專利名稱：：一種植物耐旱相關蛋白p5cs及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種植物耐旱相關蛋白P5CS及其編碼基因與應用。
背景技術：
：棉花是我國重要的纖維作物，在國民經濟中占有重要地位。但是我國棉花種植區(qū)大部分處于干旱(如新疆棉區(qū))和半干旱地區(qū)(如黃河流域棉區(qū))，目前干旱已經成為棉花生產的主要限制因素之一。在干旱和鹽脅迫時，植物通過滲透調節(jié)防止水分的過度散失，保持細胞的膨壓，從而保持細胞的生長、氣孔開放和光合作用等生理過程的正常進行。在所有的有機滲透調節(jié)物質中，脯氨酸是分布最廣的滲透調節(jié)劑。它主要以游離狀態(tài)廣泛存在于植物中。作為植物體內一種重要的滲透調節(jié)物質，脯氨酸主要有滲透調節(jié)、保護生物大分子以及參與氮代謝和能量代謝等作用。近年來已通過轉基因技術使許多植物產生更多的滲透調節(jié)保護物質脯氨酸，從而提高了植物的耐旱性。吡咯琳-5-羧酸合成酶(Pyrroline-5-carboxyatesynthetase,P5CS)是脯氨酸合成途徑中的關鍵酶。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種植物耐旱相關蛋白P5CS及其編碼基因與應用。本發(fā)明提供的植物耐旱相關蛋白(GaP5CS)，來源于亞洲棉(Gossypi咖arbore咖)，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐旱性相關的由序列2衍生的蛋白質。序列表中的序列2由716個氨基酸殘基組成，包含一個谷氨酸激酶結構域(Glutamylkinase,GK)(自序列2的氨基末端第14至259位氨基酸殘基)和一個谷氨酸-Y-半醛脫氫酶結構域(Glu-5-semialdehydedehydrogensae，GSA)(自序列2的氨基末端第286至691位氨基酸殘基)。所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指將序列2的上述兩個結構域外的氨基酸殘基進行取代和/或缺失和/或添加。為了使(a)中的GaP5CS便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表l標簽的序列標簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRR<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述(b)中的GaP5CS可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的GaP5CS的編碼基因可通過將序列表中序列1自5'端第351至2498位核苷酸所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表l所示的標簽的編碼序列得到。編碼上述植物耐旱相關蛋白的基因(GaP5CS)也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述基因可為如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)其編碼序列是序列表中序列1自5'第351至2498位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列1所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼耐旱相關蛋白的DNA分子。上述嚴格條件可為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65"下雜交，然后用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。序列表中的序列1所示由2827個核苷酸組成，自5'第1至350位核苷酸為5'非編碼區(qū)(5'-UTR)(350bp)，第351至2498位核苷酸為編碼序列(2148bp)，第2499至2501位核苷酸為終止密碼子，第2502至2827位核苷酸為3'非編碼區(qū)(3'-UTR)(326bp)。含有以上任一所述基因的重組表達載體也屬于本發(fā)明的保護范圍?？捎矛F有的植物表達載體構建含有所述基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端，如農桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3'端轉錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用所述基因構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、玉米的泛素啟動子(Ubiquitin)，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉錄起始區(qū)域或結構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。所述重組表達載體可將所述基因插入pBI21質粒的多克隆位點得到。具體來說，所述重組表達載體可為pBI121/GaP5CS;所述pBI121/GaP5CS是將pBI21質粒BamHI和SacI位點間的小片段取代為所述基因(GaP5CS)得到的。含有以上任一所述基因(GaP5CS)的表達盒、轉基因細胞系及重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。擴增所述基因(GaP5CS)全長或任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育耐旱轉基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育耐旱轉基因植物的方法，可將編碼所述植物耐旱相關蛋白的基因導入目的植物(如植物細胞或組織)中，得到耐旱能力高于目的植物的轉基因植物。具體來說，可以將所述重組表達載體導入目的植物中，得到耐旱能力高于目的植物的轉基因植物。本發(fā)明同時提供了一種培育持水力提高的轉基因植物的方法，是將所述植物耐旱相關蛋白的基因導入目的植物(如植物細胞或組織)中，得到持水力高于目的植物的轉基因植物。具體來說，可以將所述重組表達載體導入目的植物中，得到持水力高于目的植物的轉基因植物。作物離體葉片在空氣中的失水速率(單位時間的失水量)反映葉片的持水力，或稱植物組織抗脫水能力。離體葉片失水速率與植株的抗旱性之間有密切關系。利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將編碼所述蛋白的基因導入植物細胞，可獲得耐旱能力增強的轉基因細胞系及轉基因植株。攜帶有所述基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如煙草、百脈根、擬南芥、水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等。本發(fā)明發(fā)現了一種植物耐旱相關蛋白(GaP5CS)及其編碼基因(GaP5CS)。GaP5CS基因可被PEG6000誘導表達。將轉化GaP5CS基因后得到的過量表達的煙草植株進行逆境生理實驗，證明轉入GaP5CS基因后，提高了煙草的耐旱性。本發(fā)明的耐旱相關蛋白及其編碼基因為人為控制植物中耐旱相關基因的表達提供了基礎，將在培育耐旱植物中發(fā)揮重要的作用。以下結合附圖及具體實施例進一步闡述本發(fā)明。圖1為GaP5CS基因受到PEG6000脅迫條件誘導表達。圖2為pBI121-GaP5CS表達載體的構建示意圖。圖3為獲得的抗卡那霉素轉pBI121/GaP5CS煙草；ck:對照煙草；1_2:轉基因煙草。圖4為轉pBI121/GaP5CS煙草基因組PCR檢測結果；M:Marker;CK:對照煙草；1、2:轉基因煙草。圖5為干旱條件下轉pBI121/GaP5CS煙草和對照煙草比較；CK:對照煙草；1、2:轉基因煙草。圖6為轉基因煙草葉片在脫水過程中失水速率的變化；CK:對照煙草；L1、L2:轉基因煙草。圖7為轉基因煙草葉片在脫水過程中離子滲漏的變化；CK:對照煙草；L1、L2:轉基因煙草。具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。棉花(石系亞1號)購自中國農業(yè)科學院棉花研究所棉花種質資源中期庫，庫編號I3A01616。實施例1、植物耐旱相關蛋白(GaP5CS)及其編碼基因的發(fā)現提取3-6片真葉幼苗期棉花(石系亞1號)幼苗總RNA，反轉錄得其全基因組的cDNA。將cDNA作為模板，進行RT-PCR擴增。上游引物5'-ATGGCTGAGGATAGTTCAAGAGCTTTTGTT-3';下游引物5'-TCAAGAATTTATTGGTTGTCTTTGTGGGTGT-3'。PCR擴增體系(50ul):MgCl2(25mM)2ul，10XBuffer5ul，dNTPMixture(10uM)4ul，Easy_AHigh-FidelityPCRCloningEnzyme(5u/ul)lul，反轉錄反應液5ul(0.25ug)，上游引物(10uM)2ul，下游引物(10uM)2ul，ddH20補齊至50ul。PCR條件94。C預變性3min;94。C30s，55。C40s，72。C5min，30個循環(huán)；72。C延伸10min。反應結束后，將得到PCR產物進行測序鑒定。在測序結果的基礎上，通過3'和5'RACE技術(Takara)獲得PCR產物上游和下游的核苷酸序列。最終獲得序列表中序列1所示的核苷酸序列，該核苷酸序列具有完整的編碼框。將序列1所示的核苷酸序列命名為GaP5CS。GaP5CS基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，由2827個核苷酸組成。序列表的序列1自5'第1至350位核苷酸為5'非編碼區(qū)(5'-UTR)(350bp)，第351至2498位核苷酸為編碼序列(2148bp)，第2499至2501位核苷酸為終止密碼子，第2502至2827位核苷酸為3'非編碼區(qū)(3'-UTR)(326bp)。GaP5CS基因編碼序列表的序列2所示的蛋白質(GaP5CS)。GaP5CS由716個氨基酸組成，預測分子量為77.5kD，等電點(pl)7.019。TargetP軟件預測GaP5CS基因表達產物為細胞質定位；無跨膜螺旋；蛋白質功能域預測發(fā)現GaP5CS包含兩個功能域谷氨酸激酶結構域(Glutamylkinase,GK)和谷氨酸-Y-半醛脫氫酶(Glu-5-semialdehydedehydrogensae，GSA)。因此，GaP5CS基因能編碼一個催化合成脯氨酸合成的酶，從而在棉花耐旱中起到功能。實施例2、植物耐旱相關蛋白(GaP5CS)的誘導表達將石系亞1號幼苗在28t:恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至3-6片真葉，小心拔出幼苗進行干旱脅迫處理。17%PEG6000(質量百分含量)處理0、0.5、1、2、3、4、5、6h后，分別提取幼苗總RNA(總RNA純度與質量都較高，每個樣品RNA的A260/A280都在1.8_2.1之間，濃度在1.0ug/ul以上)。分別將不同處理時間的幼苗的總RNA進行1X瓊脂糖凝膠電泳檢測，28SrRNA與18SrRNA條帶非常清晰，表明所提取的RNA樣品能用于RT-PCR反應。將不同處理時間的幼苗的總RNA進行RT-PCR分析，以棉花看家基因Histone3(GENBANKACCESSIONNUMBER:AF024716)為內參，作為衡量模板量的對照。RT-PCR引物如下擴增內參引物上游引物5'-TCAAGACTGATTTGCGTTTCCA-3';下游引物5'-GCGCAAAGGTTGGTGTCTTC-3';擴增GaP5CS基因的引物上游引物5'-TGAAAGGAAGTGGGCAGGTAGT-3';下游引物5'-TTCTACTCAAATTCTCCTGACACA-3'。結果如圖1所示。PEG6000模擬干旱脅迫處理時，GaP5CS基因的mRNA迅速積累并在脅迫2h時達到最大值，PEG脅迫4h后，GaP5CS的轉錄本開始下降，之后在脅迫6h時又開始回升。實施例3、耐旱轉基因植株的獲得與耐旱性鑒定—、重組表達載體的構建構建流程見圖2。1、制備帶有BamHI和SacI酶切位點的GaP5CS基因(編碼區(qū)；序列表的序列1自5'第351至2498位核苷酸)。2、用BamHI和SacI雙酶切植物表達載體pBI121(購自Clontech;Cat.恥018-1);用BamHI和SacI雙酶切步驟1制備的GaP5CS基因；將酶切后的載體骨架和酶切后的GaP5CS基因連接，得到重組質粒。3、將得到的重組質粒進行測序，測序結果表明GaP5CS基因插入到了pBI21的35S啟動子下游，將攜帶GaP5CS的pBI121重組載體命名為pBI121/GaP5CS。二、耐旱轉基因植株的獲得將步驟一構建的pBI121/GaP5CS，凍融法轉化至農桿菌LBA4404(購自Invitrogen;Cat.No.18313-015)，采用葉盤轉化法轉化野生型煙草NC89(購自中國農業(yè)科學院煙草研究所煙草種質資源中期庫，庫編號I5A01846);將pBI121凍融法轉化至農桿菌LBA4404(購自Invitrogen;Cat.No.18313-015)，采用葉盤轉化法轉化野生型煙草NC89，得到轉空載體對照植株；具體步驟如下1、煙草種子用2.5X次氯酸鈉處理8min，用無菌水洗一次，然后用70%乙醇浸泡lmin，無菌水洗34次，播種于MS培養(yǎng)基上，于25°C，16h光照/8h黑暗條件培養(yǎng)5周。2、將煙草葉片剪去邊緣和葉脈，切成0.4cmX0.6cm大??；切好的煙草葉盤用重組農桿菌菌液浸泡3-5min;用無菌濾紙吸干植物材料表面的菌液，轉入煙草共培養(yǎng)基中，25t:黑暗條件下共培養(yǎng)兩天；將轉化處理的煙草葉盤浸于MS液體培養(yǎng)基(含500mg/L羧芐青霉素)中，浸泡35min后用無菌濾紙吸去殘留液，轉入分化培養(yǎng)基(50-100mg/L濃度7的卡納霉素)中，約一周繼代一次，直到分化出幼芽；將幼芽切下，置入生根培養(yǎng)基中誘導生根。獲得的抗卡那霉素的轉基因煙草(T。代)見圖3。3、提取抗卡那霉素轉pBI121/GaP5CS煙草和轉空載體對照植株的基因組DNA，進行PCR檢測，煙草中可能含有目的基因的同源基因，為保證PCR檢測的特異性，根據載體啟動子序列和外源轉化基因的保守區(qū)設計引物，來區(qū)別外源基因和內源基因。引物為5'-GCTCCTACAAATGCCATCA-3';5'-CTGCACATGCCTTCCCATCAAGTT-3'。PCR檢測結果見圖4。結果表明得到了含有目的基因的轉基因植株。三、T。代轉基因煙草耐旱性測定煙草為盆栽土培，正常供水，定期施MS營養(yǎng)液。以轉空載體的煙草作為轉基因煙草的對照(每個株系50棵)。均設置三次重復試驗，結果取平均值。1、自然干旱處理在棉花所溫室內，相同條件培育轉基因煙草、對照煙草和野生型煙草NC89，待植株生長至4個月左右時，停止供水5天后觀察植株的萎蔫程度。對照植株和野生型煙草NC89明顯萎蔫，轉基因植株受影響程度明顯好于對照煙草和野生型煙草NC89，對照煙草和野生型煙草NC89表型一致。轉pBI121/GaP5CS煙草和對照煙草比較見圖5。2、離體葉片失水速率測定作物離體葉片在空氣中的失水速率(單位時間的失水量)反映葉片的持水力，或稱植物組織抗脫水能力。離體葉片失水速率與植株的抗旱性之間有密切關系，且與某些產量和植株性狀存在較明確的關系。檢測轉基因植株、對照植株和野生植株離體葉片的失水速率，方法如下相同條件培育轉基因煙草、對照煙草和野生型煙草NC89，待植株生長至4個月時，快速剪取生長一致的煙草新鮮葉片，迅速裝入塑料袋密封蔽光。在溫濕度相對穩(wěn)定的實驗室內稱取初始葉重后，空氣中放置9h自然風干后稱重，最后于105t:烘干30min，8(TC烘干10h，測干重，計算單位重量的葉片在單位時間的失水量。離體葉片失水速率由RWL=(IW-Wi)/{DWX(T「T0)}計算。式中IW為T。時初始葉重(g)，Wi為1\時葉重(g)，DW為干重(g)，T。和1\分別為稱取IW和某Wi的時間(h)。在空氣中自然風干9h后，煙草轉基因株系的葉片失水速率明顯小于對照煙草和野生型煙草NC89，對照煙草和野生型煙草NC89的葉片失水速率一致，說明GaP5CS的轉入增強了煙草的持水力。轉基因煙草和對照煙草葉片在脫水過程中失水速率的變化結果見圖6。3、葉片細胞的質膜透性測定干旱脅迫會導致細胞膜結構的破壞，葉片離子滲漏反映細胞質膜的完整性，檢測轉基因植株、對照植株和野生植株葉片的電導率，方法如下相同條件培育轉基因煙草、對照煙草和野生型煙草NC89，待植株生長至4個月時，快速剪取生長一致的煙草新鮮葉片，迅速裝入塑料袋密封蔽光。在溫濕度相對穩(wěn)定的實驗室內稱取初始葉重后，空氣中放置9h自然風干。風干后的煙草葉片放入75ml去離子水中(25°C)，2h后測定電阻率Rl，測完Rl的樣本IO(TC煮沸20分鐘，冷卻至25。C測定電阻率R2。離子滲漏=(Rl/R2)X100%。在空氣中自然干燥9h后，煙草轉基因株系的葉片離子滲漏小于對照煙草和野生型煙草NC89，對照煙草和野生型煙草NC89的葉片離子滲漏一致，表明干旱脅迫條件下，轉基因植株對干旱逆境膜傷害的抵抗能力顯著增強，推測這與脯氨酸所具有的對生物膜結構的保護作用有關。轉基因煙草和對照煙草葉片在脫水過程中離子滲漏的變化結果見圖7。序列表〈110〉中國農業(yè)科學院棉花研究所〈120〉一種植物耐旱相關蛋白P5CS及其編碼基因與應用〈130〉CGGNARY92549〈160>3〈210>1〈211>2827〈212>DNA〈213〉棉屬亞洲棉(GossypiumarboreumL.)〈400〉1g皿皿皿皿caccatcatcgtcttcgagtcgcctcaaccacccaatttea60gcggcagttgcctetctgacgcagttttcc郷卿tgtggctttgtcccttcgctgaga1203CgCC3tgg3atctg^cgaactttcatgaga皿cgte皿gcgtgtgttcgtte郷tgg180g皿cagctgtggteactcgagctgatgg皿gattegcagtgggg郷cttggagctttet240gtg皿cagctteagg皿ctgaattctcaagggtetg卿ttgttttggtcacttcaggtg300ctgttggtcttggtcgtcaaaggcttegat3gtC皿C3gCatggctg郷360ategttc皿gagcttttgttagcgtetcgtcatteaggttgggactgctg420ttgttectcga^tgatggacgattegcacttgg皿gatt3gg3gcactetgtgagc卿■gaactctcaaggatetg卿tcattttggtgtcatcaggtgctgttggct540teggtcgcca皿ggcttegatecaggagactegtc皿cagcagttttgctgatcttcaga6003gCC3C皿gtag^cttgatggg皿ggratgtgcagccgtagtcttetgg660ctttgtetgatecattgttc3gtg3gCtggatetttcatcagctcaacttcttgteacag720acagtgattttegagategaagc皿cte皿tg卿ragtgaagtctttet780tetcgttgaaagttettcctatettteatg皿皿cgatgctgtcagtecc3gg皿3gCtC840catecgaggattcttctggtatettttgggtttegcggctctectcgctt■tggagcte皿agctgatcttcttgttttettgagtgatgttgagggtctttecagtggcc960ctccaagtgaaagcteatccacacatetgt1020agattecctttggagac皿gt咖gggteggtegagggggtetgactgca皿3gte皿3g1080ctgctgtcaatgcagcttetgctggcattcctgttgttetcaccagtggaagtgctcctg1140ag^cateataagagtccttc皿ggtc皿cg皿ttggtectctctttcacC3gg3tgC3C12003tttgtgggag皿gttggtgcccgtgaaatggC3gttgC3gC皿g3g3C31260gttccagacgacttcaggcattgtcttcac皿gagcg皿3a^gattttettegacateg1320ctgatgcctttcactgttg3g皿tg皿gctgatgtegctg1380ctgcacaacaggctggatetgaga^tccttgatetctcgactegctctgaagcctggaa1440agattgc^gccttgcaaagtcaattcgtgtgCttgCg皿C3tgg皿g3Cccaatcggcc1500gtgttttgaacttgcagatggacttetttt3gag皿皿cctcaagtcctt1560tgggtgttcttttgattgtttttgaatctcgacctgatgcgcttgtecagategcctcat1620tegctetccg朋gtggteacgggctccttttg腿ggggg皿3gg3ggCC皿gcggtcca1680atgctettttgcateaggteateactg皿gccattccagacattgttgggggte皿gtte1740ttggacttgtgatgagattcctgatctttt3皿gcttgatgacgttettg1800atcttgtgatcccacgaggcagc皿c皿gcttgtttccca1860ttcctgttcttggtcatgcagatgg朋tttgccatgtetetgttgateagtctgcteata1920tggatetggc咖gcgggttgttttggatgttecccagctgcttgcaatg1980c朋tgg朋actcttcttgtetegtgac皿3tggtgcactt皿tgagct朋2040ttgttgatcttcgtetacaaggtgttactttetetggtgg3cc朋gggcaagtttettgt2100tgaatetccc3C皿gC3CgCtcttttcatcttcaatggaatgcactgttg21603朋tegtggacgacgtggctgcagccatcgatcacatccatcaccatggcagtgcacaca2220cagattgtetcatcaccgaacttcttgtetcaagttgaca2280gcgctgctgttttccacaatgc皿grac皿gattttgtgatggtgctcgatttggtcteg2340gcgctgaggttgggat皿gt3c皿gteggattcacgctcggggtccggttggagttg皿g2400gattgttaac朋c皿gatggg皿gtgggraggtegtegatggtgate朋g2460gggtcattteg3catecc皿teaattcttg2520ccteaaatgc朋3gggga皿atggctg皿gctgctgaattggtttcttga郷gggttga2580attgggateagagtgttttgtcagggtgttaattgttetectetaatettgtgaaattet2640tgcteatgctttetgtttttgtegattcttttcttttcaagtgtgateat2700teg朋ttteggatttgagteatttgtgtcagg卿atttg2760ag朋gtgttttgatgtaattttetttctgtteteatgc皿28202827〈210〉2〈211〉716〈212〉PRT〈213〉豐帛JSM別'I豐帛(GossypiumarboreumL.)〈400〉2MetAlaGluAspSerSerArgAlaPheValLysAspValLysArglie151015VallieLysValGlyThrAlaValValThrArgAsnAspGlyArgLeu202530AlaLeuGlyArgLeuGlyAlaLeuCysGluGinlieLysGluLeuAsn354045SerGinGlyTyrGlu:lelieLeuValSerSerGlyAlaValGlyLeu505560GlyArgGinArgLeuArgTyrArgArgLeuValAsnSerSerPheAla65707580AspLeuGinLysProGinValGluLeuAspGlyLysAlaCysAlaAla859095ValGlyGinAsnSerLeuMetAlaLeuTyrAspThrLeuPheSerGlu100105110LeuAsplieSerSerAlaGinLeuLeuValThrAspSerAspPheArg115120125AspArgAspPheArgLysGinLeuAsnGluThrValLysSerLeuLeu130135140SerLeuLysVallieProliePheAsnGluAsnAspAlaValSerThr145150155160ArgLysAlaProTyrGluAspSerSerGlyliePheTrpAspAsnAsp165170175SerLeuAlaAlaLeuLeuAlaLeuGluLeuLysAlaAspLeuLeuVal180185190LeuLeuSerAspValGluGlyLeuTyrSerGlyProProSerAspPro195200205LysSerLysLeulieHisThrTyrValLysGluLysHisGinGlyGlu210215220lieThrPheGlyAspLysSerArgValGlyArgGlyGlyMetThrAla225230235240LysValLysAlaAlaValAsnAlaAlaTyrAlaGlylieProValVal245250255lieThrSerGlySerAlaProGluAsnlielieArgValLeuGinGly260265270GinArglieGlyThrLeuPheHisGinAspAlaHisLeuTrpGluPro275280285ThrLysGluValGlyAlaArgGluMetAlaValAlaAlaArgAspSer290295300SerArgArgLeuGinAlaLeuSerSerGinGluArgLysLyslieLeu305310315320LeuAsplieAlaAspAlaPheGluAlaAsnGluLysLeulieThrVal325330335GluAsnGluAlaAspValAlaAlaAlaGinGinAlaGlyTyrGluLys340345350SerLeulieSerArgLeuAlaLeuLysProGlyLyslieAlaSerLeu355360365AlaLysSerlieArgValLeuAlaAsnMetGluAspProlieGlyArg370375380ValLeuLysLysThrGinLeuAlaAspGlyLeulieLeuGluLysThr385390395400SerSerProLeuGlyValLeuLeulieValPheGluSerArgProAsp405410415AlaLeuValGinlieAlaSerLeuAlalieArgSerGlyAsnGlyLeu420425430LeuLeuLysGlyGlyLysGluAlaLysArgSerAsnAlalieLeuHis435440445LysVallieThrGluAlalieProAsplieValGlyGlyLysVallie450455460GlyLeuValThrSerArgAspGlulieProAspLeuLeuLysLeuAsp465470475■AspVallieAspLeuVallieProArgGlySerAsnLysLeuValSer485490495GinlieLysSerSerThrLyslieProValLeuGlyHisAlaAspGly500505510lieCysHisValTyrValAspLysSerAlaAsnMetAspMetAlaLys515520525ArgValValLeuAspAlaLyslieAspTyrProAlaAlaCysAsnAla530535540MetGluThrLeuLeuValHisLysAspLeuValThrAsnGlyAlaLeu545550555560AsnGluLeulieValAspLeuArglieGinGlyValThrLeuTyrGly565570575GlyProArgAlaSerLeuLeuLeuAsnlieProGinAlaArgSerPhe580585590HisHisGluTyrAsnSerMetGluCysThrValGlulieValAspAsp595600605ValAlaAlaAlalieAspHislieHisHisHisGlySerAlaHisThr610615620AspCyslielieThrGluAspGinGluThrAlaGluliePheLeuTyr625630635640GinValAspSerAlaAlaValPheHisAsnAlaSerThrArgPheCys645650655AspGlyAlaArgPheGlyLeuGlyAlaGluValGlylieSerThrSer660665670ArglieHisAlaArgGlyProValGlyValGluGlyLeuLeuThrThr675680685ArgTrplieLeuLysGlySerGlyGinValValAspGlyAspLysGly690695700VallieTyrThrHisLysAsplieProlieAsnSer70571071權利要求一種蛋白質，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐旱性相關的由序列2衍生的蛋白質。2.編碼權利要求l所述蛋白的基因。3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)其編碼序列是序列表中序列1自5'第351至2498位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列1所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4)與l)或2)或3)限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼耐旱相關蛋白的DNA分子。4.含有權利要求2或3所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。5.如權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體是將權利要求2或3所述基因插入pBI21質粒的多克隆位點得到的。6.擴增權利要求2或3所述基因的全長及其任意片段的引物對。7.—種培育耐旱轉基因植物的方法，是將權利要求2或3所述基因導入目的植物中，得到耐旱能力高于目的植物的轉基因植物。8.如權利要求7所述的方法，其特征在于權利要求2或3所述基因通過權利要求4或5所述重組表達載體導入目的植物中；所述目的植物為煙草。9.一種培育持水力提高的轉基因植物的方法，是將權利要求2或3所述基因導入目的植物中，得到持水力高于目的植物的轉基因植物。10.如權利要求9所述的方法，其特征在于權利要求2或3所述基因通過權利要求4或5所述重組表達載體導入目的植物中；所述目的植物為煙草。全文摘要本發(fā)明公開了一種植物耐旱相關蛋白及其編碼基因與應用。本發(fā)明提供的蛋白質，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐旱性相關的由序列2衍生的蛋白質。本發(fā)明還保護編碼所述蛋白的基因。所述基因可用于培育耐旱植物。本發(fā)明的耐旱相關蛋白及其編碼基因為人為控制植物中耐旱相關基因的表達提供了基礎，將在培育耐旱植物中發(fā)揮重要的作用。文檔編號C12N15/53GK101701210SQ20091009381公開日2010年5月5日申請日期2009年9月21日優(yōu)先權日2009年9月21日發(fā)明者劉傳亮,張朝軍,張雪妍,李付廣,武芝霞,陳亞娟,陳銀華申請人:中國農業(yè)科學院棉花研究所