專(zhuān)利名稱(chēng):一種突變基因?qū)敕椒ā⑼蛔儗?dǎo)入基因、突變導(dǎo)入盒和突變導(dǎo)入載體以及基因敲入非人類(lèi) ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種突變基因?qū)敕椒ā⑼蛔儗?dǎo)入基因、突變導(dǎo)入盒和突變導(dǎo)入載體以及基因敲入非人類(lèi)哺乳動(dòng)物。更具體地，本發(fā)明涉及一種能夠在靶基因上簡(jiǎn)便迅速且高幾率地導(dǎo)入所需要的突變基因DNA的突變基因?qū)敕椒?、突變?dǎo)入基因及其制備方法、突變導(dǎo)入盒和突變導(dǎo)入載體、以及具有突變導(dǎo)入基因的基因敲入非人類(lèi)哺乳動(dòng)物。
背景技術(shù)：
生物體中，利用基因這樣一種保持有遺傳信息的“設(shè)計(jì)圖”來(lái)控制用于維持其生命的所有機(jī)能這一說(shuō)法并不夸張。這些基因的全部遺傳信息，由被稱(chēng)為DNA的、包括4個(gè)堿基的堿基對(duì)的組合控制。若該堿基對(duì)的組合由于某種原因發(fā)生異常的變化，產(chǎn)生基因突變，則該堿基對(duì)的遺傳信息失去正常的功能，產(chǎn)生各種各樣的疾病等。
例如，為了查明人類(lèi)疾病的起因和發(fā)病等的機(jī)理，研究在人類(lèi)體內(nèi)哪個(gè)基因與該疾病的起因和發(fā)病等的表達(dá)相關(guān)是非常重要的。然而，利用人類(lèi)的活體來(lái)研究與疾病的起因和發(fā)病等的表達(dá)相關(guān)的基因是不可能的，且直接使用人類(lèi)的組織進(jìn)行研究也存在倫理上的問(wèn)題。
但是，包括人類(lèi)的動(dòng)物的基因組解析結(jié)果表明，人類(lèi)基因組與小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基因組大部分相同，具有與人類(lèi)類(lèi)似的生理機(jī)能。因此，如果向小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基因中導(dǎo)入人類(lèi)的基因突變，能夠表達(dá)與人類(lèi)的基因突變相關(guān)的基因，則通過(guò)查明基于該基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生理機(jī)能的機(jī)理等，就可以研究人類(lèi)的基因功能。當(dāng)然，由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有與人類(lèi)不同的生理機(jī)能，因此，由上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果不能直接應(yīng)用于人類(lèi)。因此，為了能夠?qū)⒂缮鲜鰟?dòng)物實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果應(yīng)用于人類(lèi)，做出了用于將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的內(nèi)源性基因變?yōu)槿祟?lèi)的基因、查明人類(lèi)疾病等的機(jī)理的基因改變模型動(dòng)物。
作為基因改變模型動(dòng)物，例如，眾所周知，有刪除了代謝酶和受體等基因的基因敲除小鼠等基因敲除動(dòng)物、在小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的內(nèi)源性基因中導(dǎo)入了人類(lèi)的外源性基因的基因敲入動(dòng)物等。目前，已作出改變了與各種疾病相關(guān)的基因的基因改變模型動(dòng)物。
基因敲除動(dòng)物為原有的特定基因的全部或一部分被實(shí)施破壞、刪除、置換等改變， 從而抑制該基因的表達(dá)，使其不能發(fā)揮機(jī)能而作出的模型動(dòng)物?；蚯贸齽?dòng)物由于原有的特定基因發(fā)生改變，不能產(chǎn)生與該突變基因相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)，因而是用于研究該基因和基因產(chǎn)物的機(jī)能、或者重要性評(píng)價(jià)的非常有用的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。然而，人類(lèi)一般的基因疾病中大部分并不起因于基因的全部缺失，而起因于由點(diǎn)突變帶來(lái)的氨基酸置換，基因敲除動(dòng)物并不適合作為這樣的基因異常的模型。
在一般的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，由于突變基因在幾1Λ的核心啟動(dòng)子序列的控制下無(wú)法表達(dá)，而且突變基因插入在染色體上的位點(diǎn)無(wú)法預(yù)測(cè)，因此，常常出現(xiàn)移入的基因不能按照期望表達(dá)的情形，成為利用該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行基因功能解析、病態(tài)模型開(kāi)發(fā)的一大阻礙。即使使用了上述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)存在問(wèn)題，但由于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物能夠在短時(shí)間內(nèi)作出，且能夠快速評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因而目前在很多研究中被使用。
另一方面，在基因敲入動(dòng)物中，由于該動(dòng)物利用外源的突變基因來(lái)置換自身具有的內(nèi)源正?；颍虼?，可以說(shuō)源自外源基因的突變蛋白質(zhì)難以受到該動(dòng)物自身內(nèi)源正常蛋白質(zhì)的影響。即，可以認(rèn)為關(guān)于該外源基因的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)源于該外源基因原有的功能。
但是，由于基因敲入動(dòng)物利用基因打靶由ES細(xì)胞作出，因此利用內(nèi)源性啟動(dòng)子活性能夠使外源突變基因正確表達(dá)，因此還具有能夠可靠地作出目標(biāo)模型動(dòng)物的優(yōu)點(diǎn)。
由此，為了更加忠實(shí)地模仿基因疾病的病態(tài)并準(zhǔn)確評(píng)價(jià)突變的影響，可以說(shuō)基因敲入動(dòng)物比基因敲除動(dòng)物更有利。然而，雖然確立了上述基因敲入動(dòng)物的作出方法，但是為了作出基因敲入動(dòng)物方面，存在基因敲入動(dòng)物的作出方法復(fù)雜，且作出需要1.5 2年的長(zhǎng)時(shí)間和需要高額的費(fèi)用的問(wèn)題。即，目前為止，基因敲入動(dòng)物通過(guò)靶基因與靶重組載體的同源重組，利用外源基因DNA對(duì)靶基因的基因DNA進(jìn)行同源重組并置換而作出。然而，該基因敲入動(dòng)物的作出方法存在很大的缺點(diǎn)利用上述同源重組，將所期望的外源基因DNA同源重組到靶基因的基因DNA的幾率非常低，約為10_5以下。因此，需要開(kāi)發(fā)能夠簡(jiǎn)便且短時(shí)間作出基因敲入動(dòng)物的技術(shù)。
因此，本發(fā)明人著眼于作為用于小鼠等的細(xì)胞和基因操作的最有用的工具之一的 Cre-IoxP系統(tǒng)(非專(zhuān)利文獻(xiàn)1-6)，嘗試開(kāi)發(fā)能簡(jiǎn)便且短時(shí)間作出基因敲入動(dòng)物的方法。該 Cre-IoxP系統(tǒng)能夠通過(guò)重組酶Cre (cyclinization recombinase)將夾在2個(gè)IoxP位點(diǎn)之間的DNA部分切除。如果在該Cre-IoxP系統(tǒng)的2個(gè)IoxP位點(diǎn)間插入外源基因等DNA，則利用由Cre重組酶進(jìn)行的IoxP序列的切斷和重組(cyclinization recombination)現(xiàn)象，將該插入的DNA削除。
本發(fā)明人為了能夠利用具有上述性質(zhì)的Cre-IoxP系統(tǒng)來(lái)有效地導(dǎo)入外源DNA，使夾著DNA的2個(gè)IoxP序列中的一個(gè)IoxP或兩個(gè)IoxP發(fā)生突變，以使Cre重組酶不能識(shí)別或難以識(shí)別該Iox序列，同時(shí)通過(guò)重組，設(shè)法不消除地插入夾在2個(gè)Iox序列之間的外源 DNA序列位點(diǎn)(例如，參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)6 8和專(zhuān)利文獻(xiàn)1、2)。即，在形成堿基對(duì)的IoxP 的2條鏈中的一條鏈或兩條鏈中，在正義鏈或反義鏈的任意一條鏈中如果存在導(dǎo)入有突變的突變Iox序列，則Cre重組酶能夠切斷并結(jié)合其中心位點(diǎn)的間隔序列。其結(jié)果，使夾在這 2個(gè)Iox序列之間的外源DNA序列位點(diǎn)重組并插入。
提出了利用上述突變型IoxP序列，作出導(dǎo)入了 DNA或發(fā)光基因等的報(bào)告基因等外源基因的捕獲載體(例如，參照專(zhuān)利文獻(xiàn)1)，同時(shí)作出導(dǎo)入有上述捕獲載體的基因敲除動(dòng)物的方法(例如，參照專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。另外，還提出了以下技術(shù)導(dǎo)入了作為突變型IoxP序列的1οχ71序列的受體載體與導(dǎo)入了作為其它突變型IoxP序列的1οχ66序列的供體載體的突變Iox序列組、以及受體載體與供體載體的IoxP序列組利用由Cre重組酶進(jìn)行的重組， 在基因組中穩(wěn)定地插入導(dǎo)入在供體載體的1οχ66序列與IoxP序列之間的外源DNA(例如， 參照專(zhuān)利文獻(xiàn)幻。但是，這些現(xiàn)有技術(shù)都不是改善同源重組發(fā)生幾率的方法，與以往的以非常低的同源重組幾率通過(guò)同源重組外源DNA來(lái)進(jìn)行導(dǎo)入的方法并無(wú)區(qū)別。
非專(zhuān)利文獻(xiàn)1 :Sauer, B. , et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5166-5170,1988
非專(zhuān)利文獻(xiàn)2 :Gu, H.，et al.，Cell, 73,1155-1164，1993
非專(zhuān)禾丨J文獻(xiàn) 3 Araki, K. , Imaizumi, K. , Oike, Y. and Yamamura, K. , J. Biochem. (Tokyo)，122,977-982,1997[0017]非專(zhuān)利文獻(xiàn)4 Lakso, M.，et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89，6232-6236，1992
非專(zhuān)利文獻(xiàn) 5 =Rosant, J.，et al.，Nature Med.，1，592-594，1995
非專(zhuān)禾丨J文獻(xiàn) 6 Araki, K. , Araki, Μ. , and Yamamura, K. , Nucleic Acids Res., 2002，Vol. 30，No.19 el03
非專(zhuān)利文獻(xiàn)7 =Albert, H.，et al.，Plant J, 7，649-659，1995
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專(zhuān)利文獻(xiàn)1 國(guó)際公開(kāi)號(hào)W001/05987A1號(hào)公報(bào)
專(zhuān)利文獻(xiàn)2 特開(kāi)2002-345477號(hào)公報(bào)
專(zhuān)利文獻(xiàn)3 特開(kāi)2006-333742號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明人為了確立能夠以高幾率在靶基因中導(dǎo)入外源基因突變的技術(shù)而潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用含有制作的突變導(dǎo)入盒的靶導(dǎo)入載體，利用Cre-突變Iox系統(tǒng)來(lái)介導(dǎo)重組重組靶基因，能夠以高幾率簡(jiǎn)便且迅速地在靶基因上導(dǎo)入外源基因的基因突變，其中所述制作的突變導(dǎo)入盒含有作為導(dǎo)入對(duì)象的突變基因DNA，所述重組靶基因是通過(guò)將要導(dǎo)入外源突變基因DNA的靶基因與含有該突變基因DNA的靶重組載體(打靶載體)的同源重組而得到的；同時(shí)通過(guò)利用該突變導(dǎo)入盒，能夠與靶基因的種類(lèi)無(wú)關(guān)地導(dǎo)入全部的突變基因，從而完成本發(fā)明。此外，還發(fā)現(xiàn)，如果利用該基因突變導(dǎo)入方法，能夠短時(shí)間且簡(jiǎn)便地作出非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的基因敲入動(dòng)物(特別是小鼠)，從而完成本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠?qū)τ谌魏伟谢虻姆N類(lèi)利用突變導(dǎo)入盒和 Cre-突變IoxP系統(tǒng)以高幾率在靶基因上導(dǎo)入外源基因的突變的基因突變導(dǎo)入方法。
本發(fā)明的目的還在于提供一種基因突變導(dǎo)入方法，該方法包括將染色體上的重組靶基因中包含的靶DNA序列通過(guò)突變導(dǎo)入載體的突變導(dǎo)入盒、與突變導(dǎo)入盒中包含的突變導(dǎo)入DNA序列區(qū)通過(guò)Cre重組酶的介導(dǎo)作用進(jìn)行重組導(dǎo)入。
本發(fā)明的目的還在于提供一種基因突變導(dǎo)入方法作為優(yōu)選的方式，該方法包括 利用靶基因與靶重組載體的同源重組，得到作為突變導(dǎo)入對(duì)象的重組靶基因。
本發(fā)明的目的還在于提供一種基因突變導(dǎo)入方法作為更優(yōu)選的方式，其中突變導(dǎo)入載體的突變導(dǎo)入盒包含突變導(dǎo)入DNA序列，該突變導(dǎo)入DNA序列含有序列對(duì)第3突變Iox 序列和第4突變Iox序列夾著的突變DNA序列和第2正選擇標(biāo)記DNA序列。
本發(fā)明的目的還在于提供一種基因突變導(dǎo)入方法作為更優(yōu)選的方式，其中突變導(dǎo)入載體的突變導(dǎo)入盒中包含的序列對(duì)第3突變Iox序列與第4突變Iox序列夾著的突變 DNA序列，利用Cre重組酶的介導(dǎo)作用，與重組靶基因中包含的序列對(duì)第1突變Iox序列與第2突變Iox序列夾著的靶DNA序列進(jìn)行重組。
本發(fā)明的的目的還在于提供一種基因突變導(dǎo)入方法作為更優(yōu)選的方式，其中各突變Iox序列為在IoxP序列的間隔序列或IoxP序列的5’端重復(fù)序列或3’端重復(fù)序列上分別具有突變的突變Iox序列，例如1οχ71、1οχ2272和loxKR3等。
本發(fā)明的目的還在于提供一種基因突變導(dǎo)入方法作為更優(yōu)選的方式，其中通過(guò)重組靶基因與突變導(dǎo)入載體的突變導(dǎo)入盒的重組而得到的突變導(dǎo)入基因含有序列對(duì)例如lox71/KMR3等的第5突變Iox序列和例如1οχ2272等的第6突變Iox序列夾著的突變DNA 序列。
本發(fā)明的目的還在于提供一種基因突變導(dǎo)入方法作為更優(yōu)選的方式，該基因突變導(dǎo)入方法包括重組工序，該工序包括利用靶基因與靶重組載體的同源重組，對(duì)靶基因的第IDNA序列區(qū)與靶重組載體的第2DNA序列區(qū)進(jìn)行同源重組，利用第2DNA序列區(qū)中包含的靶DNA序列將第IDNA序列區(qū)中包含的突變導(dǎo)入目標(biāo)外顯子重組，以得到重組靶基因；以及， 突變導(dǎo)入工序，該工序包括通過(guò)由Cre重組酶與1對(duì)突變型Iox序列組成的Cre-突變Iox 系統(tǒng)的介導(dǎo)作用，利用突變導(dǎo)入盒對(duì)重組靶基因的第3DNA序列區(qū)中包含的序列對(duì)第1突變 Iox序列和第2突變Iox序列、與該序列對(duì)夾著的突變靶DNA序列區(qū)進(jìn)行重組，以得到導(dǎo)入了突變導(dǎo)入DNA序列區(qū)的突變導(dǎo)入基因。
本發(fā)明的目的還在于提供一種基因突變導(dǎo)入方法作為更優(yōu)選的其它的方式，其中突變導(dǎo)入盒和突變導(dǎo)入基因中包含的突變DNA序列是突變外顯子。
本發(fā)明的目的還在于提供一種基因突變導(dǎo)入方法作為更優(yōu)選的其它的方式，其中靶基因?yàn)樵醋匀祟?lèi)常染色體顯性的良性家族性新生兒驚厥(BFNC)相關(guān)的電壓依賴(lài)性鉀通道KCNQ2亞基的基因，此外，靶基因的靶突變?yōu)榛騅CNQ2的Y284C(序列號(hào)1和2)或 T306A(序列號(hào)3和4)。
本發(fā)明的目的還在于提供一種突變導(dǎo)入基因的制備方法作為其它的方式，該方法包括利用上述基因突變導(dǎo)入方法，在靶基因上導(dǎo)入基因突變，從而制備突變導(dǎo)入基因。
本發(fā)明的目的還在于提供一種突變導(dǎo)入基因作為其它的方式，其中該突變導(dǎo)入基因含有突變DNA序列，該突變DNA序列包含序列對(duì)第5突變Iox序列和第6突變Iox序列夾著的突變外顯子。
本發(fā)明的目的還在于提供一種可變式的突變導(dǎo)入盒作為其它的方式，該突變導(dǎo)入盒含有突變DNA序列，該突變DNA序列含有序列對(duì)第3突變Iox序列和第4突變Iox序列夾著的突變外顯子。
本發(fā)明的目的還在于提供一種含有上述突變導(dǎo)入盒的突變導(dǎo)入載體作為其它的方式。
本發(fā)明的目的還在于提供一種突變基因?qū)隕S細(xì)胞作為其它的方式，該突變基因?qū)隕S細(xì)胞中的突變導(dǎo)入基因例如為源自人類(lèi)常染色體顯性的良性家族性新生兒驚厥 (BFNC)相關(guān)的電壓依賴(lài)性鉀通道的基因KCNQ2亞基的基因的突變基因，例如為KCNQ2的 Y284C 或 T306A。
本發(fā)明的目的還在于提供一種基因敲入非人類(lèi)哺乳動(dòng)物(特別是小鼠等)作為其它的方式，該基因敲入非人類(lèi)哺乳動(dòng)物中的突變導(dǎo)入基因例如為源自人類(lèi)常染色體顯性的良性家族性新生兒驚厥(BFNC)相關(guān)的電壓依賴(lài)性鉀通道的基因KCNQ2亞基的基因的突變基因，例如為KCNQ2的Y284C或T306A。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種基因突變導(dǎo)入方法，該方法包括將染色體上的靶基因中含有的相互不同的序列對(duì)第1突變Iox序列和第2突變Iox序列夾著的靶 DNA序列通過(guò)突變導(dǎo)入載體的突變導(dǎo)入盒、與突變導(dǎo)入盒中包含的序列對(duì)第3突變Iox序列和第4突變Iox序列夾著的突變DNA序列通過(guò)Cre重組酶的介導(dǎo)作用，進(jìn)行重組導(dǎo)入。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式提供了一種基因突變導(dǎo)入方法作為優(yōu)選的方式，其中重組靶基因?yàn)槔冒谢蚺c靶重組載體的同源重組所得的重組基因，且含有序列對(duì)第1 突變Iox序列和第2突變Iox序列夾著的靶DNA序列。
本發(fā)明還提供了一種基因突變導(dǎo)入方法作為更優(yōu)選的方式，其中突變導(dǎo)入載體的突變導(dǎo)入盒含有序列對(duì)第3突變Iox序列和第4突變Iox序列夾著的突變DNA序列和第2 正選擇標(biāo)記DNA序列。
本發(fā)明還提供了一種基因突變導(dǎo)入方法作為更優(yōu)選的方式，其中突變導(dǎo)入載體的突變導(dǎo)入盒中包含的序列對(duì)第3突變Iox序列(5 和第4突變Iox序列(56)夾著的突變 DNA序列，利用Cre重組酶的介導(dǎo)作用，與重組靶基因中包含的序列對(duì)第1突變Iox序列和第2突變Iox序列夾著的靶DNA序列進(jìn)行重組。
本發(fā)明還提供了一種基因突變導(dǎo)入方法作為更優(yōu)選的方式，其中第1突變Iox序列為突變存在于IoxP序列的5’端重復(fù)序列的突變Iox序列，例如為1οχ71 ；第2突變Iox 序列為突變存在于IoxP序列的間隔序列的突變Iox序列，例如為lOX2272 ；且第3突變Iox 序列為突變存在于IoxP序列的3’端重復(fù)序列的突變Iox序列，例如為loxKR3 ；第4突變 Iox序列為突變存在于IoxP序列的間隔序列的突變Iox序列，例如為lOX2272。
本發(fā)明還提供了一種基因突變導(dǎo)入方法作為更優(yōu)選的方式，其中通過(guò)重組靶基因與突變導(dǎo)入載體的突變導(dǎo)入盒的重組而得到的突變導(dǎo)入基因含有序列對(duì)第5突變Iox序列 (例如lox71/KMR3)和第6突變Iox序列(例如1οχ2272)夾著的突變導(dǎo)入DNA序列區(qū)，其中所述序列對(duì)第5突變Iox序列和第6突變Iox序列通過(guò)分別重組序列對(duì)第1突變Iox序列和第2突變Iox序列、與序列對(duì)第3突變Iox序列和第4突變Iox序列而得到，且該突變導(dǎo)入DNA序列區(qū)含有突變DNA序列和第2正選擇標(biāo)記DNA序列。
本發(fā)明還提供了一種基因突變導(dǎo)入方法作為更優(yōu)選的方式，該基因突變導(dǎo)入方法為將外源突變基因?qū)氲桨谢蛏系幕蛲蛔儗?dǎo)入方法，其中，該基因突變導(dǎo)入方法包括 同源重組工序，該工序包括利用靶基因(10)與靶重組載體00)的同源重組，對(duì)靶基因 (10)的第IDNA序列區(qū)(IOa)與靶重組載體QO)的第2DNA序列區(qū)(20a)進(jìn)行同源重組， 利用第2DNA序列區(qū)QOa)中包含的靶DNA序列(32)對(duì)第IDNA序列區(qū)(IOa)中包含的突變導(dǎo)入目標(biāo)外顯子(1 進(jìn)行重組，以得到重組靶基因GO)；以及，突變導(dǎo)入工序，該工序包括通過(guò)由Cre重組酶和1對(duì)突變型Iox序列組成的Cre-突變Iox系統(tǒng)的介導(dǎo)作用，利用突變導(dǎo)入載體(50)的突變導(dǎo)入盒(51)對(duì)重組靶基因00)的第3DNA序列區(qū)(40a)中包含的序列對(duì)第1突變Iox序列(30)和第2突變Iox序列(36)、與該序列對(duì)夾著的突變靶DNA 序列區(qū)(35)進(jìn)行(特異性)重組，以得到導(dǎo)入了突變導(dǎo)入DNA序列區(qū)(54)的突變導(dǎo)入基因(60)；
其中，靶重組載體OO)包括負(fù)選擇標(biāo)記DNA序列02)、第1同源重組DNA序列區(qū) (M)、靶DNA序列區(qū)( )、和第2同源重組DNA序列區(qū)(34)；且靶DNA序列區(qū)Q6)包括第 1突變Iox序列(30)、靶DNA序列(32)、第1正選擇標(biāo)記DNA序列(34)、第2突變Iox序列 (36)、和多聚腺苷酸(Poly(A))附加序列(38)；且第1和第2同源重組DNA序列區(qū)(22,28) 具有同源重組所必需的DNA序列的長(zhǎng)度；
重組靶基因00)的第3DNA序列區(qū)(40a)包括第1同源重組DNA序列區(qū)Q4)、第1 突變Iox序列(30)、突變靶DNA序列區(qū)(35)、第2突變Iox序列(36)、和第2同源重組DNA 序列區(qū)( )，且突變靶DNA序列區(qū)(35)包括靶DNA序列(32)、和第1正選擇標(biāo)記DNA序列(34)；
突變導(dǎo)入載體(50)的突變導(dǎo)入盒(51)包括第3突變Iox序列(52)、突變導(dǎo)入DNA 序列區(qū)(54)、和第2突變Iox序列(56)；且突變導(dǎo)入DNA序列區(qū)(54)包括突變DNA序列 (57)、和第2正選擇標(biāo)記DNA序列(58)；并且
突變導(dǎo)入基因(60)包括第1同源重組DNA序列區(qū)Q4)、第5突變Iox序列(62)、 突變導(dǎo)入DNA序列區(qū)(54)、第6突變Iox序列(66)、和第2同源重組DNA序列區(qū)Q8)；且突變導(dǎo)入DNA序列區(qū)(54)包括突變DNA序列(57)、和第2正選擇標(biāo)記DNA序列(58)。
本發(fā)明還提供了一種基因突變導(dǎo)入方法作為更優(yōu)選的方式，其中突變導(dǎo)入載體的突變導(dǎo)入盒或突變導(dǎo)入基因中包含的突變DNA序列包含突變外顯子。
本發(fā)明還提供了一種基因突變導(dǎo)入方法作為更優(yōu)選的方式，其中靶基因?yàn)樵醋匀祟?lèi)常染色體顯性的良性家族性新生兒驚厥(BFNC)相關(guān)的電壓依賴(lài)性鉀通道KCNQ2亞基的基因，導(dǎo)入基因KCNQ2的Y284C(序列號(hào)1和2)或T306A(序列號(hào)3和4)作為突變基因。
本發(fā)明還提供了一種突變導(dǎo)入基因的制備方法作為其它的方式，該方法包括利用上述基因突變導(dǎo)入方法，向靶基因?qū)牖蛲蛔?，以制備突變?dǎo)入基因。
本發(fā)明還提供了一種突變導(dǎo)入基因作為其它的方式，該突變導(dǎo)入基因含有第1同源重組DNA序列區(qū)、第5突變Iox序列、突變導(dǎo)入DNA序列區(qū)、第6突變Iox序列和第2同源重組DNA序列區(qū)，且突變導(dǎo)入DNA序列區(qū)被序列對(duì)第5突變Iox序列與第6突變Iox序列夾著、且含有突變DNA序列和第2正選擇標(biāo)記DNA序列。
本發(fā)明還提供了一種突變導(dǎo)入基因作為優(yōu)選的方式，其中序列對(duì)第5突變Iox序列和第6突變Iox序列，通過(guò)序列對(duì)第1突變Iox序列和第2突變Iox序列、與序列對(duì)第3 突變Iox序列和第4突變Iox序列的重組而得到。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式提供了一種可變式的突變導(dǎo)入盒，該突變導(dǎo)入盒含有序列對(duì)第3突變Iox序列(例如loxKR3)和第4突變Iox序列(例如1οχ2272)以及該序列對(duì)夾著的突變DNA序列以及第2正選擇標(biāo)記DNA序列。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式提供了一種含有上述突變導(dǎo)入盒的突變導(dǎo)入載體。
本發(fā)明還提供了一種導(dǎo)入有上述突變導(dǎo)入基因的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物(特別是小鼠) 作為其它的方式。進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了一種基因敲入非人類(lèi)動(dòng)物(例如基因敲入小鼠等)作為本發(fā)明的優(yōu)選的方式，其中該基因敲入非人類(lèi)動(dòng)物中的突變基因源自人類(lèi)常染色體顯性的良性家族性新生兒驚厥(BFNC)相關(guān)的電壓依賴(lài)性鉀通道的基因KCNQ2亞基，且突變基因?yàn)橥蛔兓騅CNQ2的Y284C或T306A。


圖1為示出了靶基因的序列結(jié)構(gòu)、以及含有靶DNA序列(32)的靶重組載體QO) 的序列結(jié)構(gòu)的示意圖；
圖2為示出了通過(guò)靶基因與靶重組載體的同源重組而獲得的重組靶基因的序列結(jié)構(gòu)的示意圖；
圖3為示出了突變導(dǎo)入載體中包含的突變導(dǎo)入盒的序列結(jié)構(gòu)以及重組靶基因與突變導(dǎo)入盒利用Cre-突變Iox序列系統(tǒng)的介導(dǎo)作用重組而得到的導(dǎo)入了基因突變的突變導(dǎo)入基因的序列結(jié)構(gòu)的示意圖；[0064]圖4為示出了作為來(lái)源于人類(lèi)的常染色體顯性的良性家族性新生兒驚厥(BFNC) 相關(guān)的電位依賴(lài)性鉀通道KCNQ2亞基的基因的靶基因、以及用于同源重組的打靶載體的序列結(jié)構(gòu)的示意圖；
圖5為示出了靶基因KCNQ2與其打靶載體的序列結(jié)構(gòu)以及含有作為突變基因的突變或T306A的突變導(dǎo)入載體的序列結(jié)構(gòu)的示意圖；
圖6為示出了含有作為突變DNA序列的基因KCNQ2的突變及T306A的突變導(dǎo)入載體的序列結(jié)構(gòu)的示意圖；
圖7為示出了在小鼠ES細(xì)胞中導(dǎo)入本發(fā)明的靶重組載體，以制備導(dǎo)入了 KCNQ2基因DNA序列部分的小鼠ES細(xì)胞的順序的圖；
圖8為示出了利用圖7中制備的小鼠ES細(xì)胞與突變導(dǎo)入載體的同源重組，制備導(dǎo)入了 KCNQ2基因的突變DNA序列部分的小鼠突變ES細(xì)胞的順序的圖；
圖9為示出了從圖8中制備的小鼠[0070]附圖標(biāo)記說(shuō)明[0071]10靶基因[0072]IOa第IDNA序列區(qū)[0073]12突變導(dǎo)入目標(biāo)外顯子[0074]20靶重組載體(打靶載體)[0075]20a第2DNA序列區(qū)[0076]22負(fù)選擇標(biāo)記DNA序列區(qū)[0077]24第1同源重組DNA序列區(qū)[0078]26靶DNA序列區(qū)[0079]28第2同源重組DNA序列區(qū)[0080]30第1突變Iox序列[0081]32靶DNA序列[0082]34第1正選擇標(biāo)記DNA序列區(qū)[0083]35突變靶DNA序列區(qū)[0084]36第2突變Iox序列[0085]38Poly(A)附加序列[0086]39aFRT序列[0087]39bFRT序列[0088]39cFRT序列[0089]40重組靶基因[0090]40a第3DNA序列區(qū)[0091]50突變導(dǎo)入載體[0092]51突變導(dǎo)入盒[0093]52第3突變Iox序列[0094]54突變導(dǎo)入DNA序列區(qū)[0095]56第4突變Iox序列[0096]58第2正選擇標(biāo)記DNA序列區(qū)[0097]60 突變導(dǎo)入基因
64 第5突變Iox序列
66 第6突變Iox序列
具體實(shí)施方式
本發(fā)明涉及一種在靶基因中導(dǎo)入基因突變的基因突變導(dǎo)入方法。本發(fā)明的基因突變導(dǎo)入方法的特征在于，利用兩個(gè)階段，將外源突變基因的對(duì)應(yīng)突變DNA序列導(dǎo)入到具有作為靶基因中包含的基因的功能的突變導(dǎo)入目標(biāo)外顯子(即靶DNA序列)。
本發(fā)明的基因突變導(dǎo)入方法的第一階段為以能夠?qū)肽繕?biāo)基因突變的方式將作為靶基因的突變導(dǎo)入的靶的突變導(dǎo)入目標(biāo)外顯子DNA序列(靶DNA序列)重組而得到重組靶基因的同源重組工序。第二階段為使用突變導(dǎo)入載體(即打靶載體)置換第一階段中獲得的重組靶基因的靶DNA序列與作為目標(biāo)的突變DNA序列的重組(特異性重組)工序。
在本發(fā)明的基因突變導(dǎo)入方法的同源重組工序中，首先，為了構(gòu)建能夠高效重組染色體上的靶基因的靶DNA序列和作為目標(biāo)的外源突變DNA序列，設(shè)置夾住該靶DNA序列位點(diǎn)且互不相同的序列對(duì)第1突變Iox序列和第2突變Iox序列，重組改變?nèi)旧w上靶基因。該重組改變方法如果為本技術(shù)領(lǐng)域：
中公知的方法，則所有的方法均可以使用，但一般可以為通過(guò)靶基因與靶重組載體(即打靶載體)的同源重組，重組構(gòu)建含有靶基因的靶DNA 序列的DNA序列區(qū)。
因此，在本發(fā)明的基因突變導(dǎo)入方法的第1段階的重組工序中，可以使用利用了被稱(chēng)為打靶載體的靶重組載體的同源重組法即所謂的基因打靶(gene targeting)法重組改變靶基因。該同源重組法能夠通過(guò)使用電穿孔等慣用的載體導(dǎo)入技術(shù)按照常規(guī)方法將含有作為突變導(dǎo)入的靶的靶DNA序列的靶重組載體即打靶載體導(dǎo)入到小鼠ES細(xì)胞等中而實(shí)施。但，由該同源重組法進(jìn)行的同源重組，具有重組幾率非常低、為0. 01%以下的缺點(diǎn)。
因此，在本發(fā)明中，為了彌補(bǔ)該同源重組法的缺點(diǎn)，通過(guò)使本發(fā)明的基因突變導(dǎo)入方法的第二階段的特異性重組工序具有以下的內(nèi)容，能夠以極高的幾率且在短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)入期望的突變基因，得到導(dǎo)入了作為目標(biāo)的基因突變的突變導(dǎo)入基因。
本發(fā)明的基因突變導(dǎo)入方法的第2段階的重組工序包括使用突變導(dǎo)入載體將如上所述已重組改變了的重組靶基因進(jìn)一步重組，并利用突變導(dǎo)入載體中包含的突變DNA序列將重組靶基因的靶DNA序列特異重組。通過(guò)該重組工序，能夠以近似100 %的極高重組幾率導(dǎo)入突變導(dǎo)入載體中包含的突變DNA序列和重組靶基因的靶DNA序列。也就是說(shuō)，本發(fā)明的一大特點(diǎn)為設(shè)計(jì)突變導(dǎo)入載體，特別是突變導(dǎo)入盒，將靶DNA序列導(dǎo)入重組靶基因， 從而能夠高幾率且迅速地導(dǎo)入作為目標(biāo)的突變DNA序列。
通過(guò)在上述2個(gè)階段中實(shí)施本發(fā)明的基因突變導(dǎo)入方法，使本發(fā)明具有不限于基因的種類(lèi)的能夠適用于全部基因的極大的優(yōu)點(diǎn)。在本發(fā)明中，在第一階段中，利用靶重組載體重組改變突變導(dǎo)入對(duì)象的靶基因的突變導(dǎo)入目標(biāo)外顯子(靶DNA序列)，一旦作出了重組靶基因，則在接下來(lái)的第二階段中，通過(guò)導(dǎo)入有包含目標(biāo)基因突變的突變導(dǎo)入盒的突變導(dǎo)入載體，能夠迅速且極高幾率地將上述基因突變重組并導(dǎo)入到上述重組靶基因的突變導(dǎo)入目標(biāo)外顯子中。換言之，在本發(fā)明中，在第一階段中，由于使用現(xiàn)有技術(shù)的同源重組法進(jìn)行重組靶基因的制作，因此，即使該重組靶基因的重組幾率非常低，一旦作出了該重組靶基因，則在接下來(lái)的第二階段中，通過(guò)包括含有目標(biāo)基因突變的突變導(dǎo)入盒的突變導(dǎo)入載體， 能夠快速且極高幾率地重組并導(dǎo)入該基因突變，且即使改變目標(biāo)基因突變，也能在極短的時(shí)間內(nèi)制作含有該基因突變的突變導(dǎo)入盒，因此能夠迅速地在短時(shí)間內(nèi)且高幾率地導(dǎo)入該基因突變。進(jìn)一步地，由于能夠通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)迅速且短時(shí)間地制作包含有目標(biāo)基因突變的突變導(dǎo)入盒和包含該突變導(dǎo)入盒的突變導(dǎo)入載體，因此最終能夠迅速且短時(shí)地并且極高幾率地制作出攜帶有已替換了目標(biāo)基因突變的導(dǎo)入基因的基因敲入動(dòng)物。
因此，由于本發(fā)明不限定基因的種類(lèi)，能夠適用于所有的基因，因此具有以下極大的優(yōu)點(diǎn)上述靶基因例如無(wú)論是癲癇相關(guān)基因或癌相關(guān)基因等疾病相關(guān)基因，還是其它的全部基因?qū)嵸|(zhì)上都能夠同樣地適用，并能夠高幾率且短時(shí)間地制作出導(dǎo)入有希望的基因突變的突變導(dǎo)入基因。同樣地，本發(fā)明還具有以下較大的優(yōu)點(diǎn)即使對(duì)于具有作為所有的靶基因的基因的功能的所有的DNA序列即外顯子DNA序列，也能夠?qū)嶋H上同樣地導(dǎo)入突變DNA 序列。
以下，參照?qǐng)D1 圖6對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地說(shuō)明。但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不限定于圖中所示的形態(tài)或方式，且圖中所示的全部?jī)?nèi)容都不具有限定本發(fā)明的意圖。更應(yīng)當(dāng)理解，從圖中所示的形態(tài)或方式等衍生出的所有的改良或變形都包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
因此，圖1為示出了導(dǎo)入基因突變的靶基因(10)的序列結(jié)構(gòu)與通過(guò)與靶基因(10) 的同源重組得到的含有靶DNA序列(32)的靶重組載體00)的序列結(jié)構(gòu)的示意圖。圖2為示出了利用靶基因(10)與靶重組載體00)的同源重組獲得的重組靶基因GO)的序列結(jié)構(gòu)的示意圖。圖3為示出了本發(fā)明的突變導(dǎo)入載體(50)中包含的突變導(dǎo)入盒(51)的序列結(jié)構(gòu)以及利用Cre-突變Iox序列系統(tǒng)的介導(dǎo)作用來(lái)重組重組靶基因00)和突變導(dǎo)入盒 (51)而得到的導(dǎo)入了基因突變的突變導(dǎo)入基因(60)的序列結(jié)構(gòu)的示意圖。圖4為示出了來(lái)源于作為靶基因的人類(lèi)的常染色體顯性的良性家族性新生兒驚厥(BFNC)相關(guān)的電位依賴(lài)性鉀通道KCNQ2亞基的基因、以及用于同源重組的打靶載體的序列結(jié)構(gòu)的示意圖。圖5 為分別示出了靶基因KCNQ2與靶基因KCNQ2的打靶載體的序列結(jié)構(gòu)、同時(shí)示出了含有作為突變基因的突變Y284C或T306A的突變導(dǎo)入載體的序列結(jié)構(gòu)的示意圖。圖6為示出了含有突變Y284C及T306A的突變導(dǎo)入載體的序列結(jié)構(gòu)的示意圖。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)充分理解，各圖中所示的示意圖僅為用于簡(jiǎn)潔地說(shuō)明本發(fā)明的示例，本發(fā)明并不受圖中所示內(nèi)容限制。
首先，能夠在本發(fā)明的基因突變導(dǎo)入方法中使用的靶基因(10)，如上所述，其種類(lèi)并無(wú)特別地限定，具有能夠適用于所有的基因的一大優(yōu)點(diǎn)。在本說(shuō)明書(shū)中，為使說(shuō)明簡(jiǎn)潔， 圖1中所示的靶基因(10)以圖5中所示的來(lái)源于作為癲癇相關(guān)基因的人類(lèi)的常染色體顯性的良性家族性新生兒驚厥(BFNC)相關(guān)的電位依賴(lài)性鉀通道KCNQ2亞基的基因?yàn)槔M(jìn)行說(shuō)明，并且作為基因突變導(dǎo)入的目標(biāo)的突變基因，以圖6中所示的突變Y284C或T306A為例進(jìn)行說(shuō)明。
在本發(fā)明的基因突變導(dǎo)入方法中，作為基因突變導(dǎo)入靶的靶基因(10)能夠從所有的基因中自由地選定具有所希望的機(jī)能的攜帶突變導(dǎo)入目標(biāo)外顯子(1 的基因作為基因。在選定作為基因突變導(dǎo)入的靶的靶基因和突變導(dǎo)入目標(biāo)外顯子(靶DNA序列)時(shí)，當(dāng)然優(yōu)選從基因突變的存在已公知的基因和基因突變中選定。在本發(fā)明中，具體地，如圖5所
13示，選擇來(lái)源于作為基因突變已公知的癲癇相關(guān)基因的人類(lèi)的常染色體顯性的良性家族性新生兒驚厥(BFNC)相關(guān)的電位依賴(lài)性鉀通道KCNQ2亞基的基因，并且從該KCNQ2基因中包含的多個(gè)外顯子中，選定存在已知基因突變Y284C(序列號(hào)1和2)或T306A(序列號(hào)3和4) 的外顯子6，作為靶DNA序列。當(dāng)然，也可以選定其它的外顯子，也可以根據(jù)目的，自由地選定作為突變導(dǎo)入靶的靶DNA序列。
如上所述，選擇的靶基因(10)，通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域：
已知的同源重組法即基因打靶法與靶重組載體(打靶載體M20)重組改變。該同源重組法能夠通過(guò)按照常規(guī)方法將包含有作為突變導(dǎo)入的靶的靶DNA序列的靶重組載體即打靶載體用電穿孔等慣用載體導(dǎo)入技術(shù)導(dǎo)入到小鼠ES細(xì)胞等中而實(shí)施。并且，由于同源重組法為本技術(shù)領(lǐng)域：
中已確立的慣用技術(shù)，因此在這里省略詳細(xì)的說(shuō)明。
該靶重組載體00)為導(dǎo)入有突變Iox序列的載體，該突變Iox序列易于在小鼠等的ES細(xì)胞的基因組DNA中的規(guī)定的靶基因中導(dǎo)入突變，且為了能夠?qū)⒛繕?biāo)突變導(dǎo)入靶基因，該靶重組載體OO)能夠在作為基礎(chǔ)的質(zhì)粒等中按照本技術(shù)領(lǐng)域：
慣用的常規(guī)方法編入制作。而且對(duì)該質(zhì)粒并無(wú)特別的限定，可以使用任意一種，且可以使用本技術(shù)領(lǐng)域：
中慣用的質(zhì)粒。例如可以列舉出 pBluescript II SK+、pGEM、pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119 等的 PUC 類(lèi)；pSP64、pSP65、pSP73 等的 pSP 類(lèi)；pGEM_3、pGEM_4、pGEM_3Z 等的 pGEM 類(lèi)等作為該質(zhì)粒，但為了構(gòu)建靶重組載體，可以考慮并適當(dāng)選擇存在于后插入的DNA片段中的限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)的種類(lèi)和序列順序。
而且，在構(gòu)建本發(fā)明的靶重組載體中使用的基因組DNA片段，例如能夠從基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中得到作為KCNQ2基因等的靶的基因的DNA堿基序列信息，并以該信息為基礎(chǔ)，以小鼠細(xì)菌人工染色體庫(kù)(BAC)克隆等作為模板、利用PCR擴(kuò)增基因的必需區(qū)域，或利用從基因組庫(kù)中分離出的克隆而制作。如上所述擴(kuò)增而得到的KCNQ2基因的堿基片段中，對(duì)于作為突變導(dǎo)入靶位點(diǎn)的外顯子部分，例如可以設(shè)計(jì)成第1同源重組DNA序列區(qū)為約5. 51Λ、且第 2同源重組DNA序列區(qū)為約21Λ的部位片段。此外，能夠利用本技術(shù)領(lǐng)域：
慣用的方法來(lái)制作寡核苷酸對(duì)中的各個(gè)寡核苷酸。另外，也可以先分別作出用于同源重組的第1同源重組 DNA序列區(qū)和第2同源重組DNA序列區(qū)，再將其結(jié)合制作。
進(jìn)一步，本說(shuō)明書(shū)中使用的技術(shù)術(shù)語(yǔ)“靶重組載體”，用于從外部導(dǎo)入到靶基因的靶DNA序列的運(yùn)輸，一般被稱(chēng)為打靶載體。本發(fā)明的靶重組載體能夠按照本技術(shù)領(lǐng)域：
的慣用方法制作。
另外，在靶重組載體OO)中，由于靶重組載體OO)的第1同源重組DNA序列區(qū) (24)的DNA序列一般構(gòu)建為比第2同源重組DNA序列區(qū)Q8)的DNA序列長(zhǎng)，因此，在本說(shuō)明書(shū)中，僅為了方便說(shuō)明，有時(shí)使用“長(zhǎng)臂區(qū)域”或與其相關(guān)的術(shù)語(yǔ)表示第1同源重組DNA 序列區(qū)(M)，此外，有時(shí)使用“短臂區(qū)域”或與其相關(guān)的術(shù)語(yǔ)表示第2同源重組DNA序列區(qū) ( )，但并不特別限定于這些術(shù)語(yǔ)。換言之，第1同源重組DNA序列區(qū)04)與第2同源重組DNA序列區(qū)08)，也可以為前者的DNA序列比后者的DNA序列短，或兩者的DNA序列相同。
為了有效地通過(guò)重組進(jìn)行該突變導(dǎo)入，可以按下述構(gòu)建靶重組載體00)。S卩，可以構(gòu)建為下述結(jié)構(gòu)靶重組載體OO)具有包含作為DNA序列的靶DNA序列(32)的第2DNA 序列區(qū)QOa)，該第2DNA序列區(qū)(20a)實(shí)質(zhì)上與包含靶基因(10)的突變導(dǎo)入目標(biāo)外顯子(12)的第IDNA序列區(qū)(IOa)相同，并且設(shè)置有夾住靶DNA序列(32)的、互不相同的序列對(duì)第1突變Iox序列(30)和第2突變Iox序列(36)。
另外，本說(shuō)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“實(shí)質(zhì)上相同”除了完全的相同的情況之外，還包括在未損害其原有性質(zhì)或特征的程度上保持著相同性的情況。
另外，此處對(duì)本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“突變Iox序列”進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。本說(shuō)明書(shū)中所使用的術(shù)語(yǔ)“突變Iox序列”是指，用其它堿基置換掉位于IoxP序列的中央位點(diǎn)的間隔序列中的8個(gè)堿基、間隔序列和/或間隔序列的5’端重復(fù)序列和/或3’端重復(fù)序列中的各自13個(gè)堿基中的1個(gè)或多個(gè)堿基的突變Iox序列。
更具體地，本發(fā)明書(shū)中使用的術(shù)語(yǔ)“第1突變Iox序列”是指，突變存在于Iox序列的5’端重復(fù)序列中、且同時(shí)位于靶DNA序列的5’端的突變Iox序列，例如可舉出1οχ71 等。所謂“第2突變Iox序列”是指，突變存在于IoxP序列的間隔序列中、并同時(shí)位于靶DNA 序列的3’端的突變Iox序列，例如可舉出lOX2272等。1οχ71為在IoxP序列的5’端重復(fù)序列的13個(gè)堿基(ATAACTTCGTATA)中，5’端的最初的5個(gè)堿基序列突變成TATTG的序列。 lox2272為IoxP序列的間隔序列突變的突變IoxP序列，且間隔序列的8個(gè)堿基(GCATACAT) 的第2個(gè)“C”置換成“G”，另外，第7個(gè)“A”置換成“T”。
以下參照?qǐng)D1說(shuō)明本發(fā)明的靶重組載體00)的詳細(xì)的序列結(jié)構(gòu)，靶重組載體00) 可以構(gòu)建為具有包含與靶基因(10)的第IDNA序列區(qū)(IOa)實(shí)質(zhì)相同的DNA序列的第2DNA 序列區(qū)QOa)，且第2DNA序列區(qū)(20a)具有包含有第1同源重組DNA序列區(qū)(M)、第1突變 Iox序列(30)、靶DNA序列區(qū)( )、第2突變Iox序列(36)、Poly(A)附加序列(38)、和第 2同源重組DNA序列區(qū)08)的序列結(jié)構(gòu)。且由互不相同的序列對(duì)第1突變Iox序列(30) 和第2突變Iox序列(36)夾著的靶DNA序列區(qū)( )，可以具有包含靶DNA序列(32)和第 1正選擇標(biāo)記DNA序列(34)的結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步，F(xiàn)RT序列(39a、39b)可以設(shè)置于靶DNA序列 (32)和第1正選擇標(biāo)記DNA序列(34)之間，且位于Poly (A)附加序列(38)的3，端。另夕卜，第1同源重組DNA序列區(qū)04)和第2同源重組DNA序列區(qū)Q8)的DNA序列一般可以分別為51Λ左右和2 31Λ左右，且第1同源重組DNA序列區(qū)Q4)和第2同源重組DNA序列區(qū)08)中也可以分別包含外顯子DNA序列和內(nèi)含子DNA序列。
進(jìn)而，在本發(fā)明的靶重組載體00)中，靶重組載體00)的第1同源重組DNA序列區(qū)04)的5’端設(shè)置有負(fù)選擇標(biāo)記DNA序列02)。例如可以使用白喉毒素A片段基因 (DT-A)等產(chǎn)生細(xì)胞毒蛋白質(zhì)的基因、或單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)等使毒性物質(zhì)的代謝產(chǎn)生變化的基因作為負(fù)選擇標(biāo)記DNA序列02)。另一方面，作為在靶重組載體 (20)的靶DNA序列區(qū)06)中編入的第1正選擇標(biāo)記DNA序列(34)，例如可以列舉出新霉素抗性基因(NecZ)等的耐藥性基因標(biāo)記。通過(guò)設(shè)置這樣的耐藥性基因標(biāo)記，在將載體導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，該載體只選擇與基因組DNA的靶位點(diǎn)進(jìn)行同源重組的細(xì)胞。
具有上述序列結(jié)構(gòu)的靶重組載體，例如用合適的限制性?xún)?nèi)切酶切斷pBluescript II SK+質(zhì)粒，在pBluescript II SK+質(zhì)粒的切位點(diǎn)上編入DT-A之后，再用合適的限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行切斷，并在限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)上編入長(zhǎng)臂-短臂片段，然后再用合適的限制性?xún)?nèi)切酶切斷該長(zhǎng)臂-短臂片段，在長(zhǎng)臂-短臂片段的切位點(diǎn)上編入1οχ71序列片段后， 在從長(zhǎng)臂區(qū)域的規(guī)定的外顯子的末端向上約200bp的位置進(jìn)行切斷，在該切位點(diǎn)上編入耐藥性基因標(biāo)記等，之后能夠通過(guò)切斷含有pBluescript II SK的規(guī)定部分，并進(jìn)行直鏈化而制作。且如上所述制作的靶重組載體能夠通過(guò)堿基序列的測(cè)定而確定。
具有如上所述的序列結(jié)構(gòu)的靶重組載體00)按照常規(guī)方法利用電穿孔等慣用的載體導(dǎo)入技術(shù)被導(dǎo)入到小鼠ES細(xì)胞等中。因此，在染色體上，靶基因(10)與靶重組載體 (20)進(jìn)行同源重組，獲得導(dǎo)入有作為突變導(dǎo)入的靶的靶DNA序列(32)的重組靶基因00)。 其結(jié)果，獲得的重組靶基因^))具有了第3DNA序列區(qū)GOa)，該第3DNA序列區(qū)(40a)具有與靶重組載體00)的第2DNA序列區(qū)QOa)實(shí)質(zhì)上相同的序列結(jié)構(gòu)(圖2)。
如圖2所示，重組靶基因00)的第3DNA序列區(qū)(40a)為包含負(fù)選擇標(biāo)記DNA序列(22)、第1同源重組DNA序列(24)、第1突變Iox序列(30)、突變靶DNA序列(35)、第2 突變Iox序列(36) ,Poly (A)附加序列(38)、FRT序列(39b)和第2同源重組DNA序列(28) 的序列結(jié)構(gòu)，并且突變靶DNA序列(35)由包含有靶DNA序列(32)、FRT序列(39a)、和第1 正選擇標(biāo)記DNA序列(34)的序列結(jié)構(gòu)組成。
接著，具有上述序列結(jié)構(gòu)的染色體上的重組靶基因00)，通過(guò)含有突變導(dǎo)入盒 (51)的突變導(dǎo)入載體(50)與Cre重組酶突變Iox系統(tǒng)的介導(dǎo)作用，將重組靶基因00)的第3DNA序列區(qū)GOa)中包含的突變靶DNA序列區(qū)(35)與突變導(dǎo)入載體(50)的突變導(dǎo)入盒(51)中包含的突變導(dǎo)入DNA序列區(qū)(54)重組，從而獲得在靶基因中導(dǎo)入有目標(biāo)基因突變的突變導(dǎo)入基因(60)。
能夠在本發(fā)明中使用的突變導(dǎo)入盒(51)為將突變DNA序列(57)導(dǎo)入到靶基因的工具，其不受特定的突變基因限定，是能夠適用于只要是具有突變的基因的所有突變基因的工具。而且，該突變導(dǎo)入盒的一大特點(diǎn)為，該突變導(dǎo)入盒是可以自由改變導(dǎo)入到靶基因的突變DNA序列的可變式的突變導(dǎo)入盒。因此，由于能夠比較容易且迅速地制備該突變導(dǎo)入盒，因此每次突變時(shí)預(yù)先制備該可變式的突變導(dǎo)入盒，即使重組靶基因的重組効率非常低， 也具有能夠在短時(shí)間內(nèi)、容易地且高幾率地制作出相應(yīng)的突變導(dǎo)入基因和導(dǎo)入有該突變導(dǎo)入基因的小鼠等非人類(lèi)動(dòng)物的較大的優(yōu)點(diǎn)。
如圖3所示，能夠這樣地可變式地構(gòu)建的突變導(dǎo)入盒(51)，為了高效地與重組靶基因GO)的靶DNA序列(32)重組，可以構(gòu)建為用互不相同的第3突變Iox序列(52)和第 4突變Iox序列(56)夾著突變DNA序列(57)與位于突變DNA序列(57)的3’端的第2正選擇標(biāo)記DNA序列(58)的結(jié)構(gòu)。而且，可以在第3突變Iox序列(52)與第2正選擇標(biāo)記 DNA序列(58)之間設(shè)置FRT序列(39c)。具有上述序列結(jié)構(gòu)的突變導(dǎo)入盒(51)可以通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域：
慣用的常規(guī)方法制作。
此處，用“第3突變Iox序列”表示的突變Iox序列為突變存在于IoxP序列的3’ 端重復(fù)序列、且位于突變DNA序列的5’端的突變Iox序列，例如可舉出loxKR3等。另外， 用“第4突變Iox序列”表示的突變Iox序列與第2突變Iox序列相同，為突變存在于IoxP 序列的間隔序列、且位于突變DNA序列的3’端的突變Iox序列，例如可舉出lOX2272等。
作為第3突變Iox序列(52)的loxKR3為將IoxP序列的3’端重復(fù)序列中從該 3’端的末端的第5個(gè)堿基到第7個(gè)堿基之間的3個(gè)堿基序列(5’ -GAA)替換為了 3個(gè)堿基序列(5’ -CGG)的突變Iox序列。另一方面，lox2272與第2突變Iox序列相同，為在IoxP 序列的間隔序列存在突變的突變Iox序列，間隔序列中的8個(gè)堿基(GCATACAT)中的第2的 “C”替換為“G”，此夕卜，第7的”A”替換為“T”。
另外，作為突變導(dǎo)入盒(51)中包含的第2正選擇標(biāo)記DNA序列(58)，例如可以設(shè)計(jì)成由嘌呤霉素抗性基因等耐藥性基因構(gòu)成。這樣，能夠選擇具有所期望的突變DNA序列的ES細(xì)胞。上述正選擇標(biāo)記DNA序列，能夠以規(guī)定的質(zhì)粒作為模板，在通過(guò)使用了合適的寡核苷酸對(duì)的PCR擴(kuò)增為規(guī)定長(zhǎng)度的片段之后，通過(guò)切斷在5’末端和3’末端人工添加的限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)而制作。通過(guò)設(shè)置上述的耐藥性基因標(biāo)記，在細(xì)胞中導(dǎo)入載體時(shí)，該載體只選擇與基因組DNA的靶位點(diǎn)進(jìn)行同源重組的細(xì)胞。
在本發(fā)明中，突變導(dǎo)入盒(51)的突變DNA序列(57)可以構(gòu)建成包含突變外顯子的DNA序列。作為該突變外顯子，例如能夠構(gòu)建成包含有作為存在于與人類(lèi)的常染色體顯性的良性家族性新生兒驚厥(BFNC)相關(guān)的電位依賴(lài)性鉀通道的基因KCNQ2亞基的外顯子 6部分中的突變部分的Y284C和T306A。另一方面，在將存在于KCNQ2基因上的其它基因突變作為目標(biāo)的情況下，可以將合適的突變導(dǎo)入到cDNA片段，以設(shè)計(jì)突變導(dǎo)入盒，其中所述 cDNA片段通過(guò)去除內(nèi)含子后連接含有外顯子6的下游的全部外顯子而成。上述內(nèi)容，對(duì)于其它突變基因也能夠同樣適用。
該基因KCNQ2亞基的突變Y284C堿基序列為將KCNQ2基因的外顯子6中的第23個(gè)堿基“A”替換為“G”的突變堿基序列(序列號(hào)為1)，并且為將外顯子6中的第8個(gè)酪氨酸替換為半胱氨酸的突變氨基酸序列(序列號(hào)為幻。另一方面，基因突變T306A的堿基序列為將KCNQ2基因的外顯子6中的第100個(gè)堿基“G”替換為“A”的突變堿基序列(序列號(hào)為 3)，并且為將外顯子6中的第34個(gè)丙氨酸替換為蘇氨酸的突變氨基酸序列(序列號(hào)為4)。
包含有能夠在本發(fā)明中使用的基因突變(Y^4C突變或A306T突變等基因突變) 的突變DNA序列，例如為將突變或A306T導(dǎo)入到包含小鼠KCNQ2基因的外顯子6的 DNA片段中，進(jìn)而將loxKR3序列添加到5’末端中的序列。
例如，包含有小鼠KCNQ2基因的外顯子6的Y284C突變的KCNQ2基因片段，以KCNQ2 基因的外顯子6的邊緣部分為模板，通過(guò)使用了外顯子6邊緣區(qū)擴(kuò)增和loxKR3序列導(dǎo)入用突變導(dǎo)入用寡核苷酸對(duì)的PCR，分別擴(kuò)增包含形成的堿基置換的5’端片段和3’端片段。上述2個(gè)片段利用上述外顯子6邊緣區(qū)擴(kuò)增和loxKR3序列導(dǎo)入用寡核苷酸對(duì)，并通過(guò)Ligation-ind印endent cloning法和PCR進(jìn)行連接和擴(kuò)增，能夠獲得規(guī)定長(zhǎng)度的片段。
并且，包含A306T突變的KCNQ2基因片段能夠與包含有突變的KCNQ2基因片段實(shí)質(zhì)相同地制作。進(jìn)而，即使對(duì)于包含其它突變的外顯子、或其它基因，也能夠?qū)嵸|(zhì)相同地制作。
具有上述序列結(jié)構(gòu)的突變導(dǎo)入盒(51)能夠按照本技術(shù)領(lǐng)域：
中慣用的常規(guī)方法導(dǎo)入到突變導(dǎo)入載體(50)。例如，可以使用與靶重組載體中使用的相同的載體作為突變導(dǎo)入載體。因此，例如，能夠使用 pBR322、pUC(pUC18、pUC19、pUC118、pUC119 等)、pBluescript II、pSP(pSP64, pSP65 等)、pGEM(pGEM_3、pGEM_4、pGEM_3Z 等)等的質(zhì)粒載體。如上述制成的包含有上述突變的KCNQ2基因片段，例如能夠構(gòu)建成具有如下序列結(jié)構(gòu)的突變導(dǎo)入載體將嘌呤霉素抗性基因等的第2正選擇標(biāo)記DNA序列區(qū)編入由限制性?xún)?nèi)切酶切斷了的合適的質(zhì)粒中，并在被限制性?xún)?nèi)切酶切斷之后，編入其切位點(diǎn)。
接著，如上所述，導(dǎo)入有突變導(dǎo)入盒(51)的突變導(dǎo)入載體(50)與重組靶基因00) 通過(guò)由Cre重組酶的介導(dǎo)作用進(jìn)行的反應(yīng)，使得序列對(duì)突變導(dǎo)入盒(51)中包含的第3突變 Iox序列(52)與第4突變Iox序列(56)、與該序列對(duì)夾著的突變導(dǎo)入DNA序列(54)被重
17組靶基因GO)重組，從而獲得突變導(dǎo)入基因陽(yáng)0)。
S卩，通過(guò)重組靶基因00)與突變導(dǎo)入載體(50)的Cre重組酶介導(dǎo)反應(yīng)，重組靶基因GO)的突變導(dǎo)入DNA序列區(qū)(35)與突變導(dǎo)入載體(50)的突變導(dǎo)入盒(51)置換。其結(jié)果，重組靶基因GO)的突變導(dǎo)入DNA序列區(qū)(35)中包含的靶DNA序列(32)與突變導(dǎo)入載體(50)的突變導(dǎo)入DNA序列區(qū)(54)中包含的突變DNA序列(57)置換，從而獲得導(dǎo)入有具有目標(biāo)基因突變的突變DNA序列(57)的目標(biāo)突變導(dǎo)入基因(60)。該Cre重組酶-突變Iox 系統(tǒng)的介導(dǎo)反應(yīng)，能夠按照公知的方法實(shí)施。
進(jìn)而，在上述的重組靶基因00)與突變導(dǎo)入載體(50)的Cre重組酶介導(dǎo)反應(yīng)中， 并不只進(jìn)行靶DNA序列與突變DNA序列的置換，也分別進(jìn)行了重組靶基因00)的第1突變 Iox序列(30)與突變導(dǎo)入盒(51)的第3突變Iox序列(52)的重組、重組靶基因(40)的第 2突變Iox序列(36)與突變導(dǎo)入盒(51)的第4突變Iox序列(56)的重組，重組成第5突變Iox序列(64)和第6突變Iox序列(66)。
如圖3所示，獲得的突變導(dǎo)入基因(60)含有由如下的序列結(jié)構(gòu)所組成的結(jié)構(gòu)，該序列結(jié)構(gòu)含有第1同源重組DNA序列04)、第5突變Iox序列(64)、突變導(dǎo)入DNA序列區(qū)(54)、第6突變Iox序列(66)、Poly(A)附加序列(38)、FRT序列(39b)、和第2同源重組DNA序列08)。突變導(dǎo)入DNA序列區(qū)(54)由包含突變DNA序列(57)、FRT序列(39c)、 第2正選擇標(biāo)記DNA序列(58)的序列結(jié)構(gòu)組成。
并且，設(shè)置于所獲得的突變導(dǎo)入基因(60)中的FRT序列(39b)與FRT序列(39c)， 例如用于在小鼠產(chǎn)生后去除藥物基因。即，作出的具有突變導(dǎo)入基因(60)的雄小鼠與野生型的雌小鼠交配生出的子代小鼠(Fl)通過(guò)與表達(dá)Flp重組酶的小鼠交配，能夠計(jì)算出去除了 FRT之間的DNA序列區(qū)的子代小鼠。之后，能夠?qū)⒉痪哂性撔蛄袇^(qū)的情形作為完成型并繼代下去。
在此，說(shuō)明突變導(dǎo)入基因(60)的第5突變Iox序列(64)與第6突變Iox序列(66)。 如上所述，由于第5突變Iox序列(64)為通過(guò)重組靶基因00)的第1突變Iox序列(30) 與突變導(dǎo)入盒(51)的第3突變Iox序列(5 的重組而獲得的突變Iox序列，因此，包括第 1突變Iox序列與第3突變Iox序列這兩者的結(jié)構(gòu)。因此，第5突變Iox序列(64)為與第 1突變Iox序列同樣地在IoxP序列的5’端重復(fù)序列中具有突變、并且與第3突變Iox序列同樣地在IoxP序列的3’端重復(fù)序列中也具有突變的突變Iox序列，例如，可舉出loX71/ KMR3等。換言之，第5突變Iox序列(64)為在IoxP序列的5’端和3’端重復(fù)序列中兼具第1突變Iox序列與第3突變Iox序列中的突變的突變Iox序列。并且，第6突變Iox序列(66)也與第5突變Iox序列相同，為通過(guò)重組靶基因GO)的第2突變Iox序列(36)與突變導(dǎo)入盒(51)的第4突變Iox序列(56)的重組而獲得的突變Iox序列，因此，包括第2 突變Iox序列與第4突變Iox序列這兩者的結(jié)構(gòu)。
在本發(fā)明中，重組靶基因00)與突變導(dǎo)入載體(50)的Cre重組酶-突變Iox系統(tǒng)介導(dǎo)反應(yīng)，能夠按照公知的方法實(shí)施。
即，在通過(guò)電穿孔等慣用的載體導(dǎo)入方法導(dǎo)入了靶重組載體的細(xì)胞中，通過(guò)設(shè)置于該載體內(nèi)的標(biāo)記基因的表達(dá)來(lái)選擇發(fā)生了同源重組的細(xì)胞。例如，若標(biāo)記基因?yàn)槟退幮曰?，則通過(guò)在該藥劑的存在下培養(yǎng)該細(xì)胞，能夠選擇發(fā)生了同源重組的細(xì)胞。即，編入了靶重組載體的細(xì)胞，例如在KSR-GMEM培養(yǎng)基等合適的培養(yǎng)基中懸濁后，通過(guò)在含有G418的培養(yǎng)基中進(jìn)行交換培養(yǎng)，殺死非重組細(xì)胞和非同源重組細(xì)胞，能夠進(jìn)行上述細(xì)胞的去除。如此，能夠進(jìn)行生存于含有G418的培養(yǎng)基中、已形成群體的已同源重組的ES細(xì)胞的分離和篩選。培養(yǎng)如上所述分離出的ES細(xì)胞，使用從其中提取的DNA，能夠通過(guò)PCR或南方雜化 (Southern hybridization)法等進(jìn)行篩選。其中，PCR通過(guò)使用用于同源重組檢測(cè)的Neo 抗性基因-短臂區(qū)下游間擴(kuò)增用寡核苷酸對(duì)，通過(guò)Neo抗性基因的3’末端部分與連接于靶重組載體的短臂區(qū)的3’末端的下游的KCNQ2基因的部分序列之間的片段的擴(kuò)增反應(yīng)，能夠獲得擴(kuò)增DNA產(chǎn)物。將上述獲得的擴(kuò)增DNA產(chǎn)物用合適的限制性?xún)?nèi)切酶切斷，并以短臂區(qū)的3’端區(qū)作為探針，進(jìn)行DNA印跡分析，通過(guò)靶同源重組來(lái)確認(rèn)已制作出DNA片段，并可以將該克隆ES細(xì)胞作為能夠在KCNQ2基因中突變導(dǎo)入的受體ES細(xì)胞凍結(jié)保存，用于以后的操作中。
使用上述獲得的受體ES細(xì)胞，能夠?qū)⑼蛔儗?dǎo)入載體中包含的基因突變，通過(guò)使用了 Cre-突變Iox系統(tǒng)的Iox特異性重組，導(dǎo)入到KCNQ2基因等靶基因中。向該KCNQ2基因的基因突變導(dǎo)入，能夠通過(guò)使用上述受體ES細(xì)胞株的克隆，通過(guò)利用電穿孔法等常規(guī)方法，在該受體ES細(xì)胞中導(dǎo)入上述突變導(dǎo)入載體和Cre重組酶表達(dá)載體而進(jìn)行。通過(guò)將突變導(dǎo)入載體編入上述受體ES細(xì)胞，并且使在質(zhì)粒中編入了 Cre重組酶基因的Cre表達(dá)載體感染，導(dǎo)入到受體ES細(xì)胞中的靶重組載體DNA中的Iox序列因子夾著的靶DNA序列部分，利用由Cre表達(dá)載體表達(dá)的Cre重組酶與Iox序列的相互作用進(jìn)行的特異性重組，能夠被導(dǎo)入到受體ES細(xì)胞中的KCNQ2基因。
如上所述，在導(dǎo)入有突變導(dǎo)入載體的受體ES細(xì)胞中，通過(guò)特異性重組產(chǎn)生了突變導(dǎo)入的細(xì)胞能夠通過(guò)抗生素耐藥性進(jìn)行篩選。通過(guò)由Cre進(jìn)行的特異性重組，在導(dǎo)入有突變導(dǎo)入盒的細(xì)胞中，靶重組載體的新霉素抗性基因被去除，取而代之的是具有嘌呤霉素抗性基因。因此，通過(guò)在含有抗生素嘌呤霉素的合適的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，殺死非重組細(xì)胞，并通過(guò)特異性重組，能夠篩選導(dǎo)入突變的細(xì)胞。分離存活的細(xì)胞群，進(jìn)一步培養(yǎng)后，從一部分中提取DNA，并通過(guò)PCR法或南方雜化法，能夠確定突變的導(dǎo)入。
本發(fā)明的基因敲入非人類(lèi)哺乳動(dòng)物，能夠通過(guò)將上述通過(guò)重組插入有靶突變DNA 序列部分的ES細(xì)胞導(dǎo)入到作為對(duì)象的除人類(lèi)以外的哺乳動(dòng)物而作出。作為對(duì)象動(dòng)物，例如為可以選自小鼠、大鼠、天竺鼠、田鼠、兔、犬、貓、羊、豬、山羊、牛、猴等，但優(yōu)選為小鼠、大鼠、天竺鼠、田鼠、兔等嚙齒動(dòng)物，特別優(yōu)選為小鼠。
如上所述，將通過(guò)重組而插入有靶突變DNA序列部分的ES細(xì)胞利用凝集法或顯微注射法注入到野生型小鼠的胚囊或8個(gè)細(xì)胞期的宿主胚中，直到生長(zhǎng)到胚囊期后，將其移植到偽妊娠狀態(tài)的假親小鼠等假親動(dòng)物的子宮中并生產(chǎn)，能夠制成嵌合體動(dòng)物。
對(duì)于小鼠，利用具有FSH樣作用的PMSG或具有LH樣作用的hCG等激素制劑，使實(shí)施了超數(shù)排卵處理的雌小鼠與雄小鼠交配。在受精后適當(dāng)?shù)臅r(shí)期內(nèi)，分別從子宮或輸卵管中回收胚囊或8個(gè)細(xì)胞期胚的早期胚胎。對(duì)于上述回收的胚，將上述同源重組ES細(xì)胞注入到試管內(nèi)，制作嵌合體胚胎。
另一方面，通過(guò)正常性周期的雌小鼠與進(jìn)行了輸精管結(jié)扎等處理的雄小鼠交配能夠作出用于作為假親的偽妊娠小鼠。對(duì)于作出的偽妊娠小鼠，通過(guò)將利用上述方法作出的嵌合體胚胎移植到子宮內(nèi)，并妊娠、分娩，能夠制作出嵌合體小鼠。為了更準(zhǔn)確地進(jìn)行嵌合體胚胎的著床、妊娠，優(yōu)選為提取受精卵的雌小鼠與作為假親的偽妊娠小鼠從具有相同的性周期的雌小鼠群中制作出。
對(duì)于具有來(lái)源于上述ES細(xì)胞的生殖細(xì)胞的小鼠個(gè)體，將該嵌合體小鼠與純種的小鼠交配，以出現(xiàn)于下一代中的來(lái)源于ES細(xì)胞的各種性狀作為指標(biāo)，能夠確認(rèn)在嵌合體小鼠生殖系列中導(dǎo)入了該ES細(xì)胞。若考慮到該確認(rèn)的容易程度，則由于在上述嵌合體小鼠與純種的小鼠交配獲得的下一代個(gè)體中出現(xiàn)了源自ES細(xì)胞的毛色，因此優(yōu)選為以下一代個(gè)體的毛色為指標(biāo)，確認(rèn)在小鼠生殖系中導(dǎo)入了 ES細(xì)胞。在小鼠中，雖然已知有野鼠色(刺豚鼠色)、黑色、黃土色、巧克力色、白色等毛色，但是考慮到源于使用的ES細(xì)胞的系統(tǒng)，可以適當(dāng)選擇與嵌合體小鼠交配的小鼠系統(tǒng)。另外，還能夠從身體的尾部尖端等提取DNA，通過(guò)進(jìn)行DNA印跡分析或PCR檢測(cè)來(lái)進(jìn)行選擇。
如上所述，選擇在生殖系中導(dǎo)入了移植到胚胎內(nèi)的重組ES細(xì)胞的動(dòng)物，通過(guò)使該嵌合體動(dòng)物繁殖，能夠得到表達(dá)了目標(biāo)突變基因的個(gè)體。通過(guò)使獲得的雜合子小鼠之間進(jìn)行交配，能夠獲得導(dǎo)入有目標(biāo)突變基因的純合子小鼠。保有制作出的突變基因的雜合子或純合子，由于在所有的生殖細(xì)胞和體細(xì)胞中都穩(wěn)定地具有上述基因突變，因此通過(guò)交配等能夠高效地將該突變傳遞給子孫代動(dòng)物。
以下，通過(guò)實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。但，下述實(shí)施例，雖然以在人類(lèi)的常染色體顯性的良性家族性新生兒驚厥(BFNC)中發(fā)現(xiàn)的、電位依存性鉀通道基因KCNQ2亞基的2 種基因突變(Y^4C和T306A)為例，但僅為用于具體說(shuō)明本發(fā)明的示例，并不用于限定本發(fā)明。
實(shí)施例1
(1)靶重組載體的序列結(jié)構(gòu)
靶重組載體從5’_末端開(kāi)始由由源自質(zhì)粒的部分、負(fù)選擇標(biāo)記盒、作為第1同源重組DNA序列區(qū)(長(zhǎng)臂區(qū))的KCNQ2基因部分序列、作為第1突變Iox序列的1οχ71序列、正選擇標(biāo)記DNA序列、作為第2突變Iox序列的lOX2272序列、第2同源重組DNA序列區(qū)(短臂區(qū))、和載體線(xiàn)性化用限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)組成的序列結(jié)構(gòu)組成。
該靶重組載體(pTgKCNQ2)構(gòu)建為以pBluescript II SK+質(zhì)粒為基礎(chǔ)，具有全長(zhǎng)為14，164bp (序列號(hào)為5)的DNA序列。其序列結(jié)構(gòu)如下，且圖4表示質(zhì)粒圖。
堿基序號(hào)1-673 源自 pBluescript II SK+ 的部分
堿基序號(hào)674-2301 =DT-A 盒
堿基序號(hào)2316-7483 :KCNQ2基因部分序列(用于同源重組的長(zhǎng)臂區(qū))
堿基序號(hào)7484-7517 :1οχ71 序列
堿基序號(hào)8091-10138 :PGK/Neo 盒
堿基序號(hào)10145-11939 :KCNQ2基因部分序列(用于同源重組的短臂區(qū))
堿基序號(hào)11940-14164 源自 pBluescript II SK+的部分
堿基序號(hào)11950-11%4 限制性?xún)?nèi)切酶Mc II酶切位點(diǎn)(用于載體線(xiàn)性化)
(1-1)質(zhì)粒
作為基礎(chǔ)的質(zhì)粒pBluescript II SK+用限制性?xún)?nèi)切酶Xho I和Xba I將由大腸桿菌提取的閉環(huán)狀DNA (2，960bp =Strategene社)切斷，并線(xiàn)性化。
(1-2)負(fù)選擇標(biāo)記盒(DT-A盒)
負(fù)選擇標(biāo)記盒由由MCl啟動(dòng)子、白喉毒素A編碼區(qū)(DT-A)、Poly (A)附加序列(pA)組成的序列結(jié)構(gòu)組成。
將質(zhì)粒pDT/ApA(由荒木喜美氏提供)的5’-端用B10 I切斷、3’-端用Spe I切斷，精制成1.61Λ的片段。
(1-3)用于KCNQ2基因的同源重組的長(zhǎng)臂區(qū)和短臂區(qū)
形成用于同源重組的長(zhǎng)臂區(qū)和短臂區(qū)的KCNQ2基因部分序列，設(shè)計(jì)為由小鼠 KCNQ2基因的內(nèi)含子2至內(nèi)含子7的區(qū)域。而且，作為靶基因的KCNQ2基因的長(zhǎng)臂區(qū)和短臂區(qū)，將含有KCNQ2基因的B6小鼠BAC克隆RPCI23-401L17作為模板，利用使用了具有下述序列的長(zhǎng)臂-短臂區(qū)擴(kuò)增用寡核苷酸對(duì)的PCR，擴(kuò)增成7. 4kb的片段。其中，長(zhǎng)臂區(qū)對(duì)應(yīng) 5，-端5. 6kb的區(qū)域，短臂區(qū)對(duì)應(yīng)3，-端1.81Λ的區(qū)域。
上述長(zhǎng)臂-短臂區(qū)擴(kuò)增用寡核苷酸對(duì)，設(shè)計(jì)成分別具有如序列號(hào)6和序列號(hào)7所表示的下述堿基序列。
序列號(hào)6:
5， -GGGAAGGAGCGGCCGCAGGAAGGGGGTGGAGGGCACTGGACCTG-3’ (KQ2-LA5， s)
序列號(hào)7:
5， GACGGTGCGCGGCCGCCGTGGCAGCCTGGGAAAGGCCAGAAAGAT-3’ (KQ2-SA3， a)
且，上述序列中，下劃線(xiàn)的部分表示限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列。
(1-4)作為第1突變Iox序列的1οχ71序列
作為第1突變Iox序列的1οχ71序列為在對(duì)應(yīng)于IoxP序列的34bp的雙鏈DNA的兩個(gè)末端，附加了限制性?xún)?nèi)切酶Spe I酶切位點(diǎn)和能夠互補(bǔ)結(jié)合的突出序列(5’-CTAG-3’) 的序列。1οχ71序列通過(guò)將具有下述序列的1οχ71序列合成用寡核苷酸對(duì)在95°C加熱變性后，緩慢冷卻至室溫，使堿基配對(duì)，T4多核苷酸激酶作為催化劑，ATP作為磷酸基供體，將雙鏈的5’端末端磷酸化而制備。
上述所示的1οχ71序列合成用寡核苷酸對(duì)，被設(shè)計(jì)成具有如序列號(hào)8和序列號(hào)9 所示的下述堿基序列。
序列號(hào)8:
5 ‘ -CTAG jATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTA
-3’ (lox71s)
序列號(hào)9:
5，-CTAG jTACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAI·
-3’ (lox71a)
上述序列中，框內(nèi)的堿基序列是對(duì)應(yīng)1οχ71序列的堿基序列。
(1-5)正選擇標(biāo)記(NeoK盒)
正選擇標(biāo)記DNA序列設(shè)計(jì)成由FRT序列、PGK/耐藥性基因標(biāo)記盒、作為第4突變 Iox序列的lOX2272序列、Poly(A)附加序列(pA)、和FRT序列構(gòu)成。這里，使用了新霉素抗性基因(NeoK)作為耐藥性基因標(biāo)記。
正選擇標(biāo)記以質(zhì)粒p03(由荒木喜美氏提供)作為模板，通過(guò)使用了具有下述序列的NecZ盒擴(kuò)增用寡核苷酸對(duì)的PCR，擴(kuò)增為2. 11Λ片段。之后，將兩末端人工附加的限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)用Nhe I切斷除去。[0191]NeoE盒擴(kuò)增用寡核苷酸對(duì)設(shè)計(jì)成具有如序列號(hào)10和11分別所示的下述序列。
序列號(hào)10
5， -TCGAGCTAGCTAATAACTTCGTATAGCATACA-3‘ (Nh-IoxPs)
序列號(hào)11
5， -GAATGCTAGCTTGCATGCCTGCAGGT-3’ (Nh-FRTa)
上述序列中，下劃線(xiàn)部分為限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列。
(2)靶重組載體的制備方法
在實(shí)施例(1-1)中，在用限制性?xún)?nèi)切酶Β ο I和Xba I切斷了的質(zhì)粒pBluescript II SK+上編入了實(shí)施例(1-2)中制備的DT-A盒后，用Not I將其切斷，并在該切位點(diǎn)上編入由實(shí)施例(1-3)制備的長(zhǎng)臂-短臂區(qū)片段。并且，將編入了長(zhǎng)臂-短臂區(qū)的片段用Spe I 切斷，在該切位點(diǎn)編入由實(shí)施例(1-4)制備的1οχ71片段。然后，由編入了 1οχ71的片段的長(zhǎng)臂區(qū)的外顯子6的5’ -末端上游約200bp處用)(ba I切斷，在該酶切位點(diǎn)上編入由實(shí)施例(1- 制備的Neo盒，制備出靶重組載體。靶重組載體的制備通過(guò)堿基序列的測(cè)定而確認(rèn)。將上述制備的靶重組載體導(dǎo)入到ES細(xì)胞。
實(shí)施例2
本實(shí)施例涉及在與由實(shí)施例1制備的靶重組載體的同源重組中使用的突變導(dǎo)入載體。
該KCNQ2突變導(dǎo)入載體(pMtKCNQ2YC和pMtKCNQ2AT)為用于通過(guò)特異性重組在受體ES細(xì)胞的KCNQ2基因中導(dǎo)入如Tyr284 — Cys或者Ala3tl6 — Thr的核苷酸置換的2種載體。 在含有上述任意核苷酸置換的570bp的KCNQ2基因片段(外顯子6及其前后)的5’末端設(shè)置loxKR3序列，在3’末端設(shè)置嘌呤霉素抗性基因(PuroR)和1οχ2272序列。這些載體與Cre重組酶表達(dá)載體一起導(dǎo)入到受體ES細(xì)胞時(shí)，通過(guò)Cre重組酶的作用，將設(shè)置在受體 ES細(xì)胞的KCNQ2基因上的1ΟΧ71-1ΟΧ2272間的區(qū)域與突變KCNQ2序列高效率地置換。為了使置換的細(xì)胞具有嘌呤霉素抗性，可以使用正選擇。該KCNQ2突變導(dǎo)入載體(pMtKCNQ2YC 和pMtKCNQ2AT)都為48%bp (序列號(hào)為12)，序列構(gòu)成如下，質(zhì)粒圖如圖6所示。
1-2243 來(lái)源于 pBluescript II SK+的部分
2243-2277 loxKR3 序列
2278-2847 KCNQ2基因部分序列(含有突變的外顯子6和邊緣區(qū))
2848-4243 PGK/Puro 盒
4238-4895 源自 pBluescript II SK+的部分
上述KCNQ2基因部分的構(gòu)成如下
2278-2471內(nèi)含子5 (3，末端部分)
2472-2582外顯子6 (包含突變)
25834847內(nèi)含子6 (5，末端部分)
2506 突變位點(diǎn)(TAC (Tyr) — TGC (Cys))(僅 p]/ftKCNQ2YC)
2571 突變位點(diǎn)(GCT (Ala) — ACT (Thr))(僅 p]/ftKCNQ2AT)
上述PGK/Puro盒中含有下列的序列因子。
2850-2949 FRT 序列
2966-3522 PGK基因啟動(dòng)子區(qū)[0216]3523-4122嘌呤霉素_N_乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼區(qū)
4204-4237 1οχ2272 序列
(2-1)質(zhì)粒
作為基礎(chǔ)的質(zhì)粒(p3T)，利用Hind III和Kpn I將從大腸桿菌中提取的閉環(huán)狀 DNA(3，003bp ；MoBiTec社)切斷并線(xiàn)性化。
(2-2)嘌呤霉素抗性基因盒(Puro盒)
嘌呤霉素抗性基因盒(Puro盒)設(shè)計(jì)成由FRT序列-PGK啟動(dòng)子(PPGK)-嘌呤霉素抗性基因(Pure/)-10x2272序列組成的序列結(jié)構(gòu)組成。
Puro盒是以質(zhì)粒p04 (由荒木喜美氏提供)作為模板，通過(guò)使用了下述寡核苷酸對(duì)的PCR，擴(kuò)增為1.51Λ的片段。然后，用Hind III和Kpn I將人工附加在5’-末端和3’-末端的限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)切斷。
Puro盒擴(kuò)增用寡核苷酸對(duì)設(shè)計(jì)成具有序列號(hào)13和14各自表示的下述序列。
序列號(hào)13
5， -AACAAGCTTCAAAAGCGCTCTGAAGTTCCTAT-3‘ (Hd-FRTs)
序列號(hào)14
5， -ATAGGTACCATAACTTCGTATAAAGTATCCTATACGAAGTTA-3' (Kp_lox2272a)
上述序列中，下劃線(xiàn)部分為限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列。
實(shí)施例3
本實(shí)施例涉及能夠向KCNQ2基因中導(dǎo)入突變的受體ES細(xì)胞的構(gòu)建。該受體ES細(xì)胞的構(gòu)建按照下述方式進(jìn)行(參照?qǐng)D7)。
將小鼠ES細(xì)胞在2個(gè)培養(yǎng)皿中繼代培養(yǎng)，通過(guò)胰蛋白酶處理，將半?yún)R合性 (semi-confluent)狀態(tài)的小鼠ES細(xì)胞(無(wú)飼養(yǎng)層KPTU株)從培養(yǎng)皿剝離，并在PBS中懸濁成總量1. 6ml。在其中加入20 μ g線(xiàn)性化的由實(shí)施例1制備的靶重組載體，在冰上冷卻 10分鐘后，等分轉(zhuǎn)移到2個(gè)電穿孔用比色皿中，用基因電穿孔儀(Gene Pulser, ^ 4才，, K社)，在0. 8kV、3. OyF的條件下各放電1次，進(jìn)行DNA的導(dǎo)入。
如上所述將靶重組載體用電穿孔向小鼠ES細(xì)胞導(dǎo)入DNA，利用靶重組在染色體上的KCNQ2基因結(jié)構(gòu)中導(dǎo)入上述序列因子。導(dǎo)入了該序列因子的小鼠ES細(xì)胞株，為了僅使在基因組DNA中穩(wěn)定地插入有含有新霉素抗性基因(NecZ)的靶重組載體的細(xì)胞能夠生存，利用含有新霉素(G418)的培養(yǎng)基培養(yǎng)并篩選小鼠ES細(xì)胞。就是說(shuō)，導(dǎo)入了該序列因子的小鼠ES細(xì)胞株，通過(guò)將電穿孔后的細(xì)胞在KSR-GMEM培養(yǎng)基60ml中懸濁，等分到6個(gè)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，M小時(shí)后，換到含有200μ g/ml的G418的培養(yǎng)基中，之后以2天換一次含有G418的培養(yǎng)基，培養(yǎng)7天而篩選出。而且，由非同源重組細(xì)胞在KCNQ2基因結(jié)構(gòu)以外的位置上插入有靶重組載體的細(xì)胞通過(guò)由設(shè)置于長(zhǎng)臂區(qū)外部的DT-A基因所表達(dá)的致死性毒素而排除。
進(jìn)而，通過(guò)上述的操作，從在含有G418的培養(yǎng)基中生存并形成了群落的ES細(xì)胞中，進(jìn)行同源重組ES細(xì)胞的分離和篩選。如上所述通過(guò)含有G418的培養(yǎng)基篩選ES細(xì)胞的結(jié)果為合計(jì)約500個(gè)ES細(xì)胞在含有G418的培養(yǎng)基中生存并形成了群落。這些細(xì)胞中，144 個(gè)作為進(jìn)行了靶同源重組的細(xì)胞的候補(bǔ)而分離并培養(yǎng)，從中提取DNA，使用該提取的DNA， 進(jìn)行PCR篩選。該P(yáng)CR，使用用于同源重組檢測(cè)的具有下述序列的Neo抗性基因-短臂區(qū)下游擴(kuò)增用寡核苷酸對(duì)，對(duì)Neo抗性基因的3’末端部分和靶重組載體的短臂區(qū)的3’末端
23的下游相鄰的KCNQ2基因的部分序列之間的2. Okb的片段進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。該擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果，在9個(gè)克隆中確認(rèn)有擴(kuò)增產(chǎn)物。
上述Neo抗性基因_短臂區(qū)下游擴(kuò)增用寡核苷酸對(duì)，如序列號(hào)15和16所示，設(shè)計(jì)為具有下述堿基序列。
序列號(hào)15
5， -GCAAAACCAAATTCCGGGCCAGCTCATTC-3， (Neo3， s)
序列號(hào)16
5， -ATTTGTCCTGCTTCAGTGCTGTATTGGGAT-3， (KQ2CA3， a)
一方面，關(guān)于這些擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA，使用具有下述序列的引物對(duì)進(jìn)行PCR，結(jié)果由于未確認(rèn)到擴(kuò)增產(chǎn)物，因此能夠判斷沒(méi)有發(fā)生由非同源重組進(jìn)行的靶重組載體的插入。艮口， 用限制性?xún)?nèi)切酶BspH I和Bgl II切斷這些DNA，以短臂區(qū)3，端區(qū)為探針進(jìn)行DNA印跡分析，結(jié)果在全部9個(gè)克隆中，在靶同源重組的情況下，均檢測(cè)出了預(yù)想的3. 2kb的DNA片段。 由此，在這9個(gè)克隆ES細(xì)胞上確認(rèn)了所期待的靶重組，作為能向KCNQ2基因中導(dǎo)入突變的受體ES細(xì)胞被凍結(jié)保存，用于以下操作。
用于檢出非同源重組的DT-A基因-長(zhǎng)臂上游擴(kuò)增用引物對(duì)被設(shè)計(jì)成具有如序列號(hào)17和18所示的下述序列。
序列號(hào)17
5， -CCTGTGCAGGAAATCGTGTCAGGGCG-3， (DT-A3， s)
序列號(hào)18
5， -TTCTCTTCCAGCTGGATCGGGGTGC-3， (KQ2LA5， a)
外顯子6邊緣區(qū)擴(kuò)增與loxKR3序列導(dǎo)入用引物對(duì)設(shè)計(jì)成具有由序列號(hào)19和20 所示的下述序列。
序列號(hào)19
5，-TAGGATcc |ataacttcgtatagcatacattataccttgttat|
CTAGTA-3'
(BH-KMR/E6S)
序列號(hào)20
5’ -GATAAGCTTAGAATCATTCAGATGGGAAAGCCACA-3’ (Hd_E6a)
上述序列中，下劃線(xiàn)表示限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列，框中表示loxKR3序列，黑體字表示突變置換位點(diǎn)。
Y284C突變導(dǎo)入用引物對(duì)設(shè)計(jì)成具有如序列號(hào)21和22所示的下述序列。
序列號(hào)21
5， -CGACCATTGGCTACGGGGACAAGTGCCCTCA-3， (Y284Cs)
序列號(hào)22
5， -GCCTCCCGTTCCAGGTCTGAGGGCACTTGT-3， (Y284Ca)
A306A突變導(dǎo)入用引物對(duì)設(shè)計(jì)成具有如序列號(hào)23和M所示的下述序列。
序列號(hào)23
5， -CCCTCATTGGTGTCTCGTTCTTTACTCTTC-3， (A306Ts)[0260]序列號(hào)24
5， -TCCCAAAATGCCAGCAGGAAGAGTAAAGAA-3， (A306Ta)
實(shí)施例4
進(jìn)一步，將由實(shí)施例2所得的突變導(dǎo)入載體和Cre重組酶表達(dá)載體，在400V、 125 μ F的條件下，利用電穿孔法共同導(dǎo)入到由實(shí)施例3制備并分離的突變受體ES細(xì)胞株的克隆中，根據(jù)突變序列是否被導(dǎo)入到染色體上的KCNQ2基因的2個(gè)Iox序列之間，再利用嘌呤霉素抗性基因篩選并分離已置換的突變ES細(xì)胞。即，如上所述電穿孔后的細(xì)胞在60ml的 KSR-GMEM培養(yǎng)基中懸濁，等分到6個(gè)IOcm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，并在M小時(shí)后交換到含有2 μ g/ ml的嘌呤霉素的培養(yǎng)基中。之后，每2天1次進(jìn)行含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基的交換，通過(guò)7天的培養(yǎng)，確認(rèn)僅2個(gè)Iox序列之間已被突變基因序列置換了的細(xì)胞形成了群落。(參照?qǐng)D 8)。
進(jìn)行如上所得的KCNQ2突變ES細(xì)胞的分離與確認(rèn)。如上所述，將形成了群落的嘌呤霉素抗性細(xì)胞株分離成多個(gè)，作為KCNQ2突變ES細(xì)胞的候補(bǔ)凍結(jié)保存。由該細(xì)胞的一部分提取DNA，利用PCR將含有突變的區(qū)域擴(kuò)增之后，根據(jù)堿基序列的測(cè)定來(lái)確認(rèn)突變導(dǎo)入。
實(shí)施例5
將如上所建立的KCNQ2突變ES細(xì)胞注入小鼠，按照常規(guī)方法作出基因敲入小鼠。 即，將KCNQ2突變ES細(xì)胞克隆與源自ICR小鼠的桑椹胚凝聚并培養(yǎng)一晚之后，選擇ES細(xì)胞與桑果胚凝聚了的混合胚。將該嵌合體胚移植到偽妊娠雌性(假親)的子宮中。約17天后出生的幼子中，選擇毛色具有源自KCNQ2細(xì)胞的組織的嵌合體小鼠。該嵌合體小鼠性成熟8 周以后，通過(guò)與C57BL/6小鼠交配，得到體內(nèi)嵌合狀地具有源自ES克隆的KCNQ2突變細(xì)胞的Fl小鼠(雜合子)個(gè)體。該Fl小鼠與Flp表達(dá)小鼠交配，去除FRT序列夾著的嘌呤霉素抗性基因等不需要的序列因子，在KCNQ2基因中分別含有上述突變(Y284C)和(T306A)， 除此以外的DNA序列作出了與野生型大致相同的所希望的突變基因敲入小鼠(參照?qǐng)D9)。
工業(yè)實(shí)用性
本發(fā)明的可變式突變導(dǎo)入載體，能夠適用于所有的基因的突變，并且，能夠迅速地作出具有導(dǎo)入有所希望的基因突變的突變基因的基因敲入小鼠等基因敲入非人類(lèi)哺乳動(dòng)物。并且，本發(fā)明的基因敲入非人類(lèi)哺乳動(dòng)物，由于能夠?qū)λ械募膊〉钠鹨蚝桶Y狀的原因解析等的研究有很大的貢獻(xiàn)，因此，特別是在醫(yī)療領(lǐng)域等中能夠期待巨大的貢獻(xiàn)。
權(quán)利要求
1.一種基因突變導(dǎo)入方法，其特征在于，該方法包括將染色體上的重組靶基因GO) 中含有的相互不同的序列對(duì)第1突變Iox序列(30)和第2突變Iox序列(36)夾著的靶DNA 序列(32)通過(guò)突變導(dǎo)入載體(50)的突變導(dǎo)入盒(51)、與所述突變導(dǎo)入盒(51)中含有的相互不同的序列對(duì)第3突變Iox序列(52)和第4突變Iox序列(56)夾著的突變導(dǎo)入DNA序列區(qū)(54)通過(guò)Cre重組酶的介導(dǎo)作用，進(jìn)行重組導(dǎo)入。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的基因突變導(dǎo)入方法，其特征在于，所述重組靶基因GO)為通過(guò)靶基因(10)與靶重組載體OO)的同源重組得到的重組基因，且含有相互不同的序列對(duì)第1突變Iox序列(30)和第2突變Iox序列(36)夾著的靶DNA序列(32)。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的基因突變導(dǎo)入方法，其特征在于，所述突變導(dǎo)入載體 (50)的突變導(dǎo)入盒(51)含有序列對(duì)第3突變Iox序列(52)和第4突變Iox序列(56)夾著的突變DNA序列(57)和第2正選擇標(biāo)記DNA序列(58)。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1 3中任一項(xiàng)所述的基因突變導(dǎo)入方法，其特征在于，所述突變導(dǎo)入載體(50)的突變導(dǎo)入盒(51)中含有的序列對(duì)第3突變Iox序列(5 和第4突變Iox序列(56)夾著的突變DNA序列(57)，通過(guò)Cre重組酶的介導(dǎo)作用，與所述重組靶基因00)中含有的序列對(duì)第1突變Iox序列(30)和第2突變Iox序列(36)夾著的靶DNA序列(32) 進(jìn)行重組。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1 4中任一項(xiàng)所述的基因突變導(dǎo)入方法，其特征在于，所述第1突變 Iox序列(30)為突變存在于IoxP序列的5’端重復(fù)序列的突變Iox序列，第2突變Iox序列(36)為突變存在于IoxP序列的間隔序列的突變Iox序列，第3突變Iox序列(52)為突變存在于IoxP序列的3’端重復(fù)序列的突變Iox序列，且第4突變Iox序列(56)為突變存在于IoxP序列的間隔序列的突變Iox序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1 5中任一項(xiàng)所述的基因突變導(dǎo)入方法，其特征在于，所述第1突變Iox序列(30)為10X71，第2突變Iox序列(36)為1οχ2272，第3突變Iox序列(52)為 loxKR3，且第 4 突變 Iox 序列(56)為 1οχ2272。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1 6中任一項(xiàng)所述的基因突變導(dǎo)入方法，其特征在于，通過(guò)所述重組靶基因GO)與突變導(dǎo)入載體(50)的突變導(dǎo)入盒(51)的重組得到的突變導(dǎo)入基因(60) 含有第5突變Iox序列(64)和第6突變Iox序列(66)夾著的突變導(dǎo)入DNA序列區(qū)(54)， 其中所述第5突變Iox序列(64)和第6突變Iox序列(66)通過(guò)序列對(duì)第1突變Iox序列 (30)和第2突變Iox序列(36)、與所述序列對(duì)第3突變Iox序列(5 和第4突變Iox序列(56)的各自的重組而獲得，并且所述突變導(dǎo)入DNA序列區(qū)(54)含有突變DNA序列(57) 和第2正選擇標(biāo)記DNA序列(58)。
8.根據(jù)權(quán)利要求
7所述的基因突變導(dǎo)入方法，其特征在于，所述第5突變Iox序列(62) 為位于IoxP序列的5，端和3，端重復(fù)序列的lox71/KR3,該lox71/KR3兼具第1突變Iox 序列(30)的1οχ71與第3突變Iox序列(36)的loxKR3的突變；并且第6突變Iox序列 (66)為 1οχ2272。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1 8項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的基因突變導(dǎo)入方法，其特征在于，該基因突變導(dǎo)入方法包括同源重組工序，該工序包括通過(guò)所述靶基因(10)與靶重組載體OO)的同源重組，對(duì)所述靶基因(10)的第IDNA序列區(qū)(IOa)與所述靶重組載體QO)的第2DNA序列區(qū)(20a)進(jìn)行同源重組，利用所述第2DNA序列區(qū)(20a)中包含的靶DNA序列(3 對(duì)包含于所述第 IDNA序列區(qū)(IOa)中的突變導(dǎo)入目標(biāo)外顯子(12)進(jìn)行重組，以得到重組靶基因00)；以及突變導(dǎo)入工序，該工序包括通過(guò)由Cre重組酶和1對(duì)突變型Iox序列組成的Cre-突變Iox系統(tǒng)的介導(dǎo)作用，利用所述突變導(dǎo)入載體(50)的突變導(dǎo)入盒(51)對(duì)所述重組靶基因GO)的第3DNA序列區(qū)GOa)中包含的序列對(duì)第1突變Iox序列(30)和第2突變Iox 序列(36)、與所述序列對(duì)夾著的突變靶DNA序列區(qū)(35)進(jìn)行重組，以得到導(dǎo)入了突變導(dǎo)入 DNA序列區(qū)(54)的突變導(dǎo)入基因(60)；其中，所述靶重組載體OO)含有負(fù)選擇標(biāo)記DNA序列(22)、第1同源重組DNA序列區(qū) (24)、靶DNA序列區(qū)(26)、和第2同源重組DNA序列區(qū)(34)，且所述靶DNA序列區(qū)Q6)含有第1突變Iox序列(30)、靶DNA序列(32)、第1正選擇標(biāo)記DNA序列(34)、第2突變Iox 序列(36)、和多聚腺苷酸附加序列(38)，并且所述第1和第2同源重組DNA序列區(qū)(22、28) 具有同源重組所必需的DNA序列的長(zhǎng)度；所述重組靶基因GO)的第3DNA序列區(qū)(40a)含有第1同源重組DNA序列區(qū)Q4)、第1 突變Iox序列(30)、突變靶DNA序列區(qū)(35)、第2突變Iox序列(36)、和第2同源重組DNA 序列區(qū)08)，且突變靶DNA序列區(qū)(35)含有靶DNA序列(32)、和第1正選擇標(biāo)記DNA序列 (34)；所述突變導(dǎo)入載體(50)的突變導(dǎo)入盒(51)含有第3突變Iox序列(52)、突變導(dǎo)入DNA 序列區(qū)(54)、和第2突變Iox序列(56)，并且所述突變導(dǎo)入DNA序列區(qū)(54)含有突變DNA 序列(57)、和第2正選擇標(biāo)記DNA序列(58)；且所述突變導(dǎo)入基因(60)含有第1同源重組DNA序列區(qū)04)、第5突變Iox序列(62)、 突變導(dǎo)入DNA序列區(qū)(54)、第6突變Iox序列(66)、和第2同源重組DNA序列區(qū)Q8)，且突變導(dǎo)入DNA序列區(qū)(54)含有突變DNA序列(57)、和第2正選擇標(biāo)記DNA序列(58)。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1 9中任一項(xiàng)所述的基因突變導(dǎo)入方法，其特征在于，所述突變導(dǎo)入載體的突變導(dǎo)入盒(51)中包含的突變DNA序列(57)為突變外顯子。
11.根據(jù)權(quán)利要求
1 10中任一項(xiàng)所述的基因突變導(dǎo)入方法，其特征在于，所述突變導(dǎo)入基因(60)中包含的突變DNA序列(57)為突變外顯子。
12.根據(jù)權(quán)利要求
1 11中任一項(xiàng)所述的基因突變導(dǎo)入方法，其特征在于，所述靶基因?yàn)閬?lái)源于人類(lèi)的常染色體顯性的良性家族性新生兒驚厥(BFNC)相關(guān)的電壓依賴(lài)性鉀通道 KCNQ2亞基的基因。
13.根據(jù)權(quán)利要求
1 12中任一項(xiàng)所述的基因突變導(dǎo)入方法，其特征在于，所述靶基因 (10)的靶突變?yōu)榛騅CNQ2的Y284C(序列號(hào)1和2)或T306A(序列號(hào)3和4)。
14.一種突變導(dǎo)入基因的制備方法，其特征在于，該方法包括利用權(quán)利要求
1 13 中任一項(xiàng)所述的基因突變導(dǎo)入方法，向靶基因(10)導(dǎo)入基因突變，以制備突變導(dǎo)入基因 (60)。
15.一種突變導(dǎo)入基因，該突變導(dǎo)入基因?yàn)橥蛔儗?dǎo)入基因(60)，其特征在于，該突變導(dǎo)入基因含有第1同源重組DNA序列區(qū)04)、第5突變Iox序列(62)、突變導(dǎo)入DNA序列區(qū) (54)、第6突變Iox序列(66)、和第2同源重組DNA序列區(qū)Q8)；所述突變導(dǎo)入DNA序列區(qū) (54)含有突變DNA序列(57)和第2正選擇標(biāo)記DNA序列(58)，且被序列對(duì)第5突變Iox 序列(62)和第6突變Iox序列(66)夾著。
16.根據(jù)權(quán)利要求
15所述的突變導(dǎo)入基因，其特征在于，所述序列對(duì)第5突變Iox序列(62)和第6突變Iox序列(66)，通過(guò)序列對(duì)第1突變Iox序列(30)和第2突變Iox序列(36)、與序列對(duì)第3突變Iox序列(52)和第4突變Iox序列(56)的重組而獲得。
17.一種突變導(dǎo)入盒，其特征在于，該突變導(dǎo)入盒含有序列對(duì)第3突變Iox序列(52) 和第4突變Iox序列(56)以及所述序列對(duì)夾著的突變DNA序列(57)以及第2正選擇標(biāo)記 DNA 序列(58)。
18.根據(jù)權(quán)利要求
17所述的突變導(dǎo)入盒，其特征在于，所述第3突變Iox序列(52)為 loxKR3，第4突變Iox序列(56)為1οχ2272，且突變DNA序列(57)含有突變外顯子。
19.一種突變導(dǎo)入載體，其特征在于，該突變導(dǎo)入載體含有權(quán)利要求
17或18所述的突變導(dǎo)入盒。
20.一種突變導(dǎo)入ES細(xì)胞，其特征在于，該突變導(dǎo)入ES細(xì)胞導(dǎo)入有利用權(quán)利要求
14所述的突變導(dǎo)入基因的制備方法制得的突變導(dǎo)入基因、或權(quán)利要求
15或16所述的突變導(dǎo)入基因。
21.一種基因敲入非人類(lèi)哺乳動(dòng)物，其特征在于，該基因敲入非人類(lèi)哺乳動(dòng)物導(dǎo)入有利用權(quán)利要求
14所述的突變導(dǎo)入基因的制備方法制備的突變導(dǎo)入基因、或權(quán)利要求
15或16 所述的突變導(dǎo)入基因。
22.根據(jù)權(quán)利要求
21所述的基因敲入非人類(lèi)哺乳動(dòng)物，其特征在于，所述基因敲入非人類(lèi)哺乳動(dòng)物為小鼠。
23.根據(jù)權(quán)利要求
21或22所述的基因敲入非人類(lèi)動(dòng)物，其特征在于，所述突變基因來(lái)源于人類(lèi)的常染色體顯性的良性家族性新生兒驚厥(BFNC)相關(guān)的電壓依賴(lài)性鉀通道的基因KCNQ2亞基。
24.根據(jù)權(quán)利要求
18 23中任一項(xiàng)所述的基因敲入非人類(lèi)哺乳動(dòng)物，其特征在于，所述突變基因?yàn)橥蛔兓騅CNQ2的Y284C或T306A。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明的基因突變導(dǎo)入方法包括以下工序利用突變導(dǎo)入目標(biāo)的靶基因與靶重組載體的同源重組，將靶基因的突變導(dǎo)入目標(biāo)外顯子與靶重組載體的靶DNA序列進(jìn)行置換的同源重組工序；以及，通過(guò)與具有包含突變外顯子的突變DNA序列的突變導(dǎo)入載體的突變導(dǎo)入盒之間的利用Cre重組酶的介導(dǎo)作用而進(jìn)行的特異性重組，用突變導(dǎo)入盒的突變DNA置換所得的重組靶基因的靶DNA序列，以得到導(dǎo)入了突變DNA序列的突變導(dǎo)入基因的突變導(dǎo)入工序。并且，本發(fā)明可以作出具有該突變導(dǎo)入基因的基因敲入小鼠等的基因敲入非人類(lèi)動(dòng)物。
文檔編號(hào)C12N15/09GKCN102203249SQ200980142501
公開(kāi)日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2009年10月23日
發(fā)明者廣瀨伸一, 弟子丸正伸, 荒木喜美 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人熊本大學(xué), 學(xué)校法人福岡大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan