專利名稱：耐旱植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)和植物育種領(lǐng)域。所提供的是耐旱植物，尤其是耐旱蔬菜物種，如番茄(Solanum lycopersicum)，及用于產(chǎn)生遺傳上修飾的耐旱植物或突變體耐旱植物的方法。本發(fā)明提供稱為S1PP2C1的新基因，該基因編碼he SIPP2C蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是脫落酸(absisic acid,ABA)反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)物。S1PP2C1基因的下調(diào)、敲除或沉默導(dǎo)致植物具有顯著提高的耐旱性。還提供在其基因組中包含突變體S1PP2C1等位基因且具有顯著提高的耐旱性的植物、種子、果實(shí)和植物部分。在另一實(shí)施方案中，本文中提供用于產(chǎn)生在其基因組中包含一個(gè)或多個(gè)突變體S1PP2C1等位基因的耐旱植物的方法。
背景技術(shù)：
植物激素脫落酸(abscisic acid, ABA)對(duì)調(diào)節(jié)非生物脅迫反應(yīng)(如干旱、鹽度、 冷休克、創(chuàng)傷、病原體侵襲)及種子發(fā)育和休眠很重要。已多次使用針對(duì)具有改變的非生物脅迫反應(yīng)或種子休眠的突變體的篩選，并導(dǎo)致了對(duì)ABA生物合成和ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)重要的基因的鑒定。通過(guò)這種篩選，已鑒定了擬南芥屬(Arabidopsis)ABA不敏感突變體abil_l和 abi2-l(Koornneef 等 1984，Physiol Plantarum 61 :377-383)。AtABIl基因的克隆和表征揭示，它編碼2C型絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(PP2C， Leung等 1994,Science 264 :1448-1452 ；Meyer 等 1994,Science264 :1452-1455)。AtAB12 也編碼2C型蛋白磷酸酶。abil-Ι和abi2-l突變體在AtABIl和AtABI2基因中攜帶突變，該突變?cè)诘韧奈恢蒙蠈?dǎo)致相同的Gly至Asp的取代(Leung等1997，Plant Cell 9 :759-771)。已顯示兩種突變體都具有降低的磷酸酶活性(Bertauche等1996，Eur J Biochem241 :193-200 ；Leung 等 1997，上文)，這暗示 AtABIl 和 AtAB12 是 ABA 敏感性的正調(diào)節(jié)物。但是，AtABIl的組成性過(guò)量表達(dá)抑制了 ABA在玉米原生質(zhì)體中的作用，且已顯示AtABIl和AtABI2的功能降低突變體對(duì)ABA具有高敏反應(yīng)(hypersensitive response) (Scheen 1998， PNAS 95 :975-980 ;Gosti 等 1999， Plant Cell 11:1897-1909 ;Merlot 等 2001，Plant J25 =295-303)?？傊虼说贸鼋Y(jié)論，AtABIl和AtABI2是ABA反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)物。雖然abil-Ι和abi2-l中的突變誘導(dǎo)ABA不敏感性的確切機(jī)制仍未知，但它可能與突變蛋白質(zhì)的優(yōu)先核定位相關(guān)(Moes等2008，Plant J 54 :806-819)。AtABIl和AtABI2對(duì)種子休眠以及幼苗生長(zhǎng)和氣孔開(kāi)張度(stomatal aperture)的調(diào)節(jié)很重要，暗示這些蛋白質(zhì)在控制組織特異性ABA信號(hào)級(jí)聯(lián)放大的主分支點(diǎn)之前發(fā)揮作用(Leung等1997，上文)。已在擬南芥屬中鑒定了 76個(gè)PP2C，其中一個(gè)亞組(亞組PP2C-A，由9個(gè)基因組成)已與 ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)(Schweighofer 等 2004，Trends in Plant Science 第 9 卷236-243)。還發(fā)現(xiàn)隸屬于此組的幾個(gè)擬南芥屬基因編碼ABA反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)物。例如， AtP2C-HA (Rodriguez 等 1998，Plant Mol Biol 38 :879-883)(也稱為 AtHABl，Saez 等 2004， Plant J 37:354-369)是調(diào)節(jié)諸如氣孔關(guān)閉、種子萌發(fā)和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)抑制的許多ABA反應(yīng)的 ABA信號(hào)傳導(dǎo)途徑的阻抑物。HAB2似乎也具有相似的調(diào)節(jié)作用。還已將AtPP2CA(Kuhn等 2006，Plant Physiol 140 :127-139)描述為ABA的負(fù)調(diào)節(jié)物，具有顯示ABA高敏性的突變體。有趣地，基因破壞突變體顯示ABA高敏性氣孔關(guān)閉反應(yīng)，而突變體的蒸騰作用(水分喪失)與野生型植物中并無(wú)不同。Yoshida等(2006,Plant Physiology 140 :115-126)還研究了 AtPP2CA中的錯(cuò)義功能喪失突變，其具有野生型的1/100蛋白磷酸酶活性，突變體擬南芥屬植物由此在種子萌發(fā)期間顯示ABA高敏性，但突變體植物與野生型相比未顯示任何耐旱性變化(124頁(yè)，LH Column，最后一段)。ABIl和ABI2是調(diào)節(jié)諸如氣孔關(guān)閉、質(zhì)膜的滲透透水性、干旱誘導(dǎo)的抗性和生根、 對(duì)葡萄糖的反應(yīng)、高光脅迫、種子萌發(fā)和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)抑制的許多ABA反應(yīng)的ABA信號(hào)傳導(dǎo)途徑的阻抑物。AHGl(At5g51760)是種子萌發(fā)期間的ABA負(fù)調(diào)節(jié)物(Nishimura等2007，Plant J 50 :935-949),而AHG3(At3gl 1410)是種子萌發(fā)和冷適應(yīng)期間的ABA負(fù)調(diào)節(jié)物。另外三種(At5g9220、At2g^380和Atlg07430)終究未涉及ABA信號(hào)發(fā)放，因?yàn)闊o(wú)效突變未顯示對(duì) ABA 的敏感性的任何改變(Yoshida 等，2006 :Plant Physiology 140 :115-126) 因此，ABA生物合成和信號(hào)發(fā)放極其復(fù)雜，雖然已在擬南芥屬中鑒定了似乎涉及其中的多種基因(PP2C-A組)，但它們?cè)贏BA依賴性反應(yīng)，如非生物脅迫、種子休眠和幼苗生長(zhǎng)中的作用在很大程度上仍不清楚。此外，蛋白質(zhì)序列顯示少許保守性，氨基酸序列具有少許序列同一性?；诘鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)域(或基序)，如通常定位在蛋白質(zhì)C端的催化結(jié)構(gòu)域(蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶樣結(jié)構(gòu)域)，將基因按系統(tǒng)發(fā)生分組在一起。N端顯著不同，且可以在底物結(jié)合中發(fā)揮作用或提供信號(hào)發(fā)放復(fù)合物的特異性附著位點(diǎn)。除體內(nèi)功能不清楚夕卜，關(guān)于這些酶的亞細(xì)胞定位、底物和特異性或在體內(nèi)如何調(diào)節(jié)這些單體酶也知之甚少。W02007/088234描述了 ABI1和HABl的組合失活增強(qiáng)了對(duì)ABA的反應(yīng)，產(chǎn)生對(duì)鹽度和水分脅迫(hydric stress)具有抗性的擬南芥屬植物。圖6和7中顯示了 ABIl (SGN-U231558)和 HABl (SGN-U217609)的番茄直向同源物。還見(jiàn) Saez 等 2006，Plant Physiol 141:1389-1399。雖然abil habl雙突變體在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中導(dǎo)致耐旱性，但仍存在提供適合用于在作物植物中，尤其是在大田作物(例如稻、玉米、大豆、小麥、大麥、黑麥、高粱、蕓苔屬(Brassica)等)和蔬菜作物(例如番茄、黃瓜、洋蔥、胡蘿卜、卷心菜、花椰菜、椰菜、西瓜、甜瓜、萵苣、韭蔥、菠菜、蘿卜、馬鈴薯、朝鮮薊、野萵苣、南瓜(pumpkin)、倭瓜 (squash)、豆、豌豆、辣椒等)中產(chǎn)生耐旱性的基因的需要。尤其是在蔬菜作物中，水分不足可以是大問(wèn)題，因?yàn)樵S多作物的根淺，且許多產(chǎn)品通常新鮮出售，水分不足可以導(dǎo)致降低的蔬菜質(zhì)量和降低的產(chǎn)率。果實(shí)和種子蔬菜，如番茄在開(kāi)花期間及果實(shí)和種子發(fā)育期間對(duì)水分不足敏感。果實(shí)發(fā)育期間水分不足可以嚴(yán)重減少果實(shí)形成。應(yīng)付潛在的水分脅迫環(huán)境的常見(jiàn)實(shí)踐是灌溉作物和/或種植具有耐旱性的栽培種或變種，只要這些是可得的。還可以使用覆蓋物和行遮蓋物(row covers)。盡管有育種的努力，番茄植物仍對(duì)干旱敏感，且無(wú)市售耐旱栽培種可得。本發(fā)明提供適合用于產(chǎn)生耐旱作物植物，尤其是番茄植物和其他蔬菜植物的稱為 S1PP2C1的新基因。本發(fā)明還提供產(chǎn)生耐旱植物的方法。還提供耐旱植物、它們自身的種子和植物部分(收獲的果實(shí)等)。一般定義術(shù)語(yǔ)“核酸序列”(或核酸分子)指單鏈或雙鏈形式的DNA或RNA分子，尤其是編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的DNA?！胺蛛x的核酸序列”指不再處于其所分離自的天然環(huán)境中的核酸序列，例如細(xì)菌宿主細(xì)胞中或植物核基因組或質(zhì)體基因組中的核酸序列。術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”或“多肽”可互換使用，指由氨基酸鏈組成的分子，而不涉及具體的作用方式、大小、三維結(jié)構(gòu)或來(lái)源。因此，S1PP2C1蛋白質(zhì)的“片段”或“部分”仍可以稱為 “蛋白質(zhì)”。用“分離的蛋白質(zhì)”來(lái)指不再處于其天然環(huán)境中的蛋白質(zhì)，例如在體外或在重組細(xì)菌或植物宿主細(xì)胞中。術(shù)語(yǔ)“基因”意指包含與適宜調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動(dòng)子)有效連接的在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄為 RNA分子(例如mRNA)的區(qū)域(轉(zhuǎn)錄區(qū))的DNA序列。因此，基因可以包含幾個(gè)有效連接的序列，如啟動(dòng)子、含有例如涉及翻譯起始的序列的5’前導(dǎo)序列、(蛋白質(zhì))編碼區(qū)(cDNA或基因組DNA)和含有例如轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)的3’非翻譯序列?！扒逗匣颉?或重組基因)指正常情況下不天然見(jiàn)于物種中的任意基因，尤其是其中存在在自然界中不相互結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)核酸序列的部分的基因。例如，啟動(dòng)子在自然界中不與部分或全部轉(zhuǎn)錄區(qū)或與另一調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“嵌合基因”理解為包含這樣的表達(dá)構(gòu)建體，其中啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列與一個(gè)或多個(gè)編碼序列或與反義序列(有義鏈的反向互補(bǔ)鏈)或反向重復(fù)序列(有義鏈和反義鏈，RNA轉(zhuǎn)錄物由此在轉(zhuǎn)錄時(shí)形成雙鏈RNA) 有效連接。“順式基因”是嵌合基因，其中優(yōu)選全部基因序列，但至少轉(zhuǎn)錄序列來(lái)自在性別上與該基因所引入的物種相容的植物物種?！盎虻谋磉_(dá)”指其中與適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)區(qū)，尤其是啟動(dòng)子有效連接的DNA區(qū)域轉(zhuǎn)錄為 RNA的過(guò)程，該RNA具有生物活性，即能夠翻譯為具有生物活性的蛋白質(zhì)或肽(或活性肽片段)，或者自身具有活性(例如在轉(zhuǎn)錄后基因沉默或RNAi中)。編碼序列可以處于有義取向，且編碼希望的具有生物活性的蛋白質(zhì)或肽，或活性肽片段。在基因沉默方法中，DNA序列優(yōu)選以反義DNA或反向重復(fù)DNA的形式存在，其以反義取向或以正義和反義取向(反向重復(fù))包含靶基因的短序列?！爱愇槐磉_(dá)”指基因正常情況下不在其中表達(dá)的組織中的表達(dá)?！盎钚缘鞍踪|(zhì)”或“功能蛋白質(zhì)”是具有可以例如通過(guò)體外活性測(cè)定在體外測(cè)量和 /或例如通過(guò)該蛋白質(zhì)所賦予的表型在體內(nèi)測(cè)量的蛋白質(zhì)活性的蛋白質(zhì)?！耙吧汀钡鞍踪|(zhì)是存在于野生型植物中的全功能蛋白質(zhì)。本文中的“突變體蛋白質(zhì)”是這樣的蛋白質(zhì)，在編碼該蛋白質(zhì)的核酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)突變，該突變由此導(dǎo)致(突變體核酸分子編碼) 例如可以通過(guò)體外(例如通過(guò)活性測(cè)定來(lái)與野生型蛋白質(zhì)的活性比較)和/或體內(nèi)(例如通過(guò)該突變體等位基因所賦予的表型)蛋白質(zhì)活性來(lái)測(cè)量的“功能降低”或“功能喪失”的蛋白質(zhì)。編碼蛋白質(zhì)的核酸分子中的“突變”是與野生型序列相比，例如通過(guò)一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入來(lái)改變一個(gè)或多個(gè)核苷酸?！包c(diǎn)突變”是單個(gè)核苷酸的取代，或單個(gè)核苷酸的插入或缺失?！盁o(wú)義”突變是編碼蛋白質(zhì)的核酸序列中的(點(diǎn))突變，密碼子由此變?yōu)榻K止密碼子。這產(chǎn)生存在于mRNA中和截短蛋白質(zhì)中的過(guò)早終止密碼子(premature stop codon)。 截短蛋白質(zhì)可以具有減少的功能或功能的喪失。“錯(cuò)義”突變是編碼蛋白質(zhì)的核酸序列中的(點(diǎn))突變，密碼子由此改變?yōu)榫幋a不同的氨基酸。產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以具有減少的功能或功能的喪失?！凹艚游稽c(diǎn)”突變是編碼蛋白質(zhì)的核酸序列中的突變，前mRNA的RNA剪接由此改變，產(chǎn)生與野生型相比具有不同核苷酸序列的mRNA和具有不同氨基酸序列的蛋白質(zhì)。產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以具有減少的功能或功能的喪失?！耙拼a”突變是編碼蛋白質(zhì)的核酸序列中的突變，mRNA的閱讀框由此改變，產(chǎn)生不同的氨基酸序列。產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以具有減少的功能或功能的喪失。調(diào)節(jié)序列中，例如基因的啟動(dòng)子中的突變是與野生型序列相比，例如通過(guò)一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入來(lái)改變一個(gè)或多個(gè)核苷酸，導(dǎo)致例如產(chǎn)生減少的基因的 mRNA轉(zhuǎn)錄物或不產(chǎn)生基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物?！俺聊敝赶抡{(diào)或完全抑制靶基因或基因家族的基因表達(dá)?；虺聊椒ㄖ械摹鞍谢颉笔腔蚧蚧蚣易?或基因的一個(gè)或多個(gè)具體等位基因)，其內(nèi)源基因表達(dá)在嵌合沉默基因(或“嵌合RNAi基因”)表達(dá)和例如產(chǎn)生沉默RNA 轉(zhuǎn)錄物(例如能夠沉默內(nèi)源靶基因表達(dá)的dsRNA或發(fā)夾RNA)時(shí)下調(diào)或完全抑制(沉默)。 在誘變方法中，靶基因是待突變，以導(dǎo)致基因表達(dá)的改變(減少或喪失)或所編碼的蛋白質(zhì)的功能的改變(減少或喪失)的內(nèi)源基因。一般通過(guò)將啟動(dòng)子與雙鏈DNA分子有效連接來(lái)產(chǎn)生“有義” RNA轉(zhuǎn)錄物，其中該DNA 分子的有義鏈(編碼鏈)為5’至3’取向，使得轉(zhuǎn)錄時(shí)轉(zhuǎn)錄出與有義DNA鏈具有相同的核苷酸序列(除RNA中通過(guò)U取代T外)的有義RNA。一般通過(guò)將啟動(dòng)子與有義DNA的互補(bǔ)鏈(反義鏈)有效連接，使得轉(zhuǎn)錄時(shí)轉(zhuǎn)錄出反義RNA來(lái)產(chǎn)生“反義” RNA轉(zhuǎn)錄物?！稗D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列”在本文中定義為能夠調(diào)節(jié)與該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列有效連接的(編碼) 序列的轉(zhuǎn)錄速率的核酸序列。因此，本文中定義的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列將包含起始轉(zhuǎn)錄(啟動(dòng)子元件)、維持和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄所必需的所有序列元件，其包括例如弱化子或增強(qiáng)子。雖然大多數(shù)情況下指編碼序列的上游(5’)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，但此定義還涵蓋見(jiàn)于編碼序列下游(3’)的調(diào)節(jié)序列。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”指核酸片段，其發(fā)揮作用來(lái)控制一個(gè)或多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄，就基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄方向而言定位在上游，且通過(guò)依賴于DNA的RNA聚合酶的結(jié)合部位、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和任意其他DNA序列的存在在結(jié)構(gòu)上鑒定，該任意其他DNA序列包括但不限于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位、阻抑蛋白和激活蛋白結(jié)合部位，及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的直接或間接發(fā)揮作用來(lái)調(diào)節(jié)來(lái)自該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄量的任意其他核苷酸序列?！敖M成型”啟動(dòng)子是在大多數(shù)生理和發(fā)育條件下在大多數(shù)組織中具有活性的啟動(dòng)子?！罢T導(dǎo)型”啟動(dòng)子是在生理上(例如通過(guò)外部應(yīng)用某些化合物)或發(fā)育上受調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子?！敖M織特異性”啟動(dòng)子是僅在特定類型的組織或細(xì)胞中具有活性的啟動(dòng)子。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“有效連接”指多核苷酸元件處于功能關(guān)系中的連接。在將它置于與另一核酸序列的功能關(guān)系中時(shí)，核酸“有效連接”。例如，如果啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與該編碼序列有效連接。有效連接意指所連接的DNA序列通常相鄰，且在必需連接兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)時(shí)相鄰且處于閱讀框中，以產(chǎn)生“嵌合蛋白質(zhì)”?！扒逗系鞍踪|(zhì)”或“雜合蛋白質(zhì)”是由多種蛋白質(zhì)“結(jié)構(gòu)域”(或基序)組成的蛋白質(zhì)，在自然界中未發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域這樣連接，但其連接形成功能蛋白質(zhì)，該功能蛋白質(zhì)顯示所連接的結(jié)構(gòu)域的功能性。嵌合蛋白質(zhì)還可以是存在于自然界中的兩種或多種蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)域”意指具有特定結(jié)構(gòu)或功能的蛋白質(zhì)的任意一個(gè)或多個(gè)部分或一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域，其可以轉(zhuǎn)移至另一蛋白質(zhì)，以提供至少具有該結(jié)構(gòu)域的功能特征的新的雜合蛋白質(zhì)。還可以用特定結(jié)構(gòu)域來(lái)鑒定隸屬于蛋白質(zhì)S1PP2C1組的蛋白質(zhì)成員，如來(lái)自其他植物物種的S1PP2C1直向同源物。見(jiàn)于S1PP2C1蛋白質(zhì)中的結(jié)構(gòu)域的實(shí)例是包含在SEQ ID NO: 2的約氨基酸84-391內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶2C (PP2C或PP2C樣) 催化結(jié)構(gòu)域或S1PP2C蛋白質(zhì)的N端區(qū)域(SEQ ID No 2的氨基酸1_83)。術(shù)語(yǔ)“引導(dǎo)肽(target peptide) ”指將蛋白質(zhì)靶向至胞內(nèi)細(xì)胞器，如質(zhì)體，優(yōu)選葉綠體、線粒體，或靶向至胞外間隙(分泌信號(hào)肽)的氨基酸序列。可以將編碼引導(dǎo)肽的核酸序列融合(框內(nèi))至編碼蛋白質(zhì)氨基末端(N末端)的核酸序列。“核酸構(gòu)建體”或“載體”在本文中理解為意指源自重組DNA技術(shù)的使用，并用于將外源DNA遞送入宿主細(xì)胞的人工核酸分子。載體主鏈可以是例如本領(lǐng)域已知且描述于本文中其他地方的二元或超二元載體(見(jiàn)例如US5591616、US2002138879和W0950672》、共整合載體或T-DNA載體，其中整合入嵌合基因，或者如果其中已存在適宜的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，則僅將希望的核酸序列(例如編碼序列、反義序列或反相重復(fù)序列)整合在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列下游。載體通常包含其他遺傳元件來(lái)便于它們?cè)诜肿涌寺≈械氖褂?，如例如選擇標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)等(見(jiàn)下文)?！八拗骷?xì)胞”或“重組宿主細(xì)胞”或“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”是指由于已將至少一個(gè)核酸分子引入該細(xì)胞中而產(chǎn)生的新的個(gè)體細(xì)胞的術(shù)語(yǔ)，該核酸分子尤其包含編碼希望的蛋白質(zhì)的嵌合基因或轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生用于沉默靶基因/基因家族的反義RNA或反向重復(fù)RNA(或發(fā)夾RNA)的核酸序列。宿主細(xì)胞優(yōu)選是植物細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以作為染色體外(附加型) 復(fù)制分子包含核酸構(gòu)建體，或者更優(yōu)選地，包含整合入宿主細(xì)胞的核基因組或質(zhì)體基因組中的嵌合基因。術(shù)語(yǔ)“選擇標(biāo)記”是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的術(shù)語(yǔ)，在本文中用來(lái)描述任意遺傳實(shí)體，其在表達(dá)時(shí)可以用來(lái)選擇包含該選擇標(biāo)記的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。選擇標(biāo)記基因產(chǎn)物賦予例如抗生素抗性，或者更優(yōu)選地，除草劑抗性或另一可選擇的性狀，如表型性狀(例如色素形成的變化)或營(yíng)養(yǎng)需要。術(shù)語(yǔ)“報(bào)道基因”主要用來(lái)指可見(jiàn)標(biāo)記，如綠色熒光蛋白 (GFP)、eGFP、熒光素酶、GUS 等。術(shù)語(yǔ)基因或蛋白質(zhì)的“直向同源物”在本文中指見(jiàn)于另一物種中的同源基因或蛋白質(zhì)，其具有與該基因或蛋白質(zhì)相同的功能，但序列(通常)從具有該基因的物種趨異的時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始趨異(即通過(guò)物種形成進(jìn)化自共同祖先的基因)。因此，可以基于序列比較(例如基于整個(gè)序列內(nèi)和/或特定結(jié)構(gòu)域內(nèi)的百分比序列同一性)和/或功能分析二者，在其他植物物種中鑒定番茄S1PP2C1基因的直向同源物。術(shù)語(yǔ)“同源的”和“異源的”指核酸或氨基酸序列與它的宿主細(xì)胞或生物之間的關(guān)系，尤其是在轉(zhuǎn)基因生物的背景中。因此，同源序列天然見(jiàn)于宿主物種中(例如用番茄基因轉(zhuǎn)化的番茄植物)，而異源序列并非天然見(jiàn)于宿主細(xì)胞中(例如用來(lái)自馬鈴薯植物的序列轉(zhuǎn)化的番茄植物)。取決于背景，術(shù)語(yǔ)“同系物”或“同源物”還可以指?jìng)鞒凶怨餐嫦刃蛄械男蛄?例如它們可以是直向同源物)?？梢杂谩皣?yán)格雜交條件”來(lái)鑒定與給定的核苷酸序列基本上同一的核苷酸序列。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，且在不同環(huán)境中將不同。一般而言，選擇嚴(yán)格條件為比具體序列在確定的離子強(qiáng)度和PH下的熱解鏈溫度(thermal melting point, Tm)低約5°C。Tm是(在確定的離子強(qiáng)度和PH下)50%的靶序列雜交至完全配對(duì)的探針的溫度。通常將選擇這樣的嚴(yán)格條件，其中PH 7下的鹽濃度為約0.02摩爾，溫度為至少60°C。降低鹽濃度和/或增加
8溫度可提高嚴(yán)格性。用于RNA-DNA雜交(使用例如IOOnt的探針的Northern印跡)的嚴(yán)格條件是例如包括在63°C下在0. 2XSSC中進(jìn)行20分鐘的至少一次洗滌的那些，或等同的條件。用于DNA-DNA雜交(使用例如IOOnt的探針的Southern印跡)的嚴(yán)格條件是例如包括在至少50°C、通常約55°C的溫度下在0. 2 X SSC中進(jìn)行20分鐘的至少一次洗滌(通常為兩次)的那些,或等同的條件。還見(jiàn)Sambrook等(1989) ；Sambrook和Russell (2001)。可以通過(guò)用總體或局部對(duì)比算法比對(duì)兩個(gè)肽序列或兩個(gè)核苷酸序列來(lái)測(cè)定“序列同一性”和“序列相似性”。然后可以在序列(在通過(guò)例如程序GAP或BESTFIT或Emboss 程序“Needle”(使用默認(rèn)參數(shù)，見(jiàn)下文)最佳比對(duì)時(shí))具有至少某最小百分比的序列同一性(如下文進(jìn)一步定義)時(shí)將它們稱為“基本上同一”或“基本上相似”。這些程序用 Needleman和^msch總體對(duì)比算法來(lái)在它們的全長(zhǎng)內(nèi)比對(duì)兩個(gè)序列，最大化匹配數(shù)，而最小化缺口數(shù)。一般而言，使用默認(rèn)參數(shù)，缺口產(chǎn)生罰分=10，缺口延伸罰分=0.5(對(duì)核苷酸和蛋白質(zhì)比對(duì)二者而言)。對(duì)于核苷酸，所使用的默認(rèn)評(píng)分矩陣是nwsgapdna，對(duì)于蛋白質(zhì)， 默認(rèn)評(píng)分矩陣是 Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89,915-919) 例如可以用計(jì)算機(jī)程序，如可從 Accelrys Inc.，9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752USA 或 EMBOSS(http://www. ebi. ac. uk/Tools/webservices/services/emboss)獲得的 GCG Wisconsin Package, Version 10. 3來(lái)測(cè)定用于百分比序列同一性的序列比對(duì)和得分。備選地，可以通過(guò)針對(duì)諸如FASTA、BLAST等的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索來(lái)測(cè)定百分比相似性或同一性，但應(yīng)返回命中序列并比對(duì)配對(duì)來(lái)比較序列同一性。在此文件中及其權(quán)利要求中，以它的非限制性含義用動(dòng)詞“包含”及其詞形變化來(lái)指包括該詞后的項(xiàng)目，但不排除未明確提到的項(xiàng)目。此外，除非上下文清楚地要求有且僅有元件中的一個(gè)，通過(guò)不定冠詞“一”或“一個(gè)”提到元件不排除存在一個(gè)以上元件的可能性。 因此，不定冠詞“一”或“一個(gè)”通常意指“至少一個(gè)”。還應(yīng)理解，在本文中提到“序列”時(shí)， 一般提到具有某亞單位(例如氨基酸)序列的實(shí)際的物理分子。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“植物”包括整株植物或其任意部分或衍生物，如植物器官(例如收獲或不收獲的貯藏器官、鱗莖、塊莖、果實(shí)、葉等)、植物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、可從其再生整株植物的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物細(xì)胞團(tuán)塊和植物中完整的植物細(xì)胞，或植物的部分，如胚、花粉、胚珠、果實(shí)(例如收獲的組織或器官，如收獲的番茄等)、塊莖(例如馬鈴薯)、花、葉、種子、塊莖、鱗莖、通過(guò)克隆繁殖的植物、根、根狀莖、莖、根尖等。 還包括任意發(fā)育階段，如幼苗、未成熟和成熟等。“植物變種”是已知的最低等級(jí)的同一植物分類群內(nèi)的一組植物，其(不考慮承認(rèn)植物育種者的權(quán)利的條件是否得到滿足)可以根據(jù)源自某種基因型或基因型組合的特征的表達(dá)來(lái)定義，可以通過(guò)那些特征中的至少一種的表達(dá)來(lái)與任意其他組的植物區(qū)分，且可以視為實(shí)體，因?yàn)樗梢詿o(wú)任何改變地繁殖。因此，如果它們?nèi)急碚鳛榇嬖?個(gè)基因座或基因(或由此單基因座或基因引起的一系列表型特征)，但就其他基因座或基因而言可以在其他方面彼此非常不同，則即使它們屬于同一類型，也不可用術(shù)語(yǔ)“植物變種”來(lái)指該組植物。"FU F2等”指兩種親本植物或親本品系間雜交后的連續(xù)相關(guān)世代。從兩種植物或品系雜交產(chǎn)生的種子長(zhǎng)出的植物稱為Fl代。Fl植物自交產(chǎn)生F2代等?！癋1雜種”植物 (或Fl種子)是從兩個(gè)近交親本品系雜交獲得的世代?！癕l群體”是某個(gè)植物品系或栽培種的多個(gè)誘變種子/植物?！癕1、M2、M3、M4等”指第一誘變種子/植物(Ml)自交后獲得的連續(xù)世代。術(shù)語(yǔ)“一個(gè)或多個(gè)等位基因”意指具體基因座上的基因的一種或多種備選形式中的任一種，該等位基因全都涉及具體基因座上的一種性狀或特征。在生物的二倍體細(xì)胞中， 給定基因的等位基因定位在染色體上的具體位置或基因座。同源染色體對(duì)的每條染色體上存在一個(gè)等位基因。二倍體植物物種可以在具體基因座上包含許多不同的等位基因。這些可以是基因的同一等位基因(純合)或兩個(gè)不同的等位基因(雜合)。術(shù)語(yǔ)“基因座”意指在染色體上發(fā)現(xiàn)例如基因或遺傳標(biāo)記的具體的一個(gè)或多個(gè)位置或部位。因此，S1PP2C1基因座是在基因組中發(fā)現(xiàn)S1PP2C1基因的位置。“野生型等位基因”(WT)在本文中指編碼功能蛋白質(zhì)(野生型蛋白質(zhì))的基因的形式。野生型S1PP2C1等位基因例如顯示于SEQ ID N0:1中?！巴蛔凅w等位基因”在本文中指與野生型等位基因相比在編碼序列(mRNA或cDNA)或基因組序列中包含一個(gè)或多個(gè)突變的等位基因。這種(類)突變(例如一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入、倒位、缺失和/或取代) 可以導(dǎo)致所編碼的蛋白質(zhì)具有減少的體外和/或體內(nèi)功能性(減少的功能)或無(wú)體外和/ 或體內(nèi)功能性(功能喪失)，例如由于蛋白質(zhì)例如截短或具有其中缺失、插入或取代了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列。這類改變可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)具有不同的三維構(gòu)象、靶向至不同的亞細(xì)胞區(qū)室、具有改變的催化結(jié)構(gòu)域、具有改變的底物親和力和/或特異性等。“耐旱性”或“顯著增強(qiáng)的耐旱性”或“耐旱植物”在本文中指與適宜的對(duì)照植物 (例如野生型植物)相比，植物品系、栽培種或變種抵抗水分不足/水分脅迫/干旱的能力 (平均)顯著增強(qiáng)，即與暴露于相同的水分脅迫條件的對(duì)照相比，耐旱植物中與水分脅迫相關(guān)的癥狀(例如葉萎蔫)(統(tǒng)計(jì)上)顯著減少，和/或與對(duì)照植物，如野生型植物相比，暴露于水分不足/水分脅迫/干旱條件后植物的(平均)恢復(fù)率和/或存活率和/或可收獲產(chǎn)率顯著增加。如將在本文中其他地方解釋，存在多種用于測(cè)定植物是否耐旱的方法。優(yōu)選地，耐旱植物在所有發(fā)育階段期間，但至少在以下發(fā)育階段之一期間具有顯著增強(qiáng)的耐旱性作為成熟植物，開(kāi)花期間或開(kāi)花期、果實(shí)形成和果實(shí)發(fā)育期間、種子發(fā)育期間、果實(shí)成熟期間。優(yōu)選地，此外，植物還至少在種子階段和/或幼苗階段和/或從幼苗階段至(且包括)成熟植物期間具有耐旱性。“野生型植物”在本文中指包含編碼功能蛋白質(zhì)的野生型(WT)S1PP2C1等位基因的植物(例如與包含突變體S1PP2C1等位基因的“突變體植物”相反)。這類植物是在表型測(cè)定中適宜的對(duì)照。優(yōu)選地，野生型和/或突變體植物是“栽培植物”，即由人類栽培且具有良好農(nóng)學(xué)特征的物種的變種、育種品系或栽培種；優(yōu)選地，這類植物不是“野生植物”，即一般具有比栽培植物差的產(chǎn)率和比栽培植物差的農(nóng)學(xué)特征，且例如天然生長(zhǎng)在野生群體中的植物?！耙吧参铩卑ɡ缥锓N的生態(tài)型、PI (植物引種)品系、當(dāng)?shù)仄贩N或野生品種(wild accession)或野生親緣品種，或者所謂的祖?zhèn)髯兎N(heirloom varieties)或栽培種，即在人類歷史的較早時(shí)期普遍種植，但不用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中的變種或栽培種?！案珊怠眱?yōu)選指短期水分不足或脅迫(人工的，例如無(wú)土壤灌溉，和/或自然的，例如無(wú)降雨)和/或長(zhǎng)期水分不足或脅迫(人工的，例如無(wú)土壤灌溉，和/或自然的，例如無(wú)降雨)二者，短期水分不足或脅迫例如等于或少于30天、20天、15天、14天、10天、9、8、7、 6、5天或更少天數(shù)，長(zhǎng)期水分不足或脅迫例如等于或多于31天、35天、40天、45天、50天、60天、70天、80天、90天或更多天數(shù)。S1PP2C1基因或蛋白質(zhì)的“變體”包含見(jiàn)于物種番茄中的天然等位基因變體，以及見(jiàn)于其他植物物種，如其他雙子葉植物物種或單子葉植物物種中的直向同源物二者。發(fā)明詳述本發(fā)明人通過(guò)進(jìn)行授粉的子房和GA3(赤霉酸)處理的子房的轉(zhuǎn)錄物組分析(cDNA-AFLP)來(lái)研究在番茄果實(shí)形成期間差異表達(dá)的基因(Vriezen等2008，New Phytologist 177 :60-76)。通過(guò)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)一步表征了與ABA(脫落酸)水平(未授粉的子房中高，授粉后低)相關(guān)的一個(gè)基因(其在未授粉的子房中相對(duì)高表達(dá)，在授粉的子房中表達(dá)較少)，以研究此基因在ABA信號(hào)發(fā)放中的作用。將該番茄基因命名為S1PP2C1 (番茄PP2C1)，因?yàn)樗幋a397個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在約氨基酸84至391之間的C端區(qū)域中包含絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶2C催化結(jié)構(gòu)域(如通過(guò)hterPrc^can測(cè)定)。發(fā)現(xiàn)S1PP2C1涉及ABA信號(hào)發(fā)放，且在CaMV 35S啟動(dòng)子的控制下過(guò)量表達(dá)此基因產(chǎn)生比野生型植物對(duì)植物激素ABA更不敏感的植物，而共抑制此基因(至少在葉組織中具有顯著低于野生型植物的S1PP2C1轉(zhuǎn)錄物水平)的植物具有更高的ABA敏感性(見(jiàn)實(shí)施例)。因此，降低的(野生型)S1PP2C1蛋白質(zhì)水平增強(qiáng)了 ABA敏感性，意味著S1PP2C1蛋白質(zhì)是ABA信號(hào)發(fā)放的負(fù)調(diào)節(jié)物。令人驚奇地，還發(fā)現(xiàn)，與野生型植物相比，S1PP2C1轉(zhuǎn)錄物水平顯著降低的番茄植物在9天的水剝奪后絲毫未顯示萎蔫，而野生型植物具有萎蔫葉，且過(guò)量表達(dá)S1PP2C1的植物顯示嚴(yán)重的萎蔫跡象。這甚至更令人驚奇，因?yàn)镾1PP2C1基因和S1PP2C1蛋白質(zhì)與已顯示在擬南芥屬的耐旱性中發(fā)揮作用的任意已知的ABA負(fù)調(diào)節(jié)物，如ABIl和HAB1，或與A組的蛋白質(zhì)(見(jiàn)下文表1)中的任一種都不具有任何顯著的序列同一性。表1-涉及ABA信號(hào)發(fā)放的擬南芥屬蛋白質(zhì)(假定的)(khweigerhofer等2004， 上文，見(jiàn)其中的

圖1，A組)與S1PP2C1蛋白質(zhì)之間的序列同一性
權(quán)利要求
1.非轉(zhuǎn)基因植物，其基因組中包含S1PP2C1等位基因，S1PP2C1等位基因由此是編碼包含與SEQ ID NO :2至少60%氨基酸序列同一性的蛋白質(zhì)的等位基因，其特征在于所述 S1PP2C1等位基因在其核苷酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)突變，且由此由于所述一個(gè)或多個(gè)突變，在其基因組中包含所述突變體等位基因的植物與在其基因組中包含野生型S1PP2C1等位基因的植物相比，具有顯著增強(qiáng)的耐旱性。
2.權(quán)利要求1的植物，其特征在于所述一個(gè)或多個(gè)突變賦予所編碼的S1PP2C1蛋白質(zhì)功能喪失或功能降低。
3.權(quán)利要求1或2的植物，其中所述突變體S1PP2C1等位基因以純合形式存在。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的植物，其中所述植物屬于茄科、屬于茄屬、或?qū)儆诜盐锓N。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的植物，其中將植物暴露于相同的干旱脅迫時(shí)，與在其基因組中包含野生型S1PP2C1等位基因的植物的葉萎蔫癥狀相比，所述植物的葉萎蔫癥狀減少至少10%。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的植物，其中所述植物是雜種植物。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的植物的果實(shí)或種子或部分。
8.編碼S1PP2C1蛋白質(zhì)的核酸序列在產(chǎn)生具有增強(qiáng)的耐旱性的轉(zhuǎn)基因植物或非轉(zhuǎn)基因植物中的用途，其特征在于所述S1PP2C1蛋白質(zhì)包含與SEQ ID NO 2至少60%氨基酸序列同一性。
9.轉(zhuǎn)基因植物，其包含整合入其基因組中的嵌合基因，其中所述嵌合基因包含與核酸序列有效連接的在植物細(xì)胞中具有活性的啟動(dòng)子，所述核酸序列包含轉(zhuǎn)錄時(shí)沉默內(nèi)源 S1PP2C1基因表達(dá)的S1PP2C1基因的有義和/或反義序列，且其中所述植物與缺乏所述嵌合基因的植物相比包含顯著增強(qiáng)的耐旱性。
10.權(quán)利要求9的植物，其中所述內(nèi)源S1PP2C1基因編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含與SEQ ID NO 2至少60%氨基酸序列同一性。
11.權(quán)利要求8或9的植物，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列選自組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、 組織特異性啟動(dòng)子和發(fā)育調(diào)節(jié)啟動(dòng)子。
12.權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)的植物，其中所述植物選自以下屬茄屬、香瓜屬 (Cucumis)、西瓜屬(Citrullus)、萵苣屬(Lactuca)、胡蘿卜屬(Daucus)、蔥屬(Allium)、辣椒屬、玉蜀黍?qū)?、稻屬、小麥屬、大麥?Hordeum)、蕓苔屬、大豆屬、菜豆屬(Phaseolus)、燕麥屬(Avena)、高粱屬(Sorghum)、棉屬、楊屬、櫟屬、柳屬。
13.權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)的植物的種子或果實(shí)或部分，其包含所述嵌合基因。
14.嵌合基因，其包含在植物細(xì)胞中具有活性的組織特異性、誘導(dǎo)型或發(fā)育調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子與核酸序列有效連接，所述核酸序列包含轉(zhuǎn)錄時(shí)沉默內(nèi)源S1PP2C1基因的 S1PP2C1基因的有義和/或反義片段，其特征在于所述內(nèi)源S1PP2C1基因包含與SEQ ID NO 1至少60%序列同一性。
15.非轉(zhuǎn)基因耐旱番茄植物或其種子、后代或番茄果實(shí)，所述植物可通過(guò)TILLING獲得，在其基因組中包含突變體S1PP2C1等位基因，其特征在于所述突變體等位基因編碼與野生型S1PP2C1蛋白質(zhì)相比具有功能降低或功能喪失的S1PP2C1蛋白質(zhì)。
16.權(quán)利要求15的植物，其中所述S1PP2C1蛋白質(zhì)在Glyl48、Serl71、Alal55或Glyl32上包含氨基酸取代。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有新表型的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植物領(lǐng)域。本發(fā)明所提供的是番茄絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2C(SlPP2C1)蛋白質(zhì)和編碼其的核酸序列，其用于賦予植物新表型，尤其是耐旱性。
文檔編號(hào)C12N15/55GK102459615SQ201080034905
公開(kāi)日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月8日
發(fā)明者L·尼奇, W·H·弗里森 申請(qǐng)人:紐海姆有限公司