專利名稱:具有增大的種子大小的轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有增大種子大小的轉(zhuǎn)基因植物和制備該植物的方法。
技術(shù)背景
為了增大植物種子的大小，已經(jīng)開展了雜交育種和隨機(jī)突變目的基因的工作。但是迄今為止還沒有建立起令人滿意的植物目的基因的突變技術(shù)。因此，人工修飾還很困難。 雖然已經(jīng)分離了與種子大小相關(guān)的基因，但絕大多數(shù)這些鑒定的基因都是調(diào)控種子大小的基因，因?yàn)闅倪@些基因?qū)е路N子增大或減小。
導(dǎo)入了增大種子大小基因的轉(zhuǎn)基因植物的一個(gè)例子是導(dǎo)入了源自水稻 PLAST0CHR0N1 基因(National Center for Biotechnology Information (NCBI)注冊(cè)號(hào) AB096259)的水稻，其中利用二元載體和通過電穿孔的方法將該基因?qū)胨局参?，從而增大該水稻種子的重量(日本專利公開號(hào)(kokai) :2005-204621A)。這種轉(zhuǎn)基因植物是通過將源自水稻的基因?qū)胨局参飦碇苽?。但將這種基因?qū)肫渌撬局参飼r(shí)，是否能夠增大種子大小還不知道。
本發(fā)明公開
本發(fā)明要達(dá)到的目的
本發(fā)明的目的是鑒定與增大種子大小有關(guān)的DNA和提供通過將該DNA導(dǎo)入植物從而使種子大小增大的轉(zhuǎn)基因植物和制備該植物的方法。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的手段
本發(fā)明者們?yōu)榱诉_(dá)到以上目的，進(jìn)行了集中的研究。結(jié)果，他們通過利用Fox狩獵系統(tǒng)(Fox hunting system)鑒定了與種子大小增大有關(guān)的基因，將這種基因?qū)胫参?，使其在植物里過表達(dá)，從而完成本發(fā)明。
本發(fā)明概述如下
[1] 一種轉(zhuǎn)基因植物，其中導(dǎo)入了編碼以下(a)-(c)任意一種蛋白的DNA，使其能夠在植物中表達(dá)
(a)包含SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列的蛋白；
(b)包含源自SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列缺失、置換或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性；或
(c)包含與SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性。
[2] 一種轉(zhuǎn)基因植物，其中導(dǎo)入了以下(d)-(g)任意一種DNA，使其能夠在植物中表達(dá)
(d)包含SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列的DNA ；
(e)包含源自SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列缺失、置換或增加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的核苷酸序列的DNA，所述DNA編碼的蛋白具有增大種子大小的活性；
(f)包含與SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列具有90%以上同一性的核苷酸序列的DNA，其編碼的蛋白具有增大種子大小的活性；或
(g) 一種DNA，其在嚴(yán)格條件下與包含與SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列組成的DNA互補(bǔ)的核苷酸序列的DNA雜交，并且所述DNA編碼的蛋白具有增大種子大小的活性。
[3] 一種轉(zhuǎn)基因植物，其中導(dǎo)入了編碼以下(h)-(j)任意一種蛋白的DNA，使其能夠在植物中表達(dá)
(h)包含SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列的蛋白；
(i)包含源自SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列缺失、置換或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性；或
(j)包含與SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性。
[4]根據(jù)[1]_[3]任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述增大種子大小的活性是增大種子表面積、大小或重量的活性。
[5]根據(jù)[1]_[4]任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物，其是植物、植物的部分、培養(yǎng)的植物細(xì)胞或種子。
[6]包含編碼以下(a) -(c)任何一種蛋白的DNA的重組載體
(a)包含SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列的蛋白；
(b)包含源自SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列缺失、置換或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性；或
(c)包含與SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性。
[7]包含以下(d)(d)包含SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列的DNA ；
(e)包含源自SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列缺失、置換或增加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的核苷酸序列的DNA，所述DNA編碼的蛋白具有增大種子大小的活性；
(f)包含與SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列具有90%以上同一性的核苷酸序列的DNA，其編碼的蛋白具有增大種子大小的活性；或
(g) 一種DNA，其在嚴(yán)格條件下與包含與SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列組成的DNA互補(bǔ)的核苷酸序列的DNA雜交，并且所述DNA編碼的蛋白具有增大種子大小的活性。
[8]包含編碼以下(h)(h)包含SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列的蛋白；
(i)包含源自SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列缺失、置換或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性；或
(j)包含與SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性。
[9] 一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括將編碼以下(a)-(c)任何一種蛋白的DNA 導(dǎo)入植物細(xì)胞并且培養(yǎng)植物
(a)包含SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列的蛋白；
(b)包含源自SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列缺失、置換或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性；或[0041](c)包含與SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性。
[10] 一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括將以下(d)-(g)任何一種DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞并且培養(yǎng)植物
(d)包含SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列的DNA ；
(e)包含源自SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列缺失、置換或增加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的核苷酸序列的DNA，所述DNA編碼的蛋白具有增大種子大小的活性；
(f)包含與SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列具有90%以上同一性的核苷酸序列的DNA，其編碼的蛋白具有增大種子大小的活性；或
(g) 一種DNA，其在嚴(yán)格條件下與包含與SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列組成的DNA互補(bǔ)的核苷酸序列的DNA雜交，并且所述DNA編碼的蛋白具有增大種子大小的活性。
[11] 一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括將編碼以下(h)-(j)任何一種蛋白的 DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞并且培養(yǎng)植物
(h)包含SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列的蛋白；
(i)包含源自SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列缺失、置換或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性；或
(j)包含與SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性。
[12]根據(jù)[9]_[11]任何一項(xiàng)的方法，其中DNA的導(dǎo)入是利用前述[6]-[8]任一項(xiàng)的重組載體。
本申請(qǐng)要求日本專利申請(qǐng)序列號(hào)2008-267877的優(yōu)先權(quán)，其說明書和/或附圖公開的內(nèi)容結(jié)合到本申請(qǐng)中。
本發(fā)明的效果
用于本發(fā)明的DNA涉及增大種子大小，將這種DNA導(dǎo)入植物和在植物里過表達(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生具有增大種子大小的植物。因?yàn)槿绻麑?duì)植物實(shí)施轉(zhuǎn)化，則這種DNA能在植物里高表達(dá)，所以本發(fā)明適用于任何植物。即使被導(dǎo)入屬于不同科的植物，用于本發(fā)明的DNA也能夠增大種子大小。此外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物能使產(chǎn)生的農(nóng)作物表現(xiàn)出較高的種子產(chǎn)量。通過增大種子大小，也能夠提高植物產(chǎn)品的價(jià)值。
附圖簡(jiǎn)述

圖1示實(shí)例流程圖。
圖2示野生型種子和K06835和K15507的T2代種子。
圖3示野生型種子和K32722的T2代種子。
圖4示野生型種子和K42340的T2代種子。
圖5示野生型種子的面積和K32722和K42340的T2代種子的面積。
圖6的柱狀圖示野生型種子和K32722的T2代種子的面積。
圖7的柱狀圖示野生型種子和K42340的T2代種子的面積。
圖8示野生型種子和K32722的T2代種子的體積。
圖9示具有高同一性的玉米、擬南芥(Arabidopsis thaliana)和苜蓿蛋白(即同源蛋白)的氨基酸序列與導(dǎo)入K32722的DNA(AK073303)編碼的氨基酸序列的比較圖。[0065]執(zhí)行本發(fā)明的最佳模式
(1)涉及增大種子體積的DNA
用于本發(fā)明的涉及增大種子大小的DNA編碼以下(a)-(c)的任何一種蛋白
(a)包含SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列的蛋白；
(b)包含源自SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列缺失、置換或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性；或
(c)包含與SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性。
或者，用于本發(fā)明的涉及增大種子大小的DNA是以下(d)-(g)的任何一種DNA:
(d)包含SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列的DNA ；
(e)包含源自SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列缺失、置換或增加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的核苷酸序列的DNA，所述DNA編碼的蛋白具有增大種子大小的活性；
(f)包含與SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列具有90%以上同一性的核苷酸序列的DNA，其編碼的蛋白具有增大種子大小的活性；或
(g) 一種DNA，其在嚴(yán)格條件下與包含與SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列組成的DNA互補(bǔ)的核苷酸序列的DNA雜交，并且所述DNA編碼的蛋白具有增大種子大小的活性。
或者，用于本發(fā)明的涉及增大種子大小的DNA是編碼以下(h)-(j)的任何一種蛋白的DNA
(h)包含SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列的蛋白；
(i)包含源自SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列缺失、置換或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性；或
(j)包含與SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性。
本文所用術(shù)語“具有增大種子大小的活性的蛋白(或DNA) ”指直接或者間接涉及增大種子大小的蛋白(或DNA)。
本文所用術(shù)語“DNA，，包括基因組DNA、基因、cDNA等。
本文所用術(shù)語“增大種子大小的活性”指任何活性，只要這種活性使種子大小大于野生型的種子。其例子包括增加種子表面積、體積或重量的活性。種子大小并沒有特別限制，只要種子大小在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著大于野生型種子即可。例如，優(yōu)選種子大小比野生型的種子大至少 5%,10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,^； 50%。
本文所用術(shù)語“源自......氨基酸序列缺失、置換或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨
基酸序列”意指例如特定氨基酸序列缺失1-10個(gè)、優(yōu)選缺失1-5個(gè)氨基酸，特定氨基酸序列的1-10個(gè)、優(yōu)選1-5個(gè)氨基酸被其它氨基酸置換，或者特定氨基酸序列增加1-10個(gè)、優(yōu)選增加1-5個(gè)氨基酸。
本文所用表述“與......氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列”里的術(shù)
語“同一性”指90 %以上，優(yōu)選95 %以上，更優(yōu)選98 %以上，更優(yōu)選99 %以上的同一性。
本文所用術(shù)語“同一性”指比對(duì)的兩條氨基酸序列(或核苷酸序列)之間的匹配程度，以便使相同氨基酸殘基數(shù)量(或相同核苷酸數(shù)量)最大化。具體來說，同一性為相同氨基酸殘基數(shù)(或相同核苷酸數(shù))相對(duì)于總氨基酸殘基的數(shù)(或總核苷酸數(shù))的百分比(%)。百分比同一性能用已知的算法確定，例如BLAST或FASTA。當(dāng)在FASTA算法中引入間隔時(shí)，間隔的數(shù)量包含在氨基酸殘基的總量中(或核苷酸的總量中)。
本文所用術(shù)語“源自......核苷酸序列缺失、置換或增加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的核
苷酸序列”意指例如特定核苷酸序列缺失1-10個(gè)、優(yōu)選缺失1-5個(gè)核苷酸，特定核苷酸序列的1-10個(gè)、優(yōu)選1-5個(gè)核苷酸被其它核苷酸置換，或者特定核苷酸序列增加1-10個(gè)、優(yōu)選增加1-5個(gè)核苷酸。
本文所用表述“與......核苷酸序列具有90%以上同一性的核苷酸序列”里的術(shù)
語“同一性”指90 %以上，優(yōu)選95 %以上，更優(yōu)選98 %以上，更優(yōu)選99 %以上的同一性。
本文所用術(shù)語“嚴(yán)格條件”指在該條件下所謂的特異性雜交體能形成，而基本上沒有非特異性的雜交體形成。在這種嚴(yán)格條件下，例如具有高同一性的核酸的互補(bǔ)鏈 (即DNA的組成核苷酸序列與特定核苷酸序列具有90%以上，優(yōu)選95%以上，更優(yōu)選98% 以上，更優(yōu)選99%以上的同一性)可進(jìn)行雜交，而同一性低于此水平的核酸的互補(bǔ)鏈不能進(jìn)行雜交。更具體地，鈉鹽的濃度是15-750mM，優(yōu)選50_750mM，更優(yōu)選300-750mM ；溫度是25°C -70°C，優(yōu)選50°C -70°C，更優(yōu)選55°C -65°C ；甲酰胺的濃度是0% -50%，優(yōu)選 20% -50%，更優(yōu)選35% -45%。另外在此嚴(yán)格條件下，用于洗滌雜交后的濾膜的鈉鹽濃度通常是 15-600mM，優(yōu)選 50_600mM，更優(yōu)選 300_600mM，溫度是 50°C _70°C，優(yōu)選 55°C -70°C, 更優(yōu)選 60°C -65°C。
或者，在嚴(yán)格條件下，雜交可以在如下條件下進(jìn)行室溫到40°C并在的氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC，Ix SSC指150mM氯化鈉和15mM檸檬酸鈉；pH 7. 0)的存在下；然后，于 50°C _68°C，在 0. Ix-Ix SSC (優(yōu)選 0. Ιχ-O. 2x SSC)和 0. 1 % SDS 存在下，洗滌一次或數(shù)次。
用于本發(fā)明的DNA的核酸片段可以利用根據(jù)編碼SEQ ID NO :2、4、6、8、9、10或11 的氨基酸序列的DNA序列或者根據(jù)SEQ ID NO :1、3、5、7的DNA序列設(shè)計(jì)的引物，以及利用從cDNA文庫或基因組DNA文庫得到的核酸作為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得。這種DNA的核酸片段可以利用以上文庫等獲得的核酸作為模板和DNA片段(這種DNA的部分)作為探針通過雜交獲得?；蛘?，這種DNA核酸片段還可以通過利用本領(lǐng)域已知的各種核酸合成方法合成，例如化學(xué)合成。
上述DNA或者氨基酸的缺失、置換或者增加可以通過本領(lǐng)域已知的方法修飾編碼相關(guān)蛋白的DNA實(shí)現(xiàn)。在DNA中導(dǎo)入突變可以通過例如Kunkel法或缺口型雙鏈體法(Gapped duplex method)實(shí)現(xiàn)。導(dǎo)入突變還可用定點(diǎn)突變的突變?cè)噭┖?例如 Mutant-K (Takara Bio Inc.)或 LA PCR 體外突變?cè)噭┖?Takara Bio Inc.)) (Sambrook 等，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社；Ausubel等，1995，Short Protocols in Molecular Biology,第三版，John Wiley & Sons, Inc.)。
第一次發(fā)現(xiàn)用于本發(fā)明的DNA具有增大種子大小的活性是通過檢測(cè)利用Fox狩獵系統(tǒng)得到的轉(zhuǎn)基因植株系種子的大小，然后鑒定導(dǎo)入植株后產(chǎn)生顯著比野生型大的種子的 cDNA。
Fox狩獵系統(tǒng)(即全長(zhǎng)cDNA過表達(dá)子基因狩獵系統(tǒng))是一種依據(jù)性狀改變的用于闡釋基因功能的技術(shù)，其中性狀改變是因?yàn)樵谥参镏袑?dǎo)入全長(zhǎng)cDNA后高表達(dá)所致(日本專利公開號(hào)(Saikohyo) 2003-018808A)。本發(fā)明中，水稻全長(zhǎng)cDNA用作導(dǎo)入植物的全長(zhǎng)cDNA， 可導(dǎo)入全長(zhǎng)cDNA的植物的實(shí)例是擬南芥(Arabidopsis thaliana)，但不僅限于擬南芥。[0094]特別地，以下列方式利用Fox狩獵系統(tǒng)能鑒定用于本發(fā)明的DNA。
具體地，大約13，000種獨(dú)立水稻全長(zhǎng)cDNA以同等的比例制備成基因池(稱作“歸一化(normalization)”)，將這些cDNA整合入包含調(diào)控區(qū)域(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子(例如轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子E21或omega序列)、終止子)和選擇性標(biāo)記(例如耐藥基因)的T-DNA載體。 將得到的T-DNA載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium)，得到水稻全長(zhǎng)cDNA表達(dá)文庫(稱作水稻FOX文庫)，然后證實(shí)該文庫是否反應(yīng)了完整的cDNA分布。此后，用上述農(nóng)桿菌通過浸花法(floral dipping method)轉(zhuǎn)化擬南芥而得到轉(zhuǎn)基因的擬南芥植株系(水稻FOX植株系)。在FOX狩獵系統(tǒng)中，即使植物感染用的文庫包含數(shù)億克隆，每個(gè)植株也只有一個(gè)或兩個(gè)克隆導(dǎo)入。因而得到單株導(dǎo)入了不同克隆的轉(zhuǎn)基因植株。
從由此獲得的大約20，000個(gè)水稻FOX植株系的初級(jí)重組擬南芥(TO)收集Tl代種子，將其播種于包含抗生素的培養(yǎng)基，進(jìn)而選擇，因此得到Tl代轉(zhuǎn)化植株。通過這種轉(zhuǎn)化植株自花授粉得到的種子稱為T2代種子。視覺觀察T2代種子(例如，每株系50粒種子)，同時(shí)利用種子形態(tài)檢測(cè)程序WINSEEDLE (Regent Instruments)進(jìn)行分析，將種子圖形數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)。WINSEEDLE程序根據(jù)種子的圖形檢測(cè)種子形態(tài)、大小和顏色。該程序測(cè)量種子的長(zhǎng)和寬并輸入計(jì)算機(jī)，因此得到其面積。以野生型擬南芥種子作為對(duì)照，篩選主體產(chǎn)生的種子顯著比野生型種子大的植株系。播種和培養(yǎng)挑選出的植株系的種子，確證是否表現(xiàn)出增大種子大小的表型可以重復(fù)。提取可重復(fù)目的表型的種子的基因組DNA，通過PCR分離導(dǎo)入的水稻全長(zhǎng)cDNA。這種cDNA稱作使種子大小增大的候選DNA。候選DNA再次導(dǎo)入擬南芥， 過表達(dá)，證實(shí)種子是否增大，經(jīng)過證實(shí)的水稻全長(zhǎng)cDNA確定為具有增大種子大小的活性的 DNA(即編碼具有增大種子大小活性的蛋白的DNA)。
以此種方式鑒定的DNA注冊(cè)于NCBI，注冊(cè)號(hào)如下所示
AK100982 (DNA 序列SEQ ID NO 1 ；氨基酸序列SEQ ID NO 2)；
AK099678 (DNA 序列:SEQ ID NO 3 ；氨基酸序列:SEQ ID NO 4)；
AK073303 (DNA 序列:SEQ ID NO 5 ；氨基酸序列:SEQ ID NO 6)；
AK071204 (DNA 序列SEQ ID NO 7 ；氨基酸序列SEQ ID NO :8)。
用上述源自水稻的氨基酸序列與源自其它植物種的氨基酸序列進(jìn)行比較，編碼高度一致的氨基酸序列的DNA和編碼具有增大種子大小的活性的蛋白的DNA可用于本發(fā)明。 比較序列的同一性可以例如通過使用序列同源性檢索程序(例如BLAST或FASTA)讀取 NCBI或EMBL (歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室)的序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行(例如Alteschul，S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 15 :403-410 ；Karlin, S. and Altschul S. F. ，1990, Proc. Natl. Acad. Sci.，U. S. Α. ,87 :2264-2268)。
源自其它植物種的、與ΑΚ073303氨基酸序列具有高度同一性的氨基酸序列的例子包括源自玉米的氨基酸序列(SEQ ID N0:9 ;NCBI注冊(cè)號(hào)ACF86069(氨基酸序列)和ΒΤ041064ΦΝΑ序列))、源自擬南芥的氨基酸序列(SEQ ID NO 10 ;NCBI注冊(cè)號(hào) NP#567660 (氨基酸序列)和 NM#118359 (DNA 序列))、源自苜蓿(Medicago truncatula)的氨基酸序列(SEQ ID NO 11 ；NCBI注冊(cè)號(hào)AB擬8483 (氨基酸序列)和AC148915. 2 (DNA序列))。
(2)重組載體
構(gòu)建用于轉(zhuǎn)化植物的本發(fā)明的重組載體能通過將編碼上述(a)-(c)和(h)-(j)任何一種蛋白的DNA或上述(d)-(g)任何一種DNA導(dǎo)入合適載體獲得。作為載體，優(yōu)選能通過農(nóng)桿菌將目的DNA導(dǎo)入植物的基于pBI的、基于pPZP的、基于pSMA的載體和其他載體。 特別地，優(yōu)選基于PBI的二元載體或者中間載體，其實(shí)例包括pBI 121、pBIlOl、pBIlOl. 2、 ρΒΙΙΟΙ.3和pBIG2113載體。二元載體是能在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中繁殖的穿梭載體。當(dāng)植物感染了包含二元載體的農(nóng)桿菌，位于載體上的LB序列和RB序列組成的邊界序列之間的 DNA能夠整合進(jìn)入植物的核DNA。其他載體的實(shí)例包括基于pUC的載體，其能夠直接使DNA 導(dǎo)入植物，例如PUC18、pUC19和pUC9載體。進(jìn)一步的其他載體的實(shí)例包括植物病毒載體， 例如花椰菜花葉病毒(CaMV)、菜豆金色花葉病毒(BGMV)和煙草花葉病毒(TMV)載體。
當(dāng)使用基于二元載體的質(zhì)粒時(shí)，目的基因插入上述二元載體的邊界序列之間(LB 和RB之間)，重組載體用大腸桿菌繁殖。接下來，將繁殖的重組載體通過電穿孔或其他方式導(dǎo)入例如根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)GV310U C58、LBA4404、EHAlOl 或 EHA105或者發(fā)根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes) LBA1334,目的DNA再通過使用這種農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物。
剛開始時(shí)，為了將DNA插入載體，例如可利用的方法是用合適的限制性內(nèi)切酶切割純化的DNA，再將獲得的DNA通過插入合適載體的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)或多克隆位點(diǎn)連接到載體。
另外，有必要以使DNA發(fā)揮其功能的方式整合目的DNA進(jìn)入載體。在這方面，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子、當(dāng)使用二元載體系統(tǒng)時(shí)需要的復(fù)制起點(diǎn)(例如源于Ti或Ri質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn))、選擇標(biāo)記基因等可以連接到目的DNA的上游、內(nèi)部或下游的載體區(qū)域。
啟動(dòng)子并不一定源自植物，只要是能在植物細(xì)胞起功能、在植物特定組織或特定的發(fā)育階段誘導(dǎo)表達(dá)的DNA。其具體的實(shí)例包括花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動(dòng)子、胭脂氨酸合酶基因(NOS)的啟動(dòng)子、源于玉米的泛蛋白啟動(dòng)子、源于水稻的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和源于煙草的I3R蛋白啟動(dòng)子。
增強(qiáng)子的實(shí)例包括包含CaMV 35S啟動(dòng)子的上游序列的增強(qiáng)子區(qū)域、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子 E12和歐咪伽(omega)序列，這些增強(qiáng)子被用于提高目的DNA的表達(dá)效率。
終止子可以是能終止由啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因轉(zhuǎn)錄的任何序列，其實(shí)例包括胭脂氨酸合酶基因的終止子、章魚堿合酶(0CQ基因的終止子和CaMV 35S RNA基因的終止子。
選擇標(biāo)記基因的實(shí)例包括潮霉素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因、新霉素抗性基因、雙丙氨膦(bialaphos)抗性基因和二氫葉酸還原酶基因。
(3)轉(zhuǎn)基因植物及其制備方法
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物能通過將上述編碼(a)-(c)和(h)-(j)任意一種蛋白的DNA、 上述(d)-(g)任意一種DNA或上述重組載體導(dǎo)入目的植物獲得。本發(fā)明中，“導(dǎo)入DNA”意指這樣一種情況，其中例如通過已知的遺傳工程方法將目的DNA導(dǎo)入上述宿主植物細(xì)胞， 使得能夠在其中表達(dá)。因此而導(dǎo)入的DNA能整合到宿主植物的基因組DNA或保持包含于外源載體內(nèi)。
本文所用的條件“使得能夠被表達(dá)”指在這樣的條件下有調(diào)控序列例如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的存在時(shí)，DNA可組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)。
導(dǎo)入DNA或重組載體可以通過已知方法實(shí)現(xiàn)，例如農(nóng)桿菌法、PEG-磷酸鈣法、電穿孔法、脂質(zhì)體法、粒子基因槍法或顯微注射法。農(nóng)桿菌法包括利用原生質(zhì)體的方法、組織碎片的方法和植物體的方法(原位法，the in planta method)。利用原生質(zhì)體的方法能通過將原生質(zhì)體和包含Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒的農(nóng)桿菌(分別為根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根土壤桿菌 (Agrobacterium rhizogenes))共培養(yǎng)的方法以及將原生質(zhì)體與農(nóng)桿菌的原生質(zhì)球融合的方法(原生質(zhì)球法)來實(shí)現(xiàn)。利用組織碎片的方法能通過例如感染目的植物的無菌培養(yǎng)的葉盤或感染愈傷組織(未分化的培養(yǎng)細(xì)胞)來實(shí)現(xiàn)。另外，利用種子或植物體的原位法可以通過直接用農(nóng)桿菌處理浸潤(rùn)種子、幼年植物(幼苗)、盆栽植物等來實(shí)現(xiàn)。這些植物轉(zhuǎn)化的方法可以通過以下資料的說明實(shí)現(xiàn)，例如“Shinpan Model shokubutsu no jikken protocol, Idengakutekishuho kara genome kaiseki made，，( 華“新片反，|莫型—白勺實(shí)驗(yàn)方法,從遺傳技術(shù)到基因組分析”)(Ko Shimamoto和Kiyotaka Okada指導(dǎo)，Shujunsha Co.，Ltd.，2001)。
DNA是否整合入植物體可以通過例如PCR、Southern雜交或Northern雜交證實(shí)。 例如從轉(zhuǎn)基因植物制備DNA，根據(jù)目的DNA設(shè)計(jì)特異性引物，然后進(jìn)行PCR。接下來，用擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細(xì)管電泳，用溴乙錠、SYBR Green溶液等對(duì)凝膠進(jìn)行染色，擴(kuò)增產(chǎn)物作為單一條帶被檢測(cè)到。因此，轉(zhuǎn)化被證實(shí)。還可以使用預(yù)先標(biāo)記了熒光染料等的引物來進(jìn)行PCR，然后檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物。另外，轉(zhuǎn)化還可以通過將擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合于固相物體例如微小培養(yǎng)板，接下來用熒光、酶或其他反應(yīng)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。
或者，轉(zhuǎn)化可以如下證實(shí)制備包含各種報(bào)告基因之一的載體，例如連接葡糖苷酸酶(GUS)、熒光素酶(LUC)、綠色熒光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、或β-半乳糖苷酶(LacZ)的基因于目的DNA的下游區(qū)域，利用如上所述導(dǎo)入了載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物，然后檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)水平。
用于本發(fā)明的待轉(zhuǎn)化的植物可以是單子葉植物或雙子葉植物，其實(shí)例包括但不限于十字花科(Brassicaceae)植物(包括擬南芥、卷心菜和油菜)、豆科(Leguminosae)植物 (包括豌豆、大豆、苜猜、赤豆(Phaseolus angularis)、馬豆(horse bean)禾口豆工豆(Vigna sinensis))、禾本科(Poaceae)植物(包括水稻、玉米、大麥和小麥)、菊科(Compositae) 植物(包括草紅花和向日葵)、胡麻科(Pedaliaceae)植物(例如芝麻)和大戟科 (Euphorbiaceae)植物(包括麻風(fēng)樹(Jatropha curcas)禾口蓖麻(Ricinus communis)。尤其優(yōu)選種子植物，例如可食用的種子植物和用于榨油的種子植物。
本發(fā)明中，用于轉(zhuǎn)化的植物材料可以是任何植物器官或組織，例如莖、葉、種子、胚芽、胚珠、子房、苗端、花藥、花粉、以上植物器官和組織的部分、未分化的愈傷組織和培養(yǎng)的植物細(xì)胞(例如用酶處理去掉愈傷組織細(xì)胞壁而獲得的原生質(zhì)體)。當(dāng)用原位法時(shí)，浸潤(rùn)種子和整個(gè)植物體都可以采用。
當(dāng)培養(yǎng)的植物細(xì)胞用于轉(zhuǎn)化時(shí)，為了從獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化體，可以通過已知組織培養(yǎng)技術(shù)再生器官或生物體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地利用廣泛已知的從植物細(xì)胞再生植物體的方法開展上述的操作。例如，從植物細(xì)胞再生植物體可以如下進(jìn)行。
當(dāng)植物組織或原生質(zhì)體用作植物材料用于轉(zhuǎn)化時(shí)，該植物組織或原生質(zhì)體培養(yǎng)于培養(yǎng)基以便形成愈傷組織，其通過添加無機(jī)元素、維生素、碳源、作為能源的糖、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(植物激素，例如植物生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯和油菜素類固醇)等來制備，然后滅菌。然后植物組織或原生質(zhì)體可以形成去分化的愈傷組織，它將增殖成為無定形的團(tuán)塊(下文稱作“愈傷組織誘導(dǎo)”)。轉(zhuǎn)移因此形成的愈傷組織到包含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑例如植物生長(zhǎng)激素的新鮮培養(yǎng)基，進(jìn)行進(jìn)一步的分裂繁殖(繼代培養(yǎng))。
例如，當(dāng)愈傷組織誘導(dǎo)開展于固體培養(yǎng)基例如瓊脂以及繼代培養(yǎng)通過液體培養(yǎng)物開展時(shí)，每種培養(yǎng)都能大量有效地開展。接下來，通過繼代培養(yǎng)增殖的愈傷組織在合適的條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)器官的再分化(下文稱作“再分化誘導(dǎo)”)，最終再生獲得完整植物體?？梢酝ㄟ^適當(dāng)?shù)卦O(shè)定培養(yǎng)基中組分的類型和量，例如植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(例如植物生長(zhǎng)激素和碳源、光、溫度和其他條件)來實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)再分化。形成不定胚、不定根、不定枝、不定莖、不定葉等，這些不定器官通過再分化誘導(dǎo)進(jìn)一步生長(zhǎng)成為完整植物體?；蛘?，這些不定器官也能在他們長(zhǎng)成完整植物體之前以此形式(例如包囊化人工種子、干胚或者凍干細(xì)胞或組織的形式)保存。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物包括導(dǎo)入了編碼以上(a)-(c)和(h)-(j)任何一種蛋白的 DNA以及以上(d)-(g)任何一種DNA的任何完整植物體、植物體的部分(例如葉、花瓣、莖、 根和花粉)、培養(yǎng)的植物細(xì)胞(例如愈傷組織和原生質(zhì)體)和種子。另外，它還包括通過對(duì)植物體和其部分、培養(yǎng)細(xì)胞和子代植物體種子進(jìn)行有性或無性繁殖獲得的子代植物體。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以通過從轉(zhuǎn)基因植物獲得繁殖材料例如種子和原生質(zhì)體，然后培植或培養(yǎng)該繁殖材料從而進(jìn)行大量的產(chǎn)生。
實(shí)施例
下文用下列實(shí)施例以更詳細(xì)的方式介紹本發(fā)明，雖然本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。
(1)由FOX狩獵系統(tǒng)產(chǎn)生水稻FOX植株系
本實(shí)施例中，通過將SfiI克隆位點(diǎn)導(dǎo)入組成型表達(dá)載體pBIG2113N(Taji，Τ. et al·，Plant J. ,2002,24(4) :ρρ· 417-426 ；和 Becker，D. et al.，Nucleic Acid Res. , 1990, 18(1) :p. 203)而獲得的pBIG2113SF用作以下的載體。
(i)制備歸一化的水稻全長(zhǎng)cDNA混合物
利用CAP捕獲法從水稻制備全長(zhǎng)cDNA。獲得的cDNA克隆入Lambda ZAP或Lambda pLC-1-B的SfiI限制性內(nèi)切酶之間的位點(diǎn)(參考文獻(xiàn)=Seki, M. et al.，Plant J.，15， 707-720，1998)。利用載體序列對(duì)cDNA的5，末端和3，末端進(jìn)行測(cè)序，然后對(duì)cDNA進(jìn)行歸類，鑒定了 20，000 個(gè)獨(dú)立的克隆(參考文獻(xiàn)Seki，M. et al.，Plant Physiol. Biochem.， 39，211-220，2001)。接下來，濃度為50ng/μ 1每個(gè)克隆取0. 5 μ 1份，混合所有克隆份于一支試管中。1 μ 1的混合物用于轉(zhuǎn)化20 μ 1的電感受態(tài)細(xì)胞DHlOB (Gibco BRL, U. S. Α.)?；旌洗蠹s200，000個(gè)生長(zhǎng)于包含氨芐青霉素的瓊脂培養(yǎng)基上的獨(dú)立集落，并從中提取質(zhì)粒。 由此獲得的質(zhì)粒稱為歸一化的水稻全長(zhǎng)cDNA混合物。
(ii)制備水稻FOX文庫
混合歸一化的水稻全長(zhǎng)cDNA混合物(2 μ g)和700 μ g的pBIG2113SF，同時(shí)用SfiI 進(jìn)行完全的酶切。此后，切割好的產(chǎn)物用異丙醇沉淀濃縮。沉淀溶于8μ1水后加入Ιμ 的IOX緩沖液和1 μ 1的Τ4連接酶混合，于16°c過夜進(jìn)行連接反應(yīng)。將2 μ 1的反應(yīng)溶液和40 μ 1的電感受態(tài)細(xì)胞DHlOB混合，進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
混合大約150，000個(gè)生長(zhǎng)于包含卡那霉素(Km)的瓊脂培養(yǎng)基的獨(dú)立集落，從中提取質(zhì)粒。收集的質(zhì)粒溶液(2 μ 1)和40 μ 1電感受態(tài)農(nóng)桿菌細(xì)胞GV3101混合，進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將大約150，000于包含卡那霉素的瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的獨(dú)立菌落懸浮置入LB液體培養(yǎng)基， 加入甘油制成15%的甘油溶液。獲得的溶液于_80°C保存。因此獲得的甘油溶液稱作水稻 FOX文庫。
(iii)制備水稻FOX植株系
使上述水稻FOX文庫的大約200，000個(gè)集落生長(zhǎng)并懸浮于浸潤(rùn)溶液，用野生型擬南芥(C0Iombia(Col-O)進(jìn)行浸花法。收獲種子(Tl代種子)，讓其于包含潮霉素的貧營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基(BAM)上發(fā)芽，然后將只有大約20，000個(gè)表現(xiàn)出潮霉素抗性的植株系移植到土壤生長(zhǎng)。讓植物自花授粉，因此獲得的種子稱作T2種子，檢測(cè)這些種子的大小。
(2)通過檢測(cè)T2代種子篩選水稻FOX植株系，鑒定因果性DNA的核苷酸序列，再將 DNA導(dǎo)入擬南芥。
T2代種子以大約每株系50粒的量置入塑料培養(yǎng)板的孔中(圖1(1))。當(dāng)直觀法檢測(cè)種子時(shí)，顯示種子的圖像作為數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)(圖1(幻)。同時(shí)，篩選產(chǎn)生的大部分的種子顯著比野生型種子大的植株。用WINSEEDLE程序檢測(cè)計(jì)算機(jī)圖像中種子的長(zhǎng)和寬，然后決定種子的面積(圖1C3))。播種和培植篩選的植株系種子，證實(shí)在接下來的后代中是否能重復(fù)展現(xiàn)出增大種子大小的表型。從可重復(fù)目的表型的種子中提取基因組DNA，用PCR 分離導(dǎo)入的水稻全長(zhǎng)cDNA，因此鑒定其核苷酸序列。
PCR反應(yīng)溶液的組分示于表1，PCR的一個(gè)循環(huán)包括94°C 0. 5分鐘，55°C 0. 5分鐘和72 °C 4分鐘，循環(huán)重復(fù)40次。
表 1
反應(yīng)溶液的組成
引物(100 pM) dNTP (200 μΜ) 緩沖液(χ2) 聚合酶基因組DNA 蒸餾水
2 χ 0.25 μ 4μ1 25 μ 0.5 μ 10 μ 10 ul
總體積50 μ
以下是用于PCR的引物
GTACGTATTTTTACAACAATTACCAACAAC(SEQ ID NO :12)；
GGATTCAATCTTAAGAAACTTTATTGCCAA(SEQ ID NO :13)。
從瓊脂糖凝膠中收集PCR產(chǎn)物，與pBIG2113SF混合，用SfiI進(jìn)行完全的酶切，異丙醇沉淀后用T4連接酶處理。用獲得產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。篩選插入了 PCR產(chǎn)物片段的質(zhì)粒，用上述的引物鑒定插入的因果性候選DNA的cDNA片段的核苷酸序列(圖1 (4))。
以和FOX狩獵系統(tǒng)同樣的方式將因果性候選DNA再次過表達(dá)于擬南芥(圖1 (5))，檢查種子大小是否會(huì)增加。證實(shí)的水稻全長(zhǎng)CDNA稱作增大種子大小的DNA。
(3)增大種子大小的DNA
在上面O)中發(fā)現(xiàn)的增大種子大小的DNA是導(dǎo)入下列四株Fox植株系的DNA(用數(shù)字標(biāo)注出來)。括弧內(nèi)的數(shù)字指示NCBI的注冊(cè)號(hào)，用于本文核苷酸序列的SEQ ID NO指示導(dǎo)入水稻FOX植株系的DNA。
K06835(AK100982, SEQ ID NO 1)；
K15507(AK099678, SEQ ID NO 3)；
K32722(AK073303, SEQ ID NO 5)；
K42340 (AK071204, SEQ ID NO 7)。
圖2示野生型種子以及K06835和K15507 T2代的種子。圖3示野生型種子和 K32722 T2代的種子。圖4示野生型種子和K42340 T2代的種子。根據(jù)這些圖發(fā)現(xiàn)水稻FOX 植株系的種子比野生型的種子大。
比較野生型的種子面積和通過再將DNA導(dǎo)入擬南芥并且過表達(dá)的種子(T2代種子)面積，其中DNA是已經(jīng)被用于導(dǎo)入K32722和K42340的DNA(圖5)。和野生型的種子比較，發(fā)現(xiàn)K32722和K42340的種子面積增加了大約40%。
圖6的柱形圖示野生型種子的面積和K32722的T2代種子的面積(即K32722過表達(dá)植株系的種子面積的分布)?？v軸指示種子數(shù)量，橫軸指示面積(即像素值)。野生型的種子在像素值為1，600時(shí)出現(xiàn)大峰，且這種峰呈現(xiàn)對(duì)稱正態(tài)分布樣的圖形。相反，K32722的種子表現(xiàn)出大峰和小峰。小峰(灰色)出現(xiàn)在野生型種子相同的位置(即像素值是1，600 處)，大峰(黑色)出現(xiàn)在代表面積大于野生型種子的面積的地方(即像素值是2，200)。因?yàn)檗D(zhuǎn)化植株的表型主要出現(xiàn)在分離代(segregating generation)中，所以大峰被認(rèn)為代表轉(zhuǎn)化植株。組成小峰(像素值1，586)的種子的平均面積被發(fā)現(xiàn)和野生型的種子大體上一致(像素值1，591)，而組成大峰的種子的平均面積(像素值2，429)被發(fā)現(xiàn)比野生型種子的平均面積大了大約50%。
圖7柱狀圖示野生型種子的面積和K42340的T2代的種子面積(即K42340過表達(dá)植株系的種子面積的分布)?？v軸指示種子數(shù)量，橫軸指示面積(即像素值)。K42340表現(xiàn)出不規(guī)則峰。K42340種子的峰相對(duì)野生型種子移到了右邊。這表明比野生型種子大的種子主要在該種群部分(population)。
圖8示作為例子的K32722的T2代種子的球狀體體積的計(jì)算結(jié)果(即K32722過表達(dá)植株系的種子體積)。和野生型的種子比較，K32722種子體積增加了大約50%。
圖9示下列氨基酸序列的比較結(jié)果導(dǎo)入K32722的DNA (AK073303)的氨基酸序列 (SEQ ID NO 6)、玉米(科禾本科；屬玉蜀黍?qū)?的氨基酸序列(SEQ ID NO 9)、擬南芥 (科十字花科；屬擬南芥)的氨基酸序列(SEQ ID N0:10)、苜蓿(科豆科；屬苜蓿屬) 的氨基酸序列(SEQ ID N0:11)。結(jié)果表明AK073303的DNA在不同科植物中高度保守。因此可以認(rèn)為將編碼SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11的氨基酸序列的DNA導(dǎo)入植物可以導(dǎo)致種子大小的增大。
所有以上引述的出版物、專利和專利申請(qǐng)都通過引用整體結(jié)合到本文中。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因植物，其中導(dǎo)入了編碼以下(a)-(c)任意一種蛋白的DNA，使其能夠在植物中表達(dá)(a)包含SEQID NO :2、4、6或8的氨基酸序列的蛋白；(b)包含源自SEQID NO :2、4、6或8的氨基酸序列缺失、置換或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性；或(c)包含與SEQID NO :2、4、6或8的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性。
2.—種轉(zhuǎn)基因植物，其中導(dǎo)入了以下(d)-(g)任意一種DNA，使其能夠在植物中表達(dá)(d)包含SEQID NO :1、3、5或7的核苷酸序列的DNA ；(e)包含源自SEQID NO :1、3、5或7的核苷酸序列缺失、置換或增加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的核苷酸序列的DNA，所述DNA編碼的蛋白具有增大種子大小的活性；(f)包含與SEQID NO :1、3、5或7的核苷酸序列具有90%以上同一性的核苷酸序列的 DNA，其編碼的蛋白具有增大種子大小的活性；或(g)一種DNA，其在嚴(yán)格條件下與包含與SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列組成的 DNA互補(bǔ)的核苷酸序列的DNA雜交，并且所述DNA編碼的蛋白具有增大種子大小的活性。
3.—種轉(zhuǎn)基因植物，其中導(dǎo)入了編碼以下(h)-(j)任意一種蛋白的DNA，使其能夠在植物中表達(dá)(h)包含SEQID NO :9、10或11的氨基酸序列的蛋白；(i)包含源自SEQID NO :9、10或11的氨基酸序列缺失、置換或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性；或(j)包含與SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性。
4.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求
1-3任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述增大種子大小的活性是增大種子表面積、體積或重量的活性。
5.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求
1-4任一項(xiàng)的轉(zhuǎn)基因植物，其是植物、植物的部分、培養(yǎng)的植物細(xì)胞或種子。
6.包含編碼以下(a)-(c)任何一種蛋白的DNA的重組載體(a)包含SEQID NO :2、4、6或8的氨基酸序列的蛋白；(b)包含源自SEQID NO :2、4、6或8的氨基酸序列缺失、置換或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性；或(c)包含與SEQID NO :2、4、6或8的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性。
7.包含以下(d)-(g)任何一種DNA的重組載體(d)包含SEQID NO :1、3、5或7的核苷酸序列的DNA ；(e)包含源自SEQID NO :1、3、5或7的核苷酸序列缺失、置換或增加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的核苷酸序列的DNA，所述DNA編碼的蛋白具有增大種子大小的活性；(f)包含與SEQID NO :1、3、5或7的核苷酸序列具有90%以上同一性的核苷酸序列的 DNA，其編碼的蛋白具有增大種子大小的活性；或(g)一種DNA，其在嚴(yán)格條件下與包含與SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列組成的DNA互補(bǔ)的核苷酸序列的DNA雜交，并且所述DNA編碼的蛋白具有增大種子大小的活性。
8.包含編碼以下(h)-(j)中任何一種蛋白的DNA的重組載體(h)包含SEQID NO :9、10或11的氨基酸序列的蛋白；(i)包含源自SEQID NO :9、10或11的氨基酸序列缺失、置換或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性；或(j)包含與SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性。
9.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括將編碼以下(a)-(c)任何一種蛋白的DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞并且培養(yǎng)植物(a)包含SEQID NO :2、4、6或8的氨基酸序列的蛋白；(b)包含源自SEQID NO :2、4、6或8的氨基酸序列缺失、置換或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性；或(c)包含與SEQID NO :2、4、6或8的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性。
10.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括將以下(d)-(g)任何一種DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞并且培養(yǎng)植物(d)包含SEQID NO :1、3、5或7的核苷酸序列的DNA ；(e)包含源自SEQID NO :1、3、5或7的核苷酸序列缺失、置換或增加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的核苷酸序列的DNA，所述DNA編碼的蛋白具有增大種子大小的活性；(f)包含與SEQID NO :1、3、5或7的核苷酸序列具有90%以上同一性的核苷酸序列的 DNA，其編碼的蛋白具有增大種子大小的活性；或(g)一種DNA，其在嚴(yán)格條件下與包含與SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列組成的 DNA互補(bǔ)的核苷酸序列的DNA雜交，并且所述DNA編碼的蛋白具有增大種子大小的活性。
11.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括將編碼以下(h)-(j)任何一種蛋白的DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞并且培養(yǎng)植物(h)包含SEQID NO :9、10或11的氨基酸序列的蛋白；(i)包含源自SEQID NO :9、10或11的氨基酸序列缺失、置換或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性；或(j)包含與SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大種子大小的活性。
12.根據(jù)權(quán)利要求
9-11任何一項(xiàng)的方法，其中DNA的導(dǎo)入是利用權(quán)利要求
6-8任一項(xiàng)的重組載體。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因植物，其導(dǎo)入的DNA編碼包含源自例如水稻植物的特別氨基酸序列的蛋白，而且所述植物具有增大的種子。本發(fā)明還公開了一種制備該轉(zhuǎn)基因植物的方法。
文檔編號(hào)A01H5/00GKCN102245769SQ200980151312
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2009年10月16日
發(fā)明者吉積毅, 廣近洋彥, 松井南, 栗山朋子, 高橋真哉, 黑田浩文 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所, 獨(dú)立行政法人理化學(xué)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan