專利名稱：對(duì)人腫瘤壞死因子α具有特異性的抗體分子及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對(duì)人腫瘤壞死因子α(TNFα)的抗原決定簇具有特異性的抗體分子。本發(fā)明還涉及該抗體分子的治療用途，及生產(chǎn)該抗體分子的方法。
本發(fā)明涉及抗體分子。在抗體分子中，有兩個(gè)重鏈和兩個(gè)輕鏈。各重鏈和各輕鏈的N-端均有一個(gè)可變域。各個(gè)可變域是由四個(gè)構(gòu)架區(qū)(FRs)組成的，該構(gòu)架區(qū)與三個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDRs)相交替?？勺冇蛑械臍埢ǔＪ歉鶕?jù)Kabat等人設(shè)計(jì)的系統(tǒng)編號(hào)的。此系統(tǒng)是在Kabat等，1987，Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Department of Health and Human Services，NIH，USA(此后稱為“Kabat等(supra)”)中提出的。除非另有說明，否則將該編號(hào)系統(tǒng)用于本發(fā)明的說明書中。
Kabat殘基的命名并非總是與線性氨基酸殘基的編號(hào)直接相關(guān)。與嚴(yán)格的Kabat編號(hào)方式相比，相應(yīng)于縮短，或插入基本可變域結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)性組分，構(gòu)架或CDR，實(shí)際的線性氨基酸序列可包括較少的或附加的氨基酸。通過與具有“標(biāo)準(zhǔn)”Kabat編號(hào)序列抗體中的同系物的殘基進(jìn)行序列對(duì)比，可確定所提供抗體殘基正確的Kabat編號(hào)。
根據(jù)Kabat編號(hào)方式，重鏈可變域的CDRs位于第31-35位(CDRH1)，50-65(CDRH2)位和95-102位(CDRH3)的殘基上。
根據(jù)Kabat編號(hào)方式，輕鏈可變域的CDRs位于第24-34位(CDRL1)，50-56位(CDRL2)和89-97位(CDRL3)殘基上。
歐洲專利申請(qǐng)EP-A-0239400中描述了移植了CDR的抗體的結(jié)構(gòu)，該文獻(xiàn)還公開了一種方法，其中使用長鏈的寡核苷酸，通過定點(diǎn)誘變，把小鼠單克隆抗體的CDR移植到人免疫球蛋白可變域的構(gòu)架區(qū)上。該CDR可確定抗體的抗原結(jié)合特異性，且其是攜帶在可變域構(gòu)架區(qū)上相對(duì)較短的肽序列。
有關(guān)通過移植CDR而使單克隆抗體人源化的早期研究工作是在識(shí)別合成抗原，如NP的單克隆抗體上進(jìn)行的。Verhoeyen等(Science，239，1534-1536，1988)和Riechmann等(Nature，332，323-324，1988)分別描述了通過CDR移植，使識(shí)別溶菌酶的小鼠單克隆抗體和識(shí)別人T-細(xì)胞上抗原的大鼠單克隆抗體人源化的實(shí)施例。
Riechmann等發(fā)現(xiàn)單獨(dú)轉(zhuǎn)移CDR(如Kabat(Kabat等(supra)和Wu等，J.Exp.Med.，132，211-250，1970)所定義的)不足以在移植了CDR的產(chǎn)物中提供令人滿意的抗原結(jié)合活性。人們發(fā)現(xiàn)，不得不改變?cè)S多構(gòu)架殘基，以使它們與供體構(gòu)架區(qū)的那些相對(duì)應(yīng)。國際專利申請(qǐng)WO90/07861中描述了選擇需改變的構(gòu)架殘基的草擬標(biāo)準(zhǔn)。
目前已公開了很多討論移植了CDR的(CDR-grafted)抗體的評(píng)論，包括Vaughan等(Nature Biotechnology，16，535-539，1998)。
TNFα是一種促炎細(xì)胞因子，它通過免疫系統(tǒng)的細(xì)胞釋放并與之相互作用。因而，TNFα是通過巨噬細(xì)胞釋放的，其中的巨噬細(xì)胞已經(jīng)被革蘭氏陰性菌的脂多糖(LPS)活化。本身，TNFα是一種重要的內(nèi)源介質(zhì)，其涉及與細(xì)菌性膿毒癥有關(guān)的內(nèi)毒素性休克的發(fā)病和發(fā)展。TNFα還可以正向調(diào)節(jié)許多人類疾病，包括慢性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，克羅恩氏病，潰瘍性結(jié)膜炎和多發(fā)性硬化癥。人TNFα的轉(zhuǎn)基因鼠可產(chǎn)生組成型高水平的TNFα，并發(fā)展成一種自發(fā)的，有害的，類似類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的多發(fā)型關(guān)節(jié)炎(Kaffer等，EMBO J.，10，4025-4031，1991)。因此將TNFα稱為促炎細(xì)胞因子。
在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)描述了TNFα的單克隆抗體。Meager等，(Hybridoma，6，305-311，1987)描述了鼠科動(dòng)物重組TNFα的單克隆抗體。Fendly等，(Hybridoma，6，359-370，1987)描述了鼠科動(dòng)物重組TNFα的單克隆抗體在定義TNF上的中和表位中的用途。Shimamoto等(Immunology Letters，17，311-318，1988)描述了鼠科動(dòng)物TNFγ的單克隆抗體，及其在預(yù)防鼠類動(dòng)物內(nèi)毒素性休克中的用途。此外，國際專利申請(qǐng)WO92/11383公開了對(duì)TNFα具有特異性的重組抗體，包括移植了CDR的抗體。Rankin等(BritishJ.Rheumatology，34，334-342，1995)描述了這種移植了CDR的抗體在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的用途。US-A-5 919 452公開了抗-TNF嵌合抗體及其在治療與TNF存在有關(guān)的病狀中的用途。
人們(Beutler等，Science，234，470-474，1985)已經(jīng)提出了TNFα的抗體在預(yù)防和治療內(nèi)毒素性休克中的用途。Bodmer等，(Critical Care Medicine，21，S441-S446，1993)和Wherry等，(Critical Care Medicine，21，S436-S440，1993)討論了抗-TNFα抗體在治療膿毒性休克中的治療潛力。Kirschenbaum等(CriticalCare Medicine，26，1625-1626，1998)也討論了抗-TNFα抗體在治療膿毒性休克中的用途。使用抗-TNFα單克隆抗體可有效地治療膠原-誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(Williams等(PNAS-USA，89，9784-9788，1992))。
在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑液和外周血中可見到TNFα水平的升高。當(dāng)把TNFα阻斷劑給予患類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者時(shí)，它們可減輕炎癥，改善癥狀并延緩關(guān)節(jié)的損害(McKown等(ArthritisRheum.，42，1204-1208，1999)。
Feldman等(Transplantation Proceedings，30，4126-4127，1998)，Adorini等(Trends in Immunology Today，18，209-211，1997)和Feldman等(Advances in Immunology，64，283-350，1997)討論了抗-TNFα抗體在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和克羅恩氏病中的用途。用于這種治療的TNFα抗體通常是嵌合抗體，如US-A-5 919 452中描述的那些。
目前，已經(jīng)批準(zhǔn)了兩種TNFα阻斷產(chǎn)品用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。首先，是Immunex Corporation銷售的EnbrelTM，稱作etanercept。它是一種含兩個(gè)p75可溶性TNF-受體域的重組融合蛋白，該TNF-受體域與人免疫球蛋白的Fc部分相連。第二，是Centocor Corporation銷售的RemicadeTM，稱作infliximab。它是一種具有鼠科動(dòng)物抗-TNFα可變域和人IgG1不變域的嵌合抗體。
與導(dǎo)出可變域或CDR的抗體相比，現(xiàn)有技術(shù)中的抗-TNFα抗體分子對(duì)TNFα的親和力降低，且其通常是在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中產(chǎn)生的，造價(jià)昂貴。Stephens等，(Immunology，85，668-674，1995)，GB-A-2 246570和GB-A-2 297 145描述了現(xiàn)有技術(shù)中的抗-TNFα抗體。
因而，需要一種治療慢性炎癥疾病的抗體分子，其可以重復(fù)地使用，并可以很容易地，有效地生產(chǎn)。還需要一種抗體分子，其對(duì)TNFα具有高親和力，而對(duì)人具有低免疫原性。
在第一個(gè)方面中，本發(fā)明提供一種對(duì)TNFα具有特異性的抗體分子，其包含一個(gè)重鏈，其中的可變域包含一CDR(Kabat等(supra)定義的)，該CDR具有圖3(SEQ ID NO1)所列CDRH1的H1序列，圖3(SEQ ID NO2)所列CDRH2的H2’序列或圖3(SEQ ID NO7)所列CDRH2的H2序列，或圖3(SEQ ID NO3)所列CDRH3的H3序列。
本發(fā)明第一方面抗體分子的重鏈可變域包含至少一個(gè)選自H1，H2’或H2和H3(SEQ ID NO1；SEQ ID NO2或SEQ ID NO7和SEQ ID NO3)的CDR。優(yōu)選地，該抗體分子的重鏈可變域中包含至少兩個(gè)，更優(yōu)選全部三個(gè)CDR。
在本發(fā)明的第二個(gè)方面中，提供一種對(duì)人TNFα具有特異性的抗體分子，其包含一個(gè)輕鏈，其中的可變域含一CDR(如Kabat等(supra)所定義的)，該CDR具有圖3(SEQ ID NO4)所列CDRL1的L1序列，圖3(SEQ ID NO5)所列CDRL2的L2序列，或圖3(SEQ ID NO6)所列CDRL3的L3序列。
本發(fā)明第二方面抗體分子的輕鏈可變域包含至少一個(gè)選自L1，L2和L3(SEQ ID NO4-SEQ ID NO6)的CDR。優(yōu)選地，該抗體分子的輕鏈可變域中包含至少兩個(gè)，更優(yōu)選全部三個(gè)CDR。
優(yōu)選本發(fā)明第一和第二方面的抗體分子分別具有一個(gè)互補(bǔ)的輕鏈或一個(gè)互補(bǔ)的重鏈。
優(yōu)選地，本發(fā)明第一或第二方面的抗體分子包含一個(gè)重鏈，其中的可變域包含一CDR(Kabat等(supra)定義的)，該CDR具有圖3(SEQID NO1)所列CDRH1的H1序列，圖3(SEQ ID NO2或SEQ ID NO7)所列CDRH2的H2’或H2序列，或圖3(SEQ ID NO3)所列CDRH3的H3序列，和一個(gè)輕鏈，其中的可變域包含一CDR(如Kabat等(supra)所定義的)，該CDR具有圖3(SEQ ID NO4)所列CDRL1的L1序列，圖3(SEQ ID NO5)所列CDRL2的L2序列，或圖3(SEQ ID NO6)所列CDRL3的L3序列。
SEQ ID NO1和3-7及圖3中所列的CDR均來源于小鼠的單克隆抗體hTNF40。然而，SEQ ID NO2是由雜種CDR組成的。該雜種CDR包含部分來源于小鼠單克隆抗體hTNF40的重鏈CDR2，和部分來源于人類3組種系V區(qū)序列的重鏈CDR2。
小鼠hTNF40抗體可變域的全序列在圖6(輕鏈)(SEQ ID NO99)和圖7(重鏈)(SEQ ID NO100)中列出。下面稱此小鼠抗體為“供體抗體”。
本發(fā)明第一或第二方面的第一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例是小鼠單克隆抗體hTNF40，其具有圖6(SEQ ID NO99)和圖7(SEQ ID NO100)中分別列出的輕鏈和重鏈可變域序列。hTNF40的輕鏈不變區(qū)是κ，重鏈不變區(qū)是IgG2a。
在第二個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明第一或第二方面的抗體是一種嵌合的小鼠/人抗體分子，此處稱其為嵌合hTNF40抗體分子。該嵌合抗體分子包含小鼠單克隆抗體hTNF40(SEQ ID NO99和100)的可變域和人的不變域。優(yōu)選地，該嵌合hTNF40抗體分子的輕鏈中包含人Cκ域(Hieter等，Cell，22，197-207，1980；Genebank accession numberJ00241)，重鏈中包含人γ4域(Flanagan等，Nature，300，709-713，1982)。
在第三個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明第一和第二方面的抗體是一種移植了CDR的抗體分子。此處使用的術(shù)語“移植了CDR的抗體分子”指的是這樣一種抗體分子，其中的重鏈和/或輕鏈包含一個(gè)或多個(gè)來源于供體抗體(例如，鼠科動(dòng)物單克隆抗體)的CDR(包括，如果期望，一種雜種CDR)，其中的供體抗體被移植到受體抗體(例如，人的抗體)的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)構(gòu)架中。
優(yōu)選地，這種移植了CDR的抗體有一個(gè)可變域，其包含人的受體構(gòu)架區(qū)和上述一個(gè)或多個(gè)供體CDR。
當(dāng)移植了CDR時(shí)，任一適當(dāng)?shù)氖荏w可變區(qū)構(gòu)架序列均可采用，只要注意到CDR從中衍生的供體抗體的種類/類型，包括小鼠，靈長類動(dòng)物和人的構(gòu)架區(qū)。用于本發(fā)明的人構(gòu)架的實(shí)施例是KOL，NEWM，REI，EU，TUR，TEI，LAY和POM(Kabat等(supra))。例如，KOL和NEWM可用于重鏈，REI可用于輕鏈，EU，LAY和POM既可用于重鏈又可用于輕鏈。輕鏈的優(yōu)選構(gòu)架區(qū)是

圖1(SEQ ID NOS83，85，87和89)所示人類1組構(gòu)架區(qū)。重鏈的優(yōu)選構(gòu)架區(qū)是圖2(SEQ ID NOS91，93，95和97及SEQ ID NOS106，107，108和109)分別所示的人類1組和3組的構(gòu)架區(qū)。
在本發(fā)明移植了CDR的抗體中，優(yōu)選將具有與供體抗體鏈同源的抗體作為受體抗體使用，其具有。受體的重鏈和輕鏈并不需要來源于相同的抗體，且可以，如果需要，包含復(fù)合鏈，其中該復(fù)合鏈具有來源于不同鏈的構(gòu)架區(qū)。
且，在本發(fā)明移植了CDR的抗體中，構(gòu)架區(qū)不需要具有與受體抗體的那些序列完全相同的序列。例如，可把稀有殘基變?yōu)榫褪荏w鏈的種類或類型而言更經(jīng)常出現(xiàn)的殘基。選擇性地，可改變受體構(gòu)架區(qū)中選定的殘基，以便使它們與在供體抗體相同位置發(fā)現(xiàn)的殘基相一致。應(yīng)使這種改變保持在最小，從而恢復(fù)供體抗體的親和力。在WO91/09967中提出了一種選擇受體構(gòu)架區(qū)中需改變的殘基的方案。
優(yōu)選地，在本發(fā)明移植了CDR的抗體分子中，如果受體重鏈具有人類1組的構(gòu)架區(qū)(圖2所示)(SEQ ID NOS91，93，95和97)，那么除一種或多種供體CDR之外，重鏈的受體構(gòu)架區(qū)還包含28，69和71位的供體殘基(根據(jù)Kabat等(supra))。
選擇性地，如果受體重鏈具有1組的構(gòu)架區(qū)，那么除一種或多種供體CDR之外，重鏈的受體構(gòu)架區(qū)還包含28，38，46，67，69和71位的供體殘基(根據(jù)Kabat等(supra))。
優(yōu)選地，在本發(fā)明移植了CDR的抗體分子中，如果受體重鏈具有人類3組的構(gòu)架區(qū)(圖2所示)(SEQ ID NOS106，107，108和109)，那么除一種或多種供體CDR之外，該重鏈的受體構(gòu)架區(qū)還包含27，28，30，48，49，69，71，73，76和78位的供體殘基(根據(jù)Kabat等(supra))。
優(yōu)選地，在本發(fā)明移植了CDR的抗體分子中，如果受體輕鏈具有人類1組的構(gòu)架區(qū)(圖1所示)(SEQ ID NOS83，85，87和89)，那么該輕鏈的受體構(gòu)架區(qū)還包含46和60位的供體殘基(根據(jù)Kabat等(supra))。
供體殘基是來源于供體抗體，即，CDR最初從中衍生的抗體的殘基。
本發(fā)明的抗體分子可包含具有全長重鏈和輕鏈的完整抗體分子；其片段，如Fab，修飾的Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2或Fv片段；輕鏈或重鏈的單體或二聚體；單鏈抗體，例如單鏈的Fv，其中重鏈和輕鏈的可變域是通過肽鍵連接的。類似地，重鏈和輕鏈的可變域可與其它抗體適當(dāng)?shù)亟Y(jié)合。
本發(fā)明優(yōu)選的抗體分子是Fab片段。優(yōu)選的Fab片段有一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈，該重鏈具有SEQ ID NO111所列的序列，該輕鏈具有SEQID NO113所列的序列。優(yōu)選SEQ ID NO111和SEQ ID NO113中所列的氨基酸序列分別是由SEQ ID NO110和SEQ ID NO112中所列的核苷酸序列編碼的。
選擇性地，優(yōu)選本發(fā)明的抗體分子是一種修飾的Fab片段，其中的修飾是指將一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加到片段重鏈的C-端，從而與效應(yīng)分子或報(bào)道分子相連接。優(yōu)選地，附加的氨基酸形成含一個(gè)或兩個(gè)半胱氨酸殘基的修飾鉸鏈區(qū)，從而可與效應(yīng)分子或報(bào)道分子相連接。這種修飾的Fab片段優(yōu)選具有一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈，該重鏈具有SEQ IDNO115所列的序列，該輕鏈具有SEQ ID NO113所列的序列。SEQ IDNO115中所列的氨基酸序列優(yōu)選是由SEQ ID NO114中所列的核苷酸序列編碼的。
優(yōu)選的效應(yīng)子是一種聚合物分子，其可以與修飾的Fab片段相連接，以增加它在體內(nèi)的半衰期。
該聚合物分子通?？梢允且环N合成的或天然存在的聚合物，例如，任選取代的直鏈或支鏈的聚亞烷基，聚亞烯基或聚亞氧烷基的聚合物，或支鏈或無支鏈的多糖，例如，同-或雜-多糖。
存在于上述合成聚合物上的特殊任選取代基包括一個(gè)或多個(gè)羥基，甲基或甲氧基。合成聚合物的特殊實(shí)施例包括任選取代的直鏈或支鏈的聚(乙二醇)，聚(丙二醇)，聚(乙烯醇)或其衍生物，特別是任選取代的聚(乙二醇)，如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。天然存在的特殊聚合物包括乳糖，直鏈淀粉，葡聚糖，糖原或其衍生物。此處使用的“衍生物”可包括反應(yīng)性衍生物，例如巰基-選擇性的反應(yīng)基團(tuán)，如馬來酰亞胺等。該反應(yīng)基團(tuán)可直接或通過連接區(qū)段與聚合物相連。我們期望在某些例子中，作為抗體片段和聚合物之間的連接基團(tuán)，這種基團(tuán)的殘基可形成產(chǎn)物的一部分。
聚合物的大小可根據(jù)需要而變化，但平均分子量通常在500Da-50000Da之間，優(yōu)選在5000-4000Da，更優(yōu)選25000-4000Da。聚合物的大小可根據(jù)產(chǎn)品的用途而選擇。因而，例如，假如想使產(chǎn)物離開循環(huán)，滲透組織中，例如用于治療腫瘤，可使用小分子量的聚合物，例如分子量為5000Da的聚合物。為使產(chǎn)物留在循環(huán)中，可使用分子量較高的聚合物，例如分子量為25000Da-40000Da的聚合物。
特別優(yōu)選的聚合物包括聚亞烷基聚合物，如聚(乙二醇)或，特別是，甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，特別是具有約25000Da-約40000Da分子量的聚合物。
附著在修飾抗體片段上的各聚合物分子可與片段中半胱氨酸殘基的硫原子共價(jià)連接。該共價(jià)鍵通常是二硫鍵或，特別是，硫-碳鍵。
需要時(shí)，該抗體片段可具有一個(gè)或多個(gè)與其連接效應(yīng)分子或報(bào)道分子。該效應(yīng)分子或報(bào)道分子可通過片段中任一可利用的氨基酸側(cè)-鏈或末端氨基酸官能團(tuán)，例如任一游離氨基，亞氨基，羥基或羧基與抗體片段連接。
在制備上述聚合物-修飾的抗體片段時(shí)，可將活化的聚合物用作起始材料。該活化聚合物可以是任一含巰基反應(yīng)基團(tuán)的聚合物，如α-鹵羧酸或酯，例如，碘乙酰胺，酰亞胺，例如馬來酰亞胺，乙烯基砜或二硫化物。這種起始材料可從商業(yè)上得到(例如，從SheatwaterPolymers Inc.，Huntsville，Al，USA)或使用常規(guī)的化學(xué)方法從商業(yè)上可得到的起始物質(zhì)制備。
關(guān)于連接聚(乙二醇)(PEG)部分，可參考”Poly(ethyleneglycol)Chemistry，Biotechnical and BiomedicalApplications”，1992，J.Milton Harris(ed)，Plenum Press，New York，“Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications”，1997，J.Milton Harris和S.Zalipsky(eds)，American ChemicalSociety，Washington DC和“Bioconjugation Protein CouplingTechniques for the Biomedical Sciences”，1998，M.Aslam和A.Dent，Grove Publishers，New York。
如果希望得到連接到效應(yīng)分子或報(bào)道分子上的抗體片段，則可通過標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)或重組DNA方法制備，其中抗體片段是在與活化的聚合物反應(yīng)之前或之后，直接或經(jīng)由偶聯(lián)劑與效應(yīng)分子或報(bào)道分子連接的。特殊的化學(xué)方法包括，例如，WO93/62331，WO92/22583，WO90,195和WO89/1476中描述的那些。選擇性地，如果效應(yīng)分子或報(bào)道分子是一種蛋白或多肽，那么可以使用重組DAN方法，如WO86/01533和EP-A-0392745所描述的方法得到該鍵。
優(yōu)選地，本發(fā)明修飾的Fab片段是根據(jù)EP-A-0948544中公開的方法PEG化的(即，PEG(聚(乙二醇)與其共價(jià)連接)。本發(fā)明優(yōu)選的抗體分子是圖13所示的PEG化的修飾Fab片段。如圖13所示，該修飾的Fab片段具有一個(gè)與修飾鉸鏈區(qū)中的單巰基共價(jià)連接的馬來酰亞胺基團(tuán)。賴氨酸殘基與馬來酰亞胺基團(tuán)共價(jià)連接。賴氨酸殘基的各胺基與分子量約為20,000Da的甲氧基聚(乙二醇)聚合物相連接。因此，整個(gè)效應(yīng)分子總的分子量約為40,000Da。
優(yōu)選地，在圖13所示的化合物中，抗體部分的重鏈具有SEQ IDNO115所列的序列，而輕鏈具有SEQ ID NO113所列的序列。此處，稱此化合物為CDP870。
本發(fā)明抗體分子的不變區(qū)，如果存在，可考慮抗體分子的建議功能，特別是根據(jù)建議的效應(yīng)子功能而選擇。例如，該不變區(qū)域可以是人IgA，IgD，IgE，IgG或IgM域。特別是，當(dāng)抗體分子用于治療用途并需要抗體的效應(yīng)子功能時(shí)，可使用人IgG不變區(qū)域，特別是IgG1和IgG3的同種型。選擇性地，當(dāng)抗體分子用于治療目的但不需要抗體的效應(yīng)子功能，例如簡(jiǎn)單的阻斷TNFα活性時(shí)，可使用IgG2和IgG4的同種型。
且，本發(fā)明的抗體分子可具有與其連接的效應(yīng)分子或報(bào)道分子。例如，它可具有一個(gè)大環(huán)，用于螯合通過共價(jià)橋結(jié)構(gòu)與其連接的重金屬原子，或毒素，如篦麻毒蛋白。選擇性地，可將重組DNA技術(shù)用于生產(chǎn)抗體分子，其中完整免疫球蛋白分子的Fc片段(CH2，CH3和鉸鏈域)，CH2和CH3域或CH3域已經(jīng)被替換為，或通過肽鍵附著于，功能性的非-免疫球蛋白，如酶或毒素分子上。
本發(fā)明的抗體分子優(yōu)選具有至少0.85×10-10M，更優(yōu)選至少0.75×10-10M，最優(yōu)選至少0.5×10-10M的結(jié)合親和力。(本發(fā)明優(yōu)選的人源化抗體分子，如下所述，具有約0.5×10-10M的親和力，其比它從中衍生的鼠科動(dòng)物單克隆抗體的親和力要好。鼠科動(dòng)物抗體的親和力約為0.85×10-10M。)優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體分子包含輕鏈可變域hTNF40-gL1(SEQ IDNO8)和重鏈可變域gh3hTNF40.4(SEQ ID NO11)。這些輕鏈和重鏈可變域的序列分別在圖8和11中列出。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明抗體分子的變體，其對(duì)TNFα的親和力提高。這種變體可通過許多親和力成熟方案得到，該方案包括使CDR變異(Yang等，J.Mol.Biol.，254，392-403，1995)，鏈改組(Marks等，Biol/Technology，10，779-783，1992)，使用大腸桿菌的增變菌株(Low等，J.Mol.Biol.，250，359-368，1996)，DNA改組(Patten等，Curr.Opin.Biotechnol.，8，724-733，1997)，噬菌體展示(Thompson等，J.Mol.Biol.，256，77-88，1996)和有性PCR(Crameri等，Nature，391，288-291，1998)。Vaughan等(supra)討論了這些親和力成熟的方法。
本發(fā)明還提供一種編碼本發(fā)明抗體分子重鏈和/或輕鏈的DNA序列。
優(yōu)選地，該DNA序列編碼本發(fā)明抗體分子的重鏈或輕鏈。
在其中一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該DNA序列編碼輕鏈，且包含SEQ IDNO8(hTNF40-gL1)或SEQ ID NO9(h-TNF40-gL2)所列的序列或其簡(jiǎn)并等價(jià)物。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該DNA序列編碼重鏈，且包含SEQ IDNO10(gh1hTNF40.4)或SEQ ID NO11(gh3hTNF40.4)所列的序列或其簡(jiǎn)并等價(jià)物。
本發(fā)明的DNA序列可包含合成的DNA，例如通過化學(xué)方法生產(chǎn)的，cDNA，基因組DNA或其任意的組合。
本發(fā)明還涉及一種包含本發(fā)明一個(gè)或多個(gè)DNA序列的克隆或表達(dá)載體。優(yōu)選地，該克隆或表達(dá)載體包含兩個(gè)DNA序列，分別編碼本發(fā)明抗體分子的輕鏈和重鏈。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種含本發(fā)明DNA序列的大腸桿菌表達(dá)載體。優(yōu)選地，該表達(dá)載體是圖22中所示的pTTO(CDP870)。
本發(fā)明還包含圖19所示的載體pDNAbEng-G1。
構(gòu)造載體的普通方法，轉(zhuǎn)染方法和培養(yǎng)方法對(duì)于本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員來說是熟知的。這方面的參考文獻(xiàn)是“Current Protocols inMolecular Biology”，1999，F(xiàn).M.Ausubel(ed)，Wiley Interscience，New York和Cold Spring Harbor Publishing的Maniatis Manual。
編碼本發(fā)明抗體分子的DNA序列可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法得到。例如，編碼部分或全部抗體重鏈和輕鏈的DNA序列可根據(jù)需要從預(yù)定的DNA序列，或根據(jù)相應(yīng)的氨基酸序列而合成。
對(duì)于本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員來說，編碼受體構(gòu)架序列的DNA可廣泛地得到，且可以根據(jù)它們的已知氨基酸序列很容易地合成。
分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可用于制備編碼本發(fā)明抗體分子的DNA序列?？墒褂霉押塑账岷铣杉夹g(shù)完全或部分地合成所期望的DNA序列。還可適當(dāng)?shù)厥褂枚c(diǎn)誘變及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)。
任一適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞/載體系統(tǒng)均可用于表達(dá)編碼本發(fā)明抗體分子的DNA序列。細(xì)菌如大腸桿菌，及其它的微生物系統(tǒng)，可部分用于編碼抗體片段，如Fab和F(ab’)2片段，特別是Fv片段和單鏈抗體片段，例如，單鏈的Fvs。真核生物，如哺乳動(dòng)物的宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可用于生產(chǎn)較大的抗體分子，包括完整抗體分子。適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物宿主細(xì)胞包括CHO，骨髓瘤或雜交瘤細(xì)胞。
本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)本發(fā)明抗體分子的方法，包含在適于從編碼本發(fā)明抗體分子的DNA產(chǎn)生蛋白表達(dá)的條件下，培養(yǎng)含本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞，并分離該抗體分子。
生產(chǎn)本發(fā)明抗體分子的優(yōu)選方法包含在適于從DNA序列產(chǎn)生蛋白表達(dá)的條件下，培養(yǎng)含大腸桿菌表達(dá)載體的大腸桿菌，其中的大腸桿菌表達(dá)載體包含本發(fā)明的DNA序列，然后分離該抗體分子。該抗體分子可從細(xì)胞分泌，或通過適當(dāng)?shù)男盘?hào)序列而被導(dǎo)向胞質(zhì)。選擇性地，該抗體分子可在細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)積聚。優(yōu)選地，該抗體分子被導(dǎo)向胞質(zhì)。根據(jù)所生產(chǎn)的抗體分子及所使用的方法，可使抗體分子重折疊并接受功能性構(gòu)像。使抗體分子重折疊的方法對(duì)于本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員來說是熟知的。
該抗體分子可僅僅包含一個(gè)重鏈或輕鏈的多肽，其中編碼序列的一個(gè)重鏈或輕鏈多肽需用于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。為了生產(chǎn)既含重鏈又含輕鏈的產(chǎn)物，可用兩個(gè)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，其中第一個(gè)載體編碼輕鏈的多肽，第二個(gè)載體編碼重鏈的多肽。選擇性地，可使用單個(gè)載體，該載體包括編碼輕鏈和重鏈多肽的序列。
本發(fā)明還提供一種治療或診斷組合物，其包含本發(fā)明的抗體分子及藥學(xué)上可接受的賦形劑，稀釋劑或載體。
本發(fā)明還提供一種制備治療或診斷組合物的方法，包括將本發(fā)明的抗體分子與藥學(xué)上可接受的賦形劑，稀釋劑或載體混合。
該抗體分子在治療或診斷組合物中可以是單一的活性成分，或與其它的活性成分，包括其它的抗體成分，例如抗-T細(xì)胞，抗-IFNγ或抗-LPS抗體，或非-抗體成分如黃嘌呤組合。
優(yōu)選該藥物組合物包含治療有效量的本發(fā)明的抗體。此處使用的術(shù)語“治療有效量”指的是治療，改善或預(yù)防目標(biāo)疾病或病癥，或顯示可檢測(cè)的治療或預(yù)防效果所需的治療劑的量。對(duì)任一抗體而言，治療的有效劑量最初可在細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)或動(dòng)物模型，通常是嚙齒類動(dòng)物，兔子，狗，豬或靈長類動(dòng)物中進(jìn)行估量。該動(dòng)物模型可用于確定適宜的濃度范圍和給藥途徑。這種信息還可用于確定人的有效給藥劑量和給藥途徑。
人類受試者準(zhǔn)確的有效量取決于疾病狀況的嚴(yán)重性，受試者的一般健康狀況，受試者的年齡，體重和性，飲食，給藥時(shí)間和頻率，藥物的組合，反應(yīng)敏感性和對(duì)治療的耐受性/反應(yīng)。此劑量可通過常規(guī)的試驗(yàn)并在臨床醫(yī)師的判斷范圍內(nèi)確定。通常，有效劑量為0.01mg/kg-50mg/kg，優(yōu)選0.1mg/kg-20mg/kg，更優(yōu)選約15mg/kg。如下列實(shí)施例所示，已經(jīng)將1，5和20mg/kg的給藥劑量用于治療患類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者。
可將組合物單獨(dú)給予患者，或與其它藥劑，藥物或激素一起給藥。
本發(fā)明抗體分子的給藥劑量取決于所治病癥的特性，抗體分子是用于預(yù)防還是治療所存在的病癥，待中和的TNFα水平高于或期望高于的水平的程度。
因而，例如，當(dāng)該產(chǎn)品用于治療或預(yù)防慢性炎癥性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎時(shí)，本發(fā)明抗體分子的適宜劑量為0.5-50mg/kg，更優(yōu)選1-20mg/kg，最優(yōu)選約15mg/kg。給藥頻率取決于抗體分子的半衰期及其藥效的持續(xù)時(shí)間。
如果抗體分子的半衰期較短(例如2-10小時(shí))，則可以每天給藥一次或多次。選擇性地，如果抗體分子的半衰期較長(例如2-15天)，則只需每天，每周，甚至每1個(gè)月或2個(gè)月給藥一次。
該藥物組合物還可以包含用于給予抗體的藥學(xué)上可接受的載體。該載體自身不應(yīng)誘導(dǎo)生產(chǎn)對(duì)接受組合物的個(gè)體有害的抗體，且該載體應(yīng)是無毒的。適宜的載體可以是大的，緩慢代謝的大分子，如蛋白，多肽，脂質(zhì)體，多糖，聚乳酸，聚乙二醇酸，聚合氨基酸，氨基酸共聚物和非活性的病毒顆粒。
也可以使用藥學(xué)上可接受的鹽，例如無機(jī)酸鹽，如鹽酸鹽，氫溴酸鹽，磷酸鹽和硫酸鹽，或有機(jī)酸鹽，如醋酸鹽，丙酸鹽，丙二酸鹽和苯甲酸鹽。
治療組合物中藥學(xué)上可接受的載體還可以附帶地包含液體，如水，鹽水，甘油和乙醇。附帶地，輔助物質(zhì)，如濕潤劑或乳化劑或pH緩沖物質(zhì)，也可存在于這種組合物中。這種載體可將藥物組合物制成適于患者攝入的片劑，丸劑，糖衣丸劑，膠囊，液體，凝膠，糖漿，漿和混懸液。
優(yōu)選的給藥形式包括適于非腸道給藥的形式，例如，通過注射或輸注，如快速濃注或連續(xù)的輸注。當(dāng)產(chǎn)品用于注射或輸注時(shí)，它可以是油性或水性介質(zhì)中的混懸液，溶液或乳狀液，且它可以包含formulatory劑，如混懸劑，防腐劑，穩(wěn)定劑和/或分散劑。選擇性地，該抗體分子可以是干燥形式，使用前用適當(dāng)?shù)臒o菌液體再組成。
一旦配制好后，可將本發(fā)明的組合物直接給予患者。接受治療的患者可以是動(dòng)物。然而，優(yōu)選將該組合物給予人類患者。
本發(fā)明的藥物組合物可通過任一途徑給藥，包括，但不限制于，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，房內(nèi)，髓內(nèi)，鞘內(nèi)，心室內(nèi)，透皮，經(jīng)皮(例如，見WO98/20734)，皮下，腹膜內(nèi)，鼻內(nèi)，腸內(nèi)，局部，舌下，陰道內(nèi)或直腸給藥途徑。Hyposprays也可用于給予本發(fā)明的藥物組合物。代表性地，可將該治療組合物制備成可注射的液體溶液或混懸液。還可以制備用于注射前配制于液體賦形劑的溶液或混懸液的固體形式。
組合物的直接傳遞通常可通過皮下，腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射來完成，或?qū)⒔M合物傳遞到組織的間隙空間。還可以將該組合物給藥到損傷中。治療方案可以是單一給藥或復(fù)合給藥。
期望組合物中的活性成分是抗體分子。這樣，其在胃腸道中的降解令人懷疑。因而，如果該組合物是通過胃腸道途徑給藥，那么該組合物需包含防止抗體降解，但一旦從胃腸道吸收則釋放該抗體的藥劑。
有關(guān)藥學(xué)上可接受載體的徹底討論見Remington’s PharmaceutiaclSciences(Mack Publishing Company，N.J.1991)。
通過基因治療給予本發(fā)明的抗體也是可以想到的。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，將在適當(dāng)DNA組分的控制下編碼抗體分子重鏈和輕鏈的DNA序列引入到患者中，從而自DNA序列表達(dá)抗體鏈并原位裝配(in situassembly)。
本發(fā)明還提供用于治療TNFα介導(dǎo)的疾病的抗體分子。
本發(fā)明進(jìn)一步提供本發(fā)明抗體分子在制備治療TNFα介導(dǎo)疾病的藥劑中的用途。
本發(fā)明的抗體分子可用于任意一種治療當(dāng)中，其中希望能降低存在于人或動(dòng)物體中生物活性的TNFα的水平。該TNFα可在體內(nèi)循環(huán)，或以不期望的高水平存在于體內(nèi)的特殊位置。
例如，TNFα水平的升高參與急性和慢性的免疫和免疫調(diào)節(jié)疾病，感染包括膿毒性，內(nèi)毒素性的和心血管性休克，炎癥疾病，神經(jīng)變性疾病，惡性疾病和酒精誘導(dǎo)的肝炎。與TNFα水平升高有關(guān)的多種疾病的描述在US-A-5 919 452中提出。本發(fā)明的抗體分子可用于治療TNFα介導(dǎo)的疾病。可用本發(fā)明抗體分子治療的，特別相關(guān)的疾病包括膿毒癥，充血性心力衰竭，膿毒性或內(nèi)毒素性的休克，惡病質(zhì)，成人呼吸窘迫綜合癥，AIDS，變態(tài)反應(yīng)，牛皮癬，TB，炎性骨疾病，血液凝聚病，燒傷，器官或組織移植后的排斥反應(yīng)發(fā)作，克羅恩氏病和自身免疫疾病，如甲狀腺炎和類風(fēng)濕性-和骨-關(guān)節(jié)炎。
附帶地，該抗體分子或組合物還可用于減輕在腫瘤治療過程中與TNFα產(chǎn)生有關(guān)的副作用；消除或減輕與使用抗-淋巴細(xì)胞抗體治療或預(yù)防移植排斥相關(guān)的休克癥狀；或治療多-器官衰竭。
本發(fā)明的抗體分子優(yōu)選用于治療類風(fēng)濕性-或骨-關(guān)節(jié)炎。
本發(fā)明還提供一種治療患TNFα介導(dǎo)的疾病或具有患TNFα介導(dǎo)疾病風(fēng)險(xiǎn)的人或動(dòng)物受試者的方法，該方法包括給予受試者有效量的本發(fā)明的抗體分子。
本發(fā)明的抗體分子還可用于診斷，例如體內(nèi)診斷，及反映疾病的狀況，其中該疾病涉及TNFα水平的升高。
本發(fā)明還提供一種含雜種CDR的抗體分子，其中的CDR含截短的供體CDR序列，其中截短的供體CDR的缺失部分被不同的序列代替，并形成功能性的CDR。此處使用的術(shù)語“雜種CDR”指的是一種含供體CDR的CDR，其中在一個(gè)或多個(gè)位置，例如，在其一個(gè)或兩個(gè)末端平截該供體CDR。用不同的序列代替截短的供體CDR的缺失部分，從而形成一個(gè)完整的，功能性的CDR。與完整的供體CDR相比，該雜種CDR具有至少一個(gè)氨基酸的改變。代替CDR截短部分的序列可以是任一序列。優(yōu)選地，CDR序列的非-供體部分來源于抗體，而該抗體又是抗體分子構(gòu)架區(qū)從中衍生的抗體，如種系抗體序列。
人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)含雜種CDR的抗體分子基本上保留了與含完整供體CDR的抗體分子相同的結(jié)合親和力。此處使用的術(shù)語”基本上相同的結(jié)合親和力”指的是與相應(yīng)的含完整供體CDR的抗體分子相比，至少70％，更優(yōu)選至少85％，最優(yōu)選至少95％相同的結(jié)合親和力。如上所述，在某些例子中，本發(fā)明抗體的親和力可比供體抗體的親和力大很多。雜種CDR的使用提供了這樣一種有利之處，即減少了存在于抗體分子中外源(即供體)序列的量，且與相應(yīng)含完整供體CDR的抗體分子相比，增加了抗體分子的結(jié)合親和力。
任一抗體分子的CDR均可以是雜種的。優(yōu)選在抗體分子中重鏈的CDR2是雜種。
優(yōu)選平截供體CDR的1-8個(gè)氨基酸，更優(yōu)選4-6個(gè)氨基酸。進(jìn)一步優(yōu)選在CDR的C-端進(jìn)行平截。
根據(jù)CDR截短部分的序列和代替缺失部分的不同序列的序列，可進(jìn)行多種氨基酸的改變。優(yōu)選進(jìn)行至少2個(gè)，更優(yōu)選至少3個(gè)，最優(yōu)選至少4個(gè)氨基酸的改變。
本發(fā)明此方面的特殊實(shí)施方案是本發(fā)明第一方面的抗體，其中重鏈中的第二個(gè)CDR具有SEQ ID NO2所列的序列。與部分CDR從中衍生出的供體抗體相比，其對(duì)抗原的親和力更好。
本發(fā)明還提供一種核酸序列，其編碼含本發(fā)明雜種CDR的抗體分子。
本發(fā)明還提供一種含核酸序列的表達(dá)載體，其中的核酸序列編碼含本發(fā)明雜種CDR的抗體分子。
本發(fā)明還提供一種用本發(fā)明載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)含雜種CDR的抗體分子的方法，包含培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，并分離該抗體分子。
下面，參考附圖并結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，其中圖1表示與hTNF40輕鏈(SEQ ID NOS83-90)的構(gòu)架區(qū)相比，人輕鏈1亞組的構(gòu)架區(qū)；圖2表示與hTNF40重鏈(SEQ ID NOS91-98及106-109)的構(gòu)架區(qū)相比，人重鏈1亞組和3亞組的構(gòu)架區(qū)；圖3表示hTNF40CDR(SEQ ID NOS1-7)的氨基酸序列，其中CDR H2’是一種雜種CDR，其中C-端的六個(gè)氨基酸來源于人3亞組種系抗體的H2 CDR序列，并在氨基酸下劃線，其中該氨基酸變?yōu)橛纱穗s交所產(chǎn)生的序列；圖4表示載體pMR15.1；圖5表示載體pMR14；圖6表示鼠科動(dòng)物hTNF40V1(SEQ ID NO99)的核苷酸序列及預(yù)測(cè)的氨基酸序列；圖7表示鼠科動(dòng)物hTNF40Vh(SEQ ID NO100)的核苷酸序列及預(yù)測(cè)的氨基酸序列；圖8表示鼠科動(dòng)物hTNF40-gL1(SEQ ID NO8)的核苷酸序列及預(yù)測(cè)的氨基酸序列；圖9表示鼠科動(dòng)物hTNF40-gL2(SEQ ID NO9)的核苷酸序列及預(yù)測(cè)的氨基酸序列；圖10表示鼠科動(dòng)物gh1hTNF40.4(SEQ ID NO10)的核苷酸序列及預(yù)測(cè)的氨基酸序列；圖11表示鼠科動(dòng)物gh3hTNF40.4(SEQ ID NO11)的核苷酸序列及預(yù)測(cè)的氨基酸序列；圖12表示載體CTIL5-gL6；圖13表示稱作CDP870的化合物的結(jié)構(gòu)，該化合物包含來源于抗體hTNF40的Fab片段，其中抗體hTNF40是經(jīng)由半胱氨酸殘基與賴氨酰-馬來酰亞胺鍵共價(jià)連接的，其中各個(gè)賴氨酰殘基上的氨基與甲氧基PEG殘基共價(jià)連接，其中的n約為420；圖14表示載體pTTQ9；圖15表示0mpA寡核苷酸連接物(SEQ ID NO101)的序列；圖16表示載體pACYC184；圖17表示載體pTTO-1；圖18表示載體pTTO-2；圖19表示載體pDNAbEng-G1；圖20表示寡核苷酸彈夾，該彈夾編碼大腸桿菌修飾的Fab表達(dá)的不同基因間序列(SEQ ID NO102-105)；圖21表示IGS變體的胞質(zhì)修飾的Fab積聚；圖22表示載體pTTO(CDP870)；圖23表示用不同劑量的CDP870和安慰劑治療的患者的疾病活動(dòng)性值(DAS)。提出中值和IQ范圍。小方塊代表安慰劑，菱形代表1mg/kg，三角形代表5mg/kg，大方塊代表20mg/kg。
圖24表示用不同劑量的安慰劑和CDP870治療的患者的觸痛關(guān)節(jié)數(shù)，腫脹關(guān)節(jié)數(shù)，疼痛值，評(píng)估員對(duì)疾病活動(dòng)性的綜合評(píng)估，改進(jìn)的健康評(píng)估調(diào)查表(HAQ)，C反應(yīng)性蛋白(CRP)和血沉速率(ESR)。提出中值和IQ范圍。小方塊代表安慰劑，菱形代表1mg/kg，三角形代表5mg/kg，大方塊代表20mg/kg。
實(shí)施例嵌合的hTNF40抗體分子的基因克隆和表達(dá)從hTNF40雜交瘤細(xì)胞制備RNA總的RNA是按照下列描述從3×107個(gè)hTNF40雜交瘤細(xì)胞制備的。在生理鹽水中清洗細(xì)胞并在RNAzol(0.2ml/106個(gè)細(xì)胞)中將其溶解。加入氯仿(0.2ml/2ml勻漿)，用力振蕩該混合物15秒，然后將其放在冰上15分鐘。在Eppendorf離心機(jī)中離心15分鐘，使最終的水相和有機(jī)相分離，然后通過加入等體積的異丙醇使RNA從水相中沉淀出來。在冰上放置15分鐘后，通過離心使RNA成團(tuán)，用70％乙醇清洗，干燥，并將其溶解在無菌的，RNA酶游離水中。RNA的產(chǎn)量為400μg。hTNF40 Vh和V1的PCR克隆編碼hTNF40重鏈和輕鏈可變域的cDNA序列是使用反向轉(zhuǎn)錄酶合成的，并產(chǎn)生存在于總RNA中的mRNA的單鏈cDNA模板，接下來用特異性的寡核苷酸引物在cDNA上進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。a)cDNA的合成cDNA是在含下列試劑的20μl反應(yīng)體積內(nèi)合成的50mM Tris-HClpH8.3，75mM KCl，10mM二硫蘇糖醇，3mM MgCl2，0.5mM脫氧核糖核苷磷酸鹽，20個(gè)單位的RNA酶抑制劑，75ng的任意六核苷酸引物，2μg的hTNF40 RNA和200個(gè)單位的莫洛尼鼠科動(dòng)物白血病病毒反向轉(zhuǎn)錄酶。在42℃培養(yǎng)60分鐘后，通過在95℃加熱5分鐘而終止反應(yīng)。
b)PCR使用對(duì)重鏈和輕鏈具有特異性的引物組合，使cDNA的等分試樣經(jīng)歷PCR反應(yīng)。重鏈和輕鏈5’引物的核苷酸序列分別在表1和2中列出。這些序列均包含，適宜的，一個(gè)從5’端啟動(dòng)7個(gè)核苷酸的限制位點(diǎn)，序列為GCCGCCACC(SEQ ID NO12)，以使生成的mRNA，一個(gè)起始密碼子和基于已知小鼠抗體前導(dǎo)肽序列的20-30個(gè)核苷酸的翻譯達(dá)到最佳(Kabat等，Sequences of proteins of immunological interest，5th Edition，1991，U.S.Department of Health and Human Services，Public Health Service，National Institutes of Health)。
3’引物在表3中列出。輕鏈的引物越過抗體的J-C連接，且包含SplI酶的一個(gè)限制位點(diǎn)，從而促進(jìn)V1 PCR片段的克隆。重鏈的3’引物是一種越過抗體J-C連接的混合物。該3’引物包括促進(jìn)克隆的ApaI限制位點(diǎn)。引物的3’區(qū)包含一混合序列，該混合序列是以在已知小鼠抗體中發(fā)現(xiàn)的那些(Kabat等，1991，supra)為基礎(chǔ)的。
上述引物的組合可使Vh和V1的PCR產(chǎn)物直接被克隆適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體(見下面)，從而生產(chǎn)嵌合的(小鼠-人)的重鏈和輕鏈，且可使這些基因的PCR產(chǎn)物在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，從而生產(chǎn)出所需同種型的嵌合抗體。
下面提出PCR的培養(yǎng)物(100μl)。各反應(yīng)物均包含10mM Tris-HClpH8.3，1.5mM MgCl2，50mM KCl，0.01％w/v明膠，0.25mM脫氧核糖核苷三磷酸鹽，10pmoles的5’引物混合物(表4)，10pmoles的3’引物(CL12(輕鏈)或R2155(重鏈)(表3))，1μl的cDNA和1個(gè)單位的Taq聚合酶。在95℃培養(yǎng)該反應(yīng)物5分鐘，然后94℃循環(huán)1分鐘，55℃循環(huán)1分鐘，72℃循環(huán)1分鐘。30次循環(huán)之后，通過在瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳而分析各反應(yīng)物的等分試樣。來源于輕鏈庫1，2，和7的含5’引物混合物的輕鏈反應(yīng)物產(chǎn)生與全長V1片段大小相同的帶，而來源于重鏈反應(yīng)庫3的反應(yīng)物則產(chǎn)生與Vh基因預(yù)期大小相同的片段。由于上述結(jié)果顯示此帶與雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的輕鏈假基因相對(duì)應(yīng)，因而沒有研究輕鏈庫1引物生產(chǎn)的帶。輕鏈庫7引物所產(chǎn)生的帶比庫2引物所產(chǎn)生的帶要弱，因此沒有研究它。僅研究了來源于輕鏈反應(yīng)庫2的帶，其是最強(qiáng)的帶。
c)PCR片段的分子克隆用BstBI和SplI酶消化在輕鏈反應(yīng)庫2中產(chǎn)生的DNA片段，通過乙醇沉淀濃縮，在1.4％瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳，回收在400個(gè)堿基對(duì)范圍內(nèi)的DNA。通過將其連接到載體pMR15.1(圖4)中而克隆該DNA，其中該載體已經(jīng)被BstBI和SplI限制過了。連接之后，將混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌LM 1035，而來源于最終細(xì)菌群體的質(zhì)粒通過用BstBI和SplI消化來篩選插入片段，具有每一種連接的插入片段的代表，進(jìn)一步通過核苷酸測(cè)序分析。
在類似的方法中，在重鏈反應(yīng)庫3中產(chǎn)生的DNA片段是用HindIII和ApaI消化的，并被克隆載體pMR14(圖5)，其中該載體已經(jīng)被HindIII和ApaI限制過了。又，通過核苷酸測(cè)序分析含插入片段的代表性質(zhì)粒。
d)核苷酸序列的分析使用引物R1053(見表5)(其在pMR14的HCMV啟動(dòng)子的3’區(qū)中作為引物)和R720(見表5)(其在人C-γ4的5’區(qū)中作為引物，并通過pMR14上的DNA插入片段測(cè)序)測(cè)序質(zhì)粒DNA，其中該質(zhì)粒DNA來源于許多含Vh插入片段的分離物。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，許多克隆中的Vh插入片段的核苷酸序列除信號(hào)肽和J區(qū)不同外，均是相同的。這表明所檢驗(yàn)的克隆是獨(dú)立的分離物，這是由于在PCR階段，使用了來源于寡核苷酸混合物的不同引物。抗體hTNF40(hTNF40Vh)重鏈可變域的所確定的核苷酸序列和所預(yù)測(cè)的氨基酸序列在圖7(SEQ ID NO100)中列出。
為了分析輕鏈的克隆，檢驗(yàn)了用R1053(見表5)和R684(SEQ IDNO62)(其在人C-κ的5’區(qū)中作為引物，并通過pMR15.1上的DNA插入片段測(cè)序)作為引物所得到的序列。由于在庫2中反應(yīng)，可類似地分析V1基因的核苷酸序列和所預(yù)測(cè)的氨基酸序列。又，人們還發(fā)現(xiàn)許多克隆中的V1插入片段的核苷酸序列除信號(hào)肽和J區(qū)不同之外，均是相同的，這些表明由于在PCR階段使用了來源于寡核苷酸混合物的不同引物，所檢驗(yàn)的克隆是獨(dú)立的分離物?？贵whTNF40(hTNF40V1)輕鏈可變域的確定核苷酸序列和預(yù)測(cè)的氨基酸序列在圖6(SEQ IDNO99)中列出。表1小鼠重鏈5’區(qū)的寡核苷酸引物。CH1 5’ATGAAATGCAGCTGGGTCAT(G，C)TTCTT3’(SEQ ID NO13)CH2 5’ATGGGATGGAGCT(A，G)TATCAT(C，G)(C，T)TCTT3’(SEQ ID NO14)CH3 5’ATGAAG(A，T)TGTGGTTAAACTGGGTTTT3’(SEQ ID NO15)CH4 5’ATG(G，A)ACTTTGGG(T，C)TCAGCTTG(G，A)T3’(SEQ ID NO16)CH5 5’ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTT3’(SEQ ID NO17)CH6 5’ATGGCTGTC(C，T)T(G，A)G(G，C)GCT(G，A)CTCTTCTG3’(SEQ ID NO18)CH7 5’ATGG(G，A)ATGGAGC(G，T)GG(G，A)TCTTT(A，C)TCTT3’(SEQ ID NO19)CH8 5’ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG3’(SEQ ID NO20)CH9 5’ATGG(C，A)TTGGGTGTGGA(A，C)CTTGCTATT3’(SEQ ID NO21)CH105’ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCT3’(SEQ ID NO22)CH115’ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG3’(SEQ ID NO23)CH125’ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCT3’(SEQ ID NO24)上述各引物均具有加入到其5’端的庫列5’GCGCGCAAGCTTGCCGCCACC3’(SEQ ID NO25)表2小鼠輕鏈5’區(qū)的寡核苷酸引物。
CL1 5’ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT3’(SEQ ID NO26)CL2 5’ATGGAG(T，A)CAGACACACTCCTG(T，C)TATGGGT3’(SEQ ID NO27)CL3 5’ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCT3’(SEQ ID NO28)CL4 5’ATGAGG(G，A)CCCCTGCTCAG(A，T)TT(C，T)TTGG3’(SEQ ID NO29)CL5 5’ATGGATTT(T，A)CAGGTGCAGATT(T，A)TCAGCTT3’(SEQ ID NO30)CL5A5’ATGGATTT(T，A)CA(A，G)GTGCAGATT(T，A)TCAGCTT3’(SEQ ID NO31)CL6 5’ATGAGGT(T，G)C(T，C)(T，C)TG(T，C)T(G，C)AG(T，C)T(T，C)CTG(A，G)G3’(SEQID NO32)CL7 5’ATGGGC(T，A)TCAAGATGGAGTCACA3’(SEQ ID NO33)
CL8 5’ATGTGGGGA(T，C)CT(G，T)TTT(T，C)C(A，C)(A，C)TTTTTCAAT3’(SEQ IDNO34)CL9 5’ATGGT(G，A)TCC(T，A)CA(G，C)CTCAGTTCCTT3’(SEQ ID NO35)CL10 5’ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTC3’(SEQ ID NO36)CL11 5’ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTT3’(SEQ ID NO37)CL12A5’ATG(A，G)AGT(T，C)(A，T)CAGACCCAGGTCTT(T，C)(A，G)T3’(SEQ IDNO38)CL12B5’ATGGAGACACATTCTCAGGTCTTTGT3’(SEQ ID NO39)CL13 5’ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTAT3’(SEQ ID NO40)CL14 5’ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTT3’(SEQ ID NO41)CL15 5’ATGAATTTGCCTGTTCATCTCTTGGTGCT3’(SEQ ID NO42)CL16 5’ATGGATTTTCAATTGGTCCTCATCTCCTT3’(SEQ ID NO43)CL17A5’ATGAGGTGCCTA(A，G)CT(C，G)AGTTCCTG(A，G)G3’(SEQ ID NO44)CL17B5’ATGAAGTACTCTGCTCAGTTTCTAGG3’(SEQ ID NO45)CL17C5’ATGAGGCATTCTCTTCAATTCTTGGG3’(SEQ ID NO46)上述各引物均具有加入到其5’端的序列5’GGACTGTTCGAAGCCGCCACC3’(SEQ ID NO47)。表3小鼠Vh和V1基因3’端的寡核苷酸引物。輕鏈(CL12)5’GGATACAGTTGGTGCAGCATCCGTACGTTT3’(SEQ ID NO48)重鏈(R2155)5’GCAGATGGGCCCTTCGTTGAGGCTG(A，C)(A，G)GAGAC(G，T，A)GTGA3’(SEQ ID NO49)表4a)輕鏈PCR反應(yīng)的5’引物混合物庫1CL2庫2CL7庫3CL13庫4CL6庫5CL5A，CL9，CL17A庫6CL8庫7CL12A庫8CL1，CL3，CL4，CL5，CL10，CL11，CL2B，CL14，CL15，CL16，CL17B，CL17Cb)重鏈PCR反應(yīng)的5’引物混合物庫1CH1，CH2，CH3，CH4庫2CH5，CH6，CH7，CH8庫3CH9，CH10，CH11，CH12表5用于核苷酸序列分析的引物R10535’GCTGACAGACTAACAGACTGTTCC3’(SEQ ID NO50)R720 5’GCTCTCGGAGGTGCTCCT3’(SEQ ID NO51)嵌合基因活性的評(píng)估嵌合基因的活性是通過在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，純化它們，并測(cè)定新合成抗體的數(shù)量而評(píng)估的。下面描述其操作方法，及用于抗體生物特性描述的細(xì)胞和生物化學(xué)測(cè)定法。
a)嵌合hTNF40抗體分子的生產(chǎn)用于生物評(píng)估的嵌合抗體是通過使用磷酸鈣沉淀共-轉(zhuǎn)染成中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞之后，瞬時(shí)表達(dá)適當(dāng)?shù)闹劓満洼p鏈對(duì)而生產(chǎn)的。
在轉(zhuǎn)染之前，使半-融合瓶的CHO-L761細(xì)胞接受胰蛋白酶作用，計(jì)算細(xì)胞數(shù)，每個(gè)T75瓶含107個(gè)細(xì)胞。
第二天，在轉(zhuǎn)染之前3個(gè)小時(shí)，改變培養(yǎng)基。為了進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將1.25ml各含50μg重鏈和輕鏈表達(dá)載體的0.25M CaCl2和1.25ml2×HBS(1升水中含16.36g NaCl，11.0g HEPES和0.4g Na2HPO4，并用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.1)混合，并立即加入到細(xì)胞的培養(yǎng)基中制備磷酸鈣沉淀。在37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)后，除去培養(yǎng)基和沉淀，通過在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中加入15ml 15％的甘油1分鐘來振蕩細(xì)胞。除去甘油，用PBS洗該細(xì)胞一次，并在25ml含10mM丁酸鈉的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48-96小時(shí)。通過結(jié)合并從蛋白A-瓊脂糖上洗脫而從培養(yǎng)基純化抗體。
b)ELISA為了進(jìn)行ELISA，用濃度為5μg/ml的多克隆山羊抗-人Fc片段特異性抗體(Jackson Immunoresearch，code 109-006-098)的F(ab)2片段的包被緩沖液(15mM碳酸鈉，35mM碳酸氫鈉，pH6.9)4℃過夜覆蓋Nunc ELISA平板。用蒸餾水清洗5次，除去未包被的抗體。將定量的樣品和純標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至在共軛緩沖液(0.1M Tris-HCl，pH7.0，0.1M NaCl，0.2％v/v Tween 20，0.2％w/v Hammersten酪蛋白)中的濃度約為1μg/ml。以2-倍的稀釋度在微量滴定板中滴定該樣品，使得每個(gè)孔中的最終體積達(dá)到0.1ml，室溫下振蕩培養(yǎng)該平板1小時(shí)。第一次培養(yǎng)后，用蒸餾水清洗該板10次，然后如前所述，用0.1ml，在共軛緩沖液中的稀釋度為1∶700的小鼠單克隆抗-人κ(克隆GD12)過氧化物酶綴合抗體(結(jié)合位點(diǎn)，密碼MP135)培養(yǎng)該板1小時(shí)。再次清洗平板，并向各個(gè)孔中加入底物溶液(0.1ml)。該底物溶液在10ml 0.1M醋酸鈉/檸檬酸鈉中，含150μl N，N，N，N-四甲基聯(lián)苯胺(在DMSO中的濃度為10mg/ml)，150μl過氧化氫(30％的溶液)，pH6.0。使該板展開5-10分鐘，直到630nm處的吸光度相對(duì)于最高標(biāo)準(zhǔn)約為1.0。630nm處的吸光度是使用平板閱讀器測(cè)量的，而樣品的濃度則是通過與標(biāo)準(zhǔn)的滴定曲線相對(duì)照而測(cè)定的。
c)通過BiaCore分析測(cè)定親和力常數(shù)使用BIA技術(shù)調(diào)查研究hTNF40和人TNF之間的結(jié)合相互作用。使用標(biāo)準(zhǔn)的NHS/EDC化學(xué)過程，將hTNF40不變區(qū)的親和純化山羊多克隆抗體固定在葡聚糖聚合物傳感器芯片的表面上。捕獲相對(duì)低水平(200-500RU)的hTNF40，以確保傳質(zhì)效率達(dá)到最小。捕獲的hTNF40越過不同濃度的人TNF，從而評(píng)估締合動(dòng)力學(xué)。注射配位體之后，緩沖液越過該表面，從而測(cè)量解離作用。計(jì)算固相hTNF40和人TNF之間相互作用的締合和解離常數(shù)，得到KD值。實(shí)施例1hTNF40的CDR-移植上面已經(jīng)描述了hTNF40抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的分子克隆，及其用于生產(chǎn)嵌合(小鼠-人)hTNF40抗體的用途。鼠科動(dòng)物hTNF40V1和Vh的核苷酸和氨基酸序列分別在圖6和7(SEQ ID NO99和100)中列出。此實(shí)施例描述hTNF40抗體的CDR-移植。hTNF40輕鏈的CDR-移植hTNF40輕鏈的構(gòu)架區(qū)與四個(gè)人輕鏈亞組的構(gòu)架區(qū)的序列對(duì)比(Kabat等，1991，supra)顯示了hTNF40與人輕鏈的亞組1中的抗體是最類似的。因此，為了構(gòu)造移植了CDR的輕鏈，選擇與人類1組共有序列的那些構(gòu)架區(qū)相對(duì)應(yīng)的構(gòu)架區(qū)。
鼠科動(dòng)物hTNF40構(gòu)架區(qū)與共有序列人類1組輕鏈的氨基酸序列的對(duì)比在圖1中列出，其顯示兩個(gè)序列之間有22個(gè)不同之處(下面劃線的部分)。就這些構(gòu)架的任一不同之處對(duì)于抗原結(jié)合的貢獻(xiàn)進(jìn)行分析，確定了2個(gè)用于研究的殘基，它們位于46和60位。根據(jù)此分析構(gòu)造了兩個(gè)移植了CDR的輕鏈的譯本。第一個(gè)是hTNF40-gL1(SEQ IDNO8)，殘基46和60來源于hTNF40的輕鏈，而第二個(gè)是hTNF40-gL2(SEQ ID NO9)，除了60號(hào)殘基之外，所有殘基均是人的共有序列，而60號(hào)殘基則來源于hTNF40的輕鏈。移植了CDR的輕鏈hTNF40-gL1的結(jié)構(gòu)hTNF40-gL1的結(jié)構(gòu)在下面詳細(xì)給出。將下列重疊的寡核苷酸(P7982-P7986)用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中，從而裝配出截短的移植輕鏈。所評(píng)估的片段缺少抗體前導(dǎo)序列和構(gòu)架1開始的17個(gè)氨基酸。
寡1 P79825’GAATTCAGGGTCACCATCACTTGTAAAGCCAGTCAGAACGTAGGTACTAACGTAGCCTGGTATCAGCAAA3’(SEQ ID NO52)寡2 P79835’ATAGAGGAAAGAGGCACTGTAGATGAGGGCTTTTGGGGCTTTACCTGGTTTTTGCTGATACCAGGCTACGT3’(SEQ ID NO53)寡3 P79845’TACAGTGCCTCTTTCCTCTATAGTGGTGTACCATACAGGTTCAGCGGATCCGGTAGTGGTACTGATTTCAC3’(SEQ ID NO54)寡4 P79855’GACAGTAATAAGTGGCGAAATCTTCTGGCTGGAGGCTACTGATCGTGAGGGTGAAATCAGTACCACTACCG3’(SEQ ID NO55)寡5 P79865’ATTTCGCCACTTATTACTGTCAACAGTATAACATCTACCCACTCACATTCGGTCAGGGTACTAAAGTAGAAATCAAACGTACGGAATTC3’(SEQ ID NO56)Fwd P79815’GAATTCAGGGTCACCATCACTTGTAAAGCC3’(SEQ ID NO57)Bwd P79805’GAATTCCGTACGTTTGATTTCTACTTTAGT3’(SEQ ID NO58)，制備100μl的PCR反應(yīng)物，其包含10mM Tris-HCl pH8.3，1.5mMMgCl2，50mM KCl，0.01％w/v明膠，0.25mM脫氧核糖核苷三磷酸鹽，2pmoles的P7982，P7983，P7984，P7985，P7986，10pmoles的P7980，P7981和1個(gè)單位的Taq聚合酶。該反應(yīng)在94℃循環(huán)1分鐘，55℃循環(huán)1分鐘，72℃循環(huán)1分鐘。30次循環(huán)之后，通過在瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳而分析各反應(yīng)物，從凝膠上切除PCR片段，并用Mermaid試劑盒回收。在適當(dāng)?shù)木彌_液中用BstEII和SplI酶限制回收的片段。最后，使最終的產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖膠電泳，從凝膠切片回收270個(gè)堿基對(duì)DNA片段，并將其連接到載體CTIL5-gL6(圖12)中，該載體已經(jīng)預(yù)先用相同的酶消化過了。上述載體提供缺失抗體前導(dǎo)序列和構(gòu)架1開始的17個(gè)氨基酸。
該連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株LM1035及通過PCR分析得到的克隆，限制酶消化和核苷酸測(cè)序。hTNF40-gL1的V1區(qū)的核苷酸和氨基酸序列在圖8中列出(SEQ ID NO8)。移植了CDR的輕鏈hTNF40-gL2的結(jié)構(gòu)使用PCR構(gòu)造hTNF40-gL2(SEQ ID NO9)。下列寡核苷酸用于引入氨基酸變化。
R10535’GCTGACAGACTAACAGACTGTTCC3’(SEQ ID NO59)R53505’TCTAGATGGCACACCATCTGCTAAGTTTGATGCAGCATAGATCAGGAGCTTAGGAGC3’(SEQ ID NO60)R53495’GCAGATGGTGTGCCATCTAGATTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGACTTTACCCTAAC3’(SEQ ID NO61)R684 5’TTCAACTGCTCATCAGAT3’(SEQ ID NO62)制備各20μl的兩個(gè)反應(yīng)物，每個(gè)均包含10mM Tris-HCl pH8.3，1.5mM MgCl2，50mM KCl，0.01％w/v明膠，0.25mM脫氧核糖核苷三磷酸鹽，0.1μg hTNF40-gL1，6pmoles的R1053/R5350或R5349/R684和0.25個(gè)單位的Taq聚合酶。該反應(yīng)在94℃循環(huán)1分鐘，55℃循環(huán)1分鐘，72℃循環(huán)1分鐘。30次循環(huán)之后，通過在瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳而分析各反應(yīng)物，并從凝膠切除PCR片段，然后用Mermaid試劑盒回收。
使這些反應(yīng)物的等分試樣經(jīng)歷第二個(gè)PCR循環(huán)。100μl該反應(yīng)物含10mM Tris-HCl pH8.3，1.5mM MgCl2，50mM KCl，0.01％w/v明膠，1/5來源于第一組反應(yīng)的各PCR片段，30pmoles的R1053和R684，和2.5個(gè)單位的Taq聚合酶。反應(yīng)溫度如上所述。PCR之后，先用苯酚/氯仿提取該混合物，然后用氯仿提取，并用乙醇沉淀。通過離心回收乙醇沉淀，將其溶解在適當(dāng)?shù)木彌_液中，并用BstEII和SplI酶限制。最后，使最終的產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖膠電泳，從凝膠切片回收270個(gè)堿基對(duì)DNA片段，并使其連接到載體pMR15.1(圖4)中，該載體已經(jīng)預(yù)先用相同的酶消化了。
該連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株LM1035及通過PCR分析的最終群體，限制酶消化和核苷酸測(cè)序。HTNF40-g1L2的V1區(qū)的核苷酸和氨基酸序列在圖9中列出(SEQ ID NO9)。HTNF40重鏈的CDR-移植hTNF40重鏈的CDR-移植是使用與輕鏈相同的策略完成的。hTNF40重鏈與屬于1亞組的人重鏈最類似，因此選擇人亞組1構(gòu)架的共有序列來接受hTNF40重鏈的CDR。
為了調(diào)查研究同源的人構(gòu)架充當(dāng)CDR移植的受體構(gòu)架的要求，選擇第二個(gè)構(gòu)架，人類3組從而使hTNF40重鏈人源化。
hTNF40與兩個(gè)不同構(gòu)架區(qū)的對(duì)比在圖2中列出，從中可看出hTNF40與32位(下面劃線的部分)的人1亞組共有序列不同，與40位的人3亞組共有序列不同(下面劃線的部分)。在分析任一結(jié)果之后，可知使用1組構(gòu)架將殘基28，38，46，67和71作為供體保留在移植了CDR的重鏈gh1hTNF40.1，從而可使抗原結(jié)合。使用3組構(gòu)架將殘基27，28，30，48，49，69，71，73，76和78作為供體保留在移植了CDR的重鏈，gh3hTNF40.4中。使用1組構(gòu)架將殘基28，69和71作為供體保留在移植了CDR的重鏈，gh1hTNF40.4中。移植了CDR的重鏈gh1hTNF40.4的結(jié)構(gòu)gh1hTNF40.4(SEQ ID NO10)是在有適當(dāng)引物參與的情況下，通過使重疊的寡核苷酸經(jīng)歷PCR而裝配的。下列寡核苷酸用于PCR中1組移植物寡1 P79895’GAAGCACCAGGCTTCTTAACCTCTGCTCCTGACTGGACCAGCTGCACCTGAGAGTGCACGAATTC3’(SEQ ID NO63)寡2 P79905’GGTTAAGAAGCCTGGTGCTTCCGTCAAAGTTTCGTGTAAGGCCTCAGGCTACGTGTTCACAGACATGGTA3’(SEQ ID NO64)寡3 P79915’CCAACCCATCCATTTCAGGCCTTGTCCCGGGGCCTGCTTGACCCAATTCATACCATAGTCTGTGAACACGT3’(SEQ ID NO65)寡4 P79955’GGCCTGAAATGGATGGGTTGGATTAATACTTACATTGGAGAGCCTATTTATGTTGACGACTTCAAGGGCAGATTCACGTTC3’(SEQ ID NO66)寡5 P79925’CCATGTATGCAGTGCGTTGTGGAGGTGTCTAGAGTGAACGTGAATCTGCCCTTGAA3’(SEQ ID NO67)寡6 P79935’CCACAAGCACTGCATACATGGAGCTGTCATCTCTGAGATCCGAGGACACCGCAGTGTACTAT3’(SEQ ID NO68)寡7 P79945’GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCATGGCATAAGATCTGTATCCTCTAGCACAATAGTACACTGCGGTGTCCTC3’(SEQ ID NO69)FwdP79885’GAATTCGTGCACTCTCAGGTGCAGCTGGTC3’(SEQ ID NO70)Bwd P79875’GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCAT3’(SEQ ID NO71)類似的100μl反應(yīng)物含10mM Tris-HCl pH8.3，1.5mM MgCl2，50mMKCl，0.01％w/v明膠，0.25mM脫氧核糖核苷三磷酸鹽，2pmoles的P7989，P7990，P7991，P7995，P7992，P7993和P7994，10pmoles的P7988，P7987和1個(gè)單位的Taq聚合酶。反應(yīng)在94℃循環(huán)1分鐘，55℃循環(huán)1分鐘，72℃循環(huán)1分鐘。30次循環(huán)之后，先用苯酚/氯仿(1/1)提取反應(yīng)物，然后用氯仿提取，并用乙醇沉淀。離心之后，將DNA溶解在適當(dāng)?shù)南拗凭彌_液中，并用ApaLI和KpnI消化。從瓊脂糖膠分離最終的片段，并將其連接到pMR14(圖5)中，該載體已經(jīng)預(yù)先用相同的酶消化過了。當(dāng)用ApaLI和KpnI使pMR14裂開時(shí)，pMR14包含人γ4重鏈不變區(qū)，該裂開的載體可接收消化的DNA，這樣所消化DNA的3’端在讀框中與編碼γ4不變區(qū)序列的5’端相連接。因此，從此載體表達(dá)的重鏈?zhǔn)铅?的同型。該連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株LM1035，并通過限制消化及核苷酸序列分析篩選最終的細(xì)菌群體。在此方法中，鑒定了含gh1hTNF40.4(圖10)(SEQ ID NO10)正確序列的質(zhì)粒。移植了CDR的重鏈gh3hTNF40.4的結(jié)構(gòu)gh3hTNF40.4(SEQ ID NO11)是在有適當(dāng)引物參與的情況下，通過使重疊的寡核苷酸經(jīng)歷PCR而裝配的。下列寡核苷酸用于PCR中3組移植物寡1 P79995’GATCCGCCAGGCTGCACGAGACCGCCTCCTGACTCGACCAGCTGAACCTCAGAGTGCACGAATTC3’(SEQ ID NO72)寡2 P80005’TCTCGTGCAGCCTGGCGGATCGCTGAGATTGTCCTGTGCTGCATCTGGTTACGTCTTCACAGACTATGGAA3’(SEQ ID NO73)寡3 P80015’CCAACCCATCCATTTCAGGCCCTTTCCCGGGGCCTGCTTAACCCAATTCATTCCATAGTCTGTGAAGACGT3’(SEQ ID NO74)寡4 P79955’GGCCTGAAATGGATGGGTTGGATTAATACTTACATTGGAGAGCCTATTTATGTTGACGACTTCAAGGGCAGATTCACGTTC3’(SEQ ID NO66)寡5 P79975’GGAGGTATGCTGTTGACTTGGATGTGTCTAGAGAGAACGTGAATCTGCCCTTGAA3’(SEQ ID NO75)寡6 P79985’CCAAGTCAACAGCATACCTCCAAATGAATAGCCTGAGAGCAGAGGACACCGCAGTGTACTAT3’(SEQ ID NO76)寡7 P79935’GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCATGGCATAAGATCTGTATCCTCTAGCACAATAGTACACTGCGGTGTCCTC3’(SEQ ID NO77)Fwd P79965’GAATTCGTGCACTCTGAGGTTCAGCTGGTC3’(SEQ ID NO78)Bwd P79875’GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCAT3’(SEQ ID NO71)100μl的裝配反應(yīng)物含10mM Tris-HCl pH8.3，1.5mM MgCl2，50mMKCl，0.01％w/v明膠，0.25mM脫氧核糖核苷三磷酸鹽，2pmoles的P7999，P8000，P8001，P7995，P7997，P7998和P7993，10pmoles的P7996，P7987和1個(gè)單位的Taq聚合酶。反應(yīng)在94℃循環(huán)1分鐘，55℃循環(huán)1分鐘，72℃循環(huán)1分鐘。30次循環(huán)之后，先用苯酚/氯仿(1/1)提取反應(yīng)物，然后用氯仿提取，并用乙醇沉淀。離心之后，將DNA溶解在適當(dāng)?shù)南拗凭彌_液中，并用ApaLI和KpnI消化。從瓊脂糖膠上分離最終的片段，并將其連接在pMR14(圖5)中，該載體已經(jīng)預(yù)先用相同的酶消化過了。pMR14包含人γ4重鏈不變區(qū)。當(dāng)用ApaLI和KpnI使pMR14裂開時(shí)，該裂開的載體可接收消化的DNA，這樣所消化DNA的3’端在讀框中與編碼γ4不變區(qū)序列的5’端相連接。因此，從此載體表達(dá)的重鏈?zhǔn)铅?的同型。該連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株LM1035，并通過限制消化和核苷酸序列分析篩選最終的細(xì)菌群體。在此方法中，鑒定了含gh3hTNF40.4(SEQ ID NO11)(圖11)正確序列的質(zhì)粒。移植了CDR的修飾Fab片段的生產(chǎn)使用大腸桿菌載體pTTO-1構(gòu)造基于抗體hTNF40的，移植了CDR的修飾Fab片段。將抗體hTNF40的可變區(qū)亞-克隆此載體，優(yōu)化基因間的序列以制造pTTO(CDP870)。該pTTO表達(dá)載體引起可溶的，重組蛋白在大腸桿菌中的胞質(zhì)積累。此質(zhì)粒的主要特征是(i)四環(huán)素抗性標(biāo)記-沒有被抗性基因產(chǎn)物滅活的抗生素，因此保持了對(duì)含質(zhì)粒細(xì)胞的選擇；(ii)低拷貝數(shù)-來源于質(zhì)粒p15A的復(fù)制源，其適合含co1E1的質(zhì)粒，其中co1E1得自復(fù)制子；(iii)用于轉(zhuǎn)錄克隆基因的較強(qiáng)的，誘導(dǎo)tac啟動(dòng)子；(iv)lacIq基因-提供lac阻遏蛋白的基本表達(dá)，保持阻抑狀態(tài)中的tac啟動(dòng)子，直到用IPTG/異乳糖誘導(dǎo)；(v)OmpA信號(hào)序列-提供克隆基因的胞質(zhì)分泌；和(vi)OmpA信號(hào)序列至短lacZ肽的翻譯偶聯(lián)，可有效的引發(fā)翻譯。
該載體用于從雙順反子信息表達(dá)修飾的Fab片段，以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)從一系列目標(biāo)-建立的彈夾選擇最佳的基因間序列。還描述了其在構(gòu)造pTTO(CDP870)中的應(yīng)用。材料和方法DNA技術(shù)用于此方案的標(biāo)準(zhǔn)方法包括DNA限制，瓊脂糖膠電泳，連接和轉(zhuǎn)化。限制酶和DNA修飾酶是從New England Biolabs或BoehringerMannheim得到的，并根據(jù)供應(yīng)商的建議使用。使用GeneClean方案(BIO101)從瓊脂糖純化DNA片段。寡核苷酸是由Oswel OligonucleotideService提供的，并在40nm的等級(jí)合成。使用Qiagen的質(zhì)粒DNAMini/Midi試劑盒分離質(zhì)粒DNA。使用推薦的Perkin Elmer‘Amplitaq’進(jìn)行PCR。使用應(yīng)用生物系統(tǒng)Taq循環(huán)測(cè)序試劑盒進(jìn)行DNA測(cè)序。搖瓶誘導(dǎo)大腸桿菌W3110培養(yǎng)物是在添加了四環(huán)素(7.5μg/ml)的L-肉湯中生長的。為了進(jìn)行誘導(dǎo)，在2L帶擋板搖瓶的200mL的L-肉湯中，將新鮮的隔夜培養(yǎng)物(在30℃生長)稀釋成0.1的OD600，并在30℃的軌道培養(yǎng)箱中生長。加入200μM，0.5的OD600的IPTG。間隔采集樣品(相對(duì)于OD標(biāo)準(zhǔn)化的)。胞質(zhì)提取物在冰上冷凍培養(yǎng)樣品(5分鐘)，然后通過離心采集細(xì)胞。在提取緩沖液(100mM Tris.HCl，10mM EDTA，pH7.4)中重混懸后，30℃過夜培養(yǎng)該樣品，然后通過離心使其澄清。裝配試驗(yàn)修飾Fab的濃度是通過ELISA測(cè)定的。用抗-人Fd 6045(2μg/ml的包被緩沖液，生理鹽水，每個(gè)孔100μl)4℃過夜覆蓋平板。清洗后，每個(gè)孔裝入100μl的樣品；將最初為2μg/ml的純化A5B7γ-1 Fab’用作標(biāo)準(zhǔn)樣品。越過平板在樣品共軛緩沖液(每升6.05g三氨基甲烷；2.92g NaCl；0.1ml Tween-20；1ml酪蛋白(0.2％))中連續(xù)稀釋2-倍；室溫下攪拌培養(yǎng)平板1小時(shí)。清洗并干燥平板，然后加入100μl的抗-人C-κ(GD12)-過氧化物酶(在樣品共軛緩沖液中稀釋)。室溫下攪拌培養(yǎng)1小時(shí)。清洗并干燥平板，然后加入100μl的底物溶液(10ml醋酸鈉/檸檬酸鈉溶液(0.1M pH6))；100μl的H2O2溶液；100μl的四甲基聯(lián)苯胺溶液(10mg/ml的二甲基sulphoxide)。加入底物后，讀4-6分鐘630nm處的吸光度。質(zhì)粒pTTO-1的結(jié)構(gòu)(a)pTTQ9多接頭的置換質(zhì)粒pTTQ9是從Amersham獲得的，并在圖14中列出。用限制酶SalI和EcoRI消化等分試樣(2μg)，該消化是在1％瓊脂糖膠上進(jìn)行的，純化大的DNA片段(4520bp)。當(dāng)共同退火時(shí)，合成兩個(gè)寡核苷酸，其編碼圖15所示的OmpA多接頭區(qū)。此序列具有粘性末端，其與由pTTQ9限制所產(chǎn)生的SalI和EcoRI相一致。通過把此寡核苷酸“彈夾”克隆pTTQ9載體，SalI位點(diǎn)沒有再生，但保留了EcoRI位點(diǎn)。該彈夾編碼在OmpA基因的Shine Dalgarno核糖體結(jié)合位點(diǎn)前加上的，大腸桿菌外-膜蛋白Omp-A的信號(hào)序列的前13個(gè)氨基酸。另外，存在XabI，MunI，StyI和SplI酶的限制位點(diǎn)。MunI和StyI位點(diǎn)位于OmpA信號(hào)序列的編碼區(qū)內(nèi)，并將作為基因插入的5’克隆位點(diǎn)。組成此彈夾的兩個(gè)寡核苷酸通過在5pmoles/μl的濃度混合，并在水浴中加熱至95℃3分鐘而共同退火，然后緩慢冷卻至室溫。將退火的序列連接到SalI/EcoRI半裂pTTQ9中。最終的質(zhì)粒中間體，稱作pTQOmp，是通過DNA測(cè)序加以證實(shí)的。(b)片段的制備和連接質(zhì)粒pTTO-1是通過將來源于質(zhì)粒pACYC184的一個(gè)DNA片段與來源于pTQOmp的兩個(gè)片段連接而成的。質(zhì)粒pACYC184從New EnglandBiolabs得到，限制性酶切圖在圖16中給出。消化等分試樣(2μg)以包括限制酶StyI，然后用綠豆核酸酶處理；通過切掉后面的5’堿基突出端而產(chǎn)生平端。苯酚提取和乙醇沉淀之后，用酶PvuII限制該DNA，產(chǎn)生2348，1081，412和403bp的片段。2348bp的片段是在進(jìn)行瓊脂糖膠電泳后純化的。此片段編碼四環(huán)素抗性標(biāo)記和p15A的復(fù)制源。然后用小牛小腸堿性磷酸酶處理該片段，以除去5’端的磷酸鹽，從而防止此分子的自身連接作用。
用酶SspI和EcoRI消化質(zhì)粒pTQOmp的等分試樣(2μg)，進(jìn)行瓊脂糖膠電泳后，從不需要的2040bp和170bp的片段純化2350bp的片段；此片段編碼轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)和lacIq基因。用EcoRI和XmnI消化pTQOmp的另一個(gè)等分試樣，產(chǎn)生2289，1670，350和250bp的片段。凝膠純化該編碼tac啟動(dòng)子，OmpA信號(hào)序列和多克隆位點(diǎn)的350bp的片段。
然后使用約等量的各片段連接上述三個(gè)片段，以產(chǎn)生質(zhì)粒pTTO-1。所有的克隆連接均是通過DNA測(cè)序加以證實(shí)的。此質(zhì)粒的限制性酶切圖在圖17中給出。然后通過插入編碼人Ig輕鏈κ不變域的DNA而生產(chǎn)質(zhì)粒pTTO-2。其作為SplI-EcoRI的限制片段，是從質(zhì)粒pHC132得到的，并被插入到pTTO-1的相應(yīng)位點(diǎn)中。質(zhì)粒pTTO-2在圖18中列出。將人源化的hTNF40可變區(qū)插入到pTTO-2中可變輕鏈區(qū)hTNF40gL1(SEQ ID NO8)是通過PCR從哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)pMR10.1的相應(yīng)載體‘拯救’得到的。OmpA的前導(dǎo)序列代替天然的Ig前導(dǎo)序列。PCR引物的序列如下所示5’引物CGCGCGGCAATTGCAGTGGCCTTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAAGCTGACATTCAAATGACCCAGAGCCC(SEQ ID NO79)3’引物TTCAACTGCTCATCAGATGG(SEQ ID NO80)在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行PCR后，純化產(chǎn)物，用MunI和SplI酶消化，然后進(jìn)行凝膠純化。將純化的片段插入到pTTO-2的MunI/SplI位點(diǎn)中，以產(chǎn)生輕鏈中間體pTTO(hTNF40L)。
gh3hTNF40.4的可變重鏈區(qū)是用相同的方法從載體pγ-4獲得的。PCR引物的序列如下所示5’引物
GCTATCGCAATTGCAGTGGCGCTAGCTGGTTTCGCCACCGTGGCGCAAGCTGAGGTTCAGCTGGTCGAGTCAGGAGGC(SEQ ID NO81)3’引物GCCTGAGTTCCACGACAC(SEQ ID NO82)進(jìn)行PCR后，純化產(chǎn)物，用NheI和ApaI酶消化，然后將其亞-克隆載體pDNAbEng-G1(圖19)。通過DNA測(cè)序加以證實(shí)后，用EcoRI酶限制重鏈，并將其亞-克隆pTTO(hTNF40L)的EcoRI位點(diǎn)，以生產(chǎn)大腸桿菌的表達(dá)質(zhì)粒pTTO(hTNF40)。修飾Fab表達(dá)的基因間序列的優(yōu)化在pTTO載體中，修飾的Fab表達(dá)是從先編碼輕鏈然后編碼重鏈的雙順反子信息發(fā)生的。兩個(gè)基因(基因間的序列，IGS)間的DNA序列可通過影響轉(zhuǎn)錄的起始速率而影響重鏈的表達(dá)水平。例如，短的基因間序列可導(dǎo)致輕鏈和重鏈間的轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)，其中在完成輕鏈合成之后，引發(fā)重鏈合成之前，翻譯核糖體不可能完全與mRNA分離。任一Shine Dalgarno(SD)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(與16S rRNA同源)的‘強(qiáng)度’還可影響SD和ATG起始密碼子之間的距離和序列組成。ATG周圍的mRNA的潛在二級(jí)結(jié)構(gòu)是另一個(gè)重要的因素；當(dāng)反向用于SD時(shí)，ATG應(yīng)位于‘環(huán)’中，而不應(yīng)被限制在‘莖區(qū)’中。因而通過改進(jìn)IGS的長度和組成，可修飾轉(zhuǎn)錄起始的長度，和重鏈的生產(chǎn)水平。很可能需獲得轉(zhuǎn)錄起始的最佳速率，以使所提供修飾Fab重鏈的表達(dá)達(dá)到最大值。例如，具有一個(gè)修飾的Fab，可容許高水平的表達(dá)，但對(duì)于具有不同氨基酸序列的不同修飾Fab來說，高水平的表達(dá)可能是有毒的，這可能是由于不同的分泌或折疊效率。由于這個(gè)原因，設(shè)計(jì)了一系列4個(gè)基因間序列(圖20)，可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定基于hTNF40的修飾的Fab的最佳IGS。IGS1和IGS2具有非常短的基因間序列(分別-1和+1)，可提供緊密偶聯(lián)的翻譯；SD序列(下面劃線的部分)稍有不同。這兩個(gè)序列最可能提供高水平的轉(zhuǎn)錄起始。IGS3和IGS4在起始和終止密碼子(+13)之間具有較長的距離，且與它們的組成不同；IGS3具有‘較強(qiáng)’的SD序列。研究所有序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)(使用m/fold程序)并盡可能地使其優(yōu)化；然而，隨著兩個(gè)鏈翻譯的緊密偶聯(lián)，核糖體解離的缺少意味著mRNA可以不是裸露的，防止二級(jí)結(jié)構(gòu)形成。IGS變體的克隆圖20所示的IGS彈夾具有側(cè)面SacI和MunI克隆位點(diǎn)。它們是通過退火互補(bǔ)的寡核苷酸對(duì)而建立的。載體片段是通過用SacI和NotI消化pTTO(hTNF40)而制備的，重鏈片段是通過用MunI和NotI消化pDNAbEngG1(hTNF40H)而制備的。然后使用兩個(gè)等量的限制片段，和各約0.05pmoles的退火寡彈夾進(jìn)行三交連。其產(chǎn)生四個(gè)表達(dá)質(zhì)粒pTTO(hTNF40 IGS-1)，pTTO(hTNF40 IGS-2)，pTTO(hTNF40 IGS-3)，pTTO(hTNF40 IGS-4)。搖瓶表達(dá)分析將上述四個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株W3110，和原始的表達(dá)構(gòu)造，然后分析搖瓶中的表達(dá)。代表性試驗(yàn)的結(jié)果在圖21中列出。不同的基因間序列提供不同的表達(dá)分布。在誘導(dǎo)后1小時(shí)，IGS1和IGS2迅速積累胞質(zhì)的修飾Fab至最大值，之后水平又降低。IGS1的最大值更大，并更急劇地降低。如所期望的這些結(jié)構(gòu)的緊密翻譯偶聯(lián)，這些結(jié)果與高水平的合成一致。IGS1較之IGS2明顯提供較高水平的重鏈表達(dá)。在這個(gè)實(shí)施例中，在1小時(shí)的峰值之后，因?yàn)榘|(zhì)表達(dá)水平降低，所容許的高水平表達(dá)較差。這可在IGS1培養(yǎng)物(未標(biāo)出)的生長分布中見到，下降之前，其在誘導(dǎo)后1小時(shí)達(dá)到峰值，表明細(xì)胞死亡并溶解。在水平降低之前，IGS3更緩慢地累積修飾Fab，其在誘導(dǎo)后2小時(shí)達(dá)到峰值，但峰值更高(325ng/ml/OD)。此培養(yǎng)物的生長在誘導(dǎo)后又繼續(xù)了3個(gè)小時(shí)，并達(dá)到更高的峰值生物量(未標(biāo)出)。其與低水平的重鏈合成相一致。IGS4仍然以較低的速率積累材料，但與其他三個(gè)結(jié)構(gòu)相比，其不能達(dá)到其它3個(gè)結(jié)構(gòu)的峰值產(chǎn)率。所有IGS變體均顯著out-完成原始載體。有關(guān)不同的IGS序列提供不同的翻譯初始速率的假設(shè)是通過這些試驗(yàn)結(jié)果支持的。對(duì)于hTNF40-修飾的Fab來說，似乎高速率的重鏈翻譯初始耐受較差，因此其不是最佳的。IGS3提供的較低速率產(chǎn)生較好的生長特性，和超時(shí)的較好的產(chǎn)率累積。
對(duì)比發(fā)酵罐中的產(chǎn)率，IGS3結(jié)構(gòu)的產(chǎn)率最高，并將其稱為pTTO(CDP870)-見圖22。
由質(zhì)粒pTTO(CDP870)編碼的重鏈具有SEQ ID NO115所列的序列，輕鏈具有SEQ ID NO113所列的序列。移植了CDR的，hTNF40基-修飾Fab的PEG化作用純化的修飾Fab與支鏈的PEG分子位點(diǎn)-特異性綴合。其可以通過活化修飾Fab的截短鉸鏈區(qū)中的單一半胱氨酸殘基，接著按照上述(A.P.Chapman等，nature Biotechnology 17，780-783，1999)與(PEG)-賴氨酰馬來酰亞胺反應(yīng)而獲得。該P(yáng)EG化的分子在圖13中列出，并將其稱為化合物CDP870。PEG化的移植了CDR的，hTNF40基修飾Fab(CDP870)在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的功效。
CDP870具有約11天的較長半衰期。
我們?cè)u(píng)估了靜脈內(nèi)CDP870在患RA患者的隨機(jī)，雙盲，安慰劑-對(duì)照，給藥逐漸升高試驗(yàn)中的安全性和功效。方法患者患者的年齡在18-75步之間，滿足1987年修訂的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的American College of Rheumatology(ACR)診斷標(biāo)準(zhǔn)，上述患者是從位于倫敦，劍橋，諾福克和Norwich(英國)的風(fēng)濕病診所的門診病人中征募的。要求患者具有由至少3個(gè)下列標(biāo)準(zhǔn)定義的臨床活性疾病≥6個(gè)疼痛或觸痛的關(guān)節(jié)；≥45分鐘的早晨的強(qiáng)直；及血沉速率(ESR)≥28mm/hr。它們必須至少對(duì)一種疾病改善抗-類風(fēng)濕藥物(DRARD)沒有良好的反應(yīng)，且至少已經(jīng)4周沒有治療。如果潑尼松龍的給藥劑量≥7.5mg/day，則可以給皮質(zhì)類固醇。懷孕的婦女，哺乳的婦女和未使用有效的避孕方法，可能分娩的婦女被排除在外。具有惡性腫瘤既往史，伴發(fā)嚴(yán)重的不可控制的內(nèi)科病癥，TNFα-中和治療失敗的既往史，或?qū)垡叶歼^敏的患者被排除在外。書面提供的同意書是在登記之前從各患者處得到的。該研究由地方研究倫理委員會(huì)證實(shí)。治療方案將36名RA患者分成3組，每位患者均接受給藥劑量逐漸增加的試驗(yàn)藥物(1，5或20mg/kg)。把每組的12個(gè)人隨機(jī)的分成8個(gè)人接受CDP870，4個(gè)人接受安慰劑。靜脈內(nèi)單獨(dú)輸注CDP870(總量100ml)超過60分鐘。類似地，將100ml安慰劑(醋酸鈉緩沖液)靜脈內(nèi)單獨(dú)輸注超過60分鐘。在門診病人的基礎(chǔ)上提供治療。8周之后，所有的患者均有機(jī)會(huì)開放地接受5或20mg/kg的CDP870的輸注。臨床評(píng)估根據(jù)世界衛(wèi)生組織和International League of Associations forRheumatology(Boers等，J.Rheumatol-Supplement，41，86-89，1994)和European League Against Rheumatism(EULAR)(Scott等，Clin.Exp.Rheumatol.，10，521-525，1992)用28個(gè)關(guān)節(jié)計(jì)數(shù)組合的核心數(shù)據(jù)評(píng)估RA的疾病活動(dòng)性。通過疾病活動(dòng)性值(Prevoo等，Arthritis Rheum.，38，44-48，1995)和ACR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)(Felson等，Arthritis Rheum.，38，727-735，1995)評(píng)估疾病活動(dòng)性的變化。在治療前和治療后的第1，2，4，6和8周進(jìn)行評(píng)估。而且還評(píng)估患者對(duì)所研究藥物的耐受性和安全性。并且評(píng)估了Haematology，生物化學(xué)，抗-CDP870抗體和不利事件。CDP870的血漿濃度和抗-CDP870的抗體CDP870是通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)量的。在用重組人TNFα(Strathmann Biotech GmbH，Hannover)包被的微量滴定平板(Nunc)中培養(yǎng)患者血漿的連續(xù)稀釋液。用辣根過氧化物酶綴合的山羊抗-人κ輕鏈(Cappel，ICN)，和四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物顯示捕獲的CDP870。
使用生物素化的CDP870作為第二層的雙抗原夾層ELISA篩選CDP870的抗體(1/10的血漿稀釋度)。使用HRP-鏈霉抗生物素和TMB底物顯示束縛抗體。使用超免疫兔IgG標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)該測(cè)定法。1個(gè)單位的活動(dòng)性等于1μg兔的標(biāo)準(zhǔn)。統(tǒng)計(jì)分析該研究實(shí)質(zhì)上是探察性的，樣品的多少是根據(jù)先前相似藥劑的經(jīng)驗(yàn)而確定的。CDP870的功效可通過計(jì)算疾病活動(dòng)性值(DAS)和ACR20/50來分析，其使用閉合的試驗(yàn)方法治療。疾病的活動(dòng)性值是按照下列公式計(jì)算的DAS＝0.555x(28個(gè)觸痛關(guān)節(jié))的平方根+0.284x(28個(gè)腫脹關(guān)節(jié))的平方根+0.7xIn(ESR)+0.0142x(患者的綜合評(píng)估)。首先，將活性組與安慰劑組進(jìn)行對(duì)比。如果此對(duì)比在5％水平是顯著的，則將各給藥組與安慰劑組對(duì)比。所有的對(duì)比是雙尾的具有5％顯著水平的。所有的P值均來源于探察性的分析，且不應(yīng)用于推論解釋。結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)征募36個(gè)患RA的患者。它們的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)在表6中給出。平均年齡56歲，30名患者為女性?；糝A的平均時(shí)間為13年，21名患者的類風(fēng)濕因子顯陽性。不同組的患者具有相似的統(tǒng)計(jì)特性。在盲給藥時(shí)，6/12用安慰劑治療的患者因?yàn)榻o藥后RA≥4，疾病惡化而退出本研究。2/24用CDP870治療的患者退出，均為1mg/kg組的，其在給藥之后＞4周，RA惡化。其差值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的(p＝0.009，F(xiàn)isher精確試驗(yàn))。表6統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)性別 年齡 疾病的類風(fēng)濕因子 以前DMARD數(shù)(MF)持續(xù)時(shí)間 的數(shù)安慰劑 12 1.11 51±8 12±8 8(67％) 5±11mg/kg 817 59±4 12±7 4(50％) 4±15mg/kg 826 54±13 13±5 5(63％) 5±220mg/kg 82.6 61±11 14±13 4(50％) 4±2臨床功效在給安慰劑，1，5和20mg/kg的CDP870(聯(lián)合治療效果p＝0.012)之后第4周，ACR20提高的患者的比例分別為16.7，50，87.5和62.5％，給藥后第8周的比例分別為16.7，25，75和75％(p＝0.032)。在給安慰劑，1，5和20mg/kg的CDP870(聯(lián)合治療效果p＝0.001)之后第4周，DAS值(中值)降低的比例分別為0.15，1.14，1.91和1.95％，給藥后第8周的比例分別為0.31，0.09，2.09和1.76％(p＝0.008)(圖23)。世界衛(wèi)生組織和International League of Associations forRheumatology各成員核心數(shù)據(jù)值的改變?cè)趫D24中列出。
給予CDP870的開放標(biāo)記劑量后，可獲得相似的有益效果。上述36個(gè)該研究招募的患者，其中的32個(gè)患者接受CDP870的第二次輸注。第一次輸注5和20mg/kg CDP后第4周，ACR20提高的患者的比例為72.2和55.6％，在第8周后為55.6和66.7％。不利的結(jié)果該治療可較好地耐受，且沒有與輸注相關(guān)的反應(yīng)產(chǎn)生。沒有關(guān)于變態(tài)反應(yīng)或皮疹的報(bào)道。在雙-盲階段，在安慰劑，1，5和20mg/kg組中分別有19，38，8和14個(gè)不利事件。最普遍的是5個(gè)患者中有9次頭痛發(fā)作(安慰劑組1個(gè)，1mg/kg組3個(gè)，20mg/kg組1個(gè))。一個(gè)接受安慰劑的患者和三個(gè)接受CDP870的患者(1個(gè)為5mg/kg，2個(gè)為20mg/kg)有較弱的呼吸道感染。據(jù)報(bào)道這些為輕度或中度。他們是用口服抗生素治療的，且癥狀在1-2周后消退。1和5mg/kg組的三個(gè)患者和20mg/kg組的一個(gè)患者在用CDP870治療之后1-2個(gè)月出現(xiàn)泌尿道感染。還有一個(gè)嚴(yán)重的不利事件是患者在用1mg/kg的劑量輸注3天后，出現(xiàn)頸部疼痛。在4個(gè)患者中可見到抗-核抗體的增加安慰劑組1個(gè)(低1/40)，1mg/kg組2個(gè)(低1/40，低1/80)，20mg/kg組1個(gè)(低1/40)。抗-DNA或抗-心脂質(zhì)抗體沒有變化。CDP870的血漿濃度和抗-CDP870的水平對(duì)于CDP870的所有給藥水平來說，峰值血漿濃度出現(xiàn)在輸注結(jié)束的時(shí)候，且血漿濃度水平隨著給藥的比例而緩慢降低。CDP870的血漿濃度與先前在志愿者中觀察到的非常相似，所計(jì)算的半衰期約為14天。再-給藥時(shí)，觀察到單一給藥輸注的相似分布。
單獨(dú)靜脈內(nèi)輸注后，抗-CDP870水平較低或檢測(cè)不到。討論中和TNFα對(duì)于RA來說是一種有效的治療策略。目前，這種治療還需要使用生物制劑，如嵌合mAb或可溶性受體/人Fc融合蛋白，但其成本較高。治療性的TNFα中和劑需要結(jié)合具有高親和力的TNFα，且其具有較長的血漿半衰期，低抗原性和高耐受性及安全性。且它需要接近所有從阻斷TNFα受益的RA患者?？蛇_(dá)到這些目的的其中一個(gè)技術(shù)是與大腸桿菌中產(chǎn)生的TNFα結(jié)合抗體片段的聚乙二醇相綴合。在初步研究中，我們發(fā)現(xiàn)CDP870，PEG化的，抗-TNFα，修飾的Fab，是有效的，且RA患者可很好地耐受。
體外研究證實(shí)CDP870具有與鼠科動(dòng)物抗-TNFα親代抗體相似的TNFα中和活性。此研究證實(shí)CDP870可減輕炎癥，并改善RA的癥狀。將通過ACR20反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)所測(cè)量的5和20mg/kg組(75％，75％)對(duì)臨床的改善作用與etanercept(60％)(Moreland等，AnnalsInt.Med.，130，478-486，1999)和infliximab(50％)(Maini等，Lancet，354，1932-1939，1999)相對(duì)照。在中間和最高給藥水平進(jìn)行試驗(yàn)，與前面其它的mAbs(Elliott等，Lancet，344，1105-1110，1994和Rankin等，Br.J.Rheumatol.，34，334-342，1995)相比，其治療效果可持續(xù)8周。先前的研究已經(jīng)證實(shí)抗-TNFα抗體的治療效果與它的血漿半衰期和循環(huán)抗體的產(chǎn)生有關(guān)(Maini等，ArthritisRheum，38，(增刊)S186 1995(摘要))。我們的研究則顯不CDP870的血漿半衰期為14天，與全抗體的血漿半衰期相等(Rankin等，(supra))，比未綴合的Fab片段的半衰期要長得多。此外，CDP870所產(chǎn)生抗體反應(yīng)的水平非常低。
本研究的其中一個(gè)重要目的是為了檢測(cè)給予此PEG化Fab的耐受性和安全性。在我們的研究中，CDP870顯示了良好的耐受性。雖然進(jìn)一步的研究還需要評(píng)估其長期毒性，但現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)報(bào)道過了與etanercept和infliximab有關(guān)的脫髓鞘性疾病，感染和皮疹。
總之，CDP870可有效的治療RA，且其在此短期研究中可很好地耐受。
應(yīng)當(dāng)理解，上述實(shí)施例僅僅是舉例說明，不能用來限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍在下列權(quán)利要求中限定。
序列表<110>CELLTECH CHIROSCIENCE LIMITED<120>生物制品<130>P021741GB<140><141><160>115<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列hTNF40 CDRH1的描述<400>1Asp Tyr Gly Met Asn1 5<210>2<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列hTNF40/人類雜交CDRH2的描述<400>2Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15Gly<210>3<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列hTNF40 CDRH3的描述<400>3Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr1 5<210>4<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列hTNF40 CDRL1的描述<400>4Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala1 5 10<210>5<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列hTNF40 CDRL2的描述<400>5Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser1 5<210>6<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列hTNF40 CDRL3的描述<400>6Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu Thr1 5<210>7<211>17<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列hTNF40 CDRH2的描述<400>7Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Val Asp Asp Phe Lys1 5 10 15Gly<210>8<211>321<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)..(321)<220><223>人工序列hTNF40-gL1的描述<400>8gac att caa atg acc cag agc cca tcc agc ctg agc gca tct gta gga 48Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15gac cgg gtc acc atc act tgt aaa gcc agt cag aac gta ggt act aac 96Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn20 25 30gta gcc tgg tat cag caa aaa cca ggt aaa gcc cca aaa gcc ctc atc 144Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile35 40 45tac agt gcc tct ttc ctc tat agt ggt gta cca tac agg ttc agc gga 192Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly50 55 60tcc ggt agt ggt act gat ttc acc ctc acg atc agt agc ctc cag cca 240Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80gaa gat ttc gcc act tat tac tgt caa cag tat aac atc tac cca ctc 288Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu85 90 95aca ttc ggt cag ggt act aaa gta gaa atc aaa 321Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>9<211>321<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)..(321)<220><223>人工序列hTNF40-gL2的描述<400>9gac att caa atg acc cag agc cca tcc agc ctg agc gca tct gta gga 48Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15gac cgg gtc acc atc act tgt aaa gcc agt cag aac gta ggt act aac 96Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn20 25 30gta gcc tgg tat cag caa aaa cca ggt aaa gcc cca aaa ctc ctc atc 144Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45tac agt gcc tct ttc ctc tat agt ggt gta cca tac agg ttc agc gga 192Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly50 55 60tcc ggt agt ggt act gat ttc acc ctc acg atc agt agc ctc cag cca 240Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80gaa gat ttc gcc act tat tac tgt caa cag tat aac atc tac cca ctc 288Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu85 90 95aca ttc ggt cag ggt act aaa gta gaa atc aaa 321Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>10<211>354<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)..(354)<220><223>人工序列g(shù)h1hTNF40.4的描述(圖10)<400>10cag gtg cag ctg gtc cag tca gga gca gag gtt aag aag cct ggt gct 48Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15tcc gtc aaa gtt tcg tgt aag gcc tca ggc tac gtg ttc aca gac tat 96Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr20 25 30ggt atg aat tgg gtc aga cag gcc ccg gga caa ggc ctg gaa tgg atg 144Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45ggt tgg att aat act tac att gga gag cct att tat gct caa aag ttc 192Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60cag ggc aga gtc acg ttc act cta gac acc tcc aca agc act gca tac 240Gln Gly Arg Val Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80atg gag ctg tca tct ctg aga tcc gag gac acc gca gtg tac tat tgt 288Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gct aga gga tac aga tct tat gcc atg gac tac tgg ggc cag ggt acc 336Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110cta gtc aca gtc tcc tca 354Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>11<211>354<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)..(354)<220><223>人工序列g(shù)h3hTNF40.4的描述(圖11)<400>11gag gtt cag ctg gtc gag tca gga ggc ggt ctc gtg cag cct ggc gga 48Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15tca ctg aga ttg tcc tgt gct gca tct ggt tac gtc ttc aca gac tat 96Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr20 25 30gga atg aat tgg gtt aga cag gcc ccg gga aag ggc ctg gaa tgg atg 144Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45ggt tgg att aat act tac att gga gag cct att tat gct gac agc gtc 192Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60aag ggc aga ttc acg ttc tct cta gac aca tcc aag tca aca gca tac 240Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80ctc caa atg aat agc ctg aga gca gag gac acc gca gtg tac tat tgt 288Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gct aga gga tac aga tct tat gcc atg gac tac tgg ggc cag ggt acc 336Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110cta gtc aca gtc tcc tca 354Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>12<211>9<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列部分引物序列的描述<400>12gccgccacc 9<210>13<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CH1的描述<400>13atgaaatgca gctgggtcat sttctt 26<210>14<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CH2的描述<400>14atgggatgga gctrtatcat sytctt 26<210>15<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CH3的描述<400>15atgaagwtgt ggttaaactg ggtttt 26<210>16<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CH4的描述<400>16atgractttg ggytcagctt grt 23<210>17<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CH5的描述<400>17atggactcca ggctcaattt agtttt 26<210>18<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CH6的描述<400>18atggctgtcy trgsgctrct cttctg 26<210>19<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CH7的描述<400>19atggratgga gckggrtctt tmtctt 25<210>20<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CH8的描述<400>20atgagagtgc tgattctttt gtg 23<210>21<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物cH9的描述<400>21atggmttggg tgtggamctt gctatt 26<210>22<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CH10的描述<400>22atgggcagac ttacattctc attcct 26<210>23<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CH11的描述<400>23atggattttg ggctgatttt ttttattg28<210>24<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CH12的描述<400>24atgatggtgt taagtcttct gtacct 26<210>25<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物5′端<400>25gcgcgcaagc ttgccgccac c 21<210>26<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CL1的描述<400>26atgaagttgc ctgttaggct gttggtgct 29<210>27<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CL2的描述<400>27atggagwcag acacactcct gytatgggt 29<210>28<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CL3的描述<400>28atgagtgtgc tcactcaggt cct 23<210>29<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CL4的描述<400>29atgaggrccc ctgctcagwt tyttgg 26<210>30<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CL5的描述<400>30atggatttwc aggtgcagat twtcagctt 29<210>31<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CL5A的描述<400>31atggatttwc argtgcagat twtcagctt 29<210>32<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CL6的描述<400>32atgaggtkcy ytgytsagyt yctgrg 26<210>33<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CL7的描述<400>33atgggcwtca agatggagtc aca 23<210>34<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CL8的描述<400>34atgtggggay ctktttycmm tttttcaat 29<210>35<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CL9的描述<400>35atggtrtccw casctcagtt cctt24<210>36<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CL10的描述<400>36atgtatatat gtttgttgtc tatttc 26<210>37<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CL11的描述<400>37atggaagccc cagctcagct tctctt 26<210>38<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CL12A的描述<400>38atgragtywc agacccaggt cttyrt 26<210>39<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CL12B的描述<400>39atggagacac attctcaggt ctttgt 26<210>40<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CL13的描述<400>40atggattcac aggcccaggt tcttat 26<210>41<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CL14的描述<400>41atgatgagtc ctgcccagtt cctgtt 26<210>42<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CL15的描述<400>42atgaatttgc ctgttcatct cttggtgct 29<210>43<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CL16的描述<400>43atggattttc aattggtcct catctcctt 29<210>44<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CL17A的描述<400>44atgaggtgcc tarctsagtt cctgrg 26<210>45<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CL17B的描述<400>45atgaagtact ctgctcagtt tctagg 26<210>46<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CL17C的描述<400>46atgaggcatt ctcttcaatt cttggg 26<210>47<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物5′端<400>47ggactgttcg aagccgccac c 21<210>48<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物CL12的描述<400>48ggatacagtt ggtgcagcat ccgtacgttt 30<210>49<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物R2155的描述<400>49gcagatgggc ccttcgttga ggctgmrgag acdgtga 37<210>50<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物R1053的描述<400>50gctgacagac taacagactg ttcc24<210>51<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物R720的描述<400>51gctctcggag gtgctcct 18<210>52<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列寡核苷酸P7982的描述<400>52gaattcaggg tcaccatcac ttgtaaagcc agtcagaacg taggtactaa cgtagcctgg 60tatcagcaaa70<210>53<211>71<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列寡核苷酸P7983的描述<400>53atagaggaaa gaggcactgt agatgagggc ttttggggct ttacctggtt tttgctgata 60ccaggctacg t 71<210>54<211>71<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列寡核苷酸P7984的描述<400>54tacagtgcct ctttcctcta tagtggtgta ccatacaggt tcagcggatc cggtagtggt 60actgatttca c 71<210>55<211>71<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列寡核苷酸P7985的描述<400>55gacagtaata agtggcgaaa tcttctggct ggaggctact gatcgtgagg gtgaaatcag 60taccactacc g 71<210>56<211>89<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列寡核苷酸P7986的描述<400>56atttcgccac ttattactgt caacagtata acatctaccc actcacattc ggtcagggta 60ctaaagtaga aatcaaacgt acggaattc89<210>57<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列寡核苷酸P7981的描述<400>57gaattcaggg tcaccatcac ttgtaaagcc 30<210>58<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列寡核苷酸P7980的描述<400>58gaattccgta cgtttgattt ctactttagt 30<210>59<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列寡核苷酸R1053的描述<400>59gctgacagac taacagactg ttcc 24<210>60<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列寡核苷酸R5350的描述<400>60tctagatggc acaccatctg ctaagtttga tgcagcatag atcaggagct taggagc57<210>61<211>59<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列寡核苷酸R5349的描述<400>61gcagatggtg tgccatctag attcagtggc agtggatcag gcacagactt taccctaac 59<210>62<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列寡核苷酸R684的描述<400>62ttcaactgct catcagat 18<210>63<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物P7989的描述<400>63gaagcaccag gcttcttaac ctctgctcct gactggacca gctgcacctg agagtgcacg 60aattc 65<210>64<211>71<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物P7990的描述<400>64ggttaagaag cctggtgctt ccgtcaaagt ttcgtgtaag gcctcaggct acgtgttcac 60agactatggt a 71<210>65<211>71<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物P7991的描述<400>65ccaacccatc catttcaggc cttgtcccgg ggcctgcttg acccaattca taccatagtc 60tgtgaacacg t 71<210>66<211>81<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物P7995的描述<400>66ggcctgaaat ggatgggttg gattaatact tacattggag agcctattta tgttgacgac 60ttcaagggca gattcacgtt c81<210>67<211>56<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物P7992的描述<400>67ccatgtatgc agtgcgttgt ggaggtgtct agagtgaacg tgaatctgcc cttgaa 56<210>68<211>62<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物P7993的描述<400>68ccacaagcac tgcatacatg gagctgtcat ctctgagatc cgaggacacc gcagtgtact 60at 62<210>69<211>78<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物P7994的描述<400>69gaattcggta ccctggcccc agtagtccat ggcataagat ctgtatcctc tagcacaata 60gtacactgcg gtgtcctc78<210>70<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物P7988的描述<400>70gaattcgtgc actctcaggt gcagctggtc 30<210>71<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物P7987的描述<400>71gaattcggta ccctggcccc agtagtccat 30<210>72<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物P7999的描述<400>72gatccgccag gctgcacgag accgcctcct gactcgacca gctgaacctc agagtgcacg 60aattc 65<210>73<211>71<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物P8000的描述<400>73tctcgtgcag cctggcggat cgctgagatt gtcctgtgct gcatctggtt acgtcttcac 60agactatgga a 71<210>74<211>71<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物P8001的描述<400>74ccaacccatc catttcaggc cctttcccgg ggcctgctta acccaattca ttccatagtc 60tgtgaagacg t 71<210>75<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物P7997的描述<400>75ggaggtatgc tgttgacttg gatgtgtcta gagagaacgt gaatctgccc ttgaa 55<210>76<211>62<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物P7998的描述<400>76ccaagtcaac agcatacctc caaatgaata gcctgagagc agaggacacc gcagtgtact 60at 62<210>77<211>78<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物P7993的描述<400>77gaattcggta ccctggcccc agtagtccat ggcataagat ctgtatcctc tagcacaata 60gtacactgcg gtgtcctc78<210>78<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列引物P7996的描述<400>78gaattcgtgc actctgaggt tcagctggtc 30<210>79<211>74<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列5′引物<400>79cgcgcggcaa ttgcagtggc cttggctggt ttcgctaccg tagcgcaagc tgacattcaa 60atgacccaga gccc74<210>80<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列3′引物<400>80ttcaactgct catcagatgg 20<210>81<211>78<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列5′引物<400>81gctatcgcaa ttgcagtggc gctagctggt ttcgccaccg tggcgcaagc tgaggttcag 60ctggtcgagt caggaggc78<210>82<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列3′引物<400>82gcctgagttc cacgacac 18<210>83<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列人類1組共有序列的構(gòu)架L1的描述<400>83Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys20<210>84<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列hTNF40的構(gòu)架L1的描述<400>84Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Ser Val Thr Cys20<210>85<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列人類1組共有序列的構(gòu)架L2的描述framework L2<400>85Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr1 5 10 15<210>86<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列hTNF40的構(gòu)架L2的描述<400>86Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile Tyr1 5 10 15<210>87<211>32<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列人類1組共有序列的構(gòu)架L3的描述<400>87Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr1 5 10 15Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys20 25 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Gly1 5 10<210>94<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列hTNF40的構(gòu)架H2的描述<400>94Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Ala Phe Lys Trp Met Gly1 5 10<210>95<211>32<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列人類1組共有序列的構(gòu)架H3的描述<400>95Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu1 5 10 15Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg20 25 30<210>96<211>32<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列hTNF40的構(gòu)架H3的描述<400>96Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe Leu Gln1 5 10 15Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg20 25 30<210>97<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列人類1組共有序列的構(gòu)架H4的描述<400>97Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser1 5 10<210>98<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列hTNF40的構(gòu)架H4的描述<400>98Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser1 5 10<210>99<211>324<212>DNA<213>鼠科動(dòng)物<220><221>CDS<222>(1)..(324)<223>小鼠hTNF40輕鏈的可變域<400>99gac att gtg atg acc cag tct caa aaa ttc atg tcc aca tca gta gga 48Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly1 5 10 15gac agg gtc agc gtc acc tgc aag gcc agt cag aat gtg ggt act aat 96Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30gta gcc tgg tat caa cag aaa cca gga caa tct cct aaa gca ctg att 144Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile35 40 45tac tcg gca tcc ttc cta tat agt gga gtc cct tat cgc ttc aca ggc 192Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Thr Gly50 55 60agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc act gtg cag tct 240Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Thr Val Gln Ser65 70 75 80gaa gac ttg gca gag tat ttc tgt cag caa tat aac atc tat cct ctc 288Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu85 90 95acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa cgt 324Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg100 105<210>100<211>354<212>DNA<213>鼠科動(dòng)物<220><221>CDS<222>(1)..(354)<223>小鼠hTNF40重鏈的可變域<400>100cag atc cag ttg gtg cag tct gga cct gag ctg aag aag cct gga gag 48Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct gga tat gtt ttc aca gac tat 96Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr20 25 30gga atg aat tgg gtg aag cag gct cca gga aag gct ttc aag tgg atg 144Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Ala Phe Lys Trp Met35 40 45ggc tgg ata aac acc tac att gga gag cca ata tat gtt gat gac ttc 192Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Val Asp Asp Phe50 55 60aag gga cga ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc act gcc ttt 240Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe65 70 75 80ttg cag atc aac aac ctc aaa aat gag gac acg gct aca tat ttc tgt 288Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95gca aga ggt tac cgg tcc tat gct atg gac tac tgg ggt caa gga acc 336Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110tca gtc acc gtc tct tca 354Ser Val Thr Val Ser Ser115<210>101<211>84<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(29)..(67)<223>人工序列OmpA寡核苷酸連接物的描述<400>101tcgagttcta gataacgagg cgtaaaaa atg aaa aag aca gct atc gca att52Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile1 5gca gtg gcc ttg gct 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20<210>105<211>81<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(2)..(43)<220><221>CDS<222>(57)..(80)<220><223>人工序列IGS彈夾-4的描述<400>105g agc tca cca gta aca aaa agt ttt aat aga gga gag tgt tga 43Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys1 5 10cgaggattat ata atg aag aaa act gct ata gca att g 81Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile15 20<210>106<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列人類3組共有序列的構(gòu)架H1的描述<400>106Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser20 25 30<210>107<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列人類3組共有序列的構(gòu)架H2的描述<400>107Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser1 5 10<210>108<211>32<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列人類3組共有序列的構(gòu)架H3的描述<400>108Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln1 5 10 15Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg20 25 30<210>109<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列人類3組共有序列的構(gòu)架H4的描述<400>109Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser1 5 10<210>110<211>648<212>DNA<213>人工序列<220><223>Fab的移植重鏈<400>110gaggttcagc tggtcgagtc aggaggcggt ctcgtgcagc ctggcggatc actgagattg 60tcctgtgctg catctggtta cgtcttcaca gactatggaa tgaattgggt tagacaggcc 120ccgggaaagg gcctggaatg gatgggttgg attaatactt acattggaga gcctatttat 180gctgacagcg tcaagggcag attcacgttc tctctagaca catccaagtc aacagcatac 240ctccaaatga atagcctgag agcagaggac accgcagtgt actattgtgc tagaggatac 300agatcttatg ccatggacta ctggggccag ggtaccctag tcacagtctc ctcagcttcc 360accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtcgaca agaaagtt648<210>111<211>216<212>PRT<213>人工序列<220><223>Fab的移植重鏈<400>111Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr20 25 30Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly130 135 140Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn145 150 155 160Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln165 170 175Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser180 185 190Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser195 200 205Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val210 215<210>112<211>642<212>DNA<213>人工序列<220><223>Fab的移植輕鏈和修飾的Fab<400>112gacattcaaa tgacccagag cccatccagc ctgagcgcat ctgtaggaga ccgggtcacc 60atcacttgta aagccagtca gaacgtaggt actaacgtag cctggtatca gcaaaaacca 120ggtaaagccc caaaagccct catctacagt gcctctttcc tctatagtgg tgtaccatac 180aggttcagcg gatccggtag tggtactgat ttcaccctca cgatcagtag cctccagcca 240gaagatttcg ccacttatta ctgtcaacag tataacatct acccactcac attcggtcag 300ggtactaaag tagaaatcaa acgtacggta gcggccccat ctgtcttcat cttcccgcca 360tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600ctgagctcac cagtaacaaa aagctttaat agaggagagt gt 642<210>113<211>214<212>PRT<213>人工序列<220><223>Fab的移植輕鏈和修飾的Fab<400>113Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn20 25 30Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile35 40 45Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105 110Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala130 135 140Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln145 150 155 160Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser165 170 175Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr180 185 190Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser195 200 205Phe Asn Arg Gly Glu Cys210<210>114<211>687<212>DNA<213>人工序列<220><223>修飾Fab的移植重鏈<400>114gaggttcagc tggtcgagtc aggaggcggt ctcgtgcagc ctggcggatc actgagattg 60tcctgtgctg catctggtta cgtcttcaca gactatggaa tgaattgggt tagacaggcc 120ccgggaaagg gcctggaatg gatgggttgg attaatactt acattggaga gcctatttat 180gctgacagcg tcaagggcag attcacgttc tctctagaca catccaagtc aacagcatac 240ctccaaatga atagcctgag agcagaggac accgcagtgt actattgtgc tagaggatac 300agatcttatg ccatggacta ctggggccag ggtaccctag tcacagtctc ctcagcttcc 360accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtcgaca agaaagttga gcccaaatct 660tgtgacaaaa ctcacacatg cgccgcg 687<210>115<211>229<212>PRT<213>人工序列<220><223>修飾Fab的移植重鏈<400>115Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr20 25 30Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro115 120 125Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly130 135 140Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn145 150 155 160Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln165 170 175Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser180 185 190Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser195 200 205Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr210 215 220His Thr Cys Ala Ala22權(quán)利要求
1.一種對(duì)人TNFα具有特異性的抗體分子，其包含一個(gè)重鏈，其中的可變域包含一CDR，該CDR具有圖3(SEQ ID NO1)所列CDRH1的H1序列，圖3(SEQ ID NO2)所列CDRH2的H2’序列，圖3(SEQ IDNO7)所列CDRH2的H2序列，或圖3(SEQ ID NO3)所列CDRH3的H3序列。
2.一種對(duì)人TNFα具有特異性的抗體分子，其包含一個(gè)輕鏈，其中的可變域包含一CDR，該CDR具有圖3(SEQ ID NO4)所列CDRL1的L1序列，圖3(SEQ ID NO5)所列CDRL2的L2序列，圖3(SEQ IDNO6)所列CDRL3的L3序列。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的抗體分子，其包含一個(gè)重鏈，其中的可變域包含一CDR，該CDR具有SEQ ID NO1所列的CDRH1的序列，SEQ ID NO2或SEQ ID NO7所列的CDRH2的序列，SEQ ID NO3所列的CDRH3的序列，和一個(gè)輕鏈，其中的可變域包含一CDR，該CDR具有SEQ ID NO4所列的CDRL1的序列，SEQ ID NO5所列的CDRL2的序列和SEQ ID NO6所列的CDRL3的序列。
4.如權(quán)利要求3的抗體分子，其包含CDRH1的SEQ ID NO1，CDRH2的SEQ ID NO2或SEQ ID NO7，CDRH3的SEQ ID NO3，CDRL1的SEQID NO4，CDRL2的SEQ ID NO5，CDRL3的SEQ ID NO6。
5.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的抗體分子，其包含CDRH2的SEQ IDNO2。
6.如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)的抗體分子，其是一種移植了CDR的抗體分子(CDR-grafted antibody Molecule)。
7.如權(quán)利要求6的抗體分子，其中的可變域包含人受體構(gòu)架區(qū)和非-人的供體CDRs。
8.如權(quán)利要求7的抗體分子，其中重鏈可變域的人受體構(gòu)架區(qū)是以人類1組共有序列為基礎(chǔ)的，且包含28，69和71位的非-人供體殘基。
9.如權(quán)利要求7的抗體分子，其中重鏈可變域的人受體構(gòu)架區(qū)是以人類1組共有序列為基礎(chǔ)的，且包含28，38，46，67，69和71位的非-人供體殘基。
10.如權(quán)利要求7的抗體分子，其中重鏈可變域的人受體構(gòu)架區(qū)是以人類3組共有序列為基礎(chǔ)的，且包含27，28，30，48，49，69，71，73，76和78位的非-人供體殘基。
11.如權(quán)利要求7-10中任意一項(xiàng)的抗體分子，其中輕鏈可變域的人受體構(gòu)架區(qū)是以人類1組共有序列為基礎(chǔ)的，且包含46和60位的非-人供體殘基。
12.如權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)的抗體分子，其包含輕鏈可變域hTNF40-gL1(SEQ ID NO8)和重鏈可變域gh3hTNF40.4(SEQ ID NO11)。
13.如權(quán)利要求1-12中任意一項(xiàng)的抗體分子，其是一種Fab片段。
14.如權(quán)利要求12和13的抗體分子，其是一種Fab片段，其中包含一個(gè)具有SEQ ID NO111所列序列的重鏈和一個(gè)具有SEQ IDNO113所列序列的輕鏈。
15.如權(quán)利要求1-12任意一項(xiàng)的抗體分子，其是一種修飾的Fab片段，該片段重鏈的C-端具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸，允許與效應(yīng)分子或報(bào)道分子相連接。
16.如權(quán)利要求15的抗體分子，其中附加的氨基酸形成含一個(gè)或兩個(gè)半胱氨酸殘基的修飾鉸鏈區(qū)，效應(yīng)分子或報(bào)道分子與之相連接。
17.如權(quán)利要求12的抗體分子，其是一種修飾的Fab片段，該片段含一個(gè)具有SEQ ID NO115所列序列的重鏈，和一個(gè)具有SEQ IDNO113所列序列的輕鏈。
18.一種對(duì)人TNFα具有特異性的抗體分子，其具有一個(gè)含SEQ IDNO113所列序列的輕鏈。
19.一種對(duì)人TNFα具有特異性的抗體分子，其具有一個(gè)由SEQ IDNO113所列序列組成的輕鏈。
20.一種對(duì)人TNFα具有特異性的抗體分子，其具有一個(gè)含SEQ IDNO115所列序列的重鏈。
21.一種對(duì)人TNFα具有特異性的抗體分子，其具有一個(gè)由SEQ IDNO115所列序列組成的重鏈。
22.一種對(duì)人TNFα具有特異性的抗體分子，其具有一個(gè)含SEQ IDNO113所列序列的輕鏈，和一個(gè)含SEQ ID NO115所列序列的重鏈。
23.一種對(duì)人TNFα具有特異性的抗體分子，其具有一個(gè)由SEQ IDNO113所列序列組成的輕鏈，和一個(gè)由SEQ ID NO115所列序列組成的重鏈。
24.如權(quán)利要求1-23任意一項(xiàng)抗體分子的變體，其對(duì)TNFα的親和力增加。
25.如權(quán)利要求24的變體，其是通過親和力成熟方案得到的。
26.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的抗體，其是鼠抗-TNFα的單克隆抗體hTNF40。
27.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的抗體分子，其是一種嵌合抗體分子，其中含權(quán)利要求26的單克隆抗體的輕鏈可變域和重鏈可變域。
28.一種含權(quán)利要求15-23中任意一項(xiàng)抗體分子的化合物，具有共價(jià)連接到抗體分子重鏈C-端的一個(gè)氨基酸上或抗體分子重鏈C-端的效應(yīng)分子或報(bào)道分子。
29.如權(quán)利要求28的化合物，其包含一種效應(yīng)分子。
30.如權(quán)利要求29的化合物，其中的效應(yīng)分子包含一種或多種聚合物。
31.如權(quán)利要求30的化合物，其中的一種或多種聚合物是任選取代的直鏈或支鏈聚亞烷基，聚亞烯基或聚亞氧烷基的聚合物，或支鏈或無支鏈的多糖。
32.如權(quán)利要求31的化合物，其中的一種或多種聚合物是甲氧基聚(乙二醇)。
33.一種含權(quán)利要求17的抗體分子的化合物，其中位于抗體分子重鏈C-端的其中一個(gè)半胱氨酸殘基與賴氨酰-馬來酰亞胺基相連接，其中各個(gè)賴氨酰殘基的氨基共價(jià)連接到具有約20,000Da分子量的甲氧基聚(乙二醇)上。
34.一種含對(duì)人TNFα具有特異性的抗體分子的化合物，其具有一個(gè)含SEQ ID NO113所列序列的輕鏈，和一個(gè)含SEQ ID NO115所列序列的重鏈，位于抗體分子重鏈C-端的其中一個(gè)半胱氨酸殘基與一種或多種合成或天然存在的聚合物相連接。
35.一種含對(duì)人TNFα具有特異性的抗體分子的化合物，其具有一個(gè)由SEQ ID NO113所列序列組成的輕鏈，和一個(gè)由SEQ ID NO115所列序列組成的重鏈，位于抗體分子重鏈C-端的其中一個(gè)半胱氨酸殘基與一種或多種合成或天然存在的聚合物相連接。
36.一種含對(duì)人TNFα具有特異性的抗體分子的化合物，其具有一個(gè)含SEQ ID NO113所列序列的輕鏈，位于抗體分子重鏈C-端的其中一個(gè)半胱氨酸殘基與賴氨酰-馬來酰亞胺基相連接，其中各個(gè)賴氨酰殘基的氨基共價(jià)連接到具有約20,000Da分子量的甲氧基聚(乙二醇)殘基上。
37.一種含對(duì)人TNFα具有特異性的抗體分子的化合物，其具有一個(gè)由SEQ ID NO113所列序列組成的輕鏈，位于抗體分子重鏈C-端的其中一個(gè)半胱氨酸殘基與賴氨酰-馬來酰亞胺基相連接，其中各個(gè)賴氨酰殘基的氨基共價(jià)連接到具有約20,000Da分子量的甲氧基聚(乙二醇)殘基上。
38.一種含對(duì)人TNFα具有特異性的抗體分子的化合物，其具有一個(gè)含SEQ ID NO115所列序列的重鏈，位于抗體分子重鏈C-端的其中一個(gè)半胱氨酸殘基與賴氨酰-馬來酰亞胺基相連接，其中各個(gè)賴氨酰殘基的氨基共價(jià)連接到具有約20,000Da分子量的甲氧基聚(乙二醇)殘基上。
39.一種含對(duì)人TNFα具有特異性的抗體分子的化合物，其具有一個(gè)由SEQ ID NO115所列序列組成的重鏈，位于抗體分子重鏈C-端的其中一個(gè)半胱氨酸殘基與賴氨酰-馬來酰亞胺基相連接，其中各個(gè)賴氨酰殘基的氨基共價(jià)連接到具有約20,000Da分子量的甲氧基聚(乙二醇)殘基上。
40.一種含對(duì)人TNFα具有特異性的抗體分子的化合物，其具有一個(gè)含SEQ ID NO113所列序列的輕鏈和一個(gè)含SEQ ID NO115所列序列的重鏈，位于抗體分子重鏈C-端的其中一個(gè)半胱氨酸殘基與賴氨酰-馬來酰亞胺基相連接，其中各個(gè)賴氨酰殘基的氨基共價(jià)連接到具有約20,000Da分子量的甲氧基聚(乙二醇)殘基上。
41.一種含對(duì)人TNFα具有特異性的抗體分子的化合物，其具有一個(gè)由SEQ ID NO113所列序列組成的輕鏈和一個(gè)由SEQ ID NO115所列序列組成的重鏈，位于抗體分子重鏈C-端的其中一個(gè)半胱氨酸殘基與賴氨酰-馬來酰亞胺基相連接，其中各個(gè)賴氨酰殘基的氨基共價(jià)連接到具有約20,000Da分子量的甲氧基聚(乙二醇)殘基上。
42.一種含雜種CDR的抗體分子，該雜種CDR包含截短的供體CDR序列，其中供體CDR的缺失部分可用不同的序列代替，并形成一功能性的CDR。
43.如權(quán)利要求42的抗體分子，其中CDR序列的缺失部分來源于這樣的抗體抗體分子的構(gòu)架區(qū)衍生于該抗體。
44.如權(quán)利要求43的抗體分子，其中CDR序列的缺失部分衍生于具有共有序列構(gòu)架區(qū)的種系抗體。
45.如權(quán)利要求42-44中任意一項(xiàng)的抗體分子，其中在抗體分子中的重鏈的CDRH2是雜種的。
46.如權(quán)利要求42-45中任意一項(xiàng)的抗體分子，其中平截供體CDR的1-8個(gè)氨基酸。
47.如權(quán)利要求46的抗體分子，其中平截4-6個(gè)氨基酸。
48.如權(quán)利要求42-47中任意一項(xiàng)的抗體分子，其中在CDR的C-端進(jìn)行平截。
49.一種編碼權(quán)利要求1-27和42-48中任意一項(xiàng)抗體分子的重鏈和/或輕鏈的DNA序列。
50.如權(quán)利要求49的DNA序列，其包含SEQ ID NO8或10所列的序列。
51.如權(quán)利要求49的DNA序列，其包含SEQ ID NO10或11所列的序列。
52.如權(quán)利要求49的DNA序列，其包含SEQ ID NO110，112或114所列的序列。
53.一種含權(quán)利要求49-52中任意一項(xiàng)DNA序列的克隆或表達(dá)載體。
54.一種含權(quán)利要求49-52中任意一項(xiàng)DNA序列的大腸桿菌表達(dá)載體。
55.如權(quán)利要求54的大腸桿菌表達(dá)載體，其是pTTO(CDP870)。
56.一種用權(quán)利要求53-55任意一項(xiàng)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
57.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1-27和42-48中任意一項(xiàng)抗體分子的方法，包含培養(yǎng)權(quán)利要求56的宿主細(xì)胞，并分離該抗體分子。
58.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1-27和42-48中任意一項(xiàng)抗體分子的方法，包括培養(yǎng)含大腸桿菌表達(dá)載體的大腸桿菌，其中該大腸桿菌表達(dá)載體含權(quán)利要求53-55中任意一項(xiàng)的DNA序列，并分離該抗體分子。
59.如權(quán)利要求58的方法，其中該抗體分子被導(dǎo)向胞質(zhì)。
60.一種治療或診斷組合物，其包含權(quán)利要求1-27和42-48中任意一項(xiàng)的抗體分子或權(quán)利要求28-41中任意一項(xiàng)的化合物。
61.對(duì)人TNFα具有特異性的，權(quán)利要求1-27和42-48中任意一項(xiàng)的抗體分子，或權(quán)利要求28-41中任意一項(xiàng)的化合物在治療TNFα介導(dǎo)的病狀中的用途。
62.權(quán)利要求61的抗體分子或化合物在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎中的用途。
63.對(duì)人TNFα具有特異性的，權(quán)利要求1-27和42-48中任意一項(xiàng)的抗體分子，或權(quán)利要求28-41中任意一項(xiàng)的化合物在制備治療TNFα介導(dǎo)的病狀的藥物中的用途。
64.如權(quán)利要求63的用途，其中的病狀是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎。
65.圖19所示的載體pDNAbEng-G1。
66.圖22所示的載體pTTO(CDP870)。
67.一種具有SEQ ID NO1-7中任意一個(gè)所列氨基酸序列的多肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗體分子,其包含主少一種來源于小鼠單克隆抗體的,對(duì)人TNFα具有特異性的CDR。本發(fā)明還公開了一種移植了CDR的抗體,其中至少一種CDR是雜種CDR。本發(fā)明進(jìn)一步公開了編碼抗體分子鏈的DNA序列,載體,轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞,及抗體分子在治療TNFα介導(dǎo)的疾病中的用途。
文檔編號(hào)A61P37/06GK1383450SQ01801629
公開日2002年12月4日 申請(qǐng)日期2001年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月6日
發(fā)明者D·S·阿斯瓦爾, D·T·布勞恩, A·N·C·維爾, A·G·波普萊維爾, A·P·查普曼, D·J·金 申請(qǐng)人:細(xì)胞技術(shù)研究及開發(fā)有限公司