專利名稱：：對(duì)轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測(cè)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)芯片法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及水稻、玉米、大豆、油菜籽、馬鈴薯、番茄、西葫盧、甜瓜及其加工產(chǎn)品中以及植物性詞料中轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測(cè)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)芯片法。
背景技術(shù)：
：由于對(duì)轉(zhuǎn)基因食品安全性的不確定性，使得各國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的管理從未放松過(guò)，而且越來(lái)越嚴(yán)格和規(guī)范。但隨著越來(lái)越多轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物的誕生，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的復(fù)雜性對(duì)管理部門的檢測(cè)技術(shù)提出了挑戰(zhàn)。目前對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)多采用PCR法，該方法有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，但面對(duì)越來(lái)越多需要檢測(cè)的外源基因，該方法的效率已成為瓶頸。而以高通量著稱的基因芯片(genechip)法，能滿足同時(shí)檢測(cè)大量基因的需要，但將該方法應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因檢測(cè)時(shí)，由于植物產(chǎn)品含有較多的次生代謝物質(zhì)，所提取的DNA不能直接用于芯片檢測(cè)，而要先經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物才能用于芯片檢測(cè)。因此普通基因芯片法并不能解決檢測(cè)效率低的問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種結(jié)合PCR技術(shù)和芯片技術(shù)形成的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)芯片法(簡(jiǎn)稱PCR-chip法)，使PCR擴(kuò)增和芯片檢測(cè)同步化，提高檢測(cè)效率，且能同步完成水稻、玉米、大豆、油菜籽、馬鈴薯、番茄、西葫蘆、甜瓜及其加工產(chǎn)品中以及植物性飼料中物種成分鑒定，外源基因鑒定，及轉(zhuǎn)基因植物品系鑒定。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明釆用以下技術(shù)方案1、芯片引物的設(shè)計(jì)及芯片制作選用四類引物(見表l):第一類為植物通用內(nèi)源基因，用于鑒定從植物源產(chǎn)品中抽提獲得的DNA的質(zhì)量是否符合實(shí)驗(yàn)要求；第二類為物種鑒定基因，用于成分鑒定，包括對(duì)水稻、玉米、大豆、油菜籽、馬鈴薯等的鑒定，也可用于鑒定DNA的質(zhì)量是否符合實(shí)驗(yàn)要求；第三類為外源基團(tuán)，用于外源基因鑒定，包括一系列啟動(dòng)子、終止子、各種3目的基因等；第四類為轉(zhuǎn)基因植物品系鑒定基因，用于轉(zhuǎn)基因植物的品系鑒定，包括中國(guó)允許進(jìn)口和不允許進(jìn)口的上述植物的各種轉(zhuǎn)基因品系。將上述四類引物中的下游引物的5'修飾10個(gè)連續(xù)的(GA)序列(5'-(GA)ur引物序列-3，)，并將此端固定在芯片上，點(diǎn)樣量設(shè)定為50pmol/點(diǎn)，每個(gè)引物在芯片上重復(fù)3次，完成芯片的制作。在設(shè)計(jì)芯片時(shí)，對(duì)引物的篩選考慮了對(duì)DNA質(zhì)量的判斷，即通過(guò)植物通用的內(nèi)源基因，判斷用于實(shí)驗(yàn)的DNA的質(zhì)量是否可靠，以防由于DNA的質(zhì)量而導(dǎo)致的假陰性;同時(shí)對(duì)一些已知其物種特異性基因的植物，包括水稻、玉米、大豆、油菜籽、馬鈴薯，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，進(jìn)行物種(成分)的鑒定；并針對(duì)一系列啟動(dòng)子、終止子、抗除草劑基因、抗蟲基因、抗病毒基因和品質(zhì)改良基因等外源基因設(shè)計(jì)引物，鑒定是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品和轉(zhuǎn)入的是什么外源基因等；最后通過(guò)在外源基因和植物內(nèi)源基因組之間的邊界序列，或兩個(gè)特異性外源基因之間的搭界序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)該轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品品系進(jìn)行鑒定。因此該芯片，不但能鑒定是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，同時(shí)能對(duì)物種(成分)和品系進(jìn)行鑒定。表1引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、芯片上的PCR反應(yīng)1)芯片預(yù)處理。將制備好的芯片浸泡在小牛血清(BSA，10mg/ml)中，室溫，0.5-1小時(shí)；磷酸緩沖液(PBS，pH=7.4)沖洗數(shù)變；滅菌水沖洗數(shù)變；干燥；在芯片引物陣列外圍粘上原位框(25ul)，形成PCR加樣區(qū)，備用。2)PCR加樣和PCR程序在芯片的25yl體系中，加入PCR緩沖液，MgCl"dNTP，taq酶，及需要檢測(cè)基因的上游引物(該引物的5'端用Cy5染料標(biāo)記，引物的量控制在50pmol左右)，需檢測(cè)樣品的高質(zhì)量的DNA，加水補(bǔ)足25ul。加樣完畢后，加蓋密封PCR反應(yīng)區(qū)。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C，lmin;40個(gè)循環(huán)(95°C,30S;55-60°C,150S;72。C，60S);72°C，10min。3、芯片檢測(cè)PCR程序完成后，用含O.P/。吐溫20的5XSSC緩沖液清洗芯片數(shù)次，在芯片掃描儀上檢測(cè)Cy5熒光強(qiáng)度，讀取和分析數(shù)據(jù)。上述步驟l所提及的芯片引物的設(shè)計(jì)及芯片制作，一旦引物設(shè)計(jì)完成，芯片可以批量生產(chǎn)，保證在一段時(shí)間內(nèi)使用量，并不需要每次都重新制作芯片。在有新的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品問世后，可以對(duì)芯片的引物進(jìn)行相應(yīng)的添加優(yōu)化。本發(fā)明把需檢測(cè)目的基因的下游引物通過(guò)生物素?；蛄姿峄潭ㄔ诳瞻仔酒?，而另一端自由的上游引物用Cy5染料標(biāo)記，通過(guò)芯片上的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，最后經(jīng)芯片掃描儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度判斷是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。本發(fā)明使PCR擴(kuò)增和芯片檢測(cè)同步化，具有以下有益效果l)保留了PCR方法的高靈敏度，高準(zhǔn)確度的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又繼承了芯片檢測(cè)方法高通量的優(yōu)點(diǎn)，提高了檢測(cè)效率，降低了檢測(cè)成本；2)優(yōu)化各檢測(cè)基因的引物，使不同的引物有相同或相近的退火溫度，同時(shí)通過(guò)半固定引物的方法減少了各引物間的相互干擾，保證了檢測(cè)的高準(zhǔn)確度；3)通過(guò)一次PCR程序，可以同時(shí)檢測(cè)十幾個(gè)甚至幾十個(gè)基因，大大提高了檢測(cè)的效率(理論上可以同時(shí)檢測(cè)芯片上所含引物的所有基因，為減少引物間的干擾，建議一次檢測(cè)將引物控制在50個(gè)以內(nèi)，可以保證PCR擴(kuò)增的準(zhǔn)確性)，同時(shí)，每個(gè)基因都有3個(gè)重復(fù)點(diǎn)，保證了檢測(cè)了重復(fù)性；4)PCR程序結(jié)束后，通過(guò)對(duì)熒光強(qiáng)度的掃描，可以判斷檢測(cè)樣品是否含有水稻、玉米、大豆、油菜籽、馬鈴薯等成分，同時(shí)可以判斷樣品中是否含有外源啟動(dòng)子、終止子、和各種功能性外源基因，最后還可以通過(guò)邊界序列上的引物，判斷該轉(zhuǎn)基因植物的品系；5)可以檢測(cè)到低至1%甚至0.1%的目的基因，完全可以滿足一般國(guó)際上要求的5%左右的檢測(cè)低限。下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1PCR-chip靈敏度驗(yàn)證如表1，設(shè)計(jì)、合成所有的引物，待用。將用作芯片的玻片用5N的NaOH浸泡活化2小時(shí)；ddH20沖洗30秒；在含有10%的3-氨丙基-三乙氧硅烷(3-aminopropyl-triethoxysilane)水溶液中，80。C下，浸泡2小時(shí)；ddH20沖洗30秒；12(TC下，烘干1小時(shí)；將100y1濃度為0.2mg/ml的中性親和素(neutravidin)滴加在玻片上，在潮濕的腔體內(nèi)，室溫放置2小時(shí)；ddH2O沖洗30秒；離心甩干，干燥放置備用。將適合濃度的下游引物通過(guò)點(diǎn)樣儀，按要求點(diǎn)樣在玻片上，即為所需芯片。取準(zhǔn)備好的樣品1，2，3(表2)進(jìn)行PCR-chip反應(yīng)。根據(jù)表3配制PCR反應(yīng)體系，在3個(gè)PCR反應(yīng)體系中分別加入樣品1，2，3各lwl，在3塊預(yù)處理后的芯片中分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?5°C，lmin;40個(gè)循環(huán)(95。C，30S;55。C,150S;72。C，60S);72'C，10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)芯片進(jìn)行沖洗，甩干后進(jìn)行掃描檢測(cè)。掃描結(jié)果顯示，樣品1和2都檢測(cè)到了大豆內(nèi)源基因Lectin,啟動(dòng)子CaMV35s，終止子N0S，抗除草劑8基因EPSPS和轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS40-3-2特有的DNA序列35s/cp4;而樣品3只檢測(cè)到了大豆內(nèi)源基因Lectin。結(jié)果說(shuō)明了該方法有較高的靈敏度，可以檢測(cè)到1%含量的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。表2實(shí)施例1的DNA樣品<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*由紫外分光光度計(jì)檢測(cè)得到；**由DNA總濃度和轉(zhuǎn)基因成分百分含量換算得到。表3PCR-Chip反應(yīng)體系成分體積10XPCRbuff2.5uldNTP(2,5mmol/L)2.0ulMgCl2(25腿ol/L)2.0ul標(biāo)記Cy5的上游引物X各0.5ul(20pmol/ul)*Tag(5u/y1)0.2ulDNA模板1.0ulddH20使反應(yīng)體系至25lU*已知樣品是大豆的情況下，我們只加入和轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)有關(guān)的上游引物，包括Lectin,CaMV35s，F(xiàn)MV35s，NOS，EPSPS，PAT，35s/cp4等。實(shí)施例2PCR-Chip準(zhǔn)確度和高通量驗(yàn)證芯片及引物的制備如實(shí)施例1。樣品是為以玉米為原材料的飼料。取100mg詞料，提取高質(zhì)量DNA(DNA濃度78.28ng/u1，0D26。/0D28。=1.68)。根據(jù)表3配制PCR反應(yīng)體系，由于已知樣品為玉米，上游引物的選擇和實(shí)施例l有所不同，選擇玉米內(nèi)源基因的引物ZEIN，同時(shí)為了驗(yàn)證是否含有其他原材料又選擇了大豆、油菜籽、馬鈴薯和大米的內(nèi)源引物，Lectin,PE3-PEPase,PATA和G0S9;外源基因CaMV35s，Actinl，F(xiàn)MV35s，N0S，PAT，Bar,G0X，Cry細(xì)，Cry9c，EPSPS的引物;以及和轉(zhuǎn)基因玉米品系鑒定有關(guān)的引物M0N810，BT176，BTll，GA21，T25,TC1507，M0N863，NK603,C朋351。加樣完畢后，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?5°C，lmin;40個(gè)循環(huán)(95。C，30S;56。C，150S;72'C，60S);72'C，10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)芯片進(jìn)行沖洗，甩干后進(jìn)行掃描檢測(cè)。掃描結(jié)果顯示，樣品檢測(cè)到了玉米內(nèi)源基因ZINE，啟動(dòng)子CaMV35s和Actinl，終止子NOS，9抗除草劑基因EPSPS，PAT,Bar,抗蟲基因CryIA(b)和Cry9c，同時(shí)顯示品系鑒定的有關(guān)基因位點(diǎn)GA21，CBH351，BT11也顯示陽(yáng)性。說(shuō)明這批飼料含有轉(zhuǎn)基因玉米成分，不含大豆、油菜籽、馬鈴薯和大米成分，且轉(zhuǎn)基因玉米的品系包括GA21，C朋351和BTll。核對(duì)相關(guān)的轉(zhuǎn)基因玉米品系資料發(fā)現(xiàn)，品系GA21含有的外源基因包括Actinl，N0S，EPSPS;品系CBH351含有外源基因CaMV35s，N0S，Bar，Cyr9c;品系BT11含有外源基因CaMV35s，N0S，PAT，CryIA(b)，皆和本檢測(cè)的結(jié)果符合。實(shí)施例3PCR-chip高通量驗(yàn)證芯片及引物的制備如實(shí)施例1。樣品為含有大米、油菜籽、馬鈴薯的混合物。取100mg樣品，抽提DNA(DNA濃度58.04ng/iil，OD260/OD280=2.07)。根據(jù)表3配制PCR反應(yīng)體系，選擇物種鑒定基因引物L(fēng)ectin、ZEIN、G0S9、PE3-PEPcase、PATA;外源基因CaMV35s，ActinI,FMV35s，N0S，PAT，Barnase，Barstar，Bar，NPTII,G0X,EPSPS，CrylAb/c，Cry3A，PVY-cp，PLRVr印的引物；以及和相關(guān)轉(zhuǎn)基因植物品系鑒定有關(guān)的引物Bt63,Topasl9/2，RF3，OXY235，Ms8，NewLeafAtlantic,NewLeafYRussetBurbank，NewLeafYSh印ody，NewLeafPlusRussetBurbank,EH92-527。加樣完畢后，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?5°C，lmin;40個(gè)循環(huán)(95°C，30S;56°C，150S;72°C，60S);72°C，lOmin。PCR反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)芯片進(jìn)行沖洗，甩干后進(jìn)行掃描檢測(cè)。掃描結(jié)果顯示，樣品檢測(cè)到了大米、油菜籽、馬鈴薯內(nèi)源基因G0S9、PE3-PEPcase、PATA，啟動(dòng)子CaMV35s，F(xiàn)MV35s和ActinI，終止子N0S，標(biāo)記基因NPTII，抗除草劑基因PAT，抗蟲基因Cry3A，CrylAb/c，抗病毒基因PVY-cp同時(shí)顯示品系鑒定的有關(guān)基因位點(diǎn)Bt63，Topasl9/2，NewLeafYRussetBurbank也顯示陽(yáng)性。說(shuō)明這批樣品中含有轉(zhuǎn)基因大米、油菜籽、馬鈴薯的成分，不含大豆和玉米成分，且轉(zhuǎn)基因大米的品系為Bt63，轉(zhuǎn)基因油菜籽的品系為T叩asl9/2，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的品系為NewLeafYRussetBurbank。核對(duì)相關(guān)的轉(zhuǎn)基因大米、油菜籽、馬鈴薯品系資料發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大米Bt63含有的外源基因包括Actinl、N0S、CrylAb/c;轉(zhuǎn)基因油菜籽T叩asl9/2含有的外源基因包括CaMV35s、NPTII、PAT;轉(zhuǎn)基因馬鈴薯NewLeafYRussetBurbank含有的外源基因包括FMV35s、N0S、NPTII、Cry3A、PVY-cp,皆和本檢測(cè)的結(jié)果符合。實(shí)施例4PCR-chip驗(yàn)證芯片及引物的制備如實(shí)施例1。樣品為番茄醬。取500mg樣品，抽提DNA(DNA濃度97.11ng/u1，OD260/OD280=1.67)。根據(jù)表3配制PCR反應(yīng)體系。選擇物種鑒定基因引物L(fēng)ectin、ZEIN、G0S9、PE3-PEPcase、PATA;由于番茄的物種特異性引物未知，因此有必要選擇一個(gè)植物通用引物(18SrDNA)以驗(yàn)證提取DNA的質(zhì)量；外源基因選擇CaMV35s，Actinl，F(xiàn)MV35s，N0S，PAT，NPTII，ACC，Sam-k的引物；以及和相關(guān)轉(zhuǎn)基因植物品系鑒定有關(guān)的引物，包括以下品系"華番一號(hào)"，Zeneca。加樣完畢后，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?5。C，lmin;40個(gè)循環(huán)(95。C,30S;56。C，150S;72。C，60S);72。C，10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)芯片進(jìn)行沖洗，甩干后進(jìn)行掃描檢測(cè)。掃描結(jié)果顯示，樣品檢測(cè)到了植物通用內(nèi)源基因18SrDNA，啟動(dòng)子CaMV35s，終止子NOS，標(biāo)記基因NPTII，同時(shí)顯示品系鑒定的有關(guān)基因位點(diǎn)Zeneca。說(shuō)明該樣品含有品系為Zeneca的轉(zhuǎn)基因番茄成分，但不含大豆、油菜籽、大米、馬鈴薯和玉米成分。核對(duì)相關(guān)的轉(zhuǎn)基因番茄品系資料發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄Zeneca含有的外源基因包括CaMV35s、NOS、NPTII;且含有內(nèi)源基因PG被反義后和NOS連接插入的片段(PG/NOS)，和本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果皆符合。權(quán)利要求1、對(duì)轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測(cè)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)芯片法，其方法如下把需檢測(cè)目的基因的下游引物通過(guò)生物素酰化或磷酸化固定在空白芯片上，而另一端自由的上游引物用Cy5染料標(biāo)記，通過(guò)芯片上的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，最后經(jīng)芯片掃描儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度判斷是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)芯片法，其特征在于具體步驟如下a、芯片引物的設(shè)計(jì)及芯片制作選用四類引物，第一類為植物通用內(nèi)源基因，第二類為物種鑒定基因，第三類為外源啟動(dòng)子、終止子或目的基因，第四類為轉(zhuǎn)基因植物品系鑒定基因，將上述各類引物中的下游引物的5'修飾10個(gè)連續(xù)的GA序列，并將此端固定在空白芯片上，完成芯片的制作；b、芯片上的PCR反應(yīng)1)芯片預(yù)處理將制備好的芯片浸泡在小牛血清中，室溫放置0.5-1小時(shí)，接著用磷酸緩沖液沖洗數(shù)遍，滅菌水沖洗數(shù)遍，干燥，然后在芯片引物陣列外圍粘上原位框，形成PCR加樣區(qū)，備用；2)PCR加樣和PCR程序在芯片的PCR加樣區(qū)中，加入PCR緩沖液、MgCl2、dNTP、和taq酶，及需要檢測(cè)基因的上游引物，需檢測(cè)樣品高質(zhì)量的DNA，需要檢測(cè)基因的上游引物的5'端用Cy5染料標(biāo)記，加樣完畢后，加蓋密封PCR反應(yīng)區(qū)，進(jìn)行PCR反應(yīng)；c、芯片檢測(cè)PCR反應(yīng)完成后，用吐溫20的5XSSC緩沖液清洗芯片數(shù)次，然后在芯片掃描儀上檢測(cè)Cy5熒光強(qiáng)度，讀取和分析數(shù)據(jù)。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)芯片法，其特征在于PCR反應(yīng)程序依次為95°C，lmin;40個(gè)循環(huán):95。C,30S;55。C，150S;72。C，60S;72°C，10min。全文摘要本發(fā)明公開了一種對(duì)轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測(cè)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)芯片法。目前對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)多采用PCR法，該方法有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，但面對(duì)越來(lái)越多需要檢測(cè)的外源基因，該方法的效率已成為瓶頸。本發(fā)明的技術(shù)方案為對(duì)轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測(cè)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)芯片法，其方法如下把需檢測(cè)目的基因的下游引物通過(guò)生物素?；蛄姿峄潭ㄔ诳瞻仔酒?，而另一端自由的上游引物用Cy5染料標(biāo)記，通過(guò)芯片上的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，最后經(jīng)芯片掃描儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度判斷是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。本發(fā)明保留了PCR方法的高靈敏度，高準(zhǔn)確度的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又繼承了芯片檢測(cè)方法高通量的優(yōu)點(diǎn)，提高了檢測(cè)效率，降低了檢測(cè)成本。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101638690SQ20091010209公開日2010年2月3日申請(qǐng)日期2009年8月31日優(yōu)先權(quán)日2009年8月31日發(fā)明者姍吳,張明哲,張曉峰,王華雄,陳笑梅申請(qǐng)人:浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心