo)的數(shù)字表示所述肽中氨基酸的位置。谷氨酸，不帶負(fù)電荷的大氨基酸，用以替代任何氨基酸(″谷氨酸掃描″)。同時列出的還有所述肽的長度(氨基酸#)，所計(jì)算出的分子量(MW，道爾頓(D)和統(tǒng)計(jì)的等電點(diǎn)(pI)。
將每一種肽分別溶解在咪唑緩沖液(50mM咪唑，100mM NaCl，pH7.2)中，接下來在凝集緩沖液(50mM咪唑，100mM NaCl，1％人白蛋白，pH7.4)中稀釋到所需的終濃度。還分析了來自“谷氨酸掃描”的肽的顯色活性和在FVIII缺陷血漿中縮短凝集時間的潛力。單步驟凝集試驗(yàn)基本上按照上述進(jìn)行(參見實(shí)施例6)。
肽A1/3-24表現(xiàn)出一些有趣的特性。所述分子在濃度為6.5μM-12μM時表現(xiàn)高顯色FVIII-樣活性，而在更高濃度(達(dá)24μM)下則失去活生。所述的肽在缺乏人FIXa時沒有促凝血活性但在2.2nM hFIXa存在下活性很高。
在第二套實(shí)驗(yàn)中我們通過去除C末端的Val殘基并在肽的N末端和C末端添加幾個帶電的殘基，提高了由起始肽序列(B1；EGGGFTVNWYFDV)衍生的抗體198/B1 CDR3H的促凝血活性。第一步我們通過去除C末端的Val殘基并在所述肽的N-和C-末端添加幾個帶電的殘基以提高起始肽序列的溶解性。所得的肽B1/4，B1/6(酸性pI)，B1/7(堿性pI)和其各自的雜亂變型B1/5，B1/7scr3在生理pH下的多種緩沖液系統(tǒng)中均易于溶解。
表7列出一系列抗體198/B1衍生的肽。所列出的是所述肽的長度(氨基酸#)，所計(jì)算出的分子量(MW，道爾頓(D)和統(tǒng)計(jì)的等電點(diǎn)(pI)。
將肽B1/4和B1/5溶解在50mM Tris，100mM NaCl，pH＝6.5。兩種肽均進(jìn)行了顯色活性分析。發(fā)現(xiàn)肽B1/4而非其雜亂變型具有一定的顯色活性(數(shù)據(jù)未公開)。
接下來分析了B1/6，B1/7和B1/scr3。每種肽均單獨(dú)溶解于咪唑緩沖液(50mM咪唑，100mM NaCl，pH7.2)中，接下來在凝集緩沖液(50mM咪唑，100mM NaCl，1％人白蛋白，pH7.4)或咪唑緩沖液中稀釋到所需的終濃度。還分析了所述的肽的顯色活性和在FVIII缺陷血漿中縮短凝集時間的潛力(表8&9)。單步驟凝集試驗(yàn)基本上按照上述進(jìn)行(參見實(shí)施例6)。與緩沖液對照(IZ)或控制肽(雜亂變型)比較凝集時間(從起始反應(yīng)到“凝集”形成的時間)。
首先在上述的顯色分析中測定了肽B1/7的FIXa激活活性(FVIII輔因子樣活性)。
如圖21所示，添加2.4μM肽B1/7到反應(yīng)混合物中導(dǎo)致產(chǎn)生容易測定的Fxa。相比之下，添加35μM Pefabloc Xa，F(xiàn)xa一種蛋白活性的特異抑制劑，使得顯色底物裂解反應(yīng)顯著減小，由此證明的確存在肽-FIXa介導(dǎo)的Fxa產(chǎn)生(圖22)。若沒有向反應(yīng)混合物中添加FIXa和FX，則沒有Fxa合成(圖22)。肽B1/6和對照肽B1/5和B1/7scr3不表現(xiàn)活性(數(shù)據(jù)未公布)。
圖21表明肽B1/7的顯色活性。終濃度為2.4μM的肽或緩沖液對照(IZ)在2.3nM人FIXa存在下溫育。
在圖22中，終濃度為2.4μM的肽B1/7或緩沖液對照(IZ)在2.3nM人FIXa(如所示的″+2.3nM hFIXa″或″+″)存在下溫育。發(fā)現(xiàn)肽B1/7的顯色活性依賴于FIXa和FX的存在，因?yàn)樵诜磻?yīng)中省去FIXa和FX(w/oFIXa/FX)時則沒有可檢測到的反應(yīng)。為證明所述的肽B1/7的確介導(dǎo)Fxa產(chǎn)生，向反應(yīng)混合物中加入Fxa特異性蛋白酶抑制劑Pefabloc Xa(35μMPefabloc Xa)。
在第二組實(shí)驗(yàn)中，基于aPTT的單步驟凝集試驗(yàn)檢測肽B1/6，B1/7和B1/7scr3的促凝血效果。所述的實(shí)驗(yàn)基本上按實(shí)施例6中的描述進(jìn)行。結(jié)果如表8和9所示。
表8在不存在活化的人FIX的情況下，將FVIII缺陷血漿與肽B1/6，B1/7scr3或B1/7一起溫育。將空白緩沖液加到缺陷血漿作為陰性對照。給出了各種組合的凝集時間。在這些條件下，由其延長的157秒的凝集時間說明肽B1/7在其最高濃度(12.5μM)下成為凝血過程的抑制劑。
表9在不存在活化的人FIX的情況下，將FVIII缺陷血漿與肽B1/6，B1/7scr3或B1/7一起溫育。將空白緩沖液加到缺陷血漿作為陰性對照。給出了各種組合的凝集時間。FIXa存在下，由其縮短的凝集時間說明，肽B1/7成為促凝血的(83sec，相比之下雜亂型肽為102sec和緩沖液對照為100sec)。實(shí)施例12在FVIII抑制劑血漿中由抗-FIX/FIXa-抗體CDR3區(qū)域衍生的肽衍生物的促凝血活性為分析在FVIII抑制劑血漿中肽A1/3的促凝血活性，進(jìn)行了下述實(shí)驗(yàn)。我們進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)的基于aPTT的單步驟凝集試驗(yàn)，但我們用FVIII抑制劑血漿代替FVIII缺陷血漿。所述血漿的抑制劑效力是8.1 Bethesda單位每ml。
表10將各種量的肽A1/3(12.5μM-1.25μM)加到FVIII抑制劑血漿(在2.2nM FIXa存在(FIXa)或不存在(w/o FIXa)下)。將空白緩沖液加到所述血漿(IZ)作為陰性對照。所述實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩次，計(jì)算平均值(aver.)。給出了各種組合的凝集時間(以秒計(jì))。很容易了解到所述的肽A1/3在FIXa存在下縮減了(以劑量依賴的方式)FVIII抑制劑血漿的凝集時間，盡管程度很小而且也是在FIXa不存在下。實(shí)施例13196/C4 IgM向IgG1的轉(zhuǎn)換由于一些IgM抗體在顯色分析中顯示高FVIII-樣活性，因此嘗試將這樣的IgM抗體轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG抗體(也可以生成抗體衍生物，如Fab，F(xiàn)(ab)2，scFv，等)下面詳細(xì)描述IgM可變區(qū)基因的補(bǔ)救。
表達(dá)載體pBax-IgG1(圖23)首先是由載體pSI(Promega)和pEF/Bsd(Invitrogen)通過多重克隆步驟構(gòu)建的。從血液中純化供體B淋巴細(xì)胞，再用″微量mRNA純化試劑盒″(Pharmacia)從這些細(xì)胞中純化成熟的mRNA。用″you-primefirst-strand-cDNA-″試劑盒″(Pharmacia)通過特定的引物制備人κ鏈和人γ1的cDNA。
人κ輕鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的編碼序列是使用特定的引物由其cDNA通過PCR擴(kuò)增獲得的。
人γ1鏈恒定區(qū)(CH1-hinge-CH2-CH3)結(jié)構(gòu)域的編碼序列是使用特定的引物由其cDNA通過PCR擴(kuò)增獲得的。
用XbaI和NheI消化所得的上述輕鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的PCR產(chǎn)物，再插入經(jīng)消化的pSI中。所得的載體用EcoRI和XbaI切割，插入退火的寡核苷酸，得到載體pSI-Cκ。上述退火的寡核苷酸提供引導(dǎo)肽和用于插入κ鏈可變區(qū)的SacI-XbaI位點(diǎn)。用SpeI和BamHI消化人γ1鏈恒定區(qū)的PCR產(chǎn)物，再插入經(jīng)消化的pSI中。所得的載體SpeI和NotI切割，插入退火的寡核苷酸，得到載體pSI-Cγ。上述退火的寡核苷酸提供引導(dǎo)肽和用于插入重鏈恒定區(qū)的XhoI-BstEI位點(diǎn)。載體pEF/Bsd用NheI和SfiI消化，用Klenow處理平末端，插入用BglII和BamHI切割的整個pSI-Cκ表達(dá)盒(經(jīng)Klenow處理后)。所得的載體用EcoRI和HindIII切割并用Klenow處理。pSI-Cγ的整個表達(dá)盒用BglII和BamHI切割并插入(Klenow處理后)。所得的載體命名為pBax-IgG1。
所述的輕鏈可變區(qū)可插入到SacI-XbaI位點(diǎn)之間，獲得完整的κ輕鏈編碼序列。所述的重鏈可變區(qū)可以克隆到XhoI-BstEI位點(diǎn)之間，得到完整的IgG1重鏈基因。
兩開放閱讀框均在SV40-啟動子的控制之下表達(dá)，并在所述基因的5′末端含有信號肽序列以便將重鏈和輕鏈分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞以使與親代IgM具有相同結(jié)合特性的IgG1表達(dá)。
質(zhì)粒pBax-196/C4的構(gòu)建進(jìn)一步通過使用特定的引物由PCR擴(kuò)增所述196/C4 scFv(如實(shí)施例10所述的亞克隆)的VH來完成。所述的PCR產(chǎn)物用XhoI和BstEII消化后插入到用XhoI和BstEII消化的pBaxIgG1中。196/C4 scFv的VL用特定的引物通過PCR擴(kuò)增。所述的PCR產(chǎn)物用SacI和XbaI消化后，插入到經(jīng)SacI和XbaI消化的pBax IgG1-VH中。所得的載體(pBax-196/C4)通過電穿孔轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞中表達(dá)與親代IgM具有相同特異性的雜合IgG1分子(鼠可變區(qū)和人恒定區(qū))。實(shí)施例14通過抗-FIXa抗體激活FIXa酰胺裂解活性簡要地說，在不同量的抗-FIX抗體198/B1(IgG同種型)或196/AF1(IgM同種型)存在或不存在的條件下，將20μl因子IXa(含200mU FIXa(Stago))與200μl反應(yīng)緩沖液(50mM TrisHCl pH7.4，100mM NaCl，5mMCaCl2和40％乙二醇)，25μl FIXa底物(CH3SO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA，AcOH，10μM/ml，Pentapharm LTD)在37℃下溫育。在ELISA讀數(shù)儀上405nm下監(jiān)控FIXa底物的特異性裂解?？?FIX抗體的存在對FIXa酰胺裂解活性可加強(qiáng)至少兩倍。圖24顯示在抗體198/B1(圖24A)和抗體198/AF1(圖24B)存在下，F(xiàn)IXa酰胺裂解活性的增加。實(shí)施例15由抗-FIX/FIXa-抗體衍生的Fab片段顯示的FVIII-樣活性抗-FIX/FIXa抗體的Fab片段通過常規(guī)方法制備和純化。簡要地說，1ml抗體198/A1(4mg/ml，于50mM咪唑，100mM NaCl，pH7.4)與87μl裂解緩沖液(1M醋酸鈉，10mM EDTA 67.5mg/ml L-半胱氨酸)和0.25mg木瓜蛋白酶(固定于瓊脂糖珠上)在37℃下溫育過夜。過濾所得制劑去除木瓜蛋白酶。加入L-組氨酸(終濃度50mM)，其后調(diào)節(jié)pH至7.0。最后加入固體NaCl至終濃度1M。
接下來，通過與蛋白L的結(jié)合將198/A1 Fab片段純化我們在PHARMACIA XK 16/20柱上使用免疫純化固定的蛋白L Plus(Pierce)(凝膠-體積2ml)。用于層析的緩沖液是1)平衡-緩沖液50mM L-組氨酸pH 7.0；1M NaCl；0,1％(w/v)NaN3；2)洗滌-緩沖液50mM L-組氨酸pH7.0；0.1％(w/v)NaN3；3)洗脫-緩沖液100mM甘氨酸pH 2.5；0.1％(w/v)NaN3；和4)中和緩沖液2M Tris/Cl pH 8,0；基本上按照表11所述的步驟1-7進(jìn)行層析。為中和洗脫緩沖液的低pH，預(yù)先加入“Fraction-tube”和0.2ml 2M Tris pH 8.0。
表11用50mM咪唑，100mM NaCl pH7.4透析(圖25)最終的198/A1 Fab制劑，并如上述在顯色FVIII試驗(yàn)中進(jìn)行分析(圖25)。與完整的抗體相比，所述的198/A1 Fab片段的活性有一定的減弱；但是所述的Fab片段仍可引起FIX依賴的Fxa產(chǎn)生。
圖25顯示在2.3nM人FIXa存在下抗體198/A1 Fab片段的顯色的FVIII-樣活性。我們用完整的抗體198/A1及7.5pM FVIII作為陽性對照。緩沖液對照(IZ)替代198/A1 Fab片段或FVIII用作陰性對照。實(shí)施例16由抗-FIX/FIXa抗體的scFv片段和大腸桿菌堿性磷酸酶之間的融合蛋白表現(xiàn)FVIII-樣活性用pDAP2載體系統(tǒng)(Kerschbaumer等，1996)將抗體198/B1(亞克隆AB2)單鏈FV片段(參見實(shí)施例10)與大腸桿菌堿性磷酸酶的N末端相融合。分離出兩個一樣的克隆命名為pDAP2198AB2#1和pDAP2-198AB2#100(圖26)。所得的融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，通過金屬親和層析(Kerschbaumer等，1997)純化，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的顯色分析(圖27)。
圖27顯示在2.3nM人FIXa存在下，兩抗體198/B1(亞克隆AB2)scFv片段堿性磷酸酶融合蛋白(198AB2#1和198AB2#100)的顯色FVIII-樣活性。我們用7.5pM FVIII作為陽性對照。實(shí)施例17由二價(jià)小抗體表現(xiàn)的FVIII-樣活性為獲得二價(jià)小抗體，用pZip1載體系統(tǒng)(Kerschbaumer等(分析化學(xué)249，219-227，1997)將所述抗體198/B1(亞克隆AB2)的scFv片段與兩性螺旋結(jié)構(gòu)相融合。簡要地說，SfiI和NotI消化質(zhì)粒pDAP-198AB2#100(實(shí)施例16)分離所述198/B1 scFv片段的基因。所述的DNA片段經(jīng)凝膠純化的后插入到經(jīng)SfiI/NotI消化的載體pZip1中。將所得質(zhì)粒測序，命名為pZip-198AB2#102(圖28)。平行地，我們由名為#8860的無關(guān)單克隆抗體構(gòu)建了小抗體變型。第一步，將抗體#8860的單鏈Fv片段組裝到載體pDAP2中。克隆過程基本上按照實(shí)施例10所描述的進(jìn)行。所得構(gòu)建體命名為pDAP2-8860scFV#11(圖29)。
將包含于pDAP28860scFv#11的scFv片段亞克隆到質(zhì)粒pZip1(見上)中。獲得小抗體構(gòu)建體p8860-Zip#1.2(圖30)由于抗體#8860不與FIX/FIXa(通過Western Blot和ELISA分析判斷)反應(yīng)，其適于作為陰性對照。接下來，所述的小抗體蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，依照下述方法通過與蛋白L結(jié)合從細(xì)菌上清液中純化出來我們用具有4ml凝膠容量的PHARMACIA XK 16/20柱的免疫純化固定的蛋白L Plus(Pierce)進(jìn)行親和層析。所使用的緩沖液是1)平衡-緩沖液50mM L-組氨酸pH 7.0，1M NaCl，0.1％(w/v)NaN3；洗滌緩沖液50mM L-組氨酸pH(w/v)NaN3；洗脫-緩沖液100mM甘氨酸pH(w/v)NaN3；中和緩沖液2M Tris/Cl pH 8.0。
樣品按下述方式制備離心(11,000xg，4℃，10min)細(xì)菌表達(dá)培養(yǎng)物獲得細(xì)菌培養(yǎng)物上清液。將470g硫酸銨加到1升上清液中，所述溶液在冰上攪拌1h以沉淀蛋白。所得沉淀2℃下以14,000xg離心35min形成小球，再溶解于100ml 20mM Tris pH 7.0中。然后濃縮液經(jīng)20mM TrispH 7.0透析，加入L-組氨酸至終濃度為50mM，調(diào)節(jié)pH至7.0。最后加入固體NaCl至終濃度為1M。在上樣于柱上之前，樣品先在室溫下經(jīng)16,000xg離心15min，再經(jīng)0.45μM無菌濾器過濾。層析基本上按照表12中1到7所述進(jìn)行。為了中和洗脫緩沖液的低pH，預(yù)先裝入″Fraction-tubes″和0.2ml 2M Tris pH 8.0。
表12.最終的198/B1(亞克隆AB2)小抗體制劑(命名為198AB-Zip#102)和陰性對照8860-Zip#1.2經(jīng)50mM咪唑，100mM NaCl，pH7.4透析，如上所述進(jìn)行顯色的FVIII分析(圖31)。
從圖31中可以看出，所述小抗體構(gòu)建體198AB-Zip#102引起大量Fxa產(chǎn)生(與FVIII相比)，而陰性對照小抗體8860-Zip#1.2不能。
圖31顯示在2.3nM人FIXa存在下，198/B1(亞克隆AB2)小抗體198AB-Zip#102的顯色FVIII-樣活性。我們使用4.8pM FVIII作為陽性對照，無關(guān)的小抗體(8860-Zip#1.2)和空白緩沖液(IZ)作為陰性對照。實(shí)施例18抗FIXa/FIX抗體scFv片段表現(xiàn)的FVIII-樣活性用pMycHis6載體系統(tǒng)表達(dá)所述抗體198/B1(亞克隆AB2)的單鏈FV片段和抗體#8860的scFv片段。用以下方法構(gòu)建載體pMycHis6(圖32&33)用NotI和EcoRI切割載體pCOCK(Engelhardt等，1994，生物技術(shù)，1744-46)并插入下列寡核苷酸序列mychis6-co5′ggccgcagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatggggcggcacatcaccatcaccatcactaataag 3′(SEQ.ID.NO.79)和mycchisic5′aattcttattagtgatggtgatggtgatgtgccgccccattcagatcctct tctgagatgagtttttgttctgc 3′(SEQ.ID.NO.80)。
圖32是質(zhì)粒pMycHis6的示意圖。所述的c-myc-標(biāo)記序列用于在ELISA或Westem Blot分析(Evan等，分子細(xì)胞生物學(xué)1985，5(12)，3610-6頁)中檢測scFv片段。
加入His6-標(biāo)記序列以使scFv片段易于通過金屬離子層析法進(jìn)行純化(Hochuli等，1988.生物技術(shù)，61321-1325)。所述的質(zhì)粒包括lacZ基因啟動子(PlacZ)，PelB-前導(dǎo)序列(參見圖26圖示)，大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)(colElori)和M13噬菌體復(fù)制起始位點(diǎn)(M13ori)。為進(jìn)行特異性篩選，所述質(zhì)粒還帶有由β半乳糖苷酶(AmpR)介導(dǎo)的抗氨芐青霉素的抗性基因。
198/B1(克隆AB2)-scFV的基因由SfiI和NotI切割質(zhì)粒pDAP2-198AB2#100(實(shí)施例16)獲得，再將其插入到SfiI/NotI切割的pMycHis6中。所得的質(zhì)粒命名為pMycHis198AB2#102。圖34是198AB2 scFv(連接到c-myc-tag和the His6-標(biāo)記上)的核苷酸和氨基酸序列所得表達(dá)載體的ORF命名為pMycHis6-198AB2#102。載體pMycHis6是由NotI-EcoRI切割載體pCOCK(Engelhardt O.等，生物技術(shù)17，44-46，1994)并插入下列退火的寡核苷酸序列(5′-GGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCGGCACATCACCATCACCATCACTAATAAG-3′(SEQ.ID.No.103)和5′-TTATTAGTGATGGTGATGGTGATGTGCCGCCCCATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCTGC3′(SEQ.ID.NO.104))構(gòu)建的。所得的載體命名為pMycHis6，經(jīng)SfiI-NotI切割，而基因scFv 198AB2由載體pDAP2198AB2#100交換到這一載體上。
與198AB2構(gòu)建體類似，#8860 scFv是從名為pDAP28860scFv克隆11的質(zhì)粒上克隆的。#8860的純scFv蛋白命名為8860-M/H#4c(質(zhì)粒p8860-M/H#4c，圖35).
所述的scFv在大腸桿菌中表達(dá)，并在蛋白L柱上從細(xì)菌上清液中進(jìn)行親和純化(參見實(shí)施例17)。最終的MycHis-198AB2#102和8860-M/H#4c制劑經(jīng)50mM咪唑，100mM NaCl，pH7.4透析，再如上述進(jìn)行顯色FVIII分析(圖36)。
在圖36中我們可以看出，所述的scFv構(gòu)建體MycHis198AB2#102引起大量的FXa產(chǎn)生，而陰性對照8860-M/H#4c和空白反應(yīng)緩沖液(IZ)不能。
圖36顯示在2.3nM人FIXa存在下198/B1(亞克隆AB2)scFv片段(MycHis-′198AB2#102)的顯色FVIII-樣活性。我們用4.8pM FVIII作為陽性對照，無關(guān)的scFv(8860-M/H#4c)和空白反應(yīng)緩沖液(IZ)作為陰性對照。
權(quán)利要求
1.一種針對因子IX/因子IXa的抗體或抗體衍生物，其可增強(qiáng)FIXa的促凝血活性。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體或抗體衍生物，其中，所述的抗體或抗體衍生物在FVIII抑制劑存在下可增強(qiáng)FIXa的促凝血活性。
3.如權(quán)利要求1所述的任意一種抗體，其中，所述的抗體選自IgG，IgM，IgA和IgE抗體。
4.如權(quán)利要求1所述的抗體或抗體衍生物，其中，所述的抗體或抗體衍生物選自單克隆抗體，抗體片段，嵌合抗體，人源化抗體，單鏈抗體，雙特異性抗體，雙抗體，及其二聚體，寡聚體或多聚體。
5.如權(quán)利要求1所述的抗體衍生物，其中，所述的抗體衍生物包含互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)肽。
6.如權(quán)利要求5所述的抗體衍生物，其中所述的CDR肽是CDR3肽。
7.如權(quán)利要求6所述的抗體衍生物，其中所述的CDR3肽包一種氨基酸序列，所述的氨基酸序列選自Tyr-Gly-Asn-Ser-Pro-Lys-Gly-Phe-Ala-Tyr；Cys-X-X-Tyr-Gly-Asn-Ser-Pro-Lys-Gly-Phe-Ala-Tyr-X-X-Cys，其中，X可以是任何所需的氨基酸；Tyr-Gly-Asn-Ser-Pro-Lys-Gly-Phe-Ala-Tyr；Asp-Gly-Gly-His-Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Phe-Asp-Tyr；和Phe-Arg-Asn-Arg-Gly-Met-Thr-Ala-Leu-Leu-Lys-Val-Ser-Ser-Cys-Asp。
8.如權(quán)利要求1所述的抗體或抗體衍生物，其中，所述抗體或抗體衍生物的可變區(qū)包含如
圖14所示的氨基酸1到357和/或氨基酸403到726。
9.如權(quán)利要求8所述的抗體或抗體衍生物，其中，所述的抗體或抗體衍生物還包含人工接頭序列。
10.如權(quán)利要求1所述的抗體或抗體衍生物，其中，所述抗體或抗體衍生物的可變區(qū)包含如
圖15所示的氨基酸1到363和/或氨基酸409到747。
11.如權(quán)利要求10所述的抗體或抗體衍生物，其中，所述的抗體或抗體衍生物還包含人工接頭序列。
12.如權(quán)利要求1所述的抗體或抗體衍生物，其中所述抗體或抗體衍生物的可變區(qū)包含如
圖16所示的氨基酸1到366和/或氨基酸412到747。
13.如權(quán)利要求12所述的抗體或抗體衍生物，其中，所述的抗體或抗體衍生物還包含人工接頭序列。
14.一種雜交瘤細(xì)胞系，其表達(dá)如權(quán)利要求1所述的針對因子IX/因子IXa的抗體或抗體衍生物。
15.如權(quán)利要求14所述的雜交瘤細(xì)胞系，其中所述的細(xì)胞系選自196/AF1，#196/AF2，#193/AD3，#193/K2-1，#198/AC1/1，#198/AM1，#198/A1，#198/B1，#198/AP1，198/A1，198/B1，198/BB1，198/A1，198/B1，198/BB1。
16.如權(quán)利要求1所述的抗體或抗體衍生物，其是由如權(quán)利要求14所述的雜交瘤細(xì)胞系表達(dá)的。
17.一種DNA分子，其中，所述的DNA分子編碼如權(quán)利要求1所述的抗體或抗體衍生物。
18.一種藥物制劑，其包含如權(quán)利要求1所述的抗體或抗體衍生物和制藥上可接受的載體。
19.如權(quán)利要求18所述的藥物制劑，還包含因子IXaα和/或IXaβ。
20.治療患有凝血疾病的病人的方法，該方法包括對所述病人施用藥學(xué)上有效劑量的如權(quán)利要求18所述的制劑。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述的凝血疾病包括血友病A和出血素質(zhì)。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，還包括選擇血友病抑制劑病人的步驟。
23.一種獲得能與因子IX/因子Ixa相互作用、并且可以提高因子IXa促凝血活性的抗體或抗體衍生物的方法，該方法包括下述步驟-用選自FIX，F(xiàn)IXaα，F(xiàn)IXaβ，或其片段的抗原免疫具有免疫活性的小鼠，-分離所免疫小鼠的脾細(xì)胞，-生產(chǎn)雜交瘤克隆，-為獲得因子Ixa促凝血活性提高篩選所述雜交瘤細(xì)胞上清液，從表現(xiàn)出因子Ixa促凝血活性提高的雜交瘤細(xì)胞上清液中分離純化所述的抗體或抗體衍生物。
24.如權(quán)利要求1所述的抗體或抗體衍生物的提高因子IXa酰胺裂解活性的用途。
全文摘要
一種針對因子IX/因子IXa的抗體或抗體衍生物,其可增強(qiáng)FIXa的促凝血活性。
文檔編號C12N5/10GK1390258SQ00815678
公開日2003年1月8日 申請日期2000年9月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月14日
發(fā)明者F·謝夫林格, R·凱爾施鮑默, F·G·法爾克納, F·多納, H·P·施瓦茨 申請人:巴克斯特股份公司