專利名稱:一種用于植物耐旱的新的dna標(biāo)記的制作方法
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種用于植物耐旱的新DNA標(biāo)記。
發(fā)明背景在植物中通常是采用純系作圖群體來獲得DNA標(biāo)記。這在生殖階段周期很長時(shí)是不實(shí)用的。在純系繁殖群體中已經(jīng)進(jìn)行了性狀相關(guān)的DNA標(biāo)記開發(fā)(純等基因系-RIL/近似等基因系-NIL)，其集中在性狀相關(guān)的生理參數(shù)。這是費(fèi)時(shí)的過程，花費(fèi)了許多年以獲得RIL和NIL。進(jìn)一步與任何一個(gè)表型的參數(shù)的相關(guān)，通常不能提供直接與數(shù)量性狀相關(guān)的DNA標(biāo)記。
到現(xiàn)在為止大多數(shù)已知耐旱標(biāo)記顯示出與一個(gè)或另一個(gè)與性狀有關(guān)的生理學(xué)參數(shù)相關(guān)。關(guān)注的不同表型通常是生態(tài)系統(tǒng)特異性的，因此在植物實(shí)驗(yàn)室中不能用于快速和精確鑒定/篩選種質(zhì)。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是建立一種用于植物耐旱的新DNA標(biāo)記。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供一種用于植物實(shí)驗(yàn)室中生態(tài)環(huán)境特異性栽培的精確選擇DNA標(biāo)記。
本發(fā)明更進(jìn)一步的目的是提供一種通過植物耐旱性育種以獲得改良品種的DNA標(biāo)記。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于植物中耐旱性的快速診斷的DNA標(biāo)記。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于開發(fā)改良品種中植物轉(zhuǎn)化基因鑒定的DNA標(biāo)記。
發(fā)明簡述依照本發(fā)明，提供了一種用于植物耐旱的新DNA標(biāo)記，該DNA標(biāo)記包含一段擴(kuò)增的1400bp片段。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種開發(fā)耐旱DNA標(biāo)記的方法，包括從冷凍嫩葉提取基因組DNA，使這樣獲得的DNA經(jīng)歷標(biāo)定步驟，對經(jīng)過標(biāo)定的DNA進(jìn)行分析步驟。無性系分析的DNA片段，對DNA片段進(jìn)行測序以獲得DNA標(biāo)記。
發(fā)明詳述用于建立該DNA標(biāo)記的方法是新的，因?yàn)槠涫峭ㄟ^與特定性狀的精確相關(guān)獲得，并能快速評價(jià)生化標(biāo)記。使用這個(gè)新穎的，非顯而易見的，具有創(chuàng)造性的方法，已經(jīng)確定了耐旱DNA標(biāo)記。
提取基因組DNA將200mg冷凍嫩葉用于DNA分離。使用CTAB(溴化十六烷基三甲銨)法提取DNA，獲得平均20μg的DNA。瓊脂糖凝膠電泳后，使用定量的DNA作為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)溴乙啶熒光標(biāo)定DNA。
RAPD研究在含有25μm dNTPs，40ng引物和0.3μl Taq DNA聚合酶的總體積為25ul的PCR反應(yīng)混合物中，使用來自各無性系的嫩葉DNA作為模板，進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)分析。45個(gè)循環(huán)，退火溫度為36℃進(jìn)行反應(yīng)。使用11個(gè)隨機(jī)的十聚體引物如OPAB06、OPAB18、OPAH18、OPAH02、OPAB17、OPAC19、OPAH12、OPAL04、OPAA02、OPAG13和OPAL08獲得的PCR產(chǎn)物，用1.2％瓊脂糖凝膠分離，然后在存在溴乙啶的情況下用UV光顯影。在各無性繁殖內(nèi)隨機(jī)選擇的植物的RAPD分析證實(shí)了在各無性繁殖系區(qū)域內(nèi)植物的遺傳均一性(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn))。為了用于本研究，采用了比較分析獲得的短的列出的(以耐旱性/敏感性為基礎(chǔ))無性系。為了用于本研究，對10個(gè)短的列出的(以耐旱性/敏感性為基礎(chǔ))無性系進(jìn)行了比較分析。用收集的各無性系區(qū)域中隨機(jī)選擇之植物的葉，重復(fù)此RAPD研究(每組10個(gè)無性系)。在圖1a中顯示了RAPD模式圖的典型凝膠影像。圖1b顯示相同引物在4個(gè)在田間顯示耐旱的無性系的基因組上的RAPD模式圖(那也存在于圖1a中)(圖1b未用于給RAPD條帶打分)。
在RAPD研究中使用的引物，在全部10個(gè)無性系均觀察到RAPD條帶的總數(shù)，存在單態(tài)/多態(tài)性條帶的總數(shù)，獲得的多態(tài)性條帶的百分?jǐn)?shù)在表1中給出。
與逆境相關(guān)的同功酶活性在提取緩沖液中提取離脫的(水脅迫)，茶嫩葉，然后提取物在非變性凝膠上跑膠。通過把凝膠浸入適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)混合液中，使同功酶在凝膠中反應(yīng)，來研究酶的活性，接著把凝膠浸入合適的染色液來終止酶活性。
SOD和APX活性
在用于SOD(EC 1.15.1.1)的50mM磷酸鉀(pH-7.8)緩沖液，與用于APX(EC 1.11.1.11)100mM磷酸鈉(pH-7.8)緩沖液中對分離的葉勻漿。電泳分離之后，接著把凝膠浸入到合適的染色液中，在非變性活性凝膠(12％聚丙烯酰胺)上觀察提取物中的酶活性。
通過在N，N，N1，N1-四甲基乙二胺(TEMED)和核黃素之間的反應(yīng)中產(chǎn)生的O2-來還原硝基四氮唑藍(lán)(NBT)，顯示電泳分離的SOD同功酶。由于缺乏被同功酶活性除去的O2-，代表同功酶的條帶保持無色；由于還原的NBT，剩余的凝膠被染為藍(lán)色。光密度掃描(在632.8nm)負(fù)染色的同功酶活性條帶在圖2a中顯示。
APX活性凝膠染色相似，除了不用核黃素而采用H2O2和抗壞血酸產(chǎn)生O2-。在凝膠成像裝置(Image Master VDS，Pharmacia Biotech)中記錄同功酶條帶的負(fù)染色。負(fù)染色的同功酶活性條帶在632.8nm掃描；光密度掃描的代表圖像在圖2b中顯示。
使用回歸分析，通過同功酶活性和DNA指紋之間的相關(guān)分析以得到特異性的耐旱DNA標(biāo)記使用同功酶分析(SOD和APX)的數(shù)據(jù)和RAPD條帶進(jìn)行回歸分析。使用多重回歸分析方法，分析SOD活性和APX活性與RAPD標(biāo)記之間的相關(guān)性。酶活性也就是視為從屬變量的適當(dāng)?shù)某趸锲缁?SOD)和APX同功酶(峰區(qū))和視為獨(dú)立變量的不同RAPD譜帶(標(biāo)記1作為存在譜帶和0作為缺失譜帶)?；貧w分析以如下模型為基礎(chǔ)Y＝a+b1m1+b2m2+-----bjmj+------bnmn+d其中Y是酶的特征，m是RAPD標(biāo)記，b是偏回歸系數(shù)，d是回歸后留下的增加的殘差。RAPD條帶與銅鋅超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)(條帶II)活性之間的相關(guān)程度在表2中顯示。
這個(gè)標(biāo)記的序列正在申請專利?？梢岳眠@個(gè)標(biāo)記選擇適當(dāng)?shù)幕蛐?a)用于生態(tài)系統(tǒng)特殊栽培(b)用于通過植物育種/植物轉(zhuǎn)化努力開發(fā)改良品種。
實(shí)施例茶樹無性系，報(bào)道認(rèn)為耐旱/對干旱敏感(根據(jù)田間表現(xiàn))，選擇用于該研究●在建立(通過田間研究信息相關(guān)的RAPD和同功酶分析)本研究中使用的精確DNA標(biāo)記中使用了Darjeeling的茶樹無性系
RR17/144，T246，CPI，TV26，TV 25，B777，AV2，K1/1，B688，T78(全部Darjeeling茶樹無性系)。
●用于確認(rèn)(通過與田間研究相關(guān)的RAPD研究)在其他的茶樹無性系中也就是Assam茶樹無性系TV1，TV2，TV14，TV17，TV20，TV30(全部Assam茶樹無性系)建立的DNA標(biāo)記與耐旱相關(guān)的茶樹無性系。
收集來自Ging Tea Estate，Darjeeling，和Tea Research Association(TRA)，Assam的上列各無性系植物的葉。
為了進(jìn)行酶研究，在24小時(shí)內(nèi)使用新離脫的葉(來自Darjeeling無性系)進(jìn)行提取。
茶樹是多年生并且具有長的生殖周期。因此對于均一原料(即新鮮的茶樹葉)的快速可得性，生長繁殖的茶樹無性系細(xì)成在茶工業(yè)中使用的植物種群。在這樣的種群中，通過子代的連鎖研究是費(fèi)時(shí)的。在這種情況下，開發(fā)DNA標(biāo)記可提供一種替代方法，其是通過在DNA指紋分析圖像和屬于窄基因庫的植物中想要得到的表型特性的精確生物化學(xué)參數(shù)之間的回歸分析支持的相關(guān)研究。
細(xì)胞保護(hù)酶，特別是Cu-Zn細(xì)胞溶質(zhì)超氧化物歧化酶(SOD)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)，已被報(bào)道與植物的耐旱相關(guān)。在本研究中，通過使用包括RAPD模式和干旱特異的同功酶活性的回歸分析，嘗試在茶樹中建立與耐旱相關(guān)的DNA標(biāo)記。
圖1a和圖1b顯示在建立DNA標(biāo)記中使用的茶樹無性系的RAPD模式。在3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中觀察到相同的指紋模式后，證實(shí)了數(shù)據(jù)的重復(fù)性。早些時(shí)候也報(bào)道過證明RAPD研究重復(fù)性的類似方法。
在RAPD研究中對10個(gè)無性系使用11個(gè)引物得到180條PCR條帶；其中的131個(gè)條帶(即總數(shù)180個(gè)擴(kuò)增片段的69.87％)是多態(tài)性的(表1)。這顯示了在茶樹種質(zhì)中RAPD方法能觀察到可觀測水平的多態(tài)性。
需要注意的是從屬于窄基因庫的植物中的指紋模式產(chǎn)生的多態(tài)性標(biāo)記代表對特定性狀的獨(dú)立特征，曾嘗試使用在RAPD(基因組)分析和干旱特異同功酶的活性之間的相關(guān)研究開發(fā)耐旱相關(guān)的分子(DNA)標(biāo)記。為了這個(gè)目的，在容易評分的RAPD(顯性性狀)標(biāo)記和用于植物耐旱的生物化學(xué)參數(shù)(也就是SOD和APX活性)之間進(jìn)行研究。
終于觀察到逆境相關(guān)的細(xì)胞保護(hù)酶的活性。
已知細(xì)胞溶質(zhì)Cu-Zn SOD和APX與植物中干旱逆境相關(guān)。通過評價(jià)SOD和APX同功酶活性，進(jìn)行了所研究的無性系基于同功酶標(biāo)記的耐旱性鑒定。
SOD活性凝膠的光密度掃描(圖2a)顯示4個(gè)主要峰值；大約29kD(條帶IV)的峰值代表Cu-Zn SOD。與T246，TV25，B777，K1/1，B688，T78中的峰值IV下面積(峰面積小于70mm2)比較，在無性系RR17/144，CP1，TV26和AV2中發(fā)現(xiàn)這個(gè)峰值顯現(xiàn)較高活性(峰面積超過100mm2)。這顯示無性系RR17/144，CP1，TV26和AV2具有耐旱的特征。
具有高度耐旱的煙草品種顯現(xiàn)出最高的抗壞血酸過氧化物酶活性。來自NBT染色2條同功酶條帶的非變性劑聚丙烯酰胺凝膠電泳分析顯示，我的干旱逆境的葉(茶)中的APX活性的數(shù)據(jù)(圖(2b))，其中一條稱作APX II，被發(fā)現(xiàn)是一個(gè)分子量約29kD的單體，另一條約40kD(APX譜帶1)。在活性凝膠的光密度掃描(圖2b)中，2個(gè)條帶被表現(xiàn)為2個(gè)峰值在約40kD(APX譜帶1)和在約29kD(APX譜帶II)上。大約29kD(APX II)的同功酶峰值在無性系RR17/144，CP1，TV26，AV2(峰面積超過90mm2)中顯示非常高的活性；T246，TV25，B777，K1/1，B688，T78顯示較低活性(峰面積小于50mm2)。需要注意的是顯示高APXII活性(圖2b)的無性系也顯示高Cu-Zn SOD活性(圖2a)。
這些無性系由田間行為數(shù)據(jù)也顯現(xiàn)耐旱性。
在RAPD條帶和目標(biāo)特性之間的相關(guān)性研究已被報(bào)道。為精確建立性狀相關(guān)的DNA標(biāo)記，已在多重回歸分析中采用稻的高差異性數(shù)據(jù)RAPD分析，以確定DNA標(biāo)記與數(shù)量性狀之間的相關(guān)。在本研究中，進(jìn)行了代表的回歸分析(表2)，以確定作為從屬變量的特定同功酶活性峰面積與作為獨(dú)立變量的RAPD條帶(s)(圖1a)標(biāo)記的關(guān)聯(lián)。逐步回歸顯示使用OPAH02引物獲得的RAPD條帶(在1400bp)具有非常顯著的回歸系數(shù)，對于Cu/Zn SOD活性(b＝0.970)，對于APXII活性(b＝0.968)。使用Fisher的準(zhǔn)確試驗(yàn)(F-test)，發(fā)現(xiàn)Cu/Zn SOD和APXII與1400bp的RAPD條帶之間的相關(guān)性以99.9％的置信度是顯著的。由于與顯示高度耐旱特異性同功酶活性的無性系相關(guān)，這個(gè)DNA條帶(標(biāo)記)可以在茶樹的耐旱性種質(zhì)篩選中使用。這個(gè)1400bp的條帶在圖1和1b中用箭頭標(biāo)記。
直到在RAPD模式中所示時(shí)間的驗(yàn)證研究顯示，相同引物，也就是APOH02，在一些Asssm茶樹中也擴(kuò)增到了1400bp的DNA片段(圖3a和3b用箭頭標(biāo)記)。
這條1400bp的條帶現(xiàn)在被更進(jìn)一步表征。
已在其他隨機(jī)選擇的茶樹(包括一些Assam茶樹無性系)中進(jìn)一步檢驗(yàn)這個(gè)DNA片段的有效性。
直到在RAPD模式中所示時(shí)間的驗(yàn)證研究顯示，相同引物，也就是APOH02，在一些Assam茶樹中也擴(kuò)增到了1400bp的DNA片段(圖3a和3b用箭頭標(biāo)記)。
表1具有可評分的擴(kuò)增和多態(tài)性條帶數(shù)的11個(gè)隨機(jī)引物的序列
表2Cu-Zn SOD，APX II與1400bp的RAPD條帶之間的相關(guān)
權(quán)利要求
1.一種用于植物耐旱的新DNA標(biāo)記，所述DNA標(biāo)記包含一段使用引物APOHO2產(chǎn)生的1400bp的擴(kuò)增片段。
2.如權(quán)利要求
1所要求保護(hù)的DNA標(biāo)記，其中所述擴(kuò)增的片段存在于無性系RR17/144、CP1、TV26和AV2中。
3.如權(quán)利要求
1中要求保護(hù)的DNA標(biāo)記具有如下所示的序列Tea序列g(shù)agnntntnc tatagggcga attgggcccg acacgtcgcatg ctcccggccg ccatggcggccgcgggaatt cgattcactt ccgctagggc aaattcgtga accagctggg gcatggccgactcataaata tattcggctc tagtgccaca gccgcttcat gaatcgactc atcaatattgcgtggttcgg tgtttaatgt tcatgaatca gctggggca agggtagattc atcaatctattcggctctaa tgccgtagcc gcttcatgaa ttgactcatc aatattgtgt ggttcggtgtttaatgttcat gaaccagct ggggcaaagg cagatttatc aatctattcg gctctaatgccgcagccact tcatgaattg actcatcaat attgtgtggt ttggccgttt aatattcatgaaccagctga ggcaagggca gattcatcaa tctattcggc tctaatgccc cagccgtttcatgaaccgac tcagnagnna tgaggctatc aatattgtgt ggttcggcgt ttaatgttcatgcaccagct gnggcaaggg cagattcatc aatctattcg gctnnaatgc cacagccgcttcatgaatcg actnantant nntntgnggn nccnngagta nngttnatga ncnaantggngnnatggctg atatannagt ctatantnct ctgatgncnn ancncttgtn tgaangnacaacaggcncta atcatnttat ccaaagtagc ggaagngaat cactagtgaa ttcgcggacgctgcaggtan accatatgggg agagctccca acgcgttgga tgcatagctt gagtattctatggtgtcacc taaatagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgttatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggtgcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgccccg tttccagtcgggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggnttgcgtattggcg ctcttccgct tcttcgctca ctgactcgtg cgctcggtcg gtcggctgcggngagcggna tcacttactc aaangcggna atccggtatt cacagaatna ggntacnccggaaagaaatt ggancaaagg ccncanaagg cc
4.一種開發(fā)耐旱DNA標(biāo)記的方法，包括從冷凍的嫩葉提取基因組DNA，將這樣獲得的DNA進(jìn)行標(biāo)定步驟，將標(biāo)定的DNA進(jìn)行分析步驟，無性系干旱特異的(通過回歸分析鑒定參見權(quán)利要求
6)DNA片段以獲得標(biāo)記條帶的DNA序列。
5.如權(quán)利要求
4要求保護(hù)的方法，其中所述鑒定標(biāo)記的步驟包括使用引物，例如OPAB06、OPAB18、OPAH18、OPAH02、OPAB17、OPAC19、OPAH12、OPAL04、OPAA02、OPAG13和OPAL08。
6.如權(quán)利要求
4要求保護(hù)的方法，其中分析的步驟是通過回歸分析方法完成的，方法是利用干旱逆境離脫的葉中超氧化物歧化酶(SOD)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)的干旱特異同功酶活性的相關(guān)(RAPD研究)。
7.如權(quán)利要求
4要求保護(hù)的方法，其中分析的步驟是基于作為獨(dú)立變量的RAPD條帶(作為基因型)與作為獨(dú)立變量的植物中耐旱生物化學(xué)參數(shù)之間的相關(guān)研究。
專利摘要
一種用于植物耐旱的新DNA標(biāo)記，所述DNA標(biāo)記包含一段使用引物AP OHO2產(chǎn)生的1400bp的擴(kuò)增片段。
文檔編號C12Q1/68GK1997753SQ20058000582
公開日2007年7月11日 申請日期2005年2月28日
發(fā)明者S·S·曼迪 申請人:博斯學(xué)院, 生物技術(shù)部導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan