專利名稱：具有α-苯乙醇拆分活性的嗜熱脂肪酶、編碼基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有a-苯乙醇拆分活性的嗜熱脂肪酶及其編碼基因， 以及該嗜熱脂肪酶的制備方法和應(yīng)用。
(二)
背景技術(shù)：
脂肪酶(lipase, E.C.3.1.1.3 )全稱為三?；视退饷?triacylglycerol), 是指能在油水界面上水解甘油三酯的酶。它是能催化酯水解和酯合成的水 解酶中最重要的一類。脂肪酶具有較寬的作用溫度、較強(qiáng)的底物專一性及 立體選擇性等特點(diǎn)，其催化的反應(yīng)不需輔酶，反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少， 因此已廣泛應(yīng)用于食品加工、洗滌劑、造紙、皮革加工、制藥、污水處理 等行業(yè)。由于^多數(shù)的工業(yè)反應(yīng)都在超過(guò)45。C的溫度下操作，這就要求 酶具備專交好的熱穩(wěn)、定性(Bonch隱Osmolovskaya, E.A.， Miroshnichenko, M丄.，Kostrikina, N.A.etal., Arch.Microbiol.， 154, 1990: 556~559。)， 來(lái)源于一些嗜熱菌的嗜熱脂肪酶不僅具有常溫酶的高效催化的優(yōu)點(diǎn)，而且 在高溫條件下能保持很高的穩(wěn)定性，對(duì)有機(jī)溶劑及變性劑有很強(qiáng)的抗性， 因此在許多領(lǐng)域，如食品工業(yè)、環(huán)境保護(hù)、能源以及石油開采等方面都具 有潛在的重要的應(yīng)用價(jià)值。
隨著對(duì)手性藥物和中間體需求的增長(zhǎng)，利用生物法或酶法拆分手性化 合物來(lái)合成單一對(duì)映體日益得到人們的重視。脂肪酶是目前生物催化中最 廣泛應(yīng)用的酶類，其中手性化合物的拆分(Racemate resolution)是其主 要應(yīng)用方向。脂肪酶對(duì)醇、羧酸、S旨、酰胺和胺等手性化合物均有較好的 立體選擇性，因此脂肪酶被廣泛地用來(lái)拆分外消旋醇和羧酸。拆分的主要途徑為立體選擇性水解、酯化或轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。通過(guò)篩選找到適用的具有高對(duì) 映體選擇性的新型脂肪酶酶以制備光學(xué)純的手性化合物已經(jīng)成為研究熱 點(diǎn)。在同 一生物體內(nèi)往往存在多種水解酶,但它們的立體選擇性存在差異， 因此利用微生物細(xì)胞或粗酶制品進(jìn)行催化時(shí)會(huì)降低產(chǎn)物的光學(xué)純度
(Geun-Joong Kim, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 17， 2002: 29 38) 。 Fernandez-Lorente G等人把Aspergillus niger月旨肪酶純化后其 對(duì)0-2- 丁?；?2-苯乙酸外消旋體的立體選擇性大大提高了
(Fernandez-Lorente G et al, Purification of different lipases from Jspergz7/MS w/ger by using a highly selective adsorption on hydrophobic supports, Biotechnol Bioeng, 2005, 92 (6) : 773-9)。由于大多數(shù)篩選獲得脂肪 酶產(chǎn)生菌活力較低，給分離純化造成了困難，因此需要通過(guò)基因克隆的手 段來(lái)獲得大量純化的具備高選擇性的脂肪酶以更好的滿足工業(yè)催化的要
求。 —
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種在高溫條件下顯示活性的嗜熱脂肪酶及其 編碼基因，同時(shí)提供了由重組菌抹制備脂肪酶的方法，以及純化的脂肪酶 在苯乙醇的手性拆分的應(yīng)用。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
一種具有a-苯乙醇拆分活性的嗜熱脂肪酶，所述嗜熱脂肪酶的氨基 酸序列與SEQIDNo.2所示氨基酸序列具有90%以上同源性。
優(yōu)選的，所述嗜熱脂肪酶具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。 本發(fā)明還涉及編碼所述嗜熱脂肪酶的基因。
優(yōu)選的，所述基因具有SEQIDNo.l所示的核苷酸序列，該基因編碼
SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
本發(fā)明研究證明，嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geok c"/ws WMraAwwop/z//^ )T2產(chǎn)生的脂肪酶作用溫度范圍為40 80°C, pH5 U,最佳溫度為55°C。 該脂肪酶在許多抑制劑如EDTA、 PMSF、 DTT和p-巰基乙醇的存在下都 能保持穩(wěn)定，Triton-X100能較大地提高酶活。將脂肪酶與許多有機(jī)溶劑 如乙醇、曱醇、異丙醇、丙酮、DMSO共保溫后，酶活基本未損失，其 中乙醇還能明顯地提高酶活，說(shuō)明該脂肪酶對(duì)有機(jī)溶劑具備良好的耐受 性。
本發(fā)明通過(guò)篩選獲得了具備脂肪酶活力的嗜熱脂肪芽孢桿菌 (GeoZ^c/〃w Wearc^wmop/n7ws ) T2,從上述菌抹中提耳又基因組DNA后， 通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增得到了脂肪酶基因72，測(cè)序結(jié)果表明其長(zhǎng)度為 1251bp,編碼一個(gè)由416個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。其核苷S吏序列如SEQ ID No.l所示，相應(yīng)的氨基S^f列如SEQIDNo.2所示。應(yīng)當(dāng)指出，本發(fā)明 的脂肪酶不僅限是具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，也 包括對(duì)序列2中的氨基酸進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、插入或缺失 且具有相同酶活性的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還涉及一種制備所述嗜熱脂肪酶的方法，所述方法包括
(1) 構(gòu)建含有編碼所述嗜熱脂肪酶基因(to")的表達(dá)載體；
(2) 將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主菌抹中，得到表達(dá)菌林;
(3) 篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)^KS菱裙和誘導(dǎo)獲得所述嗜熱脂肪酶。
在已知所述嗜熱脂肪酶及其編碼基因序列的前提下，所述嗜熱脂肪酶
可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法方便的獲得。所述宿主菌株可為大腸桿菌、枯草桿
菌或酵母菌。所述宿主菌林優(yōu)選為大腸桿菌BL21(DE3),轉(zhuǎn)化得到含有
重組表達(dá)制粒plip-PET的大腸桿菌BL21(DE3)。
本發(fā)明可將基因72與克隆載體pMD18-T連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌
(Esc/zen'c/z/" co//) DH5a,成功后從菌林中提取含有脂肪酶基因的重組克隆載體，將此克隆載體與表達(dá)載體pET-28a ( + )分別用限制性內(nèi)切酶處理后在T4 DNA連接酶的作用下形成包含有72的表達(dá)載體plip-PET,再用此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得的即為重組酶的生產(chǎn)菌抹。37°C培養(yǎng)該菌抹至OD60。約0.7~0.8時(shí)，加入終濃度為0.1 0.4mmolIPTG誘導(dǎo)其高水平表達(dá)脂肪酶。
所述的嗜熱脂肪酶可用于水解外消旋乙酸a-苯乙酯制備R-苯乙醇。該脂肪酶能將R-乙酸苯乙酯分解成R-苯乙醇和乙酸，留下未反應(yīng)的S-乙酸苯乙酯。然后可根據(jù)化學(xué)性質(zhì)的不同將它們分離，得到光學(xué)純的R-苯乙醇。本發(fā)明建立的反應(yīng)體系摸索了合適的反應(yīng)緩沖液濃度、pH、反應(yīng)時(shí)間和溫度、酶粉的添加量等，最后得到的e.e.p約為99°/。，產(chǎn)率大于45%。
涉及反應(yīng)式如下
(RSH "phenyiethyl acetaie
具體的，所述應(yīng)用為在50 500mmo1、 pH7~10的磷酸鹽緩沖液中，于20 50。C下以嗜熱脂肪酶水解外消旋乙酸a-苯乙酯6 24小時(shí)，制得所述R-苯乙醇。 —一
優(yōu)選的，所述應(yīng)用為在5Ommo1、 pH8.0的磷酸鹽緩沖液中加入終濃度50~80mg/mL的外消旋乙酸a-苯乙酯和終濃度0.05 0.5mg/mL的脂肪酶酶粉(純化后的脂肪酶酶粉)，于25"水解反應(yīng)9小時(shí)，水解液按常規(guī)方法分離純化可得到所述R-苯乙醇。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:提供了 一種具有立體選擇性的嗜熱脂肪酶及其編碼基因，該脂肪酶對(duì)有機(jī)溶劑具備良好的耐受性，并具有高選擇性，可用于選擇性水解外消旋乙酸a-苯乙酯制備光學(xué)純的R-苯乙醇，
7產(chǎn)率大于45%, e.e.p約為990/0。
(四)


圖1為本發(fā)明lip T2的PCR擴(kuò)增電泳圖譜，其中1、DNAMarker( DL2000，Takara) ; 2、 lipT2片段；
圖2為本發(fā)明重組表達(dá)質(zhì)粒pLIPT2-PET的BamH I和Nde I雙酶切分析圖譜，其中1、 pLIPT2-PET; 2、 pLIPT2-PET/BamH I+Nde I ; 3、DNA Marker (DL2000, Takara);
圖3為本發(fā)明重組菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后經(jīng)細(xì)胞破碎后的SDS-PAGE圖譜，其中M表示蛋白質(zhì)marker, 1為重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)并繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后破碎細(xì)胞得到發(fā)酵液的上清，2為重組菌與1在同樣條件下培養(yǎng)但是未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的發(fā)酵液上清；
圖4為本發(fā)明重組脂肪酶lip T2在大腸桿菌內(nèi)的高效表達(dá)和產(chǎn)物純化后的SDS-PAGE圖語(yǔ)，其中M、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(低，Takara) ; 1、表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化；2、脂肪酶的高效表達(dá)產(chǎn)物。
(五)
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述,但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此
實(shí)施例1:從嗜熱脂肪芽孢桿菌T2克隆LIPT2基因
根據(jù)已報(bào)道嗜熱芽孢桿菌脂肪酶基因的同源性設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物1和2。引物1序列5 ，-ARSRTGATGAAAKGCTGYCG-3 ，；引物2序列5 ，-TTAAGGSHSSAARCTYGCCA國(guó)3 ，
從實(shí)驗(yàn)室保存的嗜熱芽孢桿菌(Geo6(3"7/w WearoAwmop/z//^ )中以CTAB法提取基因組DNA (嗜熱脂肪芽孢桿菌T2基因組DNA ),以此DNA為才莫板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下所示:
反應(yīng)體系
10xPCR buffer 2pL
dNTP Mix (各2.5mM) 0攀
Prime 1 ( 10|uM) l)iL
Prime 2 ( lOjuM) lpL
模板DNA ( 50ng/ jn L ) 0.2(iL
Taq酶 (5U/ in L ) 0.25jxL
ddH20 15.05pL
總計(jì) 20pL。反應(yīng)條件
預(yù)變性95'C 5min
變性95。e-30s,退火60。C 90s,延伸72°C 60s, 30個(gè)循環(huán)延伸72 °C lOmin。
從0.7%瓊脂糖凝膠中回收出約1300bp的目的DNA片段(如圖l所示)，將其與pMD18-T (Takara,大連)連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,在含有100ug/ml氨千青霉素的LB上進(jìn)行篩選，培養(yǎng)12~16個(gè)小時(shí)后挑取陽(yáng)性克隆用菌落PCR的方法來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。最后從確定的陽(yáng)性克隆中抽取重組質(zhì)粒pLIPT2-T進(jìn)行測(cè)序，序列如SEQ ID No.l所示，相應(yīng)的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
實(shí)施例2:基因工程菌抹的獲得
根據(jù)測(cè)序結(jié)果重新設(shè)計(jì)引物3和引物4,在引物3上添加BamH I位點(diǎn)，在引物4上添加Nde I位點(diǎn)。引物3序列GGAATTCCATATGATGAAATGCTGCCGGGTGATG引物4序歹'J: CGCGGATCCTTAAGGGTCCAAGCTCGCCAAC
再次以基因組DNA為模板擴(kuò)增脂肪酶基因，將回收的目的DNA片斷和pET28a ( +) (Novagen)分別用BamH I和Nde I雙酶切5小時(shí)，從凝膠中分別回收后取5uL LIPT2片段，3uL線性pET28a ( + ) ， luL10x連接緩沖液，luL (2000U/ ja L ) T4DNA連接酶，混合均勻后在16。C反應(yīng)16小時(shí)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，在含有30ug/mL卡鈉霉素的LB上進(jìn)行篩選，從篩得的陽(yáng)性克隆中提取重組質(zhì)粒plip-PET進(jìn)行BamH I和Nde I雙酶切分析鑒定，證明該重組載體含有目的片段(如圖2所示)。最后用plip-PET轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，從而得到重組脂肪酶的基因工程菌抹。
實(shí)施例3:脂肪酶的表達(dá)和純化
將含有plip-PET的大腸桿菌BL21(DE3)接種于10ml含有30ug/ml卡鈉霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37。C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。得到的種子液按l: 50的體積比接種于新鮮的500mlLB培養(yǎng)基(置于2L三角瓶)中，培養(yǎng)至OD6oo約0.7-0.8時(shí)，加入終濃度為0.4mmo1的IPTG誘導(dǎo)，37。C繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后離心(4°C, 10000rpm， 10min )收集菌體。將菌體重懸于20mL50mmo1 Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液中，超聲破碎。離心取上清以對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯為底物檢測(cè)酶活，酶活力為205U/ml。
同時(shí)取細(xì)胞碎片、上清、沉淀進(jìn)行SDS-PAGE,檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，結(jié)果如圖3所示，其中M表示蛋白質(zhì)marker, 1為重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)并繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后破碎細(xì)胞得到發(fā)酵液的上清，2為重組菌與1在同樣條件下培養(yǎng)但是未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的發(fā)酵液上清。從圖中可以看出經(jīng)誘導(dǎo)的樣品中明顯有一條較濃的約為44KD的條帶，這與預(yù)計(jì)的大小為43KD的目標(biāo)條帶大小基本一致。所以可以基本判定目的蛋白在IPTG的誘導(dǎo)下得到了較好的表達(dá)。
利用pET28a ( + )帶有的6xHis標(biāo)簽進(jìn)行固定化金屬離子親和層析(IMAC ),填料使用的是Ni SepharoseTM 6 Fast Flow ( GE Healthcare,烏普薩拉，瑞典)。將含有可溶性脂肪酶的上清液經(jīng)濾膜過(guò)濾后與結(jié)合緩沖液(50mmol磷酸鹽，500mmolNacl， pH7.4)—起上柱，洗掉雜蛋白后再以含有一定濃度咪唑的洗脫緩沖液(50mmol磷酸鹽，250mmol咪唑，pH8.2 )洗脫目的蛋白，最后在20mmo1磷酸鹽緩沖液中透析過(guò)夜除去咪唑。得到的酶液在SDS-PAGE上顯示一條帶(如圖4)，達(dá)到了電泳純。
實(shí)施例4:重組脂肪酶的在苯乙醇手性拆分中的應(yīng)用
以純化的重組脂肪酶水解外消旋乙酸a-苯乙酯來(lái)獲得光學(xué)純的R-苯乙醇，對(duì)反應(yīng)緩沖液濃度(50 500mmo1磷酸鹽)、反應(yīng)pH ( 7~10 )、反應(yīng)溫度(20~50°C)、反應(yīng)時(shí)間(6h 24h)等反應(yīng)條件進(jìn)行了摸索，最后確定了在50mmol磷酸鹽緩沖液(pH8.0) , 25。C震蕩反應(yīng)9h為最佳反應(yīng)條件。在5Ommo1、 pH8.0的磷酸鹽緩沖液2mL中加入121mg的外消旋乙酸a-苯乙酯和0.2mg純化后的脂肪酶酶^l分，于25匸水解反應(yīng)9小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)手性柱CHIRALPAKIC HPLC(流動(dòng)相為正己烷異丙醇=95:5 (V/V)，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm,流速1.0 ml/min,檢測(cè)溫度35。C)分析轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的光學(xué)純度，分析圖譜可知得到R-苯乙醇的e.e.p約為99。/0,產(chǎn)率大于45%。SEQUENCE LISTING<110>杭州師范大學(xué)
<120>具有a-苯乙醇拆分活性的嗜熱脂肪酶、編碼基因及其應(yīng)用
<130>
<160> 6
<170> Patentln version 3.4
<210> 1<211> 1251<212> DNA
<213> Geobacillus stearothermophilus<400> 1
atgatgaaat gctgccgggt gatggttgtg ttgctcggat tatggtttgg attcggccta 60tcggtcccag gaggggctga agcggcagct tcacgcgcca atgatgcacc catcgtgctt 120ctccatgggt ttaccggatg ggggcgagag gaaatgcttg gattcaagta ttggggcggc 180gtgcgcggcg atatcgaaca atggctgaac gacaacggat atcgaacgta tacgctggcg 240gtcggaccgc tctcgagcaa ctgggaccgg gcgtgtgaag cgtatgctca gcttgtcggc 300gggacggtcg attatggggc agcccatgcg gcaaagcacg gccatgcgcg gtttggccgc 360acttatcccg gcctgttgcc ggaattgaaa aggggtggcc gcatccatat catcgcccac 420agccaagggg ggcagacggc ccgcatgctt gtctcgctcc tagagaacgg aagccaagaa 480gagcgggagt acgccaaggc gcacaacgtg tcgttgtcac cgttgtttga aggtggacat 540cattttgtgt tgagtgtgac gaccatcgcc actcctcatg acgggacgac gcttgtcaac 600atggttgatt tcaccgatcg cttttttgac ttgcaaaaag cggtgttgga agcggcggct 660gtcgccagca acgtgccgta cacgagtcaa gtatacgatt ttaagctcga ccaatgggga 720ctgcgccgcc agccgggtga atcgttcgac cattattttg aacggctcaa gcgctcccct 780gtttggacgt cgacagatac cgcccgctac gatttatccg tttccggagc tgagaagttg 840aatcaatggg tgcaagcaag cccgaatacg tattatttga gctttgccac agaacggacg 900tatcgcggag cgctcacagg caactattat cccgaactcg gaatgaatgc attcagcgcg 960gtcgtatgcg ctccgtttct cggttcgtac cgcaatccga cgctcggcat tgacgaccgc 1020tggcttgaaa acgatggcat tgtcaatacg gtttccatga acggtccaaa gcgtggatca 1080agcgatcgga tcgtaccgta tgacggggcg ttgaaaaaag gggtttggaa tgacatggga 1140acgtacaatg tcgaccattt ggaaatcatc ggcgttgace cgaatccgtc atttgatatt 1200^gcgcct講atttgcgact tgccgagcag ttggcgagct tggaccctta a 1251
<210> 2<211> 416<212> PRT
<213> Geobacillus stearothermophilus<400> 2
Met Met Lys Cys Cys Arg Val Met Val Val Leu Leu Gly Leu Trp Phe15 10 15
Gly Phe Gly Leu Ser Val Pro Gly Gly Ala Glu Ala Ala Ala Ser Arg20 25 30
Ala Asn Asp Ala Pro lie Val Leu Leu His Gly Phe Thr Gly Trp Gly35 40 45
Arg Glu Glu Met Leu Gly Phe Lys Tyr Trp Gly Gly Val Arg Gly Asp50 55 60
lie Glu Gin Trp Leu Asn Asp Asn Gly Tyr Arg Thr Tyr Thr Leu Ala65 70 75 80
Val Gly Pro Leu Ser Ser Asn Trp Asp Arg Ala Cys Glu Ala Tyr Ala85 90 95
Gin Leu Val Gly Gly Thr Val Asp Tyr Gly Ala Ala His Ala Ala Lys100 105 110
His Gly His Ala Arg Phe Gly Arg Thr Tyr Pro Gly Leu Leu Pro Glu115 120 125
Leu Lys Arg Gly Gly Arg lie His lie lie Ala His Ser Gin Gly Gly130 135 140
Gin Thr Ala Arg Met Leu Val Ser Leu Leu Glu Asn Gly Ser Gin Glu145 150 155 160<formula>formula see original document page 14</formula><210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown
<220>
<223>人工序列 <400> 3
arsrtgatga aakgctgycg 20
<210> 4 <211> 20 <212〉 DNA <213> Unknown
<220〉
<223>人工序列 <400> 4
ttaaggshss aarctygcca 20
<210> 5 <211> 34 <212〉 DNA <213> Unknown
<220>
<223>人工序列 <400> 5
ggaattccat atgatgaaat gctgccgggt gatg .34
<210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Unknown
<220>
<223>人工序列 <400> 6
cgcggatcct taagggtcca agctcgccaa c 3權(quán)利要求
1. 一種具有α-苯乙醇拆分活性的嗜熱脂肪酶，所述嗜熱脂肪酶的氨基酸序列與SEQ ID No.2所示氨基酸序列具有90％以上同源性。
2. 如權(quán)利要求1所述的嗜熱脂肪酶，其特征在于所述嗜熱脂肪酶具有SEQ ID No.2所示的氨基S臾序列。
3. 編碼權(quán)利要求1所述嗜熱脂肪酶的基因。
4. 如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述基因具有SEQ IDNo.l所示的核苷S吏序列。
5. 制備如權(quán)利要求1所述嗜熱脂肪酶的方法，所述方法包括(1) 構(gòu)建含有編碼所述嗜熱脂肪酶基因的表達(dá)載體；(2) 將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主菌抹中，得到表達(dá)菌抹；(3) 篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)微生物發(fā)酵和誘導(dǎo)獲得所述嗜熱脂肪酶。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述宿主菌林為大腸桿菌、枯 草桿菌或酵母菌。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述宿主菌抹為大腸桿菌 BL21(DE3)。
8. 如權(quán)利要求1所述的嗜熱脂肪酶在水解外消旋乙酸苯乙酯制備R-苯乙 醇中的應(yīng)用。
9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為在50 500mmo1、 pH7 10的磷酸鹽緩沖液中，于20 50。C下以嗜熱脂肪酶水解外消旋乙 酸a-苯乙酯6 24小時(shí)，制得所述R-苯乙醇。
10. 如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為在50mmol、 pH8.0 的磷酸鹽緩沖液中加入外消旋乙酸a-苯乙酯和嗜熱脂肪酶酶粉，乙酸a-苯乙酯加入量為50 80mg/mL緩沖液，嗜熱脂肪酶酶粉加入量為,0.05 0.5mg/mL緩沖液，于25。C水解反應(yīng)9小時(shí)，于水解液中得到所 述R-苯乙醇。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在高溫條件下顯示活性的嗜熱脂肪酶及其編碼基因，同時(shí)提供了由重組菌株制備脂肪酶的方法，以及純化的脂肪酶在苯乙醇的手性拆分的應(yīng)用。所述嗜熱脂肪酶的氨基酸序列與SEQID No.2所示氨基酸序列具有90％以上同源性。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一種具有立體選擇性的嗜熱脂肪酶及其編碼基因，該脂肪酶對(duì)有機(jī)溶劑具備良好的耐受性，并具有高選擇性，可用于選擇性水解外消旋苯乙酯制備光學(xué)純的R-苯乙醇，產(chǎn)率大于45％，e.e._P約為99％。
文檔編號(hào)C12N9/20GK101457217SQ20081016377
公開日2009年6月17日 申請(qǐng)日期2008年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日
發(fā)明者馮國(guó)棟, 昱 蔣, 陳振明 申請(qǐng)人:杭州師范大學(xué)