專利名稱：：腫瘤壞死因子-α特異性人源化抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及人腫瘤壞死因子-(x特異性人源化抗體及其制備方法。
背景技術(shù)：
：人腫瘤壞死因子-a(以下稱為"hTNF-a")是一種由3個17kDa蛋白亞基組成的同源三聚體(EckM.J.etal.，/SC,267:2119-2122，1992;Sm他R.A.etal.，J5C，262:6951-6954，1987)。hTNF-a是一種由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子，在幾種細(xì)胞反應(yīng)(如壞死和編程性細(xì)胞死亡)中起著信號傳遞物的作用(BeyaertR,etal.,F娜丄饑，340:9-16,1994)。hTNF-a造成促炎癥反應(yīng)引起組織破壞，如軟骨和骨破壞(Saklatvala,A^mm,322:547-549，1986))、誘導(dǎo)粘附分子、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的促凝血活性(PoberJSetal.，/mmw"o/.,136;1680-1687,1986)，并增加噬中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞粘附(Poberetal.，//附m""o/.138:3319-3324，1987)。另外，還發(fā)現(xiàn)hTNF-a在抗感染性疾病和腫瘤的防御機(jī)制中起著重要作用(FiersW.，F(xiàn)五^S丄饑，285:199-212,1991)。hTNF-a參與炎性疾病、自身免疫性疾病、細(xì)菌感染、癌癥和退行性疾病。在這些疾病中，hTNF-a被視為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克隆氏病、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎的特異生理治療中的有用的靶蛋白。同時，還建議使用hTNF-a抑制劑治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。據(jù)報(bào)道hTNF-a在從早期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)中分離出的滑膜細(xì)胞中過表達(dá)(BuchanG.etal.,C7,'".￡平/附ww"o/.,73:449-455,1988)，并且，當(dāng)使用抗-hTNF-a單克隆抗體對上述滑膜細(xì)胞進(jìn)行治療時，與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎損傷相關(guān)的細(xì)胞因子減少(ButlerD.M.etal.，qy/oA:/"eTVeAv.，6:225-230,1995)。另外，還發(fā)現(xiàn)抗-hTNF-a抗體或重組可溶性hTNF-tx受體在膠原誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)炎模型中抑制了炎癥和關(guān)節(jié)破壞(PiguetP.F.etal.,/wmw"o/ogv，77:510-514，1992;WooleyP.H.etal.，//mm柳o/.,151:6602-6607,1993;WilliamsR.O.etal.，/www"o/ogy，84:433-439,1995)。另外，還觀察到在過表達(dá)hTNF-a的轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)了炎癥性關(guān)節(jié)炎(KefferJ.etal.,五MSO丄，10:4025-4031,1991)。這些結(jié)果表明hTNF-a在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中起著控制炎性細(xì)胞因子的直接或間接調(diào)節(jié)子的重要作用。因此，需要開發(fā)一種對hTNF-a具有高度選擇性和反應(yīng)性的單克隆抗體用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。通常，通過使用抗原對小鼠進(jìn)行免疫來制備對特定抗原具有高度選擇性和反應(yīng)性的抗體(KohlerG.&MilsteinC.,Atoww，256;495-497，1975)。小鼠單克隆抗體具有易于制備抗體和選擇具有高度反應(yīng)性的抗體的優(yōu)點(diǎn)。但是，它也存在問題，即當(dāng)其被長時間給藥后在人體內(nèi)形成抗小鼠抗體(DimaggioJ.J"etal"Ca"cerC7zewo^ie"5Zo/.JespowseMo銀,11:177-203，1990)。為克服小鼠單克隆抗體的不利特性，通過使用人抗體的框架區(qū)替換除抗原-結(jié)合部位以外的框架區(qū)研制出了人源化抗體。目前采用CDR(互補(bǔ)決定區(qū))移植法作為一種制備這類人源化抗體的方法，其中僅小鼠抗體的CDR被移植入人抗體中。通過CDR移植法制備的人源化抗體具有降低體內(nèi)免疫應(yīng)答的優(yōu)點(diǎn)(Riechmannetal.,A^mm，332:323,1988;Nakatanietal.,￡"gz>7een>7g，7:435，1994)，但是，它常常喪失原始小鼠抗體的高度選擇性和反應(yīng)性(CarterP.,etal.,ZVoc.7V^/.JcW.f/W，89:4285-4289,1992)。本發(fā)明人致力于克服傳統(tǒng)人源化抗體的這類問題，并研制出了一種新的與hTNF-a特異性結(jié)合的人源化抗體，該抗體表現(xiàn)出了與原始小鼠單克隆抗體相似的抗原結(jié)合親和力，并使免疫原性降至最小。因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種hTNF-a特異性人源化抗體。本發(fā)明的另一目的是提供一種編碼所述人源化抗體的重鏈或輕鏈的DNA，和一種包含該DNA的表達(dá)載體。本發(fā)明更進(jìn)一步的目的是提供一種由所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物。本發(fā)明另一個更進(jìn)一步的目的是提供一種用于治療hTNF-a相關(guān)疾病的藥物組合物，該藥物組合物包含所述人源化抗體作為有效成分。本發(fā)明的一方面提供了一種hTNP-a特異性人源化抗體，其包括-a)互補(bǔ)決定區(qū)分別具有以下氨基酸序列的重鏈可變區(qū)HYG顧WINTNTGEPRYDEEFKGYDSRGFDC(SEQIDNO:41至43);b)互補(bǔ)決定區(qū)分別具有以下氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)TASSSISYNYFHSSSNLASHQYERSPWT(SEQIDNO:44至46);C)與人抗體的重鏈恒定區(qū)相同的重鏈恒定區(qū)；禾口d)與人抗體的輕鏈恒定區(qū)相同的輕鏈恒定區(qū)。本發(fā)明的上述及其它目的和特征將在本發(fā)明的以下描述中，結(jié)合附圖，得到清楚的說明，附圖分別顯示了圖1:與TNF-a特異性結(jié)合的小鼠單克隆抗體重鏈(TSK114H)可變區(qū)的氨基酸序列(SEQIDNO:47)、人抗體重鏈亞群1(Hhl)氨基酸序列(SEQIDNO:48)和本發(fā)明的人源化抗體重鏈(TNHV2、TNHV2k和TNHVlk)氨基酸序列(SEQIDNO:36至38)的比較；圖2:與TNF-a特異性結(jié)合的小鼠單克隆抗體輕鏈(TSK114L)氨基酸序列(SEQIDNO:49)、人抗體輕鏈亞群l(Hkl)氨基酸序列(SEQIDNO:50)和本發(fā)明的人源化抗體輕鏈(TNLV2和TNLV2d)氨基酸序列(SEQIDNO:39和40)的比較；圖3:顯示制備表達(dá)本發(fā)明的人源化抗體重鏈的pHAB-TNHV2HF載體的過程的示意圖4:顯示制備表達(dá)本發(fā)明的人源化抗體重鏈的pHAB-TNHV2kHF載體的過程的示意圖5:顯示制備表達(dá)本發(fā)明的人源化抗體重鏈的pHAB-TNHVlkHF載體的過程的示意圖6:顯示制備表達(dá)本發(fā)明的人源化抗體輕鏈的pHAB-TNLV2LF載體的過程的示意圖7:顯示制備表達(dá)本發(fā)明的人源化抗體輕鏈的pHAB-TNLV2dLF載體的過程的示意圖8:在動物細(xì)胞中制備和制備后提純的本發(fā)明的人源化抗體的SDS-PAGE結(jié)果；和圖9:顯示小鼠單克隆抗體和本發(fā)明的人源化抗體與TNF-a的結(jié)合親和力的圖示。具體實(shí)施例方式在本發(fā)明的人源化抗體中，重鏈和輕鏈可變區(qū)的CDR來自小鼠單克隆抗體，而除CDR以外的框架區(qū)以及重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)來自人抗體。優(yōu)選地，本發(fā)明的人源化抗體表現(xiàn)出1xl(T9M至1xl(T13M的抗原結(jié)合親和力(Kd)。并且，當(dāng)通過表面等離子共振(SPR)確定時，本發(fā)明的人源化抗體的解離常數(shù)(K。ff)為1x1(T6S"至1x1(T9S"。本發(fā)明的人源化抗體可由對hTNF-a具特異性的小鼠單克隆抗體TSK114(保藏號KCTC10514BP和KCTC10515BP)通過CDR移植法制備，其中小鼠單克隆抗體TSK114的重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:41至43的三個CDR，而輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:44至46的三個CDR。首先，將小鼠單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的人序列進(jìn)行比較，并選出被Kabat定義為與小鼠抗體重鏈具有最大的序列相似性的人類重鏈可變區(qū)亞群1(HM)和與小鼠抗體輕鏈具有最大相似性的人輕鏈k可變區(qū)亞群1(Hkl)(HarrisL.&BajorathJ.，7Vo她Scz.e聰，4;306-310,1995)。編碼人源化抗體重鏈和輕鏈的基因可通過使用這些選擇的人類基因作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。在該過程中，可在己知基因研究和抗體結(jié)構(gòu)分析信息的基礎(chǔ)上對每個編碼人源化抗體重鏈和輕鏈的核苷酸序列進(jìn)行修飾。并且，如果小鼠單克隆抗體的某些氨基酸殘基影響了抗原結(jié)合親和力或者它們對維持抗體結(jié)構(gòu)很重要，優(yōu)選保留編碼所述氨基酸殘基的核苷酸序列而不進(jìn)行修飾(KabatE.A.etal.，戶"W/co^'o"""w6w(7V/W」91-3242，1991;ChothiaC.etal.，A^we,342;877-883,1989;StudnickaG.M.etal.，7Vofe/"7;805-814，1994;HarrisL&BajorathJ.，尸她/"5We"ce,4;306-310，1995)。編碼人源化抗體的重鏈可變區(qū)的基因可通過使用人抗體重鏈亞群l(Hhl)替換與hTNF-a特異性結(jié)合的小鼠單克隆抗體TSK114重鏈可變區(qū)中除抗原結(jié)合部位以外的框架區(qū)而制備。這種編碼人源化抗體的重鏈可變區(qū)的基因可通過以下步驟制備使用編碼小鼠單克隆抗體TSK114的基因作為模板設(shè)計(jì)小鼠單克隆抗體人源化用引物；使用對應(yīng)的引物進(jìn)行PCR(聚合酶鏈反應(yīng))；并使用限制酶和DNA連接酶彼此連接如此擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。由此制得的編碼人源化抗體的重鏈可變區(qū)的基因被命名為TNHV2(SEQIDNO:31)、TNHV2k(SEQIDNO:32)和TNHVlk(SEQIDNO:33)，它們分別編碼具有SEQIDNO:36、37和38的氨基酸序列的多肽(見圖1)。為制備編碼人源化抗體全長重鏈的基因(包括編碼人源化重鏈可變區(qū)的基因)，將TNHV2、TNHV2k或TNHVlk基因插入合適的載體中，如TOPO載體(TOPOTA克隆試劑盒，Invitrogen，US)，以制備表達(dá)載體pCR-TNHV2Hv、pCR-TNHV2kHv和pCR-TNHV1kHv。從表達(dá)載體pCR-TNHV2Hv、pCR-TNHV2kHv或pCR-TNHVlkHv中分離出具有人源化抗體的重鏈可變區(qū)的基因片段，并插入含有編碼人抗體的重鏈恒定區(qū)域的基因的載體pHAB-HC(保藏號KCTC10229BP;韓國專利公開號2004-12266)中，以獲取人源化抗體重鏈的表達(dá)載體。由此制得的表達(dá)載體被命名為pHAB-TNHV2HF、pHAB-TNHV2kHF和pHAB-TNHVlkHF。根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，由pHAB-TNHV2HF載體和pHAB-TNHV2kHF載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(E.coli)TOP10F轉(zhuǎn)化株于2004年9月1日保藏于韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)(地址韓國生物科學(xué)與生物技術(shù)研究所(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333,韓國)，保藏號分別為KCTC10691BP和KCTC10692BP，由pHAB-TNHVlkHF載體轉(zhuǎn)化來的大腸桿菌TOP10F轉(zhuǎn)化株于2005年6月13日保藏于KCTC，保藏號為KCTC10818BP。編碼人源化抗體的全長重鏈的基因可從pHAB-TNHV2HF、pHAB-TNHV2kHF和pHAB-TNHVlkHF重鏈表達(dá)載體中分離，并被分別命名為TNHV2HF、TNHV2kHF禾口TNHVlkHF。編碼人源化抗體輕鏈可變區(qū)的基因可通過使用人抗體輕鏈亞群l(HKl)替換與hTNF-a特異性結(jié)合的小鼠單克隆抗體TSK114的輕鏈可變區(qū)中除抗原結(jié)合部位以外的框架區(qū)而制備。這種編碼人源化抗體輕鏈可變區(qū)的基因可通過以下步驟制備使用編碼小鼠單克隆抗體TSK114的基因作為模板設(shè)計(jì)小鼠單克隆抗體人源化用引物；使用對應(yīng)的引物進(jìn)《亍PCR;并使用限制酶和DNA連接酶連接如此擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。由此制得的編碼人源化抗體輕鏈可變區(qū)的基因被命名為TNLV2和TNLV2d，它們分別編碼具有SEQIDNO:39和40的氨基酸序列的多肽(參見圖2)。為制備編碼人源化抗體全長輕鏈的基因(包括編碼人源化輕鏈可變區(qū)的基因)，將TNLV2或TNLV2d基因插入合適的載體中，如TOPO載體，以制備pCR-TNLV2Lv和pCR-TNLV2dLv表達(dá)載體。從pCR-TNLV2Lv或pCR-TNLV2kLv表達(dá)載體中分離出具有人源化抗體的輕鏈可變區(qū)的基因片段，并插入含有編碼人抗體的輕鏈恒定區(qū)的基因的pHAB-KC載體(保藏號KCTC10230BP;韓國專利公開號2004-12268)中，獲取人源化抗體輕鏈的表達(dá)載體。由此制得的表達(dá)載體被命名為pHAB-TNLV2LF和pHAB-TNLV2dLF。根據(jù)國際承認(rèn)的用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，由pHAB-TNLV2LF表達(dá)載體轉(zhuǎn)化來的大腸桿菌TOP10F轉(zhuǎn)化株于2004年9月1日保藏在KCTC，保藏號為KCTC10690BP,由pHAB-TNLV2dLF表達(dá)載體裝化來的大腸桿菌TOP10F轉(zhuǎn)化株于2005年6月13日保藏在KCTC，保藏號為KCTC10817BP。所述編碼人源化抗體全長輕鏈的基因可從pHAB-TNLV2LF和pHAB-TNLV2dLF輕鏈表達(dá)載體中分離，并被分別命名為TNLV2LF和TNLV2dLF。CHO細(xì)胞系可通過使用合適的轉(zhuǎn)化液(如GenePORTER(GTS，US))由pHAB-TNHV2HF人源化重鏈表達(dá)載體和pHAB-TNLV2LF人源化輕鏈表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而來，以獲得能產(chǎn)生hTNF-a特異性人源化抗體的轉(zhuǎn)化株，轉(zhuǎn)化株被命名為CHO-YHB1406。并且，可根據(jù)與上述相同的方法，通過使用pHAB-TNHV2kHF人源化重鏈表達(dá)載體和pHAB-TNLV2LF或pHAB-TNLV2dLF人源化輕鏈表達(dá)載體制備另一種轉(zhuǎn)化株。這些轉(zhuǎn)化株被命名為CHO-YHB1411和CHO-YHB1411-2。另外，還可根據(jù)與上述相同的方法，通過使用pHAB-TNHVlkHF人源化重鏈表達(dá)載體和pHAB-TNLV2dLF人源化輕鏈表達(dá)載體制備另一種轉(zhuǎn)化株，該轉(zhuǎn)化株已被命名為CHO-YHB1406-2。為了從轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中純化本發(fā)明的人源化抗體，可在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)CHO-YHB1406、CHO-YHB1411、CHO-YHB1411-2或CHO-YHB1406-2轉(zhuǎn)化株，并使用蛋白-A(AmershamBioscience,瑞典)或山羊抗-人免疫球蛋白G(ZymedLaboratoriesInc.,USA)對培養(yǎng)物上清進(jìn)行柱層析。由此純化來的人源化抗體被分別命名為YHB1406、YHB1411、YHB1411-2和YHBl楊-2。人源化抗體的抗原結(jié)合親和力可通過，如，競爭ELISA、固相ELISA或表面等離子共振確定。與hTNF-a特異性結(jié)合的YHB1406、YHB1411、YHB1411-2和YHB1406-2人源化抗體表現(xiàn)出了從1xi(T9M到lx10"M的抗原結(jié)合親和力，說明本發(fā)明的人源化抗體具有與原始小鼠單克隆抗體相似的抗原結(jié)合活性，而免疫原性顯著減小，因此，可被有效用于治療hTNF-a相關(guān)疾病。并且，通過SPR確定的本發(fā)明的人源化抗體的解離常數(shù)(K。fO在1x10、"至1x10-9s-'的范圍內(nèi)，表明抗原-抗體復(fù)合物的解離度非常低。為此，本發(fā)明的人源化抗體可被用作藥物組合物中的有效成分，用于治療hTNF-a相關(guān)疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克隆氏病、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、敗血癥、哮喘、韋格納氏肉芽腫病、炎癥和強(qiáng)直性脊柱炎。本發(fā)明的組合物被制備為在采用本領(lǐng)域已知的任何一種方法對病人進(jìn)行給藥后提供有效成分的快速、持久或緩慢釋出。所述組合物可包含藥學(xué)可接受的賦形劑、稀釋劑、崩解劑、增甜劑、潤滑劑和調(diào)味劑。所述藥物組合物優(yōu)選制備為通過快速濃注法或持續(xù)滴液法靜脈給藥，或通過植入膠囊釋放。典型靜脈給藥劑型使用生理鹽水作為稀釋劑。實(shí)際給予病人的抗體的劑量應(yīng)由各種相關(guān)因素確定，包括將給藥的特異性抗體、給藥時間和組合物的劑型、給藥途徑、待治療的疾病、病人的體重、年齡、性別、健康狀況和飲食。典型劑量為0.01mg/kg沃到1,000mg/kg/天。更典型的劑量為0.1mg/kg/天到10mg/kg/天。以下實(shí)施例旨在對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，而不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。實(shí)施例h具有人源化抗體重鏈可變區(qū)編碼的基因的構(gòu)建使用編碼TNF-a特異性小鼠單克隆抗體TSK114(保藏號KCTC10514BP和KCTC10515BP)重鏈可變區(qū)的基因作為模板以及SEQIDNO:1和14的引物對進(jìn)行PCR，以擴(kuò)增攜帶前導(dǎo)序列的編碼人源化抗體重鏈可變區(qū)的基因A。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，并使用QIAgel回收試劑盒(Qiagen,USA)從凝膠中回收。使用SEQIDNO:l和7或SEQIDNO:6和14的引物對對由此獲得的基因A進(jìn)行PCR以擴(kuò)增DNA片段，使用得到的DNA片段和SEQIDNO:1和14的引物對進(jìn)行重疊PCR。使用TOPO載體(TOPOTA克隆試劑盒，InvitrogenInc.,USA)在室溫下對擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物孵育45分鐘進(jìn)行克隆，然后將克隆載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10F(InvitrogenInc.,USA)中。將轉(zhuǎn)化得到的大腸桿菌在含100嗎/ml氨比西林的LB培養(yǎng)基中接種后，從大腸桿菌中分離出質(zhì)粒，并使用EcoRI(BioLabsInc.,USA)酶解制備約450bp的編碼重鏈可變區(qū)的基因B。使用基因B作為模板和SEQIDNO:l和9或SEQIDNO:8和14的引物對進(jìn)行PCR以擴(kuò)增DNA片段，使用得到的DNA片段和SEQIDNO:1和14的引物對進(jìn)行重疊PCR。按照與上述相同的方法，在TOPO載體中對擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆，并使用￡coRI酶解，以制備編碼重鏈可變區(qū)的基因C。按照與上述相同的方法，使用SEQIDNO:1禾Q11或SEQIDNO:10和14的引物對對基因C進(jìn)行PCR以擴(kuò)增DNA片段，使用得到的DNA片段和SEQIDNO:1和14的引物對進(jìn)行重疊PCR。將由此擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在TOPO載體中克隆以獲得編碼重鏈可變區(qū)的基因D。使用SEQIDNO:4和14或SEQIDNO:1和5的引物對對基因D進(jìn)行PCR以擴(kuò)增DNA片段，并使用得到的DNA片段和SEQIDNO:1和14的引物對進(jìn)行重疊PCR。按照與上述同樣的方式，在TOPO載體中對由此擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆，以獲得編碼重鏈可變區(qū)的基因E。另外，使用基因E作為模板和SEQIDNO:l和3或SEQIDNO:2和14的引物對進(jìn)行PCR以擴(kuò)增DNA片段，并使用得到的DNA片段和SEQIDNO:1和14的引物對進(jìn)行重疊PCR。按照與上述相同的方法，在TOPO載體中對PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆，以獲得編碼重鏈可變區(qū)的TNHV2基因(SEQIDNO:31)，插入了TNHV2的TOPO載體被命名為pCR-TNHV2Hv。按照與上述相同的方法，使用TNHV2作為模板和SEQIDNO:1和13或SEQIDNO:12和14的引物對進(jìn)行PCR以擴(kuò)增DNA片段，并使用得到的DNA片段和SEQIDNO:1和14的引物對進(jìn)行重疊PCR，并在TOPO載體中對PCR產(chǎn)品進(jìn)行克隆以獲得編碼重鏈可變區(qū)的另一基因。該基因被命名為TNHV2k(SEQIDNO:32)，而插入了TNHV2k基因的TOPO載體被命名為pCR-TNHV2kHv。另外，按照與上述相同的方法，使用TNHV2k基因作為模板和SEQIDNO:1和15的引物對進(jìn)行PCR，并在TOPO載體中對PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆獲得另一種編碼重鏈可變區(qū)的基因。該基因被命名為TNHVlk(SEQIDNO:33)，而插入了TNHVlk的TOPO載體被命名為pCR-TNHVlkHv。表1顯示了每個PCR反應(yīng)中采用的引物對和反應(yīng)條件。每個PCR反應(yīng)在表1所示的30個循環(huán)的以下條件下進(jìn)行，預(yù)變性為95°C，7分鐘，最后延伸為72t:，10分鐘。<表1><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例2:人源化抗體的全長重鏈基因的構(gòu)建及其表達(dá)載體為使用實(shí)施例1中制備的插入TNHV2Hv載體中的編碼重鏈可變區(qū)的基因構(gòu)建編碼人源化全長重鏈的基因，采用含有編碼人抗體的重鏈恒定區(qū)的基因的pHAB-HC(KCTC10229BP,韓國專利公開號2004-12266)載體。首先，為了在表達(dá)載體pHAB-HC中插入編碼人源化抗體重鏈可變區(qū)的基因TNHV2，使用歷"dm/^al(BioLabs,Inc.,USA)在37。C對pCR-TNHV2Hv處理2小時，在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，并使用溴化乙啶(EtBr)染色，觀察到約450bp的基因片段。并且，對pHAB-HC進(jìn)行幼'"dIII"paI處理、電泳和染色，觀察到約6.5kb的酶解載體片段。然后，使用QIAgel回收試劑盒(Qiagen，USA)將觀察到的基因片段從凝膠中回收，使用T4DNA連接酶(BioLabs，Inc.,USA)在16°C處理過夜，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10F中以獲得轉(zhuǎn)化株。將轉(zhuǎn)化株在加入了100pg/ml的氨比西林的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，并從中分離出質(zhì)粒。使用///"dIII/A^I對分離出的質(zhì)粒進(jìn)行處理，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以獲得約1.4kb人源化抗體的全長重鏈基因。由此制得的人源化抗體的全長重鏈基因被命名為TNHV2HF。另外，插入了TNHV2HF的表達(dá)載體被命名為pHAB-TNHV2HF(圖3)，并被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10F中以獲取轉(zhuǎn)化株，轉(zhuǎn)化株于2004年9月1日保藏在韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)(地址生物科學(xué)與生物技術(shù)研究所，#52,Oun-dong,Yusong畫ku，Taejon,305-333,韓國)，保藏號為KCTC10691BP。按照與上述相同的方法，使用TNHV2k或TNHVlk基因也制備了人源化抗體的全長重鏈基因，由此制得的人源化抗體的全長重鏈基因被分別命名為TNHV2kHF或TNHVlkHF。另外，插入了TNHV2kHF或TNHVlkHF全長重鏈基因的人源化抗體的重鏈表達(dá)載體被分別命名為pHAB-TNHV2kHF或pHAB-TNHVlkHF(圖4禾口5)，由pHAB-TNHV2kHF或pHAB-TNHVlkHF轉(zhuǎn)化而來的大腸桿菌TOP10F分別于2004年9月1日或2005年6月13日被保藏在韓國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號分別為KCTC10692BP和KCTC10818BP。實(shí)施例3:編碼人源化抗體的輕鏈可變區(qū)的基因的構(gòu)建使用編碼特異性識別TNF-a的小鼠單克隆抗體TSK114的輕鏈可變區(qū)的基因作為模板和SEQIDNO:16和30的引物對進(jìn)行PCR，以擴(kuò)增含前導(dǎo)序列的編碼輕鏈可變區(qū)的基因A。對基因A進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和EtBr染色，并使用QIAgel回收試劑盒從凝膠中回收。使用SEQIDNO:16和25或SEQIDNO:24和30的引物對對由此純化的基因A進(jìn)行PCR以擴(kuò)增DNA片段，并使用得到的DNA片段和SEQIDNO:16禾B30的引物對進(jìn)行重疊PCR。使用TOPO載體(TOPOTA克隆試劑盒，InvitrogenInc.,USA)在室溫下對擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物孵育45分鐘，并將克隆得到的載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOPIOF中以獲得轉(zhuǎn)化株。將轉(zhuǎn)化株在含100ng/ml的氨比西林的LB培養(yǎng)基中孵育過夜后，從大腸桿菌中分離出質(zhì)粒，并用5coRI(BioLabsInc.,USA)酶解，以獲得約400bp編碼輕鏈可變區(qū)的基因B。使用基因B作為模板和SEQIDNO:26和30或SEQIDNO:16和27的引物對進(jìn)行PCR以擴(kuò)增DNA片段，并使用得到的DNA片段和SEQIDNO:16和30的引物對進(jìn)行重疊PCR。按照與上述相同的方法，在TOPO載體中對擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆，并使用五coRI進(jìn)行酶解，制備編碼輕鏈可變區(qū)的基因C。按照與上述相同的方法，使用SEQIDNO:16和23或SEQIDNO:22和30的引物對對基因C進(jìn)行PCR以擴(kuò)增DNA片段，并使用得到的DNA片段和SEQIDNO:16和30的引物對進(jìn)行重疊PCR。按照與上述相同的方法，在TOPO載體中對由此擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆，以獲得編碼輕鏈可變區(qū)的基因D。通過使用基因D作為模板和SEQIDNO:18和30或SEQIDNO:16和19的引物對進(jìn)行PCR以擴(kuò)增DNA片段，并使用得到的DNA片段和SEQIDNO:16和30的引物對進(jìn)行重疊PCR，按照與上述相同的方法，在TOPO載體中對由此擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆，以獲得編碼輕鏈可變區(qū)的基因E。通過使用基因E作為模板和SEQIDNO:20禾B30或SEQIDNO:16和21的引物放大DNA片段，并使用得到的DNA片段和SEQIDNO:16和30的引物對進(jìn)行重疊PCR。按照與上述相同的方法，在TOPO載體中對由此放大的PCR產(chǎn)品進(jìn)行克隆，獲得編碼輕鏈可變區(qū)的基因F。并且，使用基因F作為模板和SEQIDNO:28禾卩30或SEQIDNO:16禾n29的引物對進(jìn)行PCR以擴(kuò)增DNA片段，并使用得到的DNA片段和SEQIDNO:16和30的引物對進(jìn)行重疊PCR。按照與上述相同的方法，在TOPO載體中對PCR產(chǎn)品進(jìn)行克隆，以獲得編碼輕鏈可變區(qū)的基因TNLV2(SEQIDNO:34)，而插入了基因TNLV2的TOPO載體被命名為pCR-TNLV2Lv。另外，按照與上述相同的方法，使用TNHV2作為模板和SEQIDNO:16和17的引物對進(jìn)行PCR以擴(kuò)增DNA片段，并使用SEQIDNO:30的引物片段作為大引物進(jìn)行PCR，以獲得編碼人源化抗體的輕鏈可變區(qū)的基因。該基因被命名為TNLV2d(SEQIDNO:35)，而插入了TNLV2d的TOPO載體被命名為pCR-TNLV2dLv。下表2中描述了上述PCR反應(yīng)中采用的引物對和PCR條件。每個PCR反應(yīng)在表2中所示的30個循環(huán)的條件下進(jìn)行，預(yù)變性為95°C，7分鐘，最后延伸為72"C，10分鐘。<表2><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實(shí)施例4:人源化抗體的全長輕鏈基因的構(gòu)建及其表達(dá)載體為使用實(shí)施例3中制備的插入pCR-TNLV2Lv載體的編碼輕鏈可變區(qū)的基因構(gòu)建編碼人源化全長輕鏈的基因，使用了含有編碼人抗體的輕鏈恒定區(qū)的基因的pHAB-KC(KCTC10230BP，韓國專利公開號2004-12268)表達(dá)載體。首先，為將編碼人源化抗體輕鏈可變區(qū)的基因TNLV2插入表達(dá)載體pHAB-KC中，使用歷"dm/5w'附(BioLabs，Inc.,USA)在37。C對pCR-TNLV2Lv處理2小時，在1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳并使用溴化乙啶(EtBr)染色，觀察到約400bp的基因片段。按照與上述相同的方法，也使用///"dm/^s/肌對表達(dá)載體pHAB-KC進(jìn)行處理，觀察到約6.5kb的酶解載體片段。然后，使用QIAgel回收試劑盒(Qiagen，USA)將觀察到的基因片段從凝膠中回收恢復(fù)，使用T4DNA連接酶(BioLabs,Inc.,USA)在16°C處理過夜，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10F中以獲得轉(zhuǎn)化株。將轉(zhuǎn)化株在加入了100嗎/ml的氨比西林的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，并從培養(yǎng)基中分離出質(zhì)粒。使用///ml(BioLabs,Inc.,USA)對分離出的質(zhì)粒進(jìn)行處理，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以獲得約0.7kb的人源化抗體的全長輕鏈基因。由此制得的人源化抗體的全長輕鏈基因被命名為TNLV2LF。并且，插入了TNLV2LF的表達(dá)載體被命名為pHAB-TNLV2LF(圖6)，并被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10F中以獲得轉(zhuǎn)化株，轉(zhuǎn)化株于2004年9月1日保藏在韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，保藏號為KCTC10690BPo按照與上述相同的方法，使用TNLV2d基因制備人源化抗體的全長輕鏈基因，由此制得的人源化抗體的全長輕鏈基因被命名為TNLV2dLF。并且，插入了TNLV2dLF的表達(dá)載體被命名為pHAB-TNLV2dLF(圖7)，并被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10F中以獲得轉(zhuǎn)化株，轉(zhuǎn)化株于2005年6月13日保藏在韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，保藏號為KCTC10817BP。實(shí)施例5:將人源化抗體轉(zhuǎn)化到CHO細(xì)胞系中為測量動物細(xì)胞中的人源化抗體活性，如下將實(shí)施例2中制備的重鏈表達(dá)載體pHAB-TNHV2HF和實(shí)施例4中制備的輕鏈表達(dá)載體pHAB-TNLV2LF轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞系(ATCCCRL-9096，USA)中。首先，在37。C增濕二氧化碳培養(yǎng)箱中，在加入了2.0g/L碳酸氫鈉(Sigma,USA)和10%熱滅活FBS(GibcoBRL,USA)的DMEM/F12培養(yǎng)基(JRHInc.,USA)中對CHO細(xì)胞進(jìn)行2至3天培養(yǎng)。通過在室溫(25。C)對培養(yǎng)液進(jìn)行5分鐘1，200rpm離心收集培養(yǎng)細(xì)胞，使用0.4%臺盼藍(lán)(GibcoBRL，USA)染色，并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。將細(xì)胞按約3xl05的數(shù)量接種到T-75燒瓶中進(jìn)行亞培養(yǎng)。允許接種的CHO細(xì)胞增殖直至其以60-90%的密度占據(jù)燒瓶表面。將轉(zhuǎn)染用10i!gpHAB-TNHV2HF、10嗎pHAB-TNLV2LF和80^1GenePORTER溶液(GTS，USA)與5mlDMEM/F12(無血清)培養(yǎng)基混合。然后將混合物置于室溫下10至45分鐘，將培養(yǎng)基從燒瓶中取出，將亞培養(yǎng)的CHO細(xì)胞所述混合物在37°C增濕二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育約3至5小時，以獲取被命名為CHO-YHB1406的轉(zhuǎn)染體。按照與上述相同的方法，將分別在實(shí)施例2和4中制備的重鏈表達(dá)載體pHAB-TNHV2kHF和輕鏈表達(dá)載體pHAB-TNLV2LF，重鏈表達(dá)載體pHAB-TNHV2kHF和輕鏈表達(dá)載體pHAB-TNLV2dLF，或重鏈表達(dá)載體pHAB-TNHVlkHF和輕鏈表達(dá)載體pHAB-TNLV2dLF轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中以獲得轉(zhuǎn)染體，分別命名為CHO-YHB1411、CHO-YHB1411-2和CHO-YHB1406-2。實(shí)施例6:人源化抗體的純化將2xl()S個實(shí)施例5中獲得的轉(zhuǎn)染體CHO-YHB1406細(xì)胞種入含有加入了10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基的T-75燒瓶中，并將燒瓶在37°C增濕二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育7天以表達(dá)人源化抗體。收集培養(yǎng)基，離心并過濾以獲得包含抗體的無細(xì)胞培養(yǎng)液。為從溶液中純化人源化抗體，分別采用A蛋白(Pharmacia)和山羊抗畫人免疫球蛋白G(ZymedLaboratoriesInc.,USA)與瓊脂糖4快流柱相結(jié)合。含有抗體的培養(yǎng)基被施加于A蛋白結(jié)合瓊脂糖4快流柱，以允許人源化抗體與A蛋白結(jié)合，并將甘氨酸緩沖液(pH2.5)加入柱中洗提人源化抗體。然后，將洗提液與1MTris-Cl(pH8.0)按1:10的體積比混合進(jìn)行中和，并置于與山羊抗-人免疫球蛋白結(jié)合的瓊脂糖4快流柱中，使柱特異性捕獲所述抗體蛋白。根據(jù)與上述相同的方法洗提人源化抗體，純化的人源化抗體被命名為YHB1楊。按照與上述相同的方法，分別培養(yǎng)實(shí)施例5中制備的轉(zhuǎn)染體CHO-YHB1411、CHO-YHB1411-2禾QCHO-YHB1406-2，并從中純化產(chǎn)生的抗體，以獲得被分別命名為YHB1411、YHB1411-2和YHB1406-2的純化人源化抗體。作為使用SDS-PAGE對純化人源化抗體進(jìn)行分析的結(jié)果，觀察到了約50kDa和約25kDa的帶，被分別鑒定為人源化抗體的重鏈和輕鏈(圖8)。實(shí)施例7:人源化抗體與hTNF-a的抗原結(jié)合親和力測量使用競爭ELISA對實(shí)施例6中純化的人源化抗體進(jìn)行量化，并通過使用重組hTNF-a(Biosource，USA)分析其抗原結(jié)合活性。為了進(jìn)行抗體的量化，將100ng山羊抗-人免疫球蛋白G.A.M(ZymedLaboratoriesInc.,USA)分配到微量培養(yǎng)板(DynatechLaboratoriesInc.,USA)的每個孔中，并將孔板置于4。C保存過夜使其表面覆蓋免疫球蛋白。此時，小鼠單克隆抗體TSK114被作為對照。為測量人源化抗體與重組hTNF-a抗原的抗原結(jié)合親和力，將濃度為IO'"至10—7M的不同濃度的抗原溶液(每種100pl)分別與5ng小鼠單克隆抗體TSK114、人源化抗體YHB1406、YHB1411、YHB1406-2和YHB1411-2混合，并在37。C反應(yīng)2小時。將各反應(yīng)物加到包被有0.4嗎抗原的孔板上，并將孔板置于37t約1.5小時。將與辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗-人多克隆抗體(BioRad，USA)按1:1000的比例稀釋并將lO(Hil稀釋的抗體溶液加入每個孔中。將孔板置于37°C1小時。反應(yīng)完成后，使用辣根過氧化物酶底物試劑盒(BioRad，USA)測量每個孔的光密度。根據(jù)測得的光密度計(jì)算出與抗原結(jié)合和未結(jié)合的抗體的濃度，并由此確定人源化抗體的抗原結(jié)合親和力(FriguetB.etal.,//mmw"o/.77:305-319,1985)。結(jié)果示于表3和圖9中。<表3><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>如表3和圖9中可見，人源化抗體YHB1406、YHBMll、YHB1411-2和YHB1406-2的抗原結(jié)合親和力與小鼠單克隆抗體TSKl14的相似。實(shí)施例8:人源化抗體體外抗原中和能力測試采用WHEI164細(xì)胞系(ATCCCRL-1751,USA)，按以下方法確定本發(fā)明的人源化抗體的體外hTNF-a抗原中和能力(KhabarKSAetal.,/w柳w"o/.46;107-110，1995)。將小鼠單克隆抗體TSK114和人源化抗體YHB1406、YHB141KYHB1411-2和YHB1406-2分別在PBS緩沖液中稀釋為從0.024ng/mL至1.0pg/mL的不同濃度，并將各100nl所得溶液加到96-孔培養(yǎng)板的孔中。將50ul的hTNF-a溶液(IOOpg/mL)加到每個孔并在37"C反應(yīng)1小時。然后，將50ul經(jīng)2ug/ml放線菌素D(Sigma，USA)處理的WHEI164細(xì)胞系(lx106細(xì)胞/ml)加到每個孔。在37'C培養(yǎng)細(xì)胞24小時，并取出100ul培養(yǎng)液。將在PBS緩沖液中稀釋為5mg/mL的濃度的20ul甲基噻唑基四唑(MTT,Sigma,USA)溶液加到培養(yǎng)板的每個孔，并將板在37'C孵育4小時以顯色。然后將100ul的O.INHCl-10%SDS溶液(Sigma，USA)加到每個孔中以徹底溶解有色沉淀，在595nm測量每個孔的吸光度。根據(jù)以上獲得的吸光度數(shù)據(jù)繪制出WHEI164細(xì)胞系對比抗體濃度的存活率曲線。根據(jù)曲線計(jì)算出抑制50%細(xì)胞死亡的抗體濃度(1(:50)，結(jié)果顯示于表4中。<表4>抗體的抗原中和能力<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>如表4中所示，小鼠單克隆抗體(TSK114)的ICso為4.7ng/mL，而本發(fā)明的人源化抗體YHB1406、YHB1411、YHB1411-2和YHB1406-2的ICso分別為9.2ng/mL、6.7ng/mL、5.5ng/mL和6.5ng/mL。該結(jié)果表明人源化抗體具有與小鼠單克隆抗體類似的體外抗原中和能力。實(shí)施例9:通過SPR測量人源化抗體與hTNF-a的抗原結(jié)合親和力通過表面等離子共振(SPR)法測量小鼠單克隆抗體和人源化抗體與hTNF-a的結(jié)合親和力。具體地說，在傳感器芯片CM5(Biacore，瑞典)上以200ug/ml的濃度對hTNF-a(Biosource，USA)進(jìn)行固定化，并分別與25、50、100、200和400nM小鼠單克隆抗體TSK114或人源化抗體YHB1411-2反應(yīng)。然后，通過Biacore2000(Biacore,瑞典)測量反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)和解離常數(shù)。由以上測得的結(jié)合常數(shù)和解離常數(shù)計(jì)算抗體的抗原結(jié)合親和力，結(jié)果顯示在表5中。<表5>小鼠單克隆抗體和人源化抗體與hTNF-a的結(jié)合親和力比較<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>如表5中所示，本發(fā)明的人源化抗體YHB1411-2表現(xiàn)出了皮摩爾水平(10^M)的高抗原結(jié)合親和力和低解離常數(shù)。另外，人源化抗體YHB1411-2的抗原結(jié)合親和力比小鼠單克隆抗體TSK114高約3倍。盡管已從上述具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行了描述，應(yīng)認(rèn)識到由本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明作出的各種修改和更改也屬于所附權(quán)利要求書限定的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1.人腫瘤壞死因子-α(hTNF-α)特異性人源化抗體，其包括a)互補(bǔ)決定區(qū)分別具有以下氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，HYGMNWINTNTGEPRYDEEFKGYDSRGFDC(SEQIDNO41至43)；b)互補(bǔ)決定區(qū)分別具有以下氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)，TASSSISYNYFHSSSNLASHQYERSPWT(SEQIDNO44至46)；c)與人抗體的重鏈恒定區(qū)相同的重鏈恒定區(qū)；和d)與人抗體輕鏈恒定區(qū)相同的輕鏈恒定區(qū)。2.權(quán)利要求1的人源化抗體，其中所述重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)中除CDR外的框架區(qū)的氨基酸序列來自人抗體。3.權(quán)利要求1的人源化抗體，其中所述抗體的抗原結(jié)合親和力(Kd)在1x1(r9M至1x1(T13M的范圍內(nèi)。4.權(quán)利要求1的人源化抗體，其中通過表面等離子共振(SPR)測得抗體的解離常數(shù)(Koff)在1xl(T6s'1到1xl(T9s"的范圍內(nèi)。5.權(quán)利要求1的人源化抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)具有SEQIDNO:36、37或38的氨基酸序列。6.權(quán)利要求5的人源化抗體，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)由具有SEQIDNO:31、32或33的核苷酸序列的DNA編碼。7.權(quán)利要求1的人源化抗體，其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)具有SEQIDNO:39或40的氨基酸序列。8.權(quán)利要求7的人源化抗體，其中所述抗體的輕鏈可變區(qū)由具有SEQIDNO:34或35的核苷酸序列的DNA編碼。9.hTNF-ct特異性人源化抗體重鏈的表達(dá)載體，其包含編碼具有SEQIDNO:36、37或38的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的DNA。10.權(quán)利要求9的表達(dá)載體，其為pHAB-TNHV2HF、pHAB-TNHV2kHF或pHAB-TNHVlkHF。11.hTNF-a特異性人源化抗體輕鏈的表達(dá)載體，其包含編碼具有SEQIDNO:39或40的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的DNA。12.權(quán)利要求11的表達(dá)載體，其為pHAB-TNLV2LF或pHAB-TNLV2dLF。13.以權(quán)利要求9或11的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(￡."http://)細(xì)胞。14.權(quán)利要求13的大腸桿菌細(xì)胞，其為TOP10F/pHAB-TNHV2HF(保藏號KCTC10691BP)、TOP10F/pHAB-TNHV2kHF(保藏號KCTC10692BP)、TOP10F/pHAB-TNHVlkHF(保藏號KCTC10818BP)、TOP10F/pHAB-TNLV2LF(保藏號KCTC10690BP)或TOP10F/pHAB-TNLV2dLF(保藏號KCTC10817BP)。15.含權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的人源化抗體的藥物組合物，其用于治療選自如下一組的hTNF-a相關(guān)疾病類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克隆氏病、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、敗血癥、哮喘、韋格納氏肉芽腫病、炎癥和強(qiáng)直性脊柱炎。全文摘要與hTNF-α特異性結(jié)合的人源化抗體由小鼠單克隆抗體通過CDR(互補(bǔ)決定區(qū))移植法進(jìn)行制備，它們顯示出了與原始小鼠單克隆抗體相似的抗原結(jié)合親和力和顯著低的免疫原性。因此，該人源化抗體可被有效地用于治療hTNF-α-相關(guān)疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克隆氏病、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、敗血癥、哮喘、韋格納氏肉芽腫病、炎癥和強(qiáng)直性脊柱炎。文檔編號A61P29/00GK101111521SQ200580045167公開日2008年1月23日申請日期2005年12月29日優(yōu)先權(quán)日2004年12月29日發(fā)明者姜熙日,宋戊泳,樸相久,李秉圭,柳泰亨,羅康仁,金昶碩申請人:株式會社柳韓洋行