專利名稱：一種中華蜜蜂頭部表達序列基因芯片及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種中華蜜蜂頭部表達序列基因芯片 及其用途。
背景技術(shù)：
生物基因組中可轉(zhuǎn)錄表達的序列(即基因)僅占總序列的3-5% ，對這部 分序列進行測定，將直接導(dǎo)致新基因的發(fā)現(xiàn)，并獲取基因組中與產(chǎn)業(yè)化關(guān)系最 為密切的信息。20世紀80年代，高通量的自動測序的出現(xiàn)，使從質(zhì)?；パa脫 氧核糖核酸(Complement DNA，簡稱cDNA)文庫隨機選取許多cDNA克 隆和決定來自非載體兩端的幾百個堿基的DNA序列成為可能。這些短的DNA 序列叫作"表達序列標簽"(Expressed Sequence Tags,簡稱ESTs)。 1992年 Sikela和Matsubara ( Sikela , et al . Nucleic Acids Res . 19 , 1837- 1843 ; Matsubara , et al . Alature Genetics ， 2 ， 173-179)針對獲得大量信使核糖核酸 (mRNA)序列的迫切需要，提出大規(guī)?；パa脫氧核糖核酸(cDNA)測序的研 究戰(zhàn)略。其基本特征就是從以質(zhì)粒為載體，構(gòu)建完成的目的組織互補脫氧核糖 核酸(Complementary DNA，簡稱cDNA )文庫中，隨機選擇許多cDNA克 隆，利用質(zhì)粒上攜帶的通用引物對cDNA兩端進行一輪脫氧核糖核酸序列測 定，所獲得的來自3'端或5'端的幾百個堿基的非載體短脫氧核糖核酸(DNA) 序列。簡而言之，表達序列標簽是來自表達基因片段3'端或5'端的短脫氧核 糖核酸序列，代表一個表達基因的部分轉(zhuǎn)錄片段。
隨著生物技術(shù)的發(fā)展和生命科學(xué)發(fā)展的需要以及表達序列標簽固有的特 點，1995年10月Patrick Brown和他的同事[Bio Teclmiques ， 19 ( 1995), 442- 47] 提出了 cDNA微陣列技術(shù)，M Schena ( Science 1995 ; 270 ( 5235 ), 467-470 ) 和D . Shalon ( Genoe Research 1996 ; 6 (7) ， 639 - 645)等首次制造了 cDNA陣 列，隨后這項技術(shù)得到了飛速的發(fā)展?；蛐酒?Biochips)的實質(zhì)就是在面積 不大的基片上有序地點陣排列了一系列固定于一定位置地可尋址的生物識別分 子，它是綜合微電子學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)及生物學(xué)等高新技術(shù)，把大量基因探針或 基因片斷按特定排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或尼龍膜等載體上，形成的
3致密、有序的DNA分子點陣。
根據(jù)基因芯片所用探針的不同可分為寡核苷酸芯片和cDNA芯片。寡核苷 酸芯片所用探針采用原位合成方法人工合成，所有序列長度通常為20個堿基。 cDNA芯片所用探針為cDNA，通常以cDNA克隆為模板，采用PCR擴增，序 列長度不一致。基因芯片技術(shù)主要包括三個基本環(huán)節(jié)(1)芯片制備采用表 面經(jīng)過化學(xué)處理的固相載體如玻片或硅片作為芯片片基，將DNA片段按特定順 序排列在片基上；(2)樣品制備與雜交即將樣品作特定生物處理，獲取其中 的DNA或RNA信息分子并加以標記，然后選擇合適的反應(yīng)條件，使樣品分子 與靶標分子產(chǎn)生雜交反應(yīng)。(3)芯片的檢測與分析即將芯片置入芯片掃描儀 中，通過采集各反應(yīng)點的熒光強弱和熒光位置，經(jīng)軟件分析獲得相關(guān)生物信息。 因DNA芯片因具有強有力性、靈活性、敏感性和相對簡單等特點而可應(yīng)用在許 多領(lǐng)域，如DNA序列測定、基因多態(tài)性檢測、新基因的發(fā)現(xiàn)、疫苗和藥物 研究?；蛐酒夹g(shù)的出現(xiàn)，使綜合、系統(tǒng)分析某些生命現(xiàn)象成為可能，為生命 科學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究提供了一個強有力的工具。隨著人類和多種模式生物 全基因組測序的完成和公開，目前根據(jù)人類和模式生物基因組信息設(shè)計的基因 芯片已大規(guī)模商業(yè)化開發(fā)應(yīng)用，在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和其它各生命科學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用(李 瑤，裘敏燕，劉三震，等.基因芯片與功能基因組。北京化學(xué)工業(yè)出版社，2004， 153-154; Chen JJ， WuR， YangPC， etal。 Genomics, 1998， 51 (3): 313-324)。
蜜蜂是不僅具有重要的經(jīng)濟和生態(tài)價值，同時作為一種行為非常復(fù)雜的模 式生物，在生命科學(xué)領(lǐng)域有著十分重要的學(xué)術(shù)價值，為此美國于2003年初啟動 了西方蜜蜂(々& we〃喬ra)基因組測序工作。在2006年10月26日出版的《自 然》雜志上，美國蜜蜂基因測序聯(lián)盟(HGSC)首次公布了測序和分析結(jié)果，它 標志著蜂學(xué)研究進入了一個全新階段。與此同時，由美國科學(xué)院院士、伊利諾 斯大學(xué)Robinson教授等研制的西方蜜蜂腦cDNA芯片和全基因組寡核苷酸芯片 相繼問世(RobinsonGE， Ben-Shahar Y. Brain and Behavior, 2002， 1: 197-203; WhitfieidCW， BandMR， BonaldoMF， et al。 Genom Research, 2002， 12: 555-566; Honey Bee Oligonucleotide Microarray (http:〃www.beespace.UIUG.edu/ BeeArray)，并通過應(yīng)用于實驗研究，破解了不同日齡工蜂職能分化的分子機理 (Whitfield CW， CzikoAM， Robinson GE。 Science, 2003， 302: 296-299)，目前 其基因組寡核苷酸芯片已實現(xiàn)商品化。該高通量、集成化和自動化蜜蜂芯片的 開發(fā)和應(yīng)用，提供了以基因群體模式對生物學(xué)性狀的基因水平分析，闡明分子 作用機理的強有力工具，對加快養(yǎng)蜂業(yè)品種的優(yōu)育和優(yōu)選，尋找新基因、疾病 診斷、藥物篩選均具有重要價值。中華蜜蜂U. ceranacera"a，中蜂)是原產(chǎn)于我國的蜜蜂種質(zhì)資源，在我國 已有3000年以上的人工養(yǎng)殖歷史，由于其長期適應(yīng)我國的地理環(huán)境和氣候條件， 形成了很強的抗逆性和抗病性，特別是具有很強的抗大蜂螨特性，且是可遺傳 的。而大蜂螨(狄氏瓦螨&m^血Wn/"or)對西方蜜蜂是毀滅性的病害。因此， 中蜂具有西方蜜蜂不可替代的種質(zhì)特性和資源優(yōu)勢，迄今仍是我國西北地區(qū)和
各地偏遠山區(qū)的當(dāng)家蜂種，對農(nóng)村經(jīng)濟的發(fā)展依然具有重要價值；同時作為重 要的傳粉昆蟲，中蜂一直是我國自然生態(tài)體系的一個重要生物鏈環(huán)節(jié)，對保護 植物多樣性具有不可替代的重要作用(陳盛祿.中國蜜蜂學(xué)。北京中國農(nóng)業(yè)出 版社)。但目前對中蜂基因芯片的研究尚屬空白。開發(fā)具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的 中蜂基因芯片可為高通量篩選和挖掘蜜蜂功能基因提供有效方法，對我國特有 的蜜蜂種質(zhì)資源和生物多樣性的保護和利用，蜂產(chǎn)品質(zhì)量的提高均具有重要價 值。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種中華蜜蜂頭部表達序列基 因芯片及其用途。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的 一種中華蜜蜂頭部表達序列
基因芯片，它主要由載體和結(jié)合在載體上的SEQIDNO.l SEQIDNO. 718所
示序列、及它們的同源序列和互補序列的核酸分子組成。
一種上述的中華蜜蜂頭部表達序列基因芯片在生物功能的研究和檢測方面 的應(yīng)用。
進一步地，所說的生物包括動物、動物細胞、動物組織器官及系統(tǒng)。所說 的生物功能的研究包括藥物、動物的抗逆性、育種和新品種的產(chǎn)生、雜種優(yōu)勢 的早期預(yù)測、動物生長和發(fā)育的機理和藥物的毒理學(xué)；所說的生物功能的檢測 包括轉(zhuǎn)基因動物的安全性檢測、食物成分的功能性評估、病原體的檢測和診斷、 物種的鑒定。
本發(fā)明的有益效果是
1.用獲得的新的EST制成EST芯片具有許多商用價值和科研價值(1) 應(yīng)用該EST芯片可用于克隆動物的重要生產(chǎn)性狀的基因，如抗蟲、抗病害和抗 低溫等基因的克隆。(2)應(yīng)用該基因芯片也可用于對蜜蜂的雜種優(yōu)勢進行早期 預(yù)測，篩選出最佳的優(yōu)勢雜交種。(3)應(yīng)用該基因芯片也能用于對轉(zhuǎn)基因蜜蜂 及其產(chǎn)品進行商品檢驗，以檢驗可食轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性。(4)應(yīng)用該基因芯片還可用于査找藥物的毒性和副作用，進行毒理學(xué)研究，利于對新型農(nóng)藥的篩 選。(5)該基因芯片可用于動物育種和新品種的產(chǎn)生。(6)該基因芯片還可用
于從整體上研究整個信使核糖核酸(mRNA)的表達，這對生物體基因調(diào)節(jié)的整 體性研究具有重要的科研和實踐指導(dǎo)價值。(7)應(yīng)用該基因芯片還可以運用突 變體研究植物中胞間和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，為發(fā)現(xiàn)動物中的基因功能和生理代謝途 徑提供重要的理論依據(jù)。(8)該基因芯片能夠作為一種商品，廣泛應(yīng)用于生命 科學(xué)，農(nóng)業(yè)行業(yè)以及實際生產(chǎn)中。
2. 可以利用這些新的表達序列標簽繪制基因圖譜。如果一個EST在基因組 中只出現(xiàn)一次，那么它可以做為序列標簽位點(STS)。由EST構(gòu)建的物理圖譜 叫表達圖或轉(zhuǎn)錄圖。利用EST進行基因圖制作，可以加快序列標簽位點的制作 和新基因的染色體定位。
3. EST序列可以作為基因特異性探針，對組織特異性基因表達的研究具有
重要的作用。
4. 這些新的EST豐富了表達序列標簽數(shù)據(jù)庫，并可以最大限度地利用公開 的表達序列標簽數(shù)據(jù)庫信息，大大縮短克隆新的全長互補脫氧核糖核酸的周期 并可減少克隆的成本，加快蜜蜂的生物信息積累較薄弱的基因克隆進度。
5. EST還可進行新基因的遺傳迸化關(guān)系分析。EST可以對所有動物的基因 作為一種標簽庫，通過不同的序列比較可以獲得保守序列片段，從而獲得基因 的遺傳進化圖譜。
除了以上5點外，本發(fā)明在蜂學(xué)領(lǐng)域的主要技術(shù)效果還有
1. 可廣泛應(yīng)用于中蜂及同屬蜜蜂相關(guān)基因的表達分析、種質(zhì)鑒定和功能基 因挖掘。
2. 可應(yīng)用于蜜蜂抗蜂螨、抗胡蜂和抗微生物疾病品種的篩選及功能基因的篩選。
3. 可應(yīng)用于蜂王漿、蜂蜜生產(chǎn)性能的評價。
圖1是中蜂頭部總RNA甲醛變性凝膠電泳檢測圖2是中蜂頭部cDNA瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，其中，A是MA標準分子量， B是cDNA片段；
圖3是中蜂頭部cDNA文庫插入片段的PCR產(chǎn)物電泳圖，其中，M是標準分 子量；圖4是中蜂頭部EST片段PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，其中，M 是標準分子量-，
圖5是中蜂頭部表達序列基因芯片點陣設(shè)計圖，-圖6是中蜂頭部表達序列基因點陣實樣圖7是中蜂頭部表達序列基因芯片與樣本雜交前芯片掃描圖； 圖8是中蜂頭部C表達序列基因芯片與樣本雜交后掃描圖9是中蜂頭部表達序列基因芯片與樣本雜交后掃描數(shù)據(jù)分析散點圖。
具體實施例方式
本發(fā)明分離出的中蜂頭部cDNA表達序列標(EST)具有SEQIDN0.1 SEQ ID NO. 718所示的序列。所說的cDNA序列具有SEQ ID N0.1 SEQ ID NO. 718所示的序列中的一條或數(shù)條的組合。cDNA序列包括SEQIDN0.1 SEQID NO. 718所示的序列中每條序列的互補序列或同源序列。cDNA序列包括SEQ ID NCU SEQ ID NO. 718所示的每條序列中的8 100個連續(xù)核苷酸為探針的 序列或其互補序列。上述序列標簽所組成的基因芯片是在載體上結(jié)合有SEQ ID NO.l SEQIDNO. 718所示的序列、同源序列或其互補序列的核酸分子。載體 為固相載體或液相載體。固相載體為玻片、硅片、尼龍膜、硝酸纖維膜、凝膠。 所說的核酸分子是脫氧核糖核酸、核糖核酸和多聚寡核苷酸。
芯片的具體制備方法和步驟如下
1. cDNA文庫構(gòu)建
用油漆筆標記當(dāng)日羽化的中蜂工蜂，在1、 3、 4、 5、 7、 9、 12、 15、 18、 21、 24、 27和30日齡期進行回捕，-80°。保存。分別從每個日齡工蜂樣品取10 個頭部，加液氮勻漿，加TRIZOL進行總RNA提取。用試劑盒分步純化出mRNA， 合成cDNA第一鏈和第二鏈。然后用末端補平酶將雙鏈cDNA末端補平，加上 五o^I接頭并將其磷酸化，再經(jīng)J^oI酶切處理，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒 定，再用MinElute Gel Extraction試劑盒進行凝膠回收。
將cDNA與載體pBluescriptn SK(+)相連，用電擊反應(yīng)法轉(zhuǎn)化五.co/Z DH10B 感受態(tài)菌，加SOC培養(yǎng)基，37匸搖床復(fù)蘇1 h,取50 fiL菌液涂布含有IPTG/X-gal 的LB培養(yǎng)基，37'C培養(yǎng)過夜。從生長轉(zhuǎn)化菌的平板上隨機挑取若干個菌落，培 養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，采用M13通用引物進行PCR擴增鑒定文庫質(zhì)量。
2. cDNA文庫測序
從文庫挑取單克隆接種在含LB培養(yǎng)基的96孔板，37t:培養(yǎng)18小時左右，提取質(zhì)粒作為模板，用通用引物M13進行PCR擴增，樣品經(jīng)純化后放入
Megabace 1 000中進行測序，得到SEQ ID NO.l ~SEQ ID NO. 718所示的基因序 列。
3. EST功能注釋、芯片用EST篩選與數(shù)據(jù)庫構(gòu)建
利用浙江大學(xué)生物信息服務(wù)平臺服務(wù)器進行EST片段處理和拼接，phmp 軟件作有效性處理.。選出具有獨立功能的Contig、 Siglet序列，用Ontology (GO) 和Blast軟件進行功能注釋。用DNAstar軟件選出與Contig、 Siglet序列相匹配 的EST代表性序列。在此基礎(chǔ)上建立初步的EXCEL芯片EST數(shù)據(jù)庫。
4. EST片段PCR擴增與純化
根據(jù)候選EST序列編號査找出相應(yīng)的文庫，挑取質(zhì)粒，進行濃度測定和稀 釋后作為模板，采用引物M13作PCR擴增、電泳檢測。PCR產(chǎn)物用乙醇沉淀 法進行純化、冷凍干燥，后完加入相應(yīng)體積的50%二甲基亞砜(DMSO)，通過 紫外濃度檢測，使溶解后的PCR產(chǎn)物終濃度為500 1000 ng/^iL。
5. 芯片設(shè)計
將實際得到的718個EST片斷，以及陽性對照、空白對照，進行矩陣分布設(shè) 計，并在初步的EXCEL芯片EST數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，編輯好與芯片矩陣相對應(yīng) 的數(shù)據(jù)庫。芯片矩陣分布的具體要求是每張基因芯片設(shè)置3個相同的雜交矩 陣，區(qū)間距為12.5mm，每個矩陣含40X40個點，分為4個亞矩陣，每個亞矩 陣點樣密度為20列X20行。每個探針重復(fù)點樣2次，點直徑為100nm，點間 足巨200 pm。
6. cDNA芯片點制
將溶解好的PCR產(chǎn)物用Omnigrid接觸式芯片點樣儀進行點樣。點樣完畢后 在400mJ能量下用紫外交聯(lián)儀中進行交聯(lián)、晾干，抽樣進行掃描檢測。
7. 芯片質(zhì)量檢測.
隨機抽取1張基因芯片用GenePix 4100A芯片掃描儀進行掃描檢測點樣的均 勻性與信號差異。
8. 雜交樣品制備和雜交應(yīng)用試驗
分別用Trizol提取處理和對照蜜蜂總RNA，采用Cy3-dCTP和Cy5-dCTP熒光 標記，與芯片進行雜交處理。然后用GenePix4100A芯片掃描儀掃描芯片記錄雜 交信號，標準化處理后，檢測信號的有效性。采用圖片分析軟件GenePixPro5.0 對掃描結(jié)果進行定量分析。對標準化后的數(shù)據(jù)作M (熒光強度比值的對數(shù)值)-A (總熒光強度對數(shù)值)散點圖，評估芯片雜交質(zhì)量，判斷二者的相關(guān)性。
中華蜜蜂頭部表達序列基因芯片用于生物功能的研究和檢測。所說的生物包括動物(昆蟲、蜜蜂)以及它們的細胞、組織器官及其系統(tǒng)；所說的生物功 能的研究包括藥物、動物的抗逆性、育種和新品種的產(chǎn)生、雜種優(yōu)勢的早期預(yù) 測、動物生長和發(fā)育的機理和藥物的毒理學(xué)；所說的生物功能的檢測包括轉(zhuǎn)基 因動物的安全性檢測、食物成分的功能性評估、病原體的檢測和診斷、物種的 鑒定。
本發(fā)明通過采用原產(chǎn)中國的中華蜜蜂工蜂頭部總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后建 立文庫，然后抽提質(zhì)粒，采用通用引物進行表達序列標簽測序，用生物信息軟 件進行EST片段處理和拼接，有效性處理。選出具有獨立功能的Contig、 Siglet 序列，進行功能注釋，選出與Contig、 Siglet序列相匹配的EST代表性序列，進 行PCR擴增和檢測。建立初步的EXCEL芯片EST數(shù)據(jù)庫。將PCR得到的718 個EST片斷，以及陽性對照(已測全序列的一條Mrjp-l前體DNA)、空白對照， 進行矩陣分布設(shè)計。然后以經(jīng)氨基修飾的玻璃片基作為載體，用芯片點樣儀進 行點樣，紫外交聯(lián)。該芯片每張含3個相同的雜交矩陣，區(qū)間距為12.5mm，每 個矩陣含40X40個點，4個亞矩陣，每個亞矩陣點樣密度為20列X20行。使 每個探針重復(fù)點樣2次，點直徑為100pm，點間距200 pm。經(jīng)掃描檢測，芯片 樣探針點均勻，信號差異小。分別用Cy3-dCTP和Cy5-dCTP熒光標記的處理和 對照蜜蜂cDNA樣本，與芯片進行雜交處理。然后用芯片掃描儀掃描芯片記錄 雜交信號，標準化處理，檢測信號的有效性。采用圖片分析軟件對掃描結(jié)果進 行定量分析。對數(shù)據(jù)作M散點圖評估，顯示雜交信號可靠，出現(xiàn)假陽性的可能 性低。本發(fā)明芯片包含了中蜂腦的主要DNA信息，適用于生物，包括動物(昆 蟲、蜜蜂)以及它們的細胞、組織器官及其系統(tǒng)的生物的功能研究，包括藥物、 動物的抗逆性、育種和新品種的產(chǎn)生、雜種優(yōu)勢的早期預(yù)測、動物生長和發(fā)育 的機理和藥物的毒理學(xué)；檢測包括轉(zhuǎn)基因動物的安全性檢測、食物成分的功能
性評估、病原體的檢測和診斷、物種的鑒定；特別是適用于中蜂及同屬蜜蜂相 關(guān)基因的表達分析、種質(zhì)鑒定和功能基因挖掘，具有廣闊的應(yīng)用前景。
本發(fā)明根據(jù)附圖和實施例詳細說明本發(fā)明，本發(fā)明的目的和效果將變得更 加明顯。
實施例1: cDNA文庫構(gòu)建
參考Robinson實驗室的方法(Charles W W, Mark R B， Maria F B, Charu G K " a丄Genome Research. ， 2002， 55: 555-566)，用油漆筆標記當(dāng)日羽化 的工蜂，在l、 3、 4、 5、 7、 9、 12、 15、 18、 21、 24、 27和30日齡期進行回 捕，每個日齡分別回捕100頭以上，迅速剪取頭部后用液氮凍存，隨后-80。C保 存。分別從凍存的每個日齡工蜂樣品取10個頭部，共130頭，加液氮勻漿，然后加TRIZOL進行總RNA提取。用P/。甲醛變性凝膠電泳檢測總RNA的完整性，從 中蜂頭部提取的總RNA的1%甲醛變性凝膠電泳檢測結(jié)果(圖1)可見，28S、 18S 條帶十分清晰，表明所提取的總RNA完整，基本無降解。紫外分光光度計檢測 結(jié)果，提取的總RNA的OD260/280值為l.卯，表明純度較高，符合建庫要求。
用PolyATtract mRNA Isolation System II Kit olyATtract mRNA Isolation System II試劑盒純化mRNA。用pBluescript II XR cDNA Library construction試 劑盒合成cDNA第一鏈和第二鏈。由cDNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖2)可見， 本實驗所合成的雙鏈cDNA片段為數(shù)條清晰的條帶，片段集中區(qū)在0.2 4 kb之 間，表明均一性良好。
然后用末端補平酶將雙鏈cDNA末端補平，加上五coR I接頭并將其磷酸化， 再經(jīng)^o/I酶切處理，酶切產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，然后用MinElute Gel Extraction試劑盒進行凝膠回收。
參考黃曉和周榮家的方法(動物學(xué)報，1998， 44 (2): 237~238)，將cDNA 與載體pBluescript II SK(+).相連，連接反應(yīng)物用電擊反應(yīng)法轉(zhuǎn)化￡. co// DH10B 感受態(tài)菌，加1 mLS.O.C培養(yǎng)基，在37"C搖床復(fù)蘇lhr，最后取50 菌液涂 布含有IPTG/X-gal的LB培養(yǎng)基，37。C培養(yǎng)過夜，計數(shù)長出的陽性克隆，計算 文庫滴度。對所建cDNA文庫平板菌落統(tǒng)計結(jié)果，50^1 cDNA的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可產(chǎn) 生400個左右的陽性克隆，文庫的滴度約為8xl04pfo/mL。
從生長轉(zhuǎn)化菌的平板上隨機挑取32個菌落，擴大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，采用 T7/M13通用引物，艮P: 5，端引物GTAATACGACTCACTATAGGGCG，和3，端 引物GGAAACAGCTA TGACCATGA進行PCR擴增鑒定，PCR反應(yīng)參數(shù)為95 。C預(yù)變性4分；95。C變性30秒，55X:退火45秒，72。C延伸1分，35個循環(huán)； 72保溫10分；擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。對隨機挑取32個陽性 克隆的PCR擴增產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果(圖3)顯示插入片段分布均勻， 大小在0.5 3 kb之間，32個克隆的PCR產(chǎn)物泳道中有3條空白，由此得文庫 重組率為90.6°/0。
實施例2:文庫測序分析和數(shù)據(jù)庫構(gòu)建
中蜂cDNA質(zhì)?？寺∮烧憬髮W(xué)沃森基因組研究院測序，使用M13正向 引物，由3'端測序。其主要方法是從文庫挑取單克隆接種在含LB培養(yǎng)基的96 孔板，37°C培養(yǎng)18小時左右，提取質(zhì)粒作為模板，用通用引物M13進行PCR 擴增，樣品經(jīng)純化后放入Megabace 1000中進行測序。結(jié)果共獲得1，3392條EST， 通過phrap軟件作有效性處理，去除序列中的載體序列，修正3，端測出序列中 的模糊堿基，將片段長度小于100 bp的EST序列視為無效。共得到平均長度大于500bp的高質(zhì)量EST共8569條(表l)。
利用浙江大學(xué)生物信息服務(wù)平臺服務(wù)器進行EST片段處理和拼接，選出具有獨立功能的Contig (由多個EST拼接而成)、Siglet (為單一EST片段)序歹廿，用Ontology (GO)和Blast軟件進行功能注釋，用DNAstar軟件選出與Contig、Siglet序列相匹配的EST序列(每條Contig選2-3條覆蓋全長的代表性EST),在此基礎(chǔ)上建立EXCEL芯片EST數(shù)據(jù)庫。通過CAP3軟件處理，共拼接出217條Contig、 788條Singlet (表1)。
表1中蜂腦EST序列分析
高質(zhì)量EST
8569
Contig217
> 40 ESTs11
>脂ESTs6
> 500 ESTs2
>1000 ESTs1
Singlet788
在前述基礎(chǔ)上，采用DNAstar軟件從8569條EST篩選出1025條可用于點芯片的候選EST。根據(jù)候選EST序列編號查找出相應(yīng)的文庫，挑取質(zhì)粒，進行濃度測定和稀釋，采用引物M13作PCR擴增。經(jīng)PCR擴增和電泳檢測，有718條EST獲得高質(zhì)量PCR產(chǎn)物(見實施例3)，將這些ESTs與GenBank西方蜜蜂和果蠅數(shù)據(jù)庫(截至2008年7月)用Blastn進行搜索，得到的Blast最高分值，概率以及同源序列長度和功能識別描述，按芯片陣列要求，編輯成EXCEL數(shù)據(jù)庫，并用Ontology (GO)進行功能注釋，主要EST功能信息見表2。
表2中蜂頭部表達序列基因芯片探針組成
功能分類
探針
功能分類
探針
/1 me/啡ra genomic contigAme//!y^ra linkage group 1genomic contig/4.膨/詠ra linkage group 2genomic contigAwe/映ra linkage group 3genomic contig
58
51
47
21
CG4696-PACG4720-PA
Carboxylesterase
Defensin/royalisinprecursor
22
2A.mellifera linkage group 4
genomic contig
A,〃^ra linkage group 5
genomic contig
j,,//^ra linkage group 6
genomic contig
linkage group 7
genomic contig
y4.we〃i/fera linkage group 8
genomic contig
」./ne〃^fera linkage group 9
genomic contigAme/騰ra linkage group 10genomic contig
linkage group 11genomic contigj.we//z/era linkage group 12genomic contigylme/啡ra linkage group 13genomic contigv4.脂/映ra linkage group 14genomic contigA膨〃^ra linkage group 15genomic contigy4.me/啡ra linkage group 16genomic contig
Apisimin
Apisimin precursor
ADP/ATP translocase
Alpha-amylase
Alpha-glucosidase
22 ENSANGP00000013101 1
51
25
12
83
19
2
31
ENSANGPOOOOOO 18891 4
32 ENSANGP00000022830 2
Elongation factor-1alpha F2
32 Glucose dehydrogenase 1
Glucosylceramidaseprecursor
31 Glucose oxidase
Heat shock cognate 70protein
Long-wavelengthrhodopsin
19 Mrjp
26 Ribosomal protein L8
48 Transferring
11 Venom protein 2
60S acidic ribosoma
3
protein PI
60S acidic ribosomal
1
protein P2
陽性對照陰性對照
空白對照
7
2
23
2
2
2
2
411Antennal-specific protein 3c 一 ，,
1 其他 57precursor_____
實施例3 :基因芯片的制備
一、 提取質(zhì)粒
吸取lmL含Amp的LB培養(yǎng)液，加入到96孔培養(yǎng)板，接種5 uL侯選EST的克隆菌液，在150rpm、在150rpm、 37。C下培養(yǎng)16-18 h;按以下步驟提取質(zhì)粒
a) 菌液離心4000rpm， 5 min，棄上清；
b) 加入預(yù)冷的溶液IIOO PL,劇烈震蕩懸?。?br>
c) 加入溶液I1200 uL，顛倒混勻，冰浴5min;
d) 加入預(yù)冷的溶液m 150 liL，倒置后，溫和震蕩10s，冰浴5min;
e) 4°C ， 4000 rpm，離心15 min;
f) 轉(zhuǎn)移400 WL上清至深孔板，4°C， 4000 rpm，離心15 min;
g) 轉(zhuǎn)移300 WL上清至深孔板，加等體積的異丙醇混勻，4°C， 4000rpm，離心40min，棄上清；
h) 用70%乙醇洗滌，4°C， 4000 rpm，離心15 min;
i) 去上清，超凈臺干燥，至無異味；j)加入50wL的去離子水，溶解沉淀。
取luL用紫外分光光度計測定質(zhì)粒濃度，然后取3uL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。質(zhì)粒板-2(TC保存?zhèn)溆谩?br>
二、 探針的PCR擴增
在實施例2的基礎(chǔ)上，根據(jù)候選EST序列編號查找出相應(yīng)的文庫，挑取質(zhì)粒，進行濃度測定和稀釋，采用引物M13作PCR擴增(美國MJResearch公司，DNAEngine Tetrad溫度梯度PCR儀)。PCR體系(lOOpL): 10 XPCR Buffer 10 ^L，dNTP2pL，正向和反向引物各1mL， r叫酶l〖iL，模板lpL， ddH2085 pL<^l]于96孔板)。PCR反應(yīng)參數(shù)94。C預(yù)變性4min; 94。C變性30s， 56。C退火40s，72。C延伸10min， 30個循環(huán)；72。C保溫10min。反應(yīng)結(jié)束后用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。經(jīng)電泳檢測，PCR產(chǎn)物片段大小在200 1500bp。
三、 PCR產(chǎn)物處理1， PCR產(chǎn)物純化
(1)將PCR擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到0.5 raL印pendorf管中；(2)向eppendorf管中加入2X體積(200uL)無水乙醇，然后加入PCR產(chǎn)物，混勻；(3)用鋁箔紙封口，輕微離心，置于-20。C放置過夜，充分沉淀；(4) 4°C， 12000 rpm，離心20min; (5)棄上清，eppendorf管倒置于吸水紙上，去除殘余乙醇；(6)加入2X體積70。/。乙醇洗滌；(7) 4'C， 12000卬m，離心5 min; (8)去上清，超凈臺干燥；(9)將沉淀溶于適量去離子H20，移入96孔板的相應(yīng)孔內(nèi)。2. PCR產(chǎn)物的干燥、檢測和稀釋(1)用ND-1000紫外分光光度計對所有純化產(chǎn)物的濃度進行測定，并根據(jù)其體積，計算出相應(yīng)的核酸含量。同時再次電泳檢測。結(jié)果純化產(chǎn)物條帶清晰(代表性電泳結(jié)果見圖4)，紫外分析0026。/28。值在1.7 2.0，表明純度較高，符合點制芯片質(zhì)量要求。(2)將純化產(chǎn)物移入384孔板內(nèi)的項應(yīng)孔內(nèi)，放入Alphal-5真空冷凍干燥機中，進行真空干燥。待樣品完全干燥后，小心取出樣品，封上鋁箔紙，輕微離心，將核酸粉末甩至管底。(3)干燥完畢后加入相應(yīng)體積的50%二甲基亞砜(DMSO)， PCR產(chǎn)物終濃度控制在500 1000ng^L。 384孔板輕微離心后，封上鋁箔紙，置脫色搖床上使PCR產(chǎn)物充分震蕩溶解。。
四、 芯片制備
將實際得到的718個EST片斷，以及陽性對照、空白對照，進行矩陣分布設(shè)計(圖5)，并在初步的EXCEL芯片EST數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，編輯好與芯片矩陣相對應(yīng)的數(shù)據(jù)庫。芯片矩陣分布具體要求是每張基因芯片設(shè)置3個相同的雜交矩陣，區(qū)間距為12.5mm，每個矩陣含40X40個點，分為4個亞矩陣，每個亞矩陣點樣密度為20列X20行。每個探針重復(fù)點樣2次，點直徑為100 (im，點間距200 pm。按照設(shè)計的中蜂腦cDNA芯片矩陣排列圖順序。將探針溶液轉(zhuǎn)移至384孔板中，固定兩小時，避光保存?zhèn)溆?。實際點樣結(jié)果為每個亞矩陣點樣密度為20列X 18行,4個亞矩陣，本每個矩陣1440點，其中4點為空白。
cDNA芯片采用Omnigrid接觸式芯片點樣儀進行點樣。microarry載體為氨基修飾的玻璃片基(25mmX75mm，購自美國Coming公司)。點樣完畢后在400mJ能量下用紫外交聯(lián)儀中進行交聯(lián)，最后用吸耳球吹凈玻片表面，室溫放置30min晾干，保存于干燥暗室備用，完成了芯片制備(圖6)。
五、 芯片質(zhì)量檢測
1. 雜交前監(jiān)測
中蜂腦cDNA基因芯片點制完成后，隨機抽取1張基因芯片用GenePix4100A芯片掃描儀進行掃描檢測，以檢查點樣質(zhì)量。圖7為芯片上4個亞矩陣之一的點陣掃描圖像，由該圖像可見，芯片點樣點形狀規(guī)則，直徑為80±20%，熒光背景低，無連點，重復(fù)點大小形狀基本上一致，信號差異系數(shù)大于0.33的低于30%，點樣成功率超過99%。
2. 雜交檢測和應(yīng)用試驗(1) 探針制備和雜交應(yīng)用試驗
以中蜂和意蜂腦為樣本，用Trizol提取總RNA，采用RNA Fluorescence Labeling Core Kit(TaKaRa)標記總RNA，熒光基團分別為Cy3-dCTP和Cy5-dCTP。 將純化后的熒光探針溶解在5 nL雜交緩沖液中。98。C變性2min，迅速置于冰上 冷卻，然后向探針中加入等體積的雜交緩沖液混勻。將混合液滴加于雜交區(qū)內(nèi)， 用蓋玻片覆蓋，置于密閉雜交倉內(nèi)，42。C水浴18h。雜交結(jié)束后，依次用lxSSC、 0.20/。SDS， O.lxSSC、 0.2%SDS， O.lxSSC清洗，最后在室溫下浸入去離子水中， 洗滌lmin。迅速轉(zhuǎn)入50 mL空離心管中，1500 rpm離心l min，甩干芯片。
用GenePix4100A芯片掃描儀掃描芯片，雜交芯片上大部分靶點的雜交都呈 現(xiàn)出一定的雜交信號，芯片上的各個矩陣及其靶標點，排列均勻整齊，形狀規(guī) 整，熒光背景較低，矩陣間的重復(fù)性較好。陽性對照點雜交信號較強，空白對 照無雜交信號，表明芯片的點制效果良好(圖8)。經(jīng)標準化處理后，有效數(shù)據(jù) 占總數(shù)的90%以上，符合分析要求。
(2) 掃描與數(shù)據(jù)分析
采用圖片分析軟件Gene Pk Pro5.0對掃描結(jié)果進行定量分析。首先經(jīng)過自動 和人工定位與排列，圈定每個雜交點的范圍，然后用該軟件讀出熒光信號強度。 由于樣本差異、熒光標記效率和檢出率的不平衡，需要對輸出結(jié)果進行標準化 處理，以消除由于兩種熒光強度不均引起的誤差。將陽性對照的熒光信號強度 比中值(Ratio值)設(shè)定為l，由此得出標準化系數(shù)，對輸出結(jié)果進行標準化處理。 對標準化后的數(shù)據(jù)作M (熒光強度比值的對數(shù)值)-A (總熒光強度對數(shù)值)散 點圖，從而評估芯片雜交質(zhì)量，判斷二者的相關(guān)性，其中M二log2Cy5/Cy3， A=l/21og2 (Cy5XCy3)。
M-A散點圖是評估芯片雜交質(zhì)量的一種方式，它可以反應(yīng)熒光信號強度比 值是否隨信號強度的變化而變化。從圖9可見，信號點在M=0軸上下兩側(cè)分布 比較均勻，說明雜交信號可靠，熒光信號比值不受熒光強度的影響，出現(xiàn)假陽 性的可能性低。
上述實施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進行限制，在本發(fā)明的 精神和權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā) 明的保護范圍。
權(quán)利要求
1. 一種中華蜜蜂頭部表達序列基因芯片，其特征在于，它主要由載體和結(jié)合在載體上的SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.718所示序列、及它們的同源序列和互補序列的核酸分子組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的中華蜜蜂頭部表達序列基因芯片，其特征在于所述載 體為固相載體或液相載體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的中華蜜蜂頭部表達序列基因芯片，其特征在于，所述固 相載體為玻片、硅片、尼龍膜、硝酸纖維膜或凝膠。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的中華蜜蜂頭部表達序列基因芯片，其特征在于，所述核 酸分子是脫氧核糖核酸、核糖核酸或多聚寡核苷酸。
5. —種權(quán)利要求1所述中華蜜蜂頭部表達序列基因芯片在生物功能的研究和檢 測方面的應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述生物包括動物、動物細胞、動 物組織器官及系統(tǒng)。所述生物功能的研究包括藥物、動物的抗逆性、育種和新 品種的產(chǎn)生、雜種優(yōu)勢的早期預(yù)測、動物生長和發(fā)育的機理和藥物的毒理學(xué)。 所述生物功能的檢測包括轉(zhuǎn)基因動物的安全性檢測、食物成分的功能性評估、 病原體的檢測和診斷、物種的鑒定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種中華蜜蜂頭部表達序列基因芯片及其用途，該基因芯片主要由載體和結(jié)合在載體上的SEQ ID No.1～SEQ ID No.718所示序列、及它們的同源序列和互補序列的核酸分子組成。本發(fā)明的基因芯片包含了中蜂腦的主要DNA信息，適用于生物以及它們的細胞、組織器官及其系統(tǒng)的生物的功能研究，特別是適用于中蜂及同屬蜜蜂相關(guān)基因的表達分析、種質(zhì)鑒定和功能基因挖掘，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12Q1/68GK101481731SQ200810163619
公開日2009年7月15日 申請日期2008年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月22日
發(fā)明者丁美會, 張偉光, 張傳溪, 張瓅文, 李紅亮, 楊喻曉, 沈立榮, 洪旭濤, 程家安, 鳳 金, 高其康 申請人:浙江大學(xué)