專(zhuān)利名稱(chēng)：植物耐旱相關(guān)蛋白GpRZF1及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物耐旱相關(guān)蛋白GpRZFl及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在各種形式的蛋白質(zhì)翻譯后修飾(post-translational modifications, PTM)過(guò) 程中，泛素化過(guò)程近年來(lái)引起了越來(lái)越廣泛的關(guān)注，與蛋白質(zhì)磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)作用相似，泛 素化在細(xì)胞生命活動(dòng)的許多進(jìn)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。蛋白質(zhì)的泛素化是細(xì)胞生理活 動(dòng)的重要組成部分，參與了細(xì)胞基本進(jìn)程(如DNA修復(fù)，細(xì)胞周期調(diào)控，細(xì)胞凋亡等)。蛋白 質(zhì)的泛素化參與調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，植物的生物脅迫與非生物脅迫耐受性。因此，闡明泛 素在蛋白質(zhì)修飾中的作用機(jī)制對(duì)理解控制植物生長(zhǎng)發(fā)育，調(diào)節(jié)植物的生物脅迫與非生物脅 迫耐受性的生理與分子生物學(xué)機(jī)制有重要意義。在擬南芥蛋白質(zhì)組中，多于5%的被預(yù)測(cè)蛋白(超過(guò)1400個(gè)基因)參與泛素化 /26S蛋白酶體途徑(Smalle and Vierstra 2004)。在這些蛋白中，僅很少的部分編碼El 酶(有兩個(gè)同等型)，37個(gè)被預(yù)測(cè)的E2，26S蛋白酶體組分，以及其他的因子(諸如去泛素 化酶)(Smalle andVierstra 2004)。而多于1400個(gè)基因編碼的E3泛素連接酶參與泛素 化依賴(lài)的蛋白酶體降解途徑(Smalle and Vierstra 2004)。種類(lèi)多樣的E3泛素連接酶使 其參與特定的蛋白酶體降解途徑。通過(guò)不同的E2和E3的結(jié)合，也能夠增加E3識(shí)別目標(biāo)蛋 白的特異性。因此，E3的多樣性，以及E3與E2結(jié)合的多樣性，不僅能夠調(diào)節(jié)不同類(lèi)型的泛 素化修飾，也可以特異的調(diào)節(jié)目標(biāo)蛋白。根據(jù)HECT，U-box JPRING domain的存在，擬南芥 E3 泛素連接酶被分為三組(Smalleand Vierstra 2004)。其中 Cys-rich RING domain 是 在Really Interesting New Gene編碼的蛋白中首次被確認(rèn)的，所以蛋白由此得名。RING domain包含四對(duì)鋅共價(jià)結(jié)合的配體，用于結(jié)合兩個(gè)鋅離子(Barlow et al. 1994 ；Borden 2000)。鋅共價(jià)結(jié)合的配體由半胱氨酸和組氨酸殘基組成，這些殘基可以形成回紋的拉鏈結(jié) 構(gòu)。兩個(gè)主要的RING domain是C3HC4和C3H2C3，它們都在第四位上包含有保守的組氨酸， 但在第五位上分別為半胱氨酸和組氨酸。研究表明RINGdomain是RING E3泛素連接酶活 性所必需的(Stone et al. 2005)。目前為止，僅有少數(shù)的RING E3蛋白功能被研究，并多集中在擬南芥中。功能研 究的比較清楚的 RING finger E3 泛素連接酶是 COPl (Constitutive photomorphogenic) (Bauer et al. 2004)，它的生物學(xué)功能主要是參與擬南芥幼苗發(fā)育的光控調(diào)節(jié)。近年來(lái)，研 究發(fā)現(xiàn)RING型鋅指蛋白通過(guò)應(yīng)答多種植物激素參與到植物脅迫應(yīng)答途徑中。水稻RING基 因XERICO的表達(dá)受到高鹽和滲透脅迫的誘導(dǎo)。與野生型植株相比，35S: XERICO轉(zhuǎn)基因植株 的發(fā)芽率及幼苗生長(zhǎng)對(duì)高鹽、滲透脅迫和外源ABA更敏感，但成株期的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱 脅迫的耐受性較WT明顯增強(qiáng)。干旱處理下，XERICO過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中的ABA合成關(guān) 鍵基因AtNCED3表達(dá)顯著增強(qiáng)，植株ABA積累也隨之增多，因此XERICO可能介導(dǎo)依賴(lài)于ABA 的植物抗逆途徑。采用基因芯片的技術(shù)分析XERICO轉(zhuǎn)基因植株中的基因表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，許 多參與植物激素(乙烯、油菜素內(nèi)酯、赤霉素)合成的基因表達(dá)都受到調(diào)控，表明XERICO可能應(yīng)答植物中的多種激素調(diào)控途徑(Ko et al.2006)。另一個(gè)水稻RING基因OsCOIN的表 達(dá)也受到各種非生物脅迫如低溫、高鹽和干旱的誘導(dǎo)，OsCOIN過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)非生 物逆境脅迫的抗性增強(qiáng)，轉(zhuǎn)基因植株中脯氨酸積累增多(Liu et al. 2007)。此外，水稻RING 蛋白OsRING-I基因的表達(dá)受真菌侵染以及激素SA、ABA、JA和ET誘導(dǎo)(Meng et al.2006)。 OsZincl基因的表達(dá)受真菌侵染以及激素SA、MeJA, ABA和ET的誘導(dǎo)，對(duì)其正、反義轉(zhuǎn)基因 植株抗病性的研究結(jié)果表明，OsZincl基因可能參與水稻抗逆信號(hào)途徑。RING型鋅指蛋白參與植株光調(diào)控途徑及多種植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在植物生長(zhǎng) 發(fā)育及抗逆反應(yīng)中發(fā)揮作用。大量實(shí)驗(yàn)證明植物RING蛋白能與泛素相關(guān)基因互作，但其具 體的調(diào)控方式和作用機(jī)制還需要更深入的研究。本研究以我國(guó)極端環(huán)境下抗旱的苔蘚植物毛尖紫萼蘚為研究對(duì)象，通過(guò)高通量篩 選干旱脅迫下特異表達(dá)的基因，克隆得到抗旱相關(guān)基因GpRZFl。目前GpRZFl是在苔蘚植物 中首次被克隆的RING型鋅指蛋白基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物耐旱相關(guān)蛋白R(shí)ZFl及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的植物耐旱相關(guān)蛋白(GpRZFl)，來(lái)源于毛尖紫萼蘚(Grimmia. Pilifera)是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列2所示的氨基酸序組成的蛋白質(zhì)；b)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添 加且與植物耐旱性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的序列2由487個(gè)氨基酸殘基組成，包含一個(gè)C4HC3型RING結(jié)構(gòu)域(自 序列2的氨基末端第220至269氨基酸殘基)，及三個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(自序列2的氨基末端第 339至361氨基酸殘基，自序列2的氨基末端第366至388氨基酸殘基，自序列2的氨基末 端第393至415氨基酸殘基)。上述(b)中的GpRZFl可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。編碼上述植物耐旱相關(guān)蛋白的基因(GpRZFl)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列表中的序列1由2242個(gè)核苷酸組成，自5’端第1至144位核苷酸為5’端非 編碼區(qū)(5，-UTR) (144bp)，第145至1605位核苷酸為編碼序列(1461bp)，第1606至1608 位核苷酸為終止密碼子，第1609至2242位核苷酸為3，端非編碼區(qū)(3，-UTR)長(zhǎng)634bp。含有以上任一所述基因的重組表達(dá)載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植 物表達(dá)載體還可包括外源基因的3’端非翻譯區(qū)，即包括聚腺苷酸和任何其他參與mRNA加 工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端， 如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)粒基因(如胭脂合成酶NOS基因)、植物基因(如大豆貯存蛋 白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類(lèi)似功能。使用所述基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種 增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動(dòng)子、玉米的泛素啟動(dòng)子 (ubiquitin)，它們可單獨(dú)使用或與其他的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可 以使ATG起始密碼子，或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必須與編碼序列的閱讀框相同，以保證 整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，可 以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行 加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、 熒光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是 抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選 擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。所述重組表達(dá)載體可將所述基因插入質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)或通過(guò)Gateway 系統(tǒng)得到。具體來(lái)說(shuō)，所述重組表達(dá)載體可為pEarleyGate103-GpRZFl ；所述 pEarleyGatel03-GpRZFl是將GpRZFl克隆到入門(mén)載體pENTR后得到pENTR-GpRZFl再通過(guò) LR反應(yīng)到表達(dá)載體pEarleyGatel03中得到的。含有以上任一所述基因(GpRZFl)的轉(zhuǎn)基因植株及重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育耐旱轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育耐旱轉(zhuǎn)基因植物的方法，可將編碼所述植物耐旱相關(guān)蛋自的 基因?qū)肽康闹参?如植物細(xì)胞或組織)中，得到耐旱能力高于目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明同時(shí)提供了一種培育持水力提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將所述植物耐旱 相關(guān)蛋白的基因?qū)肽康闹参?如植物細(xì)胞或組織)中，得到持水力高于目的植物的轉(zhuǎn)基 因植物。作物離體葉片在空氣中的失水速率(單位時(shí)間的失水量)反映葉片的持水力，或 稱(chēng)植物組織抗脫水能力。離體葉片失水速率與植株的抗旱性之間有密切關(guān)系。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種植物耐旱相關(guān)蛋白(GpRZFl)及其編碼基因(GpRZFl)。GpRZFl 基因可被干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。將轉(zhuǎn)化GpRZFl基因后得到的過(guò)量表達(dá)的擬南芥植株進(jìn)行逆 境生理實(shí)驗(yàn)，證明轉(zhuǎn)入GpRZFl基因后，提高了擬南芥的耐旱性。本發(fā)明的耐旱相關(guān)蛋白及 其編碼基因?yàn)槿藶榭刂浦参镏心秃迪嚓P(guān)基因的表達(dá)提供了基礎(chǔ)，將在培育耐早植物中發(fā)揮 重要的作用。以下結(jié)合附圖及具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。


圖1.毛尖紫萼蘚GpRZFl蛋白的序列分析A.毛尖紫萼蘚GpRZFl蛋白與擬南芥(AT5G60580)，水稻(0s06g0677300)，蕓苔屬 植物(ADK63404)，芭蕉屬植物(ABF69983)C3HC4型RING鋅指結(jié)合蛋白的比對(duì)。其中，黑色 陰影表示保守的氨基酸序列，實(shí)線指示RING結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)τ贓3連接酶活性至關(guān)重 要。靠近GpRZFl蛋白的C端有三段跨膜結(jié)構(gòu)域，分別用星號(hào)表示。B.毛尖紫萼蘚GpRZFl蛋白與其他RING蛋白相應(yīng)結(jié)構(gòu)域的序列比對(duì)。本圖顯示為 毛尖紫萼蘚，擬南芥，水稻，蕓苔屬植物，芭蕉屬植物以及人類(lèi)的RING蛋白的保守氨基酸， 其中假定的與鋅離子結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)以數(shù)字標(biāo)注，序列右側(cè)的數(shù)字表示該結(jié)構(gòu)域包括的 氨基酸個(gè)數(shù)。
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C.具有C3HC4型RING鋅指結(jié)合蛋白的毛尖紫萼蘚GpRZFl，擬南芥(AT5G60580)， 水稻(0s06g0677300)，蕓苔屬植物(ADK63404)以及芭蕉屬植物(ABF69983)的進(jìn)化分析。圖2.毛尖紫萼蘚GpRZFl基因的表達(dá)受干旱脅迫誘導(dǎo)A.毛尖紫萼蘚在干旱脅迫下相對(duì)含水量的隨時(shí)間的變化。B. GpRZFl基因的表達(dá)受干旱脅迫誘導(dǎo)。提取不同干旱脅迫時(shí)間點(diǎn)的總RNA用于 RT-PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳分析，Actin作為內(nèi)參對(duì)照。圖3. GpRZFl重組蛋白具有體外泛素連接酶活性A. GpRZFl重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。M 蛋白分子量Marker，1 :IPTG誘導(dǎo)前的大腸桿 菌總蛋白，2 :IPTG誘導(dǎo)后的大腸桿菌總蛋白。箭頭指示重組的GpRZFl蛋白。B. GpRZFl重組蛋白的體外自泛素化活性實(shí)驗(yàn)。圖4.植物表達(dá)載體pEarleyGatel03_GpRZFl的構(gòu)建圖5.轉(zhuǎn)基因擬南芥提取基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定圖6. 35S: GpRZFl轉(zhuǎn)基因植物的干旱耐受性被提高A. Real-time RT-PCR 方法檢測(cè)!35S: GpRZFl 轉(zhuǎn)基因擬南芥mRNA水平 GpRZFl 基因
的表達(dá)量。B.野生型和35S: GpRZFl轉(zhuǎn)基因擬南芥在充足的水分下土培三周，隨后，停水培 養(yǎng)12天，繼而復(fù)水培養(yǎng)3天。C.三周齡的土培生長(zhǎng)良好的擬南芥野生型轉(zhuǎn)基因植物失水率的測(cè)定。D.經(jīng)干旱處理后的野生型和35S: GpRZFl轉(zhuǎn)基因擬南芥存活率的統(tǒng)計(jì)。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限于本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑公司購(gòu)買(mǎi)得到。毛尖紫萼蘚(Grimmiapilifera P. Beauv.)采自山東省青島市嶗山。實(shí)施例1、毛尖紫萼蘚RING型鋅指蛋白基因及蛋白質(zhì)序列的發(fā)現(xiàn)在高通量篩選獲得毛尖紫萼蘚干旱脅迫下相關(guān)候選基因信息的基礎(chǔ)上，針對(duì)特異 表達(dá)的抗旱相關(guān)的RING型鋅指蛋白基因(GpRZFl)，以獲得的EST序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)特異擴(kuò) 增引物，通過(guò)3’和5’ RACE技術(shù)(Clontech公司)獲得全長(zhǎng)序列。將得到的5’端和3’端 序列拼接獲得ORF序列，并重新設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增得到全長(zhǎng)片段，測(cè)序最終得到全基因序列。上游引物GSP1 (5，-AGAAACGGGGTCACCGGCATTGAAG-3，)上游引物GSP2 (5，-ACCCGCTCCTTGAAACACACACACG-3，)下游弓I物 UPM(universal primer A mix long 5’ -CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’ 及short 5， -CTAATACGACTCACTATAGGGC-3，)分別用于第一次擴(kuò)增5’端和3’端序列；上游引物EGSP 1(5，-GCAGGTCCCATCATCACGCCAGGAA-3，)上游引物EGSP2 (5，-TCTTGTGTGTTGGGTCTGCTTGCTG-3，)下游引物short (5，-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3，)
分別用于第二次巢式PCR擴(kuò)增CDNA5’端和3’端序列；上游引物ORF-U (5，-ATGGAGCCTCGCAACCATGAA-3，)下游引物ORF-L (5，-CTAGTGGGCCTGTGGGTTAGACTGA-3，)用于擴(kuò)增開(kāi)放閱讀框ORF。以干旱處理的毛尖紫萼蘚總RNA的逆轉(zhuǎn)錄樣品為模板進(jìn)行RACE擴(kuò)增。PCR反應(yīng) 體系組成為10xpfx buffer 2 μ l,50mM MgSO4 2 μ 1, IOmM dNTPs 1 μ 1，10 μ M 上游引物和 下游引物各1 μ 1，Pfx DNA聚合酶0. 2μ 1和適量模板，補(bǔ)充無(wú)菌水至總體積20 μ 1。PCR循 環(huán)條件，第一次PCR :94°C變性30sec，72°C延伸anin，5個(gè)循環(huán)；94°C變性30sec，70°C退火 30sec，72°C延伸 2min，5 個(gè)循環(huán)；94°C變性 30sec，68°C退火 30sec，72°C延伸 lmin，25 個(gè)循 環(huán)，最后72°C延伸5min。第二次巢式PCR條件為94°C變性30sec，56°C退火30sec，72°C延 伸lmin，12個(gè)循環(huán)。全基因擴(kuò)增PCR循環(huán)條件為94°C變性30sec，56°C退火30sec，72°C延 伸lmin，共30個(gè)循環(huán)。最終獲得序列表中序列1所示的核苷酸序列，該核苷酸具有完整的編碼框。將序 列1所示的核苷酸序列命名為GpRZFl。GpRZFl基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，由2242個(gè)核苷酸組成，自5’端 第l·至144位核苷酸為5，端非編碼區(qū)(5，-UTR) (144bp)，第145至1605位核苷酸為編碼 序列(1461bp)，第1606至1608位核苷酸為終止密碼子，第1609至2242位核苷酸為3，端 非編碼區(qū)(3，-UTR)長(zhǎng)634bp。序列表中的序列2由487個(gè)氨基酸殘基組成，包含一個(gè)C4HC3型RING結(jié)構(gòu)域(自 序列2的氨基末端第220至269氨基酸殘基)及三個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(自序列2的氨基末端第 339至361氨基酸殘基，自序列2的氨基末端第366至388氨基酸殘基，自序列2的氨基末 端第393至415氨基酸殘基)。蛋白分子量約52. 5kDa。該蛋白與其他植物中相似序列進(jìn)行同源性分析及相似性分析表明，其與擬南芥 (At5g60580)，水稻(0s06g0677300)的相似性分別為49. 23 %，40. 78 %，與蕓苔屬植物 (Brassicarapa)，芭蕉屬植物(Musa acuminata)的相似性分別為 47. 19%, 57. 14% (圖 1， A)。其中該基因所對(duì)應(yīng)的蛋白包含一個(gè)RING鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，與其他物種氨基酸序列比對(duì) 結(jié)果如圖1，B所示。實(shí)施例2、植物耐旱相關(guān)蛋白GpRZFl基因受干旱誘導(dǎo)表達(dá)為了研究毛尖紫萼蘚對(duì)干旱的耐受性，我們分別測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)植物體的相對(duì)含 水量，如圖2，A所示，在開(kāi)始1個(gè)小時(shí)內(nèi)其含水量迅速下降，從近飽和100%的含水量變化到 20%左右。而后的一個(gè)小時(shí)變化逐漸緩和，3個(gè)小時(shí)以后植物體內(nèi)含水量趨于平緩，穩(wěn)定在 4%左右?；诖?，我們分別以野外采集的毛尖紫萼蘚干旱脅迫不同程度的全植株為材料提 取RNA的逆轉(zhuǎn)錄樣品為模板通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)GpRZFl基因的表達(dá)。擴(kuò)增引物如下上游引物5，-TTTGATGGTGGAAGCTGTGGAGAGT-3，下游引物5，-TGCTTATTGGGAAATGGGCACTTCT-3，RT-PCR的結(jié)果表明，干旱脅迫能強(qiáng)烈的誘導(dǎo)GpRZFl基因的表達(dá)(圖2，B)。隨著 處理時(shí)間的延長(zhǎng)(從0. 25小時(shí)到2. 5小時(shí))，干旱處理對(duì)基因表達(dá)的誘導(dǎo)量明顯增加(如 圖2，B所示)。實(shí)施例3、GpRZFl蛋白具有泛素連接酶活性
根據(jù)缺失了 C端跨膜結(jié)構(gòu)域的GpRZFl序列以及原核表達(dá)載體pGEX_6p-l的多克 隆位點(diǎn)并在C端引入6x His標(biāo)簽序列，設(shè)計(jì)如下引物，用于擴(kuò)增GpRZFl缺失了跨膜結(jié)構(gòu)域 的開(kāi)放閱讀框序列。上游引物(劃線部分代表BamH I酶切位點(diǎn))5， -TTGGATCCATGGAGCCTCGCAAC-3’下游引物(劃線部分代表Ml I酶切位點(diǎn)，斜體字標(biāo)記為6xHis序列)5’ -TTGTCGACTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCACCCGACCCCATT-3’PCR 反應(yīng)體系組成為IOxpfx buffer 2 μ l,50mM MgSO4 2 μ 1, IOmM dNTPs 1 μ 1, 10 μ M上游引物和下游引物各1 μ 1，Pfx DNA聚合酶0. 2 μ 1和適量模板，補(bǔ)充無(wú)菌水至總 體積20μ1。94°C變性30sec，56°C退火30sec，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)。經(jīng)電泳分離 純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物，與PJET載體連接，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞JM109，選取陽(yáng)性克隆送至英俊公司進(jìn) 行核苷酸序列測(cè)定。將測(cè)序正確的pJET-GpRZFl Δ TM重組質(zhì)粒進(jìn)行BamH I和Ml I雙酶切，并將酶 切產(chǎn)物經(jīng)電泳分離純化后連接至相同雙酶切的pGEX-6p-l原核表達(dá)載體上。將構(gòu)建好的含 有GpRZFl基因的原核表達(dá)載體pGEX-6p-l-GpRZFl ΔΤΜ和空白對(duì)照質(zhì)粒pGEX_6p_l分別轉(zhuǎn) 化大腸桿菌BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析，經(jīng)考馬斯 亮藍(lán)染色成像。由于所克隆的基因約為1014bp，所以編碼蛋白分子量約為36kDa，加之表達(dá) 載體pGEX-6p-l上的GST蛋白約^kDa,因此其融合蛋白的分子量約為62kDa。從SDS-PAGE 結(jié)果可以看出，在預(yù)計(jì)的大小處有明顯的蛋白條帶，而空載對(duì)照沒(méi)有(圖3，A)，說(shuō)明已成功 構(gòu)建了 pGEX-6p-l-GpRZFlΔTM基因原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中成功表達(dá)。該融合蛋白 的純化按照Ni-NTA His · Bind Resins(NOVAGEN)試劑盒進(jìn)行。E3 泛素連接酶活性測(cè)定按照 Liu (Liu et al. 2007)和 Qin (Qin et al. 2008)的 方法進(jìn)行。約 500ng 的 GST-GpRZFl ΔΤΜ 的融合蛋白，50ng human El (BostonBiochem), 50ng humanUbcH5c (BostonBiochem)禾口 1 μ g ubiquitin (BostonBiochem)依次力口入反應(yīng)液 (50mMTris-HCI, pH7. 4,2mM ATP,5mM MgCl2, 2mM DTT)中，混合均勻后 30°C孵育 45min 及 90min。樣品經(jīng) SDS-PAGE 電泳檢測(cè)并以 anti-Ub antibody 做 Western Blot 檢測(cè)(圖 3， B)。實(shí)施例4、耐旱轉(zhuǎn)基因植株的獲得與耐旱性的鑒定一、重組表達(dá)載體的構(gòu)建構(gòu)建流程見(jiàn)圖41、GpRZFl的全長(zhǎng)cDNA序列用以下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增上游引物5，-CACCATGGAGCCTCGCAACCATGAA-3，下游引物5，-GTGGGCCTGTGGGTTAGACTGAGCCTG-3，制備上游帶有CACC的GpRZFl基因的編碼區(qū)，序列表的序列1自第146至1605位 核苷酸，將得到的PCR進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序保證準(zhǔn)確無(wú)誤后繼續(xù)后面的實(shí)驗(yàn)。2、擴(kuò)增所得的片段，經(jīng)凝膠回收，進(jìn)行TOPO Cloning reaction，直接將基因片段 倒入 pENTRtm/D-T0P0 vector (Invitrogen)。3、通過(guò)LR reaction將克隆片段轉(zhuǎn)入植物表達(dá)載體pEarleyGatel03 (購(gòu)自ABRC) 得到重組質(zhì)粒，重組載體命名為pEarleyGatel03-GpRZFl。二、轉(zhuǎn)基因植株的獲得
1、將步驟一構(gòu)建的pEarleyGatel03_GpRZFl通過(guò)電轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌EV3101中，用蘸花 法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，具體步驟為1)種植選擇吸水性好，土質(zhì)松軟的至石配合營(yíng)養(yǎng)土(1 1)作為擬南芥種植土 壤。直徑IOcm的花盆，每盆播種約20顆。播種以后在花盆上罩上薄膜，給植株的生長(zhǎng)提供 一個(gè)濕潤(rùn)的環(huán)境。2)去頂在擬南芥初次開(kāi)花時(shí)將花蕾剪掉，可以促進(jìn)側(cè)枝更多的花枝的增生。適 合轉(zhuǎn)化植株的花卉并沒(méi)有成熟，也沒(méi)有產(chǎn)生已受精的角果。3)配制浸染液于中午12點(diǎn)接菌于LB培養(yǎng)液的試管中10μ1 IOml接種。 ^°C，200rpm搖過(guò)夜，次日下午2點(diǎn)將已活化的菌按(1 400)即750μ1菌液轉(zhuǎn)至含 300mlLB+Kana+Gen+Rif的LB培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)，300rpm約14小時(shí)，次日上午8點(diǎn)測(cè)OD 值，當(dāng)菌液達(dá)到0D600為1.5 3.0之內(nèi)時(shí)，收集菌體。用15%蔗糖(含0.02% Silwet) 重懸菌體并稀釋至0D600為0. 8 1. 0。4)浸染將盛花期擬南芥的花表面部分浸泡在農(nóng)桿菌懸浮液中30s，同時(shí)輕輕旋 轉(zhuǎn)。5)暗培養(yǎng)將浸染后植株套袋保持高度的濕潤(rùn)狀態(tài)暗室培養(yǎng)Mh。2、提取具有Basta抗性轉(zhuǎn)pEarleyGate103-GpRZFl基因擬南芥和野生型植株基因 組DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)，為保證PCR檢測(cè)的特異性，設(shè)計(jì)特異引物序列，引物序列為上游引物5，-ATGCTACAGTTGCTTCAGAGAGCGG-3，下游引物5，-AGCAGCACAGTTGCCCCACTACTTA-3，3、擬南芥(Arabidopsis thaiiana)野生型和轉(zhuǎn)基因植物基因組DNA的PCR檢測(cè) 結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果表明得到了含有目的基因的轉(zhuǎn)基因植株。4,Real time RT-PCR 分析。擬南芥(Arabidopsis. thaliana) S 生型和轉(zhuǎn)基因植 物總RNA用Trizol (Invitrogen)提取，以1 μ g總RNA作為模板，在20 μ 1反應(yīng)體系中用 QuantiTeck ReverseTransciption Kit(Qiagen)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一條 cDNA。cDNA反應(yīng)混 合物稀釋50倍后，5 μ 1稀釋物作為模板被用于20 μ 1 real time RT-PCR反應(yīng)體系。反應(yīng) 條件為95°C變性30sec，60°C兩步法30sec，共40個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)都用STOR Green PCR Master Mix(ABI)作為熒光染料。Real time RT-PCR所用引物都為基因特異性引物(同 2)。每個(gè)反應(yīng)都被重復(fù)至少三次。融解曲線被用于數(shù)據(jù)分析。根據(jù)每個(gè)株系中GpRZFl的 過(guò)表達(dá)水平，我們得到過(guò)表達(dá)GpRZFl的轉(zhuǎn)基因株系，選擇其中的五個(gè)株系(#7，14，15，17和 19)進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)(圖6，A)。5、T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得。由于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法只能將目標(biāo)片段整合 到一條DNA單鏈上，為后續(xù)生理性狀實(shí)驗(yàn)需要，將Ttl代轉(zhuǎn)基因種子培育至T2代。根據(jù)雜合 子在發(fā)生性狀分離時(shí)會(huì)產(chǎn)生野生型后代，而野生型種子不能在除草劑Basta噴灑時(shí)正常生 長(zhǎng)，從而篩選得到轉(zhuǎn)基因植株純合子。三、轉(zhuǎn)基因擬南芥耐旱性的測(cè)定1、自然干旱處理為了評(píng)價(jià)GpRZFl過(guò)表達(dá)后對(duì)植物抗旱性的作用，在溫室內(nèi)，相同條件土培三周的 野生型植物和35S: GpRZFl轉(zhuǎn)基因植物停止?jié)菜?2天觀察植株的萎蔫程度。大部分野生 型植物萎蔫，而35S: GpRZFl轉(zhuǎn)基因植物仍正常生長(zhǎng)并保持綠色(圖5，B)。這個(gè)結(jié)果暗示35S: GpRZFl轉(zhuǎn)基因植物消耗水分的速度比野生型慢，所以萎蔫速度也慢。2、葉片失水(Water Loss)測(cè)定作物離體葉片在空氣中的失水速率(單位時(shí)間的失水量)反映葉片的持水力，或 稱(chēng)植物組織抗脫水能力。離體葉片失水速率與植株的抗旱性之間有密切關(guān)系。三周齡的土 培生長(zhǎng)良好的擬南芥(Arabidopsis.thaliana)野生型和轉(zhuǎn)基因植物。每個(gè)植株收集六片 葉子，將其放置在半開(kāi)的培養(yǎng)皿中置于桌面上，在預(yù)定的時(shí)間稱(chēng)量葉片的鮮重，計(jì)算其失水 率。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)四次。失水率用預(yù)定時(shí)間點(diǎn)的鮮重比上起始鮮重(Time point fresh weight/initial frestiweight)。轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥葉片在脫水過(guò)程中的失水 率變化結(jié)果見(jiàn)圖7，C。
權(quán)利要求
1.一種編碼植物耐旱相關(guān)蛋白的核酸分子，其特征在于所述核酸是如下1)或2)或 3)的DNA分子1)其編碼序列是序列表中序列1自5’端第145至1608位核苷酸所示；2)序列表中序列1所示；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼耐旱相關(guān)蛋白。
2.一種植物耐旱相關(guān)蛋白的多肽，其特征在于所述多肽是如下(a)或(b)的多肽(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成；(b)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加 且與植物耐旱性相關(guān)。
3.含有權(quán)利要求1所述核酸的重組表達(dá)載體。
4.如權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體是將權(quán)利要求1 所述核酸經(jīng)過(guò)Gateway技術(shù)的LR反應(yīng)轉(zhuǎn)入pEarleyGatel03質(zhì)粒得到的。
5.含有權(quán)利要求1所述核酸的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
6.含有權(quán)利要求1所述核酸的重組菌。
7.一種培育耐旱轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1所述核酸導(dǎo)入目的植 物中，得到耐旱能力高于目的的植物的轉(zhuǎn)基因植物。
8.其特征在于權(quán)利要求1所述核酸通過(guò)權(quán)利要求3或4所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的 植物中。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，所述目的植物為擬南芥。
10.一種培育持水力提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1所述核酸 導(dǎo)入目的植物中，得到持水力高于目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于權(quán)利要求1所述核酸通過(guò)權(quán)利要求3或4 所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中。
12.如權(quán)利要求10或11所述的方法，所述目的植物為擬南芥。
13.權(quán)利要求1所述核酸或權(quán)利要求2所述多肽在提高植物抗旱能力中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種植物耐旱相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐旱性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還保護(hù)編碼所述蛋白的基因。所述蛋白及其編碼基因?yàn)榭刂浦参镏心秃迪嚓P(guān)基因的表達(dá)提供了基礎(chǔ)，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)有效地利用該基因，可提高植物在缺水環(huán)境下的適應(yīng)性，最終達(dá)到提高植物抗旱能力的目的。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102115752SQ20101057596
公開(kāi)日2011年7月6日 申請(qǐng)日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月7日
發(fā)明者李萌萌, 王英典, 趙君怡 申請(qǐng)人:北京師范大學(xué)