專利名稱:用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的給料添加劑及使用方法
用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的給料添加劑及使用方法
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明一般涉及用于培養(yǎng)用于生產(chǎn)重組蛋白例如抗體的細(xì)胞的培養(yǎng)基添加劑 (media supplement)。
發(fā)明背景
中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞培養(yǎng)物通常被用于生產(chǎn)用作治療劑的蛋白質(zhì)例如治療性抗體。用于此類細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基歷來(lái)包括動(dòng)物來(lái)源的添加劑，但此類添加劑近年來(lái)已與傳播性海綿狀腦病(transmissible spongiform encephalopathies) (TSE)例如牛海綿樣腦病(BSE，瘋牛病)的出現(xiàn)相關(guān)，所述疾病與人的變異克雅氏癥(variant Creutzfeldt-Jakob disease) (vCJD)相關(guān)。參見(jiàn)，例如，Cleland 等人 Q007) J. Microbiol. Meth. 69:345。鑒于由此產(chǎn)生的關(guān)于此類污染的擔(dān)憂，優(yōu)選使用不包含動(dòng)物來(lái)源的成分的生產(chǎn)培養(yǎng)基進(jìn)行藥物試劑的制備。
蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物例如大豆水解產(chǎn)物也已在細(xì)胞培養(yǎng)基中被用作添加劑以增加生產(chǎn)率。然而，此類水解產(chǎn)物的質(zhì)量在不同批次間可變化，從而影響生產(chǎn)的產(chǎn)品的數(shù)量和質(zhì)量。
因此，存在對(duì)用于在培養(yǎng)的CHO細(xì)胞中生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)的改進(jìn)的方法的需要， 所述方法不涉及添加可引入麻煩的污染物的動(dòng)物來(lái)源成分。優(yōu)選地，此類方法還可支持從培養(yǎng)的CHO細(xì)胞高水平表達(dá)治療性多肽。
發(fā)明概述
本發(fā)明通過(guò)提供基于改良的20X DMEM/F12的給料添加劑(feed supplement)濃縮物進(jìn)本文中稱為“SP給料”，其不含動(dòng)物成分和蛋白質(zhì)裂解物)和使用該添加劑用于培養(yǎng)產(chǎn)生治療性多肽的CHO細(xì)胞的方法來(lái)滿足這些需要和更多需要。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療性多肽是抗體或其抗原結(jié)合片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療性多肽是IgG抗體或其抗原結(jié)合片段。在一些實(shí)施方案中，治療性抗體是特異性結(jié)合人IL-23pl9的嵌合抗體、人源化抗體或完全人抗體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的生產(chǎn)給料添加劑包括維生素E和/或亞硒酸鈉 (Na2SeO4) 0在另一個(gè)實(shí)施方案中，維生素E以約30. 2 mg/L存在于添加劑濃縮物中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，亞硒酸鈉以約0.3 mg/L存在于添加劑濃縮物中。在另外的實(shí)施方案中， 生產(chǎn)給料添加劑濃縮物包含表3中所列的成分。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的補(bǔ)充劑生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括順流進(jìn)料(forward-feeding)原理，其中向細(xì)胞培養(yǎng)物提供的營(yíng)養(yǎng)物的量基于細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和營(yíng)養(yǎng)物消耗。在不同實(shí)施方案中，在生產(chǎn)過(guò)程中在超過(guò)一個(gè)場(chǎng)合，例如在一系列兩次或更多次批式進(jìn)料(bolus feeding)中，例如在第3、5和10 天，向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入本發(fā)明的給料添加劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在早期指數(shù)生長(zhǎng)期、 晚期指數(shù)生長(zhǎng)期和靜止期中，加入本發(fā)明的添加劑。在不同的實(shí)施方案中，將培養(yǎng)物補(bǔ)充1、 2、3、4、5或更多次。在還其他實(shí)施方案中，可每天加入或在連續(xù)或半連續(xù)的基礎(chǔ)上加入添加劑以確保隨時(shí)間推移成分的濃度穩(wěn)定。在不同實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)期后從培養(yǎng)物回收蛋白質(zhì)，該回收可來(lái)自培養(yǎng)基(上清液)、細(xì)胞(例如，通過(guò)裂解)或兩者。
在一個(gè)實(shí)施方案中，分開(kāi)地向培養(yǎng)物中加入本發(fā)明的生產(chǎn)給料添加劑的一個(gè)或多個(gè)成分，例如1、2、3或更多個(gè)成分可與其余成分的混合物分開(kāi)地加入。在一個(gè)實(shí)施方案中，酪氨酸和/或半胱氨酸與其他給料成分的混合物分開(kāi)地加入。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在培養(yǎng)物中補(bǔ)充哺乳動(dòng)物細(xì)胞用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括在生產(chǎn)運(yùn)行過(guò)程中向培養(yǎng)基中加入維生素E和/或亞硒酸鈉至少一次。在不同的實(shí)施方案中，給培養(yǎng)物補(bǔ)充維生素E至約2 mg/L、4 mg/L或6 mg/L的終濃度。在不同的其他實(shí)施方案中，給培養(yǎng)物補(bǔ)充亞硒酸鈉至約0.02 mg/L、0.04 mg/L或0. 06 mg/L的終濃度。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和給料添加劑以至少與使用補(bǔ)充有植物水解產(chǎn)物例如大豆水解產(chǎn)物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基獲得的一樣高的水平(效價(jià))支持治療性蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。 在不同實(shí)施方案中，本發(fā)明的給料和方法以為基礎(chǔ)給料(僅有葡萄糖和谷氨酰胺)的約1. 2、 1. 4,1. 6、1. 8或2. 0倍或更高效價(jià)支持治療性單克隆抗體的生產(chǎn)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和培養(yǎng)基支持治療性蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，所述蛋白質(zhì)至少與使用含大豆水解產(chǎn)物的給料培養(yǎng)基獲得的一樣純。在一些實(shí)施方案中，在利用蛋白質(zhì)A親和層析純化抗體后評(píng)估純度?？梢岳缤ㄟ^(guò)反相HPLC或大小排阻層析(HP-SEC) 測(cè)定純度。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在生產(chǎn)過(guò)程中例如在生產(chǎn)的第3、4或5天將培養(yǎng)的溫度從 37°C 轉(zhuǎn)換至;34°C。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的添加劑制備為20X的濃縮物并且在生產(chǎn)運(yùn)行中將其加入至1. 33X、2. 66X和/或4X的終濃度。在其他實(shí)施方案中，制備添加劑，并且將其以 2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、10X、11X、12X、12X、13X、14X、15X、16X、17X、18X、19X 或更高倍數(shù)的濃縮物使用。在還其他實(shí)施方案中，制備補(bǔ)充劑并且將其以21X、22X、23X、MX、25XJ6X、 27X.28X.29X.30X或更高倍數(shù)的濃縮物使用。
附圖簡(jiǎn)述
圖IA顯示作為在生產(chǎn)過(guò)程中如何(以及是否)向培養(yǎng)物進(jìn)行給料的函數(shù)的使用商業(yè)基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的3個(gè)抗體生產(chǎn)細(xì)胞系的相對(duì)效價(jià)的增加。由所述細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體在本文中稱為抗體A(空心柱)、B(陰影線柱)和C(實(shí)心柱)。將所有細(xì)胞培養(yǎng)在具有指定的添加劑的商業(yè)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。所使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是Sigma C5467 EX-CELL ACF CHO培養(yǎng)基(其不含動(dòng)物成分，具有HEPES，不具有L-谷氨酰胺，為過(guò)濾滅菌的液體)，細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)試的，具有金黃三羧酸(ATA)(針對(duì)產(chǎn)生抗體A和C的細(xì)胞)或不具有ATA (針對(duì)產(chǎn)生抗體B 和將在下文中進(jìn)行論述的抗體D、E和F的細(xì)胞)。在37°C下培養(yǎng)圖IA和IB中的所有培養(yǎng)物。用大豆水解產(chǎn)物、商購(gòu)可得的給料培養(yǎng)基濃縮物或SP給料補(bǔ)充培養(yǎng)物。商購(gòu)可得的給料培養(yǎng)基是Sigma C1615 CHO給料生物反應(yīng)器添加劑(Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., USA)。利用反相HPLC測(cè)定抗體效價(jià)。
圖IB顯示與圖IA中顯示的數(shù)據(jù)相似的數(shù)據(jù)，除了提供的數(shù)據(jù)是補(bǔ)充大豆水解物和SP給料的細(xì)胞以外。
圖2A圖3顯示作為是用大豆水解產(chǎn)物、SP給料或兩者補(bǔ)充培養(yǎng)物的函數(shù)的在37°C (斑點(diǎn)狀柱)或34°C (空心柱)下培養(yǎng)的抗體生產(chǎn)細(xì)胞系的相對(duì)效價(jià)。用于本實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系產(chǎn)生抗體A。在37°C下生長(zhǎng)的培養(yǎng)物在所有條件下具有更低的效價(jià)。將數(shù)據(jù)針對(duì)用大豆水解產(chǎn)物補(bǔ)充的并且在37°C下培養(yǎng)的培養(yǎng)物標(biāo)準(zhǔn)化。
圖4顯示單克隆抗體生產(chǎn)細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡的膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶(PI)流式細(xì)胞術(shù)分析。用于本實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系產(chǎn)生抗體D。用大豆水解產(chǎn)物或SP給料補(bǔ)充培養(yǎng)物。在第0、6、13和19天采集樣品，用膜聯(lián)蛋白V (χ-軸)和碘化丙啶(y_軸)染色，利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。
圖5顯示補(bǔ)充有大豆水解產(chǎn)物或SP給料的單克隆抗體生產(chǎn)細(xì)胞系(產(chǎn)生抗體D) 的流式細(xì)胞術(shù)分析。在第0、6、13或19天，用多聚甲醛固定細(xì)胞，透化細(xì)胞，然后用異硫氰酸熒光素(FITC)-抗-人Fc 抗體染色。Lecoeur 等人(1997) J. Immunol. Methods 209: 111?；趶那跋蛏⑸?側(cè)向散射(FSC/SSC)概況(profile)得到的細(xì)胞大小和和粒度設(shè)置活力門控(Viable gate)。直方圖在FITC強(qiáng)度的范圍上標(biāo)繪了表達(dá)指定的FITC強(qiáng)度的細(xì)胞的數(shù)目，從而反映了包含抗體的細(xì)胞的數(shù)目。χ-軸是從0至IO4個(gè)細(xì)胞的對(duì)數(shù)標(biāo)度，y_軸是0至200的計(jì)數(shù)的線性標(biāo)度。
詳述
本文中引用的全部參考資料以引用的方式全部并入本文中，該引用的程度就如同已特定地及個(gè)別地將各個(gè)公開(kāi)案、數(shù)據(jù)庫(kù)條目(database entry)(例如GenBank序列或GeneID 條目)、專利申請(qǐng)或?qū)＠w公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式并入一般。本文中參考的核酸和蛋白質(zhì)序列的GenBank登錄號(hào)是指至本申請(qǐng)的提交日期為止的數(shù)據(jù)庫(kù)的內(nèi)容。雖然可隨后修飾此類數(shù)據(jù)庫(kù)條目，但GenBank維持根據(jù)日期的所有以前版本的序列的公開(kāi)記錄，使得此類數(shù)據(jù)條目成為對(duì)特定序列的明確參考。
此外，通過(guò)引用并入任何專利或公開(kāi)的專利申請(qǐng)意圖為并入該專利或公開(kāi)的專利申請(qǐng)的序列表中的序列。例如，通過(guò)引用并入公開(kāi)特異性結(jié)合IL-23pl9的抗體的專利或公開(kāi)的專利申請(qǐng)意圖為并入其中所有序列，包括以蛋白質(zhì)和核酸形式存在的所有CDR、CDR變體、可變結(jié)構(gòu)域以及輕鏈和重鏈。
由申請(qǐng)者根據(jù)37 C. F. R. § 1.57(b)(1)做出的通過(guò)引用而并入的該聲明意圖為涉及各個(gè)和每一個(gè)單個(gè)的公開(kāi)、數(shù)據(jù)庫(kù)條目(例如GenBank序列或GeneID條目)、專利申請(qǐng)或?qū)＠裾?7 C. F. R. § 1. 57(b) (2)明確地確定其每一個(gè)，即使這樣的引用不與指定的通過(guò)引用而并入的專門聲明直接相鄰。將通過(guò)引用而并入的專門聲明(如果有的話)包括在本說(shuō)明書(shū)中不以任何方式削弱通過(guò)引用而并入的該一般聲明。本文中參考的引用無(wú)意作為所述參考資料是有關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)的承認(rèn)，其也不構(gòu)成關(guān)于這些公開(kāi)或文獻(xiàn)的內(nèi)容或日期的任何承認(rèn)。
I.定義如本文(包括所附權(quán)利要求
)中所使用的，除非上下文明確的指出，否則單詞的單數(shù)形式例如“一” (“a”和“an”)和“其”(“the”)包括其相應(yīng)的復(fù)數(shù)指代。
如本文中所使用的，"DMEM/F12"是指達(dá)爾伯克氏改進(jìn)伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)與 Ham's F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基的1:1混合物。該培養(yǎng)基例如作為Sigma EX-CELL ACF CHO培養(yǎng)基 (目錄號(hào)C5467)是商購(gòu)可得的。本發(fā)明的給料添加劑(SP給料)基于20X DMEM/F12的改進(jìn)形式，該改進(jìn)形式具有減少的無(wú)機(jī)鹽(以在生產(chǎn)過(guò)程中減少滲量(osmolarity)建立)并且不具有HEPES或酚紅。20X DMEM/F12的該改進(jìn)形式包含表3的成分1至46。除非另外指出，否則編號(hào)的“成分”在本文中是指表3中所列的成分。SP給料包含表3的全部49個(gè)成分，即具有加入至15g/L的谷氨酰胺并且還補(bǔ)充有亞硒酸鈉(0.3 mg/L)和維生素E (30.2 mg/L)的改進(jìn)20X DMEM/F12，如所指示的。
除非另外指出，否則按其在表3中的編號(hào)提及的成分以表3中所列的濃度使用。
出于實(shí)用原因，通常只在即將進(jìn)料之前向SP給料混合物中加入谷氨酰胺(成分 47)以避免谷氨酰胺的脫酰胺作用。此外，不提前將酪氨酸(成分27)和半胱氨酸(成分 13)與其他成分混合，而是相反在進(jìn)料時(shí)將其分開(kāi)地加入培養(yǎng)物。不希望受理論束縛，酪氨酸和半胱氨酸的溶解度排除了在進(jìn)料前將它們加入SP給料濃縮物，因?yàn)樗鼈儍A向于隨時(shí)間流逝從溶液沉降出來(lái)。例如，對(duì)于包括3次一次性進(jìn)料的生產(chǎn)運(yùn)行，在進(jìn)料的當(dāng)天通過(guò)加入6. 7%的培養(yǎng)物體積(在生產(chǎn)運(yùn)行期間加入的總共20%的給料的1/3)向培養(yǎng)物中加入在 SP給料成分1至47的預(yù)混合溶液。向培養(yǎng)物中加入適當(dāng)量的亞硒酸鈉，以及向培養(yǎng)物中加入適當(dāng)量的維生素E，以便培養(yǎng)物中全部49個(gè)成分的終濃度大體上與當(dāng)全部49個(gè)成分以包含表3中提供的量的預(yù)混合物溶液(濃縮物)加入時(shí)它們可具有的濃度相同。這樣的計(jì)算完全在制造治療性蛋白質(zhì)的技術(shù)人員的能力之內(nèi)。雖然分開(kāi)地向培養(yǎng)物中加入成分48、成分49和成分1至17的混合物，但可以以任意次序加入它們。因此表3中提供的制劑可在這樣的意義上(即可向培養(yǎng)物中加入給料濃縮物的成分以達(dá)到與當(dāng)制備單個(gè)溶液(無(wú)論是出于實(shí)用原因還是出于方便而分開(kāi)地加入有限的組分?jǐn)?shù)目)時(shí)獲得的相同的最終結(jié)果)被視為“實(shí)際”制劑。
在不同的實(shí)施方案中，本發(fā)明的添加劑包括由存在于表3中的成分的比率(無(wú)論其配制時(shí)的濃度)確定的組合物。因此，本發(fā)明不限定于任意指定的濃度。本發(fā)明包括表 3中提供的20X濃縮物形式，但也可包括任意其他濃度，例如低于1X、1X、2X、3X、4X、5X、6X. 7X、8X、9X、10X、11X、12X、12X、13X、14X、15X、16X、17X、18X、19X、20X、21X、22X、23X、24X、25X、 沈父、27乂、觀乂、四乂、3(^或高于3(^以及還包括任意非整數(shù)倍的濃度。意欲加入添加劑以產(chǎn)生約(但不必正好是)4X的終濃度。
本文中報(bào)導(dǎo)的“X”濃度是任意的，并且只基于本發(fā)明的給料添加劑來(lái)源于 “20X”DMEM/F12培養(yǎng)基的事實(shí)。因此，“X”濃度不反映任意具體的期望的工作濃度或終濃度。培養(yǎng)基中4X的終濃度例如可以是完全適合的。該用法可以與典型用法不同，在典型用法中這通常意指"IX"代表反應(yīng)混合物或培養(yǎng)基的某種期望的“終”濃度。
如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“抗體”可以指展示期望的生物活性的任意抗體形式。因此，其以最廣泛的意義使用并且明確地涵蓋單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、嵌合抗體、人源化抗體、完全人抗體等，只要它們展示期望的生物活性。[0030]如本文中所使用的，當(dāng)提及抗體時(shí)，術(shù)語(yǔ)“其結(jié)合片段”或其抗原結(jié)合片段包括仍然大體上保持結(jié)合其靶的能力的抗體的片段或衍生物?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、Fab'、 F(ab’)2和Fv片段；雙體(diabody)；線性抗體；單鏈抗體分子例如sc-Fv和從抗體片段形成的多特異性抗體。一般地，結(jié)合片段或衍生物保持至少10%的其對(duì)于其靶的親和力，例如解離平衡結(jié)合常數(shù)(dissociation equilibrium binding constant) (Kd)的 10 倍以內(nèi)的變化。優(yōu)選，結(jié)合片段或衍生物保持至少25%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100% (或更多)的其結(jié)合親和力，雖然具有足以產(chǎn)生期望的生物效應(yīng)的任意結(jié)合片段將是有用的。 當(dāng)明確提出時(shí)，也期望結(jié)合片段可包括具有不顯著改變其生物活性的保守氨基酸置換的序列變體。
"IL-23拮抗劑“是以任意方式抑制IL-23的活性的分子。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段是例如通過(guò)結(jié)合IL-23的亞基或其受體經(jīng)由IL-23受體抑制 IL-23的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在其他實(shí)施方案中，IL-23拮抗劑是小分子或多核苷酸，例如反義核酸或 siRNA。
〃白細(xì)胞介素-23(或"IL-23")意指由兩個(gè)多肽亞基pl9和p40組成的蛋白質(zhì)。 P19亞基(也稱為IL-23pl9，IL23A)的序列以NCBI蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)NP _057668、 AAH67511、AAH66267, AAH66268, AAH66269, AAH667512、AAH67513 或此類序列的天然存在的變體的任一個(gè)提供。p40亞基(也稱為IL-12p40、IL12B)的序列是如NCBI蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào) NP_002178、P29460, AAG32620、AAH74723、AAH67502、AAH67499、AAH67498、 AAH67501或這些序列的天然存在的變體的任一個(gè)中所述的序列。所有這些序列在此完整引入作為參考。
“白細(xì)胞介素-23R〃或〃IL_23R〃意指由如NCBI蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)NP 653302 (IL23R，Gene ID: 14923 或其天然存在的變體中所述的人IL-23R的成熟形式的序列組成的單個(gè)多肽鏈。另外的IL-23R序列變體公開(kāi)于WO 01/23556和WO 02/29060中。 所有這些序列和文獻(xiàn)在此完整引入作為參考。
〃白細(xì)胞介素-12Ri3 1〃或〃IL_12Ri3 1〃意指由如NCBI蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)NP_714912、NP_005526 (IL12RB1, Gene ID: 35p4)或其天然存在的變體中所述的人 IL-12Ri3 1的成熟形式的序列組成的單個(gè)多肽鏈。所有這些序列和文獻(xiàn)在此完整引入作為參考。
如本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指從基本上同質(zhì)的抗體群體獲得的抗體， 即，組成群體的單個(gè)抗體除了可能天然發(fā)生的突變(其可以以少量存在)外是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，其指向單個(gè)抗原性表位。相反地，常規(guī)(多克隆)抗體制劑通常包括許多指向(或特異于)不同表位的抗體。修飾語(yǔ)"單克隆的"表示如從基本上同質(zhì)的抗體群體獲得的抗體的特征，并且不被解釋為需要通過(guò)任何特定方法產(chǎn)生抗體。例如，按照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過(guò)由Kohler等人(1975) Nature 256: 495首先描述的雜交瘤方法制造，或可通過(guò)重組DNA方法(例如參照，美國(guó)專利號(hào)4，816，567)制造?！皢慰寺】贵w”還可使用例如 Clackson 等人(1991) Nature 352: 6^-6 和 Marks 等人(1991) J. MoI. Biol. 222: 581-597中描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫(kù)分離。
本文中的單克隆抗體明確地包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)(其中一部分重鏈和/ 或輕鏈與源自特定種類或?qū)儆谔囟贵w種類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列同一或同源，而鏈的其余部分與源自另一種類或?qū)儆诹硪豢贵w種類或亞類的抗體的相應(yīng)序列同一或同源)以及此類抗體的片段，只要它們展示期望的生物活性。美國(guó)專利號(hào)4，816，567 ；Morrison等人 (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA Sl 6851-6855。
“結(jié)構(gòu)域抗體“是只包含重鏈的可變區(qū)或輕鏈的可變區(qū)的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情況下，通過(guò)肽連接體共價(jià)連接兩個(gè)或更多個(gè)Vh區(qū)來(lái)產(chǎn)生二價(jià)結(jié)構(gòu)域抗體。 二價(jià)結(jié)構(gòu)域抗體的兩個(gè)Vh區(qū)可靶向相同的或不同的抗原。
"二價(jià)抗體"包含兩個(gè)抗原結(jié)合部位。在一些情況下，兩個(gè)結(jié)合部位具有相同的抗原特異性。然而，二價(jià)抗體可以是雙異性的。
如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“單鏈Fv"或"scFv"抗體是指包含抗體的Vh和/結(jié)構(gòu)域的抗體片段，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單個(gè)多肽鏈中。一般地，所述Fv多肽還包含Vh與/ 結(jié)構(gòu)域之間的多肽連接體，該連接體使得scFv能夠形成用于抗原結(jié)合的期望的結(jié)構(gòu)。關(guān)于 scFv 的綜述，參見(jiàn) Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES,第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore eds. Springer- Verlag, New York, pp. 269-315。
本文中的單克隆抗體還包括駱駝化的(camelized)單結(jié)構(gòu)域抗體。參見(jiàn)，例如， Muyldermans 等人(2001) Trends Biochem. Sci. 26 230 ；Reichmann 等人(1999) J. Immunol. Methods 231 :25 ；WO 94/04678 ；WO 94/25591 ；美國(guó)專利號(hào) 6，005，079)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了單結(jié)構(gòu)域抗體，所述抗體包含兩個(gè)具有修飾(以便形成單結(jié)構(gòu)域抗體)的Vh結(jié)構(gòu)域。
如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“雙體“是指具有兩個(gè)抗原結(jié)合部位的小抗體片段，所述片段在相同的多肽鏈或V^Vh)上包含連接的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(/)。通過(guò)使用太短以至不允許相同鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的連接體，所述結(jié)構(gòu)域被迫與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)并且產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合部位。雙體更詳細(xì)地描述于例如EP 404，097 ;W0 93/11161 和Holliger 等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448中。關(guān)于工程改造的抗體變體的綜述，參見(jiàn)Holliger和Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136。
如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”是指包含來(lái)自非人(例如，鼠)抗體以及人抗體的序列的抗體形式。此類抗體包含來(lái)源于非人免疫球蛋白的最小序列。一般地，人源化抗體可包含基本上至少一個(gè)，通常兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的全部，其中高變環(huán)的全部或基本上全部相應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)并且FR區(qū)的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的FR區(qū)。人源化抗體任選地也可包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)(通常人免疫球蛋白的恒定區(qū))的至少一部分。當(dāng)必需將人源化抗體與親本嚙齒類動(dòng)物抗體相同區(qū)別時(shí)，為抗體克隆名稱加上前綴"hum"、“hu"或"h"(盡管取決于上下文，這些相同的名稱也可指明特定蛋白質(zhì)的人形式)。嚙齒類動(dòng)物抗體的人源化形式通常包含親本嚙齒類動(dòng)物抗體的相同CDR序列， 雖然可包含某些氨基酸置換來(lái)增加人源化抗體的親和力、增加其穩(wěn)定性或出于其他原因。
抗體還包括具有經(jīng)修飾的(或經(jīng)封閉的)Fc區(qū)域(以提供改變的效應(yīng)子功能)的抗體。參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào) 5,624,821 ;W0 2003/086310 ；WO 2005/120571 ；WO 2006/0057702 ；Presta (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656。此類修飾可用于增強(qiáng)或抑制免疫系統(tǒng)的各種反應(yīng)，在診斷和治療中具有可能的有益作用。Fc區(qū)域的改變包括氨基酸的變化(置換、缺失和插入)、糖基化或去糖基化以及添加多個(gè)Fe。對(duì)Fc的改變還可改變治療性抗體的抗體半衰期。更長(zhǎng)的半衰期可導(dǎo)致更低頻率的給藥，伴隨著增加的方便和減少的材料使用。參見(jiàn)Presta (2005) J. Allergy CHn. Immunol. 116:731 at 734-35。
抗體還包括具有提供完全效應(yīng)子功能的完整Fc區(qū)域的抗體，例如人同種型IgGl 的抗體，其在靶細(xì)胞中誘導(dǎo)補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)或抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)。在一些實(shí)施方案中，施用本發(fā)明的抗體以從細(xì)胞群體中選擇性耗盡表達(dá)關(guān)連抗原(cognate antigen)的細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“完全人抗體”是指只包含人免疫球蛋白序列的抗體。如果在小鼠中，在小鼠細(xì)胞中或在來(lái)源于小鼠細(xì)胞的雜交瘤中產(chǎn)生，那么完全人抗體可包含鼠類糖鏈。類似地， “小鼠抗體”或“大鼠抗體”是指分別只包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗體。完全人抗體可利用噬菌體展示或其他分子生物學(xué)方法在人類中，在具有人免疫球蛋白種系序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中產(chǎn)生。
“結(jié)合化合物”是指能夠結(jié)合靶的分子、小分子、高分子、多肽、抗體或其片段或類似物或可溶性受體?！敖Y(jié)合化合物“還可以指分子的復(fù)合物，例如非共價(jià)復(fù)合物，離子化的分子以及共價(jià)或非共價(jià)地修飾的分子，例如通過(guò)磷酸化、酰化、交聯(lián)、環(huán)化或有限切割修飾的分子，所述分子能夠結(jié)合靶。當(dāng)用于指抗體時(shí)，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合化合物”是指抗體和其抗原結(jié)合片段?！敖Y(jié)合”是指結(jié)合化合物與靶的締合，其中在其中結(jié)合化合物可溶解或懸浮在溶液中的情況下，所述締合導(dǎo)致結(jié)合化合物的正常布朗運(yùn)動(dòng)減少?！敖Y(jié)合組合物“是指與穩(wěn)定劑、 賦形劑、鹽、緩沖劑、溶液或添加劑組合的分子例如結(jié)合化合物，其能夠結(jié)合靶。
預(yù)期的方法的抗體或來(lái)源于抗體的抗原結(jié)合部位的結(jié)合組合物以比對(duì)于無(wú)關(guān)抗原的親和力大至少在1倍，優(yōu)選大至少2倍，優(yōu)選大至少大9倍，更優(yōu)選大至少大19倍和最優(yōu)選大至少大99倍的親和力結(jié)合其抗原。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體可具有如例如通過(guò)katchard分析測(cè)定的大于約IO9升/mol的親和力。Munsen等人(1980) Analyt. Biochem. 107:220—239。
II.不含動(dòng)物產(chǎn)物/不含水解產(chǎn)物的生產(chǎn)給料添加劑
本發(fā)明基于消除對(duì)于在哺乳動(dòng)物(例如CH0)細(xì)胞培養(yǎng)中生產(chǎn)單克隆抗體和蛋白質(zhì)生物制劑中對(duì)動(dòng)物成分和成分不明確的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的依賴的期望。結(jié)果是在小規(guī)模生物反應(yīng)器中具有比補(bǔ)充有大豆水解產(chǎn)物的培養(yǎng)物的效價(jià)高25%的生產(chǎn)收得率以及在搖瓶研究中具有為不使用任意添加劑的培養(yǎng)物的效價(jià)的2倍的生產(chǎn)收得率的化學(xué)成分確定的生產(chǎn)給料添加劑。參見(jiàn)圖2。使用該改進(jìn)DMEM/F12濃縮物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的純度可與使用含水解產(chǎn)物的添加劑產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的純度相當(dāng)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了不含動(dòng)物成分和蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的高產(chǎn)單克隆抗體(mAb)生產(chǎn)給料添加劑。此類添加劑以增加的效價(jià)產(chǎn)生mAb，該mAb具有可與使用水解產(chǎn)物的常規(guī)方法相比較的產(chǎn)品質(zhì)量概括(product quality profile)。
在一些實(shí)施方案中，所述添加劑可用于培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生例如通過(guò)pl9亞基特異性結(jié)合人IL-23的治療性抗體或其抗原結(jié)合片段。結(jié)合人IL-23pl9的示例性抗體公開(kāi)了通常指定的國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào).WO 2008/103432中。在其他實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基可用于產(chǎn)生其他蛋白質(zhì)，包括特異性結(jié)合除了 IL_23pl9外的蛋白質(zhì)的抗體，包括抗體片段或衍生物、細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體、生長(zhǎng)因子、用作疫苗的多肽和甚至非治療性蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的生長(zhǎng)培養(yǎng)基添加劑(稱為“SP給料”)基于補(bǔ)充有維生素E和亞硒酸鈉(Na2SeO3)的改進(jìn)的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基濃縮制物。已報(bào)導(dǎo)了另一個(gè)用于抗體生產(chǎn)的進(jìn)料方案，其包括利用DMEM/F12和亞硒酸鈉的補(bǔ)充。Zhou等人(1997) Cytotechnology 24:990
進(jìn)料策略基于順流進(jìn)料原理，其中引入細(xì)胞培養(yǎng)物的營(yíng)養(yǎng)物的量基于營(yíng)養(yǎng)物消耗和細(xì)胞的生長(zhǎng)速率。參見(jiàn)，例如，Zhou等人(1997) Cytotechnology 24:99。在搖瓶中和小規(guī)模攪拌釜式生物反應(yīng)器(small-scale stirred tank bioreactors)(STR)中測(cè)試本發(fā)明的培養(yǎng)基和方法。同時(shí)評(píng)價(jià)生產(chǎn)過(guò)程的特征和產(chǎn)物評(píng)估。將搖瓶用于評(píng)估參數(shù)例如細(xì)胞生長(zhǎng)的一般特征、作為溫度的函數(shù)的生長(zhǎng)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基和給料培養(yǎng)基的作用和細(xì)胞系的初步穩(wěn)定性估計(jì)。平行地，將STR用于研究新型生產(chǎn)給料培養(yǎng)基在更受控制的環(huán)境中的可行性。 分析并且監(jiān)控隨營(yíng)養(yǎng)物給料和過(guò)程參數(shù)變化而發(fā)生的生理變化以減少產(chǎn)物偏差(product deviation)。
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如CHO細(xì)胞以產(chǎn)生治療性多肽例如抗體的方法。申請(qǐng)者通過(guò)使用每天補(bǔ)充SP給料，研究培養(yǎng)中的數(shù)個(gè)抗體生產(chǎn)細(xì)胞系以測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)物消耗率為最高時(shí)的時(shí)間。申請(qǐng)者發(fā)現(xiàn)每4g葡萄糖消耗Ig谷氨酰胺，從而導(dǎo)致SP給料中的1:4的谷氨酰對(duì)葡萄糖的比率。申請(qǐng)者還發(fā)現(xiàn)對(duì)于至少一些細(xì)胞系可能通過(guò)在生產(chǎn)運(yùn)行使用有限次數(shù)的批式進(jìn)料(bolus feed)而非每日給料來(lái)獲得高抗體效價(jià)和產(chǎn)量?？梢岳缭诮臃N后例如第3、5和10天以3次一次性進(jìn)料來(lái)進(jìn)行進(jìn)料。進(jìn)料次數(shù)的減少極大地簡(jiǎn)化了生產(chǎn)運(yùn)行，這在大規(guī)模生產(chǎn)運(yùn)行(例如用于制備臨床材料)中是特別有價(jià)值的。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括在生產(chǎn)運(yùn)行期間的一次或多次一次性進(jìn)料，例如，1、2、3、4、5或更多次一次性進(jìn)料。此類進(jìn)料優(yōu)選在培養(yǎng)物中的營(yíng)養(yǎng)物耗盡之前進(jìn)行，以便最優(yōu)化細(xì)胞活力和生產(chǎn)力。在一些情況下，此類進(jìn)料可在接種后第3、5和10天發(fā)生。
如圖IA中所顯示的，SP給料相對(duì)當(dāng)用大豆水解產(chǎn)物(用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的常用添加劑)補(bǔ)充細(xì)胞時(shí)獲得的效價(jià)增加抗體的終效價(jià)約20%至80%。本發(fā)明的給料添加劑還可與其他添加劑例如大豆水解產(chǎn)物組合使用，以使一些細(xì)胞系的產(chǎn)量再增加一些。圖IB顯示大豆水解產(chǎn)物增加產(chǎn)量20%，SP給料增加產(chǎn)量大于70%，而組合增加產(chǎn)生抗體B的細(xì)胞系的產(chǎn)
量 90%ο
如圖2A至2D中所舉例說(shuō)明的，對(duì)于許多不同的抗體，使用SP給料的補(bǔ)充相對(duì)于使用大豆水解產(chǎn)物的補(bǔ)充提高效價(jià)約20%至60%。在生物反應(yīng)器和搖瓶(圖2 A和2B)中使用SP給料的效價(jià)更高，對(duì)于兩種添加劑，與使用搖瓶相比較，在生物反應(yīng)器中效價(jià)高20 -33 % (數(shù)據(jù)未顯示)。
用于結(jié)果示于
圖1A、1B和2A至2D中的實(shí)驗(yàn)的抗體概述于表1中。
表1用于評(píng)估使用SP給料效價(jià)增加的抗體
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞給料添加劑濃縮物，其包含表3的成分1至47以及a)亞硒酸鈉；或b)維生素E。
2.權(quán)利要求
1的添加劑，其包含亞硒酸鈉和維生素E。
3.權(quán)利要求
1的添加劑，其中所述亞硒酸鈉以約0.3 mg/L存在。
4.權(quán)利要求
1的添加劑，其中所述維生素E以約30.2 mg/L存在。
5.一種生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，其包括在補(bǔ)充有權(quán)利要求
1的添加劑的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。
6.一種生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，其包括a)在培養(yǎng)物中使表達(dá)所述蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)；b)用權(quán)利要求
1的添加劑補(bǔ)充所述培養(yǎng)物；和c)從所述培養(yǎng)物回收蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求
6的方法，其還包括將培養(yǎng)物的溫度從37°C轉(zhuǎn)換至34°C。
8.權(quán)利要求
7的方法，其中在接種后第3、第4或第5天進(jìn)行溫度的轉(zhuǎn)換。
9.權(quán)利要求
6的方法，其中另外重復(fù)補(bǔ)充步驟(b)兩次或更多次。
10.權(quán)利要求
10的方法，其中在接種后第3、5和10天進(jìn)行補(bǔ)充步驟。
11.權(quán)利要求
5或6的方法，其中所述細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
12.權(quán)利要求
5或6的方法，其中所述蛋白質(zhì)是抗體或其抗原結(jié)合片段。
13.權(quán)利要求
12的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含人IgG恒定結(jié)構(gòu)域。
14.權(quán)利要求
12的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合人IL-23pl9。
15.權(quán)利要求
14的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含國(guó)際專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào) WO 2008/103432中公開(kāi)的抗體hui;3B8b的至少一個(gè)重鏈CDR和至少一個(gè)輕鏈CDR。
16.一種生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，其包括a)在培養(yǎng)物中使表達(dá)所述蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)；b)用亞硒酸鈉或維生素E補(bǔ)充所述培養(yǎng)物；和c)從細(xì)胞培養(yǎng)物獲得所述蛋白質(zhì)。
17.權(quán)利要求
16的方法，其中用亞硒酸鈉和維生素E補(bǔ)充所述培養(yǎng)物。
18.權(quán)利要求
16的方法，其中向所述培養(yǎng)物中加入亞硒酸鈉以產(chǎn)生約0.02mg/L的終濃度。
19.權(quán)利要求
16的方法，其中向所述培養(yǎng)物中加入維生素E以產(chǎn)生約2mg/L的終濃度。
20.權(quán)利要求
16的方法，其中向所述培養(yǎng)物中加入亞硒酸鈉以產(chǎn)生約0.02mg/L的終濃度和向培養(yǎng)物中加入維生素E以產(chǎn)生約2 mg/L的終濃度。
專利摘要
提供了用于培養(yǎng)用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物的改進(jìn)的給料添加劑。改進(jìn)的添加劑不含動(dòng)物來(lái)源的成分和蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。本發(fā)明還提供了在治療性蛋白例如抗體的生產(chǎn)中使用添加劑的方法。在一些實(shí)施方案中，抗體是抗人IL-23p19抗體。
文檔編號(hào)C12N5/07GKCN102257131SQ200980151008
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2009年12月17日
發(fā)明者歐陽(yáng) A., S. 馬納罕 M., L. W. 凌 W. 申請(qǐng)人:先靈公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan