專利名稱：用于轉化騰沖嗜熱厭氧桿菌mb4的質粒、培養(yǎng)基和轉化方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物基因工程和發(fā)酵工程領域，涉及一種細菌的遺傳轉化方法，具體是關于騰沖嗜熱厭氧桿菌MB4 (Thermoanaerobactertengcongensis MB4，以下簡稱為 T. tengcongensis MB4)的遺傳轉化方法。本發(fā)明還涉及用于該轉化方法中的質粒、培養(yǎng)基、 以及采用該轉化方法篩選的轉化子。另外，本發(fā)明還涉及上述質粒的構建方法。
背景技術：
嗜熱厭氧菌的生境與原始地球的高溫無氧環(huán)境較為接近，對其環(huán)境適應性機制和生理特征的研究對于研究生命進化乃至生命的起源都有重要的意義。T. tengcongensis MB4是從我國云南騰沖溫泉中分離到的一株嗜熱、厭氧、 革蘭氏陰性、桿狀真細菌，其可在50 80°C下生長，最適生長溫度為75°C (Xue等人， 2001, International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology,51 1335-1341)。Τ. tengcongensis MB4也是我國自主完成基因組測序的第一個微生物基因組， 其基因組中大多數(shù)基因的功能已得到注釋(Bao等人，2002，Genome Res. , 12 :689-700)。 基因組測序及基因功能注釋極大地促進了對Τ. tengcongensis MB4的研究，目前已有 60余篇與T. tengcongensis MB4相關的研究得以發(fā)表(Zhang等人，2007，Archivesof Biochemistry and Biophysics, 466 :211-220 ;Zhang等人，2010, NucleicAcids Research, 38 :3709-3720 ；Qian 等人，2010，J Bacteriol.，192 :4311-4316)。然而，縱觀已發(fā)表的研究結果，可以發(fā)現(xiàn)相關的研究都集中于T. tengcongensis MB4相關基因用大腸桿菌系統(tǒng)進行克隆、異源表達和蛋白純化，進而研究相關蛋白的體外生化功能。迄今為止，世界上還沒有T. tengcongensis MB4體內遺傳學研究的任何報道，究其主因是因為到目前為止還未能建立該菌株的遺傳操作系統(tǒng)。實際上，只有從生理功能水平上對相關蛋白進行研究才能揭示T. tengcongensis MB4環(huán)境適應的機制，這也使得建立該菌的遺傳操作系統(tǒng)是相當迫切和必要的。目前來看，以下幾方面問題的存在致使建立該菌遺傳操作系統(tǒng)變得相當困難1)T. tengcongensis MB4菌株本身不含內源性質粒，從而需要尋找或構建能在 T. tengcongensis MB4中自主復制的質粒；幻建立遺傳操作系統(tǒng)往往采用含有抗生素的環(huán)境來篩選轉化子，但T. tengcongensis MB4的最適生長溫度為75°C，僅有少數(shù)幾種抗生素能在此溫度下不失活；幻只有極少數(shù)抗生素抗性基因能在75°C下有效表達，也就使得篩選轉化子的篩選標記相當匱乏；4)培養(yǎng)T. tengcongensis MB4所需要的嚴格厭氧環(huán)境也進一步加大了操作的難度。因此，要建立T. tengcongensis MB4的遺傳操作系統(tǒng)就必須克服上述問題，簡而言之就是構建能在T. tengcongensis MB4中復制和表達抗生素抗性的質粒、 設計將構建好的質粒轉入細胞內的遺傳轉化方法和轉化子篩選條件。對于轉化方法而言，電擊轉化由于其制備感受態(tài)細胞簡單和轉化率高的特點， 對未知特性的菌株的轉化來說一直都是首選的方法。但自然界也存在自然感受態(tài)的菌株，如 Thermus thermophilus HB27 (Friedrich 等人，2001，Applied and EnvironmentalMicrobiology, 67 :3140-3148)禾口 Acinetobacter calcoaceticus(Juni 等人，1969, J. Bacteriol. ,98 :281-288)，這些菌株不需要特殊處理(如制備感受態(tài)和電擊等)就能吸收體外環(huán)境中質粒。這類菌株的自然感受態(tài)的存在大大地簡便了轉化過程。綜上所述，構建T. tengcongensis MB4遺傳操作系統(tǒng)存在相當多的難題，因此本領域中需要構建一種適宜的質粒以及使用該質粒遺傳轉化T. tengcongensis MB4的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種用于轉化騰沖嗜熱厭氧桿菌MB4 (T. tengcongensis MB4)的質粒以及使用該質粒遺傳轉化T. tengcongensis MB4的方法。另外，本發(fā)明中還構建了破壞T. tengcongensis MB4中組氨酸合成操縱子中的hisG基因的質粒，并利用所建立的轉化方法將該質粒轉入T. tengcongensis MB4中，并實現(xiàn)了對hisG基因的破壞。因此，在本發(fā)明的第一個方面，提供了一種用于轉化騰沖嗜熱厭氧桿菌T. tengcongensis MB4的質粒(以下簡稱為“本發(fā)明的質?！?，所述質粒包含 T. tengcongensis MB4的ttel482的啟動子序列，以及與所述啟動子序列可操作地連接的具有編碼熱穩(wěn)定性蛋白酶的抗生素抗性基因。在本發(fā)明的質粒的一個實施方案中，所述質粒以質粒PHT3101為骨架，并包含 T. tengcongensis MB4染色體復制起點序列。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，該質粒為 pBFLOl。在本發(fā)明的質粒的另一個實施方案中，本發(fā)明的質粒以質粒pBluescript KSII+ 為骨架，并包含T. tengcongensis MB4染色體上hisG的左右相鄰的1. 0 2. 01Λ DNA片段。 在一個優(yōu)選實施方案中，所述質粒用于破壞騰沖嗜熱厭氧桿菌T. tengcongensis MB4中組氨酸合成操縱子中的hisG基因，例如該質粒為pTTHOl。在本發(fā)明的質粒的一個優(yōu)選實施方案中，所述抗生素抗性基因為卡那霉素氨基糖苷磷酸轉移酶基因kanK。在第二個方面，本發(fā)明提供了一種用于轉化Τ. tengcongensis MB4的TTE培養(yǎng)基， 所述TTE培養(yǎng)基的配方為以每升計包含下列成分酵母浸出物2. 0 2. 5g，蛋白胨2. 5 7. 5g，氯化鈉1. 5 3. Og,硫酸銨1. 0 3. Og,磷酸二氫鉀0. 1 0. 5g，磷酸氫二鉀0. 1 0. 5g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0. 2 0. 8g，可溶性淀粉7. 5 15g，1 %刃天青溶液0. 8 1. 2ml， 硫代硫酸鈉0. 3 0. 8g，pH值為7. 5。在第三個方面，本發(fā)明提供了一種轉化T. tengcongensis MB4的方法(以下簡稱為“本發(fā)明的轉化方法”)，該方法包括以下步驟1)菌種活化菌種活化將保存于_70°C的騰沖嗜熱厭氧桿菌T. tengcongensis MB4菌體懸液于60°C厭氧滾管培養(yǎng)60 72h ；挑取較大的菌落接入液體TTE培養(yǎng)基中，于 75°C培養(yǎng)至 OD600 為 0.8 1.2。2)菌體培養(yǎng)在液體TTE培養(yǎng)基中以所述液體TTE培養(yǎng)基體積的1 2%接種步驟1)中活化的密度為IO6細胞/ml的T. tengcongensis MB4,并在75°C下培養(yǎng)12 18h至菌體密度為1 2X IO8細胞/ml ；3)菌體轉化用本發(fā)明的質粒對步驟幻中得到的培養(yǎng)物使用電擊轉化法或自然感受態(tài)法進行轉化獲得轉化子；
4
4)轉化子篩選將步驟3)中得到的轉化子在400 600 μ g/ml，優(yōu)選400 μ g/ml 含具有熱穩(wěn)定性的抗生素(所述抗生素與本發(fā)明的質粒中的抗生素基因相對應，諸如卡那霉素)的固體TTE培養(yǎng)基在55 60°C，優(yōu)選60°C下溫育60 7 進行轉化子篩選，在所述固體TTE培養(yǎng)基上生長的為T. tengcongensis MB4轉化子。在本發(fā)明的轉化方法的一個優(yōu)選實施方案中，當使用電擊轉化法時，使用的電擊電壓為1. 8 3. Okv，優(yōu)選1. 8kv ；電擊時間為4 6ms。在本發(fā)明的轉化方法的另一個優(yōu)選實施方案中，當使用自然感受態(tài)法時無需厭氧設備來創(chuàng)造厭氧環(huán)境。在第四個方面，本發(fā)明提供了 T. tengcongensis MB4轉化子，所述轉化子是通過本發(fā)明的轉化方法產(chǎn)生和篩選的。在本發(fā)明的轉化株的一個優(yōu)選實施方案中，所述轉化株含有本發(fā)明的質粒，例如含有質粒pTTHOl或pBFLOl。在一個實施方案中，該轉化子含有質粒pTTHOl，并且其hisG 基因已被破壞。在本發(fā)明的轉化子的另一個優(yōu)選實施方案中，所述轉化子為保藏號為CGMCC4332 的轉化子，該轉化子于11月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)，該轉化子包含本發(fā)明的質粒pTTHOl。本發(fā)明的有益效果如下1.建立了有效轉化T. tengcongensis MB4的方法，并優(yōu)化電擊轉化的條件，在較低電壓(如Ukv)條件下轉化效率最高。2.建立了采用自然感受態(tài)轉化法轉化T. tengcongensis MB4的方法，該法不需要特殊處理(如制備感受態(tài)和電擊等)，且其轉化效率不低于電擊轉化效率。3.構建了用于轉化T. tengcongensis MB4的適宜質粒及其構建方法，實現(xiàn)了 T. tengcongensis MB4遺傳轉化和體內研究的突破。該質粒pBFLOl含有T. tengcongensis MB4的ttel482啟動子(Pttel482)、編碼熱穩(wěn)定性的卡那霉素氨基糖苷磷酸轉移酶的基因 (kanK)、蘇云金芽孢桿菌復制起點(ori B. t)和T. tengcongensis MB4染色體復制起點(ori Tte)的特征，其能有效地攜帶耐熱抗生素抗性基因，從而有利于轉化子在高溫下的篩選。4.發(fā)明了用于本發(fā)明的轉化方法的改良TTE培養(yǎng)基。5.制備了用于破壞hisG基因的質粒，利用本發(fā)明的轉化方法實現(xiàn)了 T. tengcongensis MB4 中 hisG 基因的破壞。


圖1為T. tengcongensis MB4染色體復制原點(ori Tte)的序列表。圖2為T. tengcongensis MB4磷酸乙?；D移酶啟動子(Pttel482)(下劃線部分) 和卡那霉素抗性基因(KanK)(非下劃線部分)的序列表。圖3為pHT3101的物理圖譜。圖4為本發(fā)明的質粒pBFLOl的構建示意圖。圖5為本發(fā)明的質粒pBFLOl的電泳圖，其中質粒經(jīng)EcoR I酶切。圖6為T. tengcongensis MB4的ttel482基因的啟動子啟動卡那霉素抗性基因表達的驗證結果，在圖中，A:含有質粒pHT3101的E. coli JM109在含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上能生長；B 含有質粒pHT3101的E. coli JM109在含有100 μ g/mL氨芐青霉素和卡那霉素的LB培養(yǎng)基上不能生長；C 含有質粒pBFLOl的E. coli JM109在含有 100 μ g/mL氨芐青霉素和卡那霉素的LB培養(yǎng)基上能生長。圖7為轉化子篩選，在圖中，A 質粒pBFLOl轉化T. tengcongensisMB4后在含有400 μ g/mL卡那霉素固體TTE培養(yǎng)基中有菌落出現(xiàn)；B Τ. tengcongensis MB4在含有400 μ g/mL卡那霉素固體TTE培養(yǎng)基中無菌落出現(xiàn)；C :T. tengcongensis MB4在不含 400 μ g/mL卡那霉素固體TTE培養(yǎng)基中形成菌膜。圖8為菌落PCR方法驗證轉化子(擴增卡那霉素抗性基因)，其中PCR的模板分別為1 12 轉化子的總DNA，包括染色體和質粒DNA，13 :T. tengcongensis MB4染色體DNA， 14 :Marker。圖9為顯示本發(fā)明的轉化方法中電擊電壓與轉化效率的圖。圖10為利用質粒pTTHOl破壞hisG基因示意圖。圖11 為破壞 T. tengcongensis MB4 的 hisG 基因的驗證結果，其中 l，2，3，4:hisG 破壞菌株染色體作模板的PCR擴增結果；5 野生菌株染色體作模板的PCR擴增結果；6 質粒pTTHOl作模板的PCR擴增結果；7 =Ikb ladder。圖 12 為 SEQ ID :3_10 的序列，SEQ ID No :3、SEQ ID No :4 為進行 PCR 擴增 T. tengcongensis MB4染色體復制起點相關序列的上下游引物；SEQ ID No :5、SEQ ID No 6為進行PCR擴增T. tengcongensis MB4染色體上ttel482的啟動子區(qū)域的上下游引物； SEQ ID No 7,SEQ ID No :8為PCR擴增編碼熱穩(wěn)定性的卡那霉素氨基糖苷磷酸轉移酶基因 (kanE)的上下游引物；SEQ ID No :9、SEQ ID No :100 為 PCR 擴增 SEQ ID No 11 的上下游引物。圖 13 為 SEQ ID 11-13 的序列，SEQ ID 11 為 T. tengcongensis MB4 染色體上包括hisG及該基因左側基因的部分序列，即用于破壞hisG的左端同源序列；SEQ ID :12、SEQ ID 13為PCR擴增SEQ ID No 14的上下游引物。圖 14 為 SEQ ID 14-16 的序列，SEQ ID 14 為 T. tengcongensis MB4 染色體上包括hisG及該基因右側基因的部分序列，即用于破壞hisG的右端同源序列；SEQ ID :15、SEQ ID 16為驗證hisG破壞株的上下游引物。
具體實施例方式在本發(fā)明的第一個方面，提供了一種用于轉化騰沖嗜熱厭氧桿菌MB4(T. tengcongensis MB4)的質粒(以下簡稱為“本發(fā)明的質?！?，所述質粒包含 T. tengcongensis MB4的ttel482的啟動子序列，以及與所述啟動子序列可操作地連接的具有編碼熱穩(wěn)定性蛋白酶的抗生素抗性基因。本發(fā)明中所述的具有熱穩(wěn)定性的抗生素是指能耐受60°C _75°C左右的溫度的抗生素。在本發(fā)明中，用于轉化質粒中的抗生素基因不受限制，只要其能夠在適于質粒轉化的轉化子表達的條件下能夠表達能耐受60°C-75°C溫度的抗生素，諸如卡那霉素、氯霉素等， 因為只有耐受該溫度才能夠達到篩選騰沖嗜熱厭氧桿菌轉化子的目的。在本發(fā)明的質粒的另一個優(yōu)選實施方案中，所述抗生素抗性基因為具有熱穩(wěn)定性的卡那霉素氨基糖苷磷酸轉移酶基因kanK。由于在眾多的抗生素中，卡那霉素在較高的溫度下能有效存在，這也使其成為用于嗜熱菌研究的常用抗生素；加之，與之相應的熱穩(wěn)定性的卡那霉素氨基糖苷磷酸轉移酶基因(kanK)也開發(fā)成功?？敲顾丶捌湎鄳目剐曰蛞惨虼顺蔀檠芯渴葻峋睦硐牍ぞ咧?Lasa等人，1992，Mol. Microbiol. ,11 :1555-1564 ； Mather 等人，1992，Appl. Environ. Microbiol.，58 :421-425)。同樣，卡那霉素及其相應的抗性基因也可用于對T. tengcongensis MB4的研究工作。在本文中，“可操作地連接”是指與啟動子序列連接的基因可以在適于表達該基因的條件下表達。另外，根據(jù)需要本發(fā)明的質粒還可以任選地包含調控序列以調節(jié)該基因的表達。在本發(fā)明的質粒的一個實施方案中，所述質粒以質粒PHT3101為骨架，并包含 T. tengcongensis MB4染色體復制起點序列。在本發(fā)明的質粒中，T. tengcongensis MB4染色體復制起點序列(ori Tte)見序列表中的SEQID No :1，T. tengcongensis MB4的ttel482 的啟動子序列見序列表中SEQ IDNo 2中的劃線部分。質粒PHT3101的物理圖譜已公開，具體參見 Yu 等人，2000，Current microbiology, 40 123-127。該質粒的構建方法可以采用以下方式進行以質粒pHT3101為骨架，將 T. tengcongensis MB4染色體復制起點序列ori Tte插入質粒pHT3101多克隆位點的EcoR I和Xba I位點之間，再將T. tengcongensis MB4的ttel482的啟動子Pttel482和卡那霉素抗性基因kanlQ建的融合基因(見SEQ IDNo 2)插入質粒pHT3101多克隆位點的)(ba I 和I3St I位點之間。作為示例性的實施例，本發(fā)明提供了如上所述基于PHT3101構建的質粒，即 PBFLOl0在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，還提供了質粒pBFLOl的具體構建步驟1)以 T. tengcongensis MB4 染色體為模板，SEQ ID No :3、SEQ ID No :4 分別為上下游引物進行PCR擴增T. tengcongensis MB4染色體復制起點相關序列(見SEQ ID No 1)； 2)用EcoR I和)(ba I分別酶切所擴增的PCR產(chǎn)物和質粒pHT3101，回收目的片段，將目的片段進行連接而得到質粒PHT31010 ;3)以T. tengcongensis MB4染色體為模板，SEQ ID No: 5、SEQ ID No 6分別為上下游引物進行PCR擴增T. tengcongensis MB4染色體上ttel482 的啟動子區(qū)域；4)以質粒pMK18為模板，SEQ ID No :7、SEQ ID No :8為引物擴增編碼熱穩(wěn)定性的卡那霉素氨基糖苷磷酸轉移酶基因(kanK) ；5)以上述兩個PCR產(chǎn)物為模板，SEQ ID No 5和SEQ IDNo 8為上下游引物通過fusion PCR把上述的PCR產(chǎn)物融合成由ttel482的啟動子調控kanK表達的基因(見SEQ ID No 2) ；6)用)(ba I和I^stI分別酶切質粒pHT31010 和融合PCR產(chǎn)物，回收目的片段，將兩個目的片段連接而得到能在Τ. tengcongensis MB4中進行復制和表達抗性基因的質粒pBFLOl。在本發(fā)明的質粒的另一個實施方案中，本發(fā)明的質粒以質粒pBluescript KSII+(購自 Stratagene 公司，La Jolla,. CA, USA))為骨架，并包含 Τ. tengcongensis MB4 染色體上hisG的左右相鄰的1. O 2. Okb DNA片段，此段DNA的具體大小和片段以能夠插入至質粒中并可以整合至T. tengcongensis MB4的基因組中為度，根據(jù)本發(fā)明的介紹其選擇是顯而易見的。該質?？捎糜谄茐尿v沖嗜熱厭氧桿菌T. tengcongensis MB4中組氨酸合成操縱子中的hisG基因，例如該質粒為pTTHOl，其構建方法可參見實施例7。當然，根據(jù)本發(fā)明的介紹，本領域技術人員能夠制備出各種其他的質粒用于破壞騰沖嗜熱厭氧桿菌 T. tengcongensis MB4中的其他目的基因，諸如海藻糖磷酸化酶基因和海藻糖合成酶基因等與該菌的熱適應性相關基因。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于轉化騰沖嗜熱厭氧桿菌T.tengcongensis MB4的TTE培養(yǎng)基，所述TTE培養(yǎng)基的配方為以每升計包含下列成分酵母浸出物2. 0 2. 5g，蛋白胨2. 5 7. 5g，氯化鈉1. 5 3. Og,硫酸銨1. 0 3. Og,磷酸二氫鉀0. 1 0. 5g， 磷酸氫二鉀0. 1 0. 5g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0. 2 0. 8g，可溶性淀粉7. 5 15g，刃天青溶液0. 8 1. anl，硫代硫酸鈉0. 3 0. 8g，pH值為7. 5 (具體參見實施例1)。在實施本發(fā)明時，當TTE培養(yǎng)基以液體培養(yǎng)基使用時，通過如下示例性的步驟制備(溶液總體積以一升計)1)用適量去離子水將稱量好的酵母浸出物、蛋白胨、氯化鈉、硫酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀溶解；幻將稱量好的可溶性淀粉傾入少量的水中并攪拌成糊狀后，緩慢地將淀粉懸液傾入適量的沸水，并繼續(xù)煮沸5 10分鐘后，將淀粉溶液轉移至 1)所配的溶液中；3)向上述溶液中加入Iml的刃天青溶液，并煮沸至溶液成無色，將溶液移至無氧環(huán)境中，并冷卻至60°C以下；4)加入0.5g L-半胱氨酸鹽酸鹽并混勻，調pH值至7.5 ;5)在無氧的環(huán)境中，將溶液分裝至厭氧管或厭氧瓶中；6)滅菌(12rC、30min)后， 備用。7)在接種之前，加入50%硫代硫酸鹽溶液至其終濃度為0.5wt%。當本發(fā)明的TTE培養(yǎng)基以固體培養(yǎng)基使用時，通過如下示例性的步驟制備固體 TTE培養(yǎng)基配制步驟與液體TTE培養(yǎng)基的配制步驟基本相同，區(qū)別在液體TTE培養(yǎng)基分裝之前，向厭氧管中加入Gelrite Gellum Gum至終濃度為0. 8% 1. 2wt%，其它步驟同液體 TTE培養(yǎng)基的配制。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種轉化騰沖嗜熱厭氧桿菌T.tengcongensis MB4 的方法，該方法包括以下步驟1)菌種活化將保存于_70°C的T. tengcongensis MB4菌體懸液于60°C厭氧滾管培養(yǎng)60 72h ；挑取較大的菌落接入液體TTE培養(yǎng)基中，于75°C培養(yǎng)至OD6tltl為0. 8 1. 2。2)菌體培養(yǎng)在液體TTE培養(yǎng)基中以所述液體TTE培養(yǎng)基體積的1 2%接種步驟1)中活化的密度為IO6細胞/ml的T. tengcongensis MB4,并在75°C下培養(yǎng)12 18h至菌體密度為1 2X IO8細胞/ml ；3)菌體轉化用本發(fā)明的質粒對步驟幻中得到的培養(yǎng)物使用電擊轉化法或自然感受態(tài)法進行轉化獲得轉化子；4)轉化子篩選將步驟3)中得到的轉化子在400 600 μ g/ml，優(yōu)選400 μ g/ml 含具有熱穩(wěn)定性的抗生素的固體TTE培養(yǎng)基在55 60°C，優(yōu)選60°C下溫育60 7 進行轉化子篩選，在所述固體TTE培養(yǎng)基上生長的為T. tengcongensis MB4轉化子，其中所述具有熱穩(wěn)定性的抗生素與步驟幻中使用的質粒所包含的抗生素抗性基因相對應，例如當質粒中含有卡那霉素氨基糖苷磷酸轉移酶基因kanK時，則使用卡那霉素。在本發(fā)明的轉化方法中，T. tengcongensis MB4菌種活化的方法是本領域中公知的，例如可以采用以下的具體步驟將以20%甘油保存于-70°C的菌體懸液用無菌水稀釋 IO4倍后，取100 μ L稀釋液加入含有7ml融化后固體TTE培養(yǎng)基的亨蓋特厭氧管中并混勻后，亨蓋特厭氧管中培養(yǎng)，于60°C培養(yǎng)60 72h。挑取較大的菌落接入液體TTE培養(yǎng)基中， 于75°C培養(yǎng)至OD600為0. 8 1. 2。在本發(fā)明的轉化方法的一個優(yōu)選實施方案中，當使用電擊轉化法時，使用的電擊電壓為1.8 3. Okv，優(yōu)選Ukv ；電擊時間為4 6ms。在本發(fā)明中，從下面的實施例5中可以看出，在較低的電擊電壓(如I^kv)的轉化子數(shù)明顯多于較高電壓時的轉化子數(shù)，即轉化效率與電擊電壓成負相關性。因此，優(yōu)選1. Skv的電壓來進行轉化。在本發(fā)明的轉化方法的另一個優(yōu)選實施方案中，當使用自然感受態(tài)法時無需厭氧設備來創(chuàng)造厭氧環(huán)境。令人意外地，從實施例5中，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)當不進行電擊即電壓為Okv時，轉化子數(shù)最多，這表明T. tengcongensisMB4存在自然感受態(tài)的性質。因此提示，自然感受態(tài)的存在使得不需要制備感受態(tài)，即實際上不需要電擊轉化，極大地方便了對 T. tengcongensisMB4的轉化。這是本發(fā)明的一個重要發(fā)現(xiàn)和一個有利的優(yōu)點，其大大地簡化了 T. tengcongensis MB4 的轉化。另外，本發(fā)明還提供了 T. tengcongensis MB4轉化子，所述轉化子是通過本發(fā)明的轉化方法產(chǎn)生和篩選的。在本發(fā)明的轉化子的一個優(yōu)選實施方案中，所述轉化子含有本發(fā)明的質粒，例如實施例4中的質粒pBFLOl，實施例7中的質粒pTTHOl。hisG破壞的菌株自身不能合成組氨酸，需要向培養(yǎng)基加入外源性組氨酸來滿足該菌的生長，即該破壞株為組氨酸營養(yǎng)缺陷株。組氨酸組氨酸營養(yǎng)缺陷可作為篩選標記，可廣泛用于T. tengcongensis MB4轉化子的篩選。根據(jù)本發(fā)明的方法和質粒篩選的一個轉化子作為保藏號CGMCC4332保存，本發(fā)明的質粒pTTHOl已定點整合該轉化子染色體上，并實現(xiàn)了 hisG的破壞。下面以具體的實施例進一步詳細闡述本發(fā)明方法。要理解的是，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，并非意在限制本發(fā)明的范圍。另外，除特殊說明外，本發(fā)明所涉及的原料和試劑都市售可得。實施例ITTE培養(yǎng)基配方本發(fā)明的TTE培養(yǎng)基的配方如表1中所示，表中的用量按每升的重量計。表ITTE培養(yǎng)基的基礎配方(以每升計)
權利要求
1.一種用于轉化騰沖嗜熱厭氧桿菌MB4(Thermoanaerobactertengcongensis MB4)的質粒，所述質粒包含Thermoanaerobactertengcongensis MB4的ttel482的啟動子序列，以及與所述啟動子序列可操作地連接的具有編碼熱穩(wěn)定性蛋白酶的抗生素抗性基因。
2.如權利要求1所述的質粒，其以質粒PHT3101為骨架，并包含ThermoanaercAacter tengcongensis MB4染色體復制起點序列，所述質粒優(yōu)選為pBFLOl。
3.如權利要求1所述的質粒，其以質粒pBluescriptKSII+為骨架，并包含 Thermoanaerobacter tengcongensis MB4 hisG 的&^■才目令P的 1. O 2. Okb DNA 片段，該質粒優(yōu)選為pTTHOl。
4.如權利要求1-3中任一項所述的質粒，其特征在于所述的抗生素抗性基因為卡那霉素氨基糖苷磷酸轉移酶基因kanK。
5.一種用于轉化 Hiermoanaerobacter tengcongensis MB4 的 TTE 培養(yǎng)基，所述 TTE 培養(yǎng)基的配方為以每升計包含下列成分酵母浸出物2. O 2. 5g，蛋白胨2. 5 7. 5g，氯化鈉 1. 5 3. Og,硫酸銨1. O 3. Og,磷酸二氫鉀0. 1 0. 5g，磷酸氫二鉀0. 1 0. 5g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0. 2 0. 8g，可溶性淀粉7. 5 15g，刃天青溶液0. 8 1. ^iil，硫代硫酸鈉0.3 0. 8g, pH 值為 7. 5。
6.—ft, Thermoanaerobacter tengcongensis MB4 的方^去，該方^去包括以下步馬聚1)菌種活化將保存于_70°C的ThermoanaerobactertengcongensisMB4菌體懸液于 60°C厭氧滾管培養(yǎng)60 72h ；挑取較大的菌落接入液體TTE培養(yǎng)基中，于75°C培養(yǎng)至0D_ 為 0. 8 1. 2 ；2)菌體培養(yǎng)在液體TTE培養(yǎng)基中以所述液體TTE培養(yǎng)基體積的1 2%接種步驟1) 中活化的密度為 IO6 細胞 /ml 的 Thermoanaerobactertengcongensis MB4,并在 75°C下培養(yǎng)12 18h至菌體密度為1 2X IO8細胞/ml ；3)菌體轉化用權利要求1-5所述的質粒對步驟幻中得到的培養(yǎng)物使用電擊轉化法或自然感受態(tài)法進行轉化獲得轉化子；4)轉化子篩選將步驟3)中得到的轉化子在400 600μ g/ml，優(yōu)選400 μ g/ml含具有熱穩(wěn)定性的抗生素的固體TTE培養(yǎng)基在55 60°C，優(yōu)選60°C下溫育60 7 進行轉化子篩選,在所述固體TTE培養(yǎng)基上生長的為Thermoanaerobacter tengcongensis MB4轉化子，其中所述具有熱穩(wěn)定性的抗生素與步驟幻中使用的質粒所包含的抗生素抗性基因相對應。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于當使用電擊轉化法時，使用的電擊電壓為1.8 3. Okv，優(yōu)選1. 8kv ；電擊時間為4 6ms。
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于當使用自然感受態(tài)法時無需厭氧設備來創(chuàng)造厭氧環(huán)境。
9.一禾中Thermoanaerobacter tengcongensis MB4轉化子,所述轉化子是通過權禾Ij要求 6-8中任一項所述的方法產(chǎn)生和篩選的。
10.如權利要求9所述的轉化子，其特征在于所述轉化子含有權利要求1-4任一項中所述的質粒；優(yōu)選含有權利要求3所述的質粒，且其hisG基因已被破壞；該轉化子優(yōu)選為 CGMCC 4332。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種騰沖嗜熱厭氧桿菌MB4(Thermoanaerobactertengcongensis MB4)的遺傳轉化方法。本發(fā)明還涉及用于該轉化方法中的質粒、培養(yǎng)基、以及采用該轉化方法篩選的Thermoanaerobactertengcongensis MB4轉化子。另外，本發(fā)明還涉及上述質粒的構建方法。
文檔編號C12N1/21GK102477442SQ20101057582
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月30日 優(yōu)先權日2010年11月30日
發(fā)明者劉波, 張樹利, 楊?；? 譚華榮 申請人:中國科學院微生物研究所