專(zhuān)利名稱(chēng)：：調(diào)節(jié)植物光能利用及油脂積累的基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及到一種AP2/EREBP類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子BnWRI1基因及其在調(diào)節(jié)植物種子光合作用及油脂合成代謝中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：除了對(duì)人類(lèi)重要的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值外，植物油脂還作為廣泛的非食用產(chǎn)品的原料，特別是全球能源日趨緊張，利用植物油生產(chǎn)可再生能源已成為世界各國(guó)應(yīng)對(duì)能源危機(jī)的重要戰(zhàn)略選擇。提高單位面積油脂產(chǎn)出量是油料作物育種始終追求的目標(biāo)，含油量與單產(chǎn)作為單位面積油脂產(chǎn)出量的兩個(gè)組成因素，也是油料作物生產(chǎn)效益的重要決定因素(李云昌等，中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)。28:92-96,2006)。種子含油量這個(gè)經(jīng)濟(jì)性狀是受遺傳控制的，屬于數(shù)量性狀遺傳，并有較高的遺傳力(王貴春等，安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，35:5373-5375，5411，2007)。對(duì)調(diào)控這一性狀功能基因的了解，是運(yùn)用轉(zhuǎn)基因或常規(guī)雜交育種途徑培育高油品種的基礎(chǔ)。油脂合成代謝涉及眾多酶系，實(shí)踐證明，對(duì)單一結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)調(diào)控，難以充分發(fā)揮油脂高效積累的潛能(RoeslerK.etal.PlantPhysiology.113:75-81，1997)。利用轉(zhuǎn)錄因子提高脂肪酸合成整體代謝水平，提供了高油育種的新途徑。目前已知的影響種子油脂積累的轉(zhuǎn)錄因子主要有擬南芥WRIl、GLABRA2CernacA.etal.PlantPhysiology,141:745-757,2006.ShenB.etal.PlantMolBiol.60:377-87，2006)，大豆GmDof4禾口GmDofll(WangHWetal.PlantJo52:716-29.2007).，控制種子發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子LECl、L1L、LEC2也對(duì)種子含油量具有調(diào)控作用。WRI1是擬南芥脂肪酸合成關(guān)鍵調(diào)控基因，該基因突變導(dǎo)致種子含油量下降80%。該基因在擬南芥中組成型超表達(dá)可提高種子油脂含量，但會(huì)導(dǎo)致在含糖培養(yǎng)上幼苗生長(zhǎng)異常。光合作用是指綠色植物利用太陽(yáng)能將二氧化碳和水轉(zhuǎn)化為碳水化合物并放出氧氣的過(guò)程，是作物產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)。提高光合作用光能利用效率將使作物單產(chǎn)有極大提高，也是作物達(dá)到高產(chǎn)的必要條件。光照對(duì)作物產(chǎn)量的貢獻(xiàn)以前主要著重于葉片等光合器官，近年來(lái)才逐漸開(kāi)始重視光照在油菜、大豆等"綠色種子"中的作用。已有的研究表明，雖然有莢殼包被，到達(dá)種子的較低水平的光照仍能實(shí)質(zhì)性地提高光合作用相關(guān)酶的活性、增加脂肪酸合成量(WillmsJRetal.，PlantPhysiology,120:1117-1127,1999;R墜ka，SA.etal.PlantPhysiology,136:2700-2709,2004)。Goffmant等(GoffmantFDetal.PlantPhysiology,138:2269-2279,2005)發(fā)現(xiàn)，光照不僅可促進(jìn)油菜種子光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成貯藏物質(zhì)的合成代謝效率，同時(shí)也提高了胚的生長(zhǎng)速度。Li等(LiYHetal.Phytochemistry，67:904-915，2006)發(fā)現(xiàn)，擬南芥在6001mo1m-、」光照強(qiáng)度下生長(zhǎng)較在1001mo1m_2s-1生長(zhǎng)其單粒種子重量和單粒種子積累的油脂含量都有所增加。這些研究結(jié)果都顯示，光照對(duì)油菜、大豆等油料作物種子油脂等貯藏物質(zhì)積累、產(chǎn)量形成具有重要作用。R皿ska等發(fā)現(xiàn)，在擬南芥種子發(fā)育過(guò)程中，許多與光合作用相關(guān)的功能基因與脂肪酸合成酶系(FAS)編碼基因的表達(dá)模式相類(lèi)似(R皿skaSAetal.PlantCell.14:1191-1206，2002)，顯示其可能存在某種協(xié)同調(diào)控機(jī)制。中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利(申請(qǐng)?zhí)枮?00610058763.7)公開(kāi)了一個(gè)與油脂代調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一個(gè)來(lái)源于大豆的與油脂代謝調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子GmDofA及其編碼基因與其在調(diào)控植物油脂代謝中的應(yīng)用。該轉(zhuǎn)錄因子是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQIDN2:1;2)將序列表中SEQIDN2:1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有轉(zhuǎn)錄激活功能的調(diào)控植物油脂代謝的蛋白質(zhì)。該專(zhuān)利基因的克隆及功能鑒定對(duì)提高和改良作物油脂成分、特別是對(duì)于提高大豆油脂成分，培育高油脂大豆品種具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。雖然植物光合作用、油脂合成的研究一直備受關(guān)注，分別與這兩個(gè)重要生物學(xué)過(guò)程相關(guān)的功能基因也不斷相繼被克隆，但至今仍未有發(fā)現(xiàn)可同時(shí)調(diào)控油料作物種子光合作用和油脂積累的基因報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一個(gè)調(diào)控植物種子光合作用和脂肪酸合成代謝的轉(zhuǎn)錄因子、其編碼基因及其用途。本發(fā)明所提供的調(diào)控植物種子光合作用和脂肪酸合成代謝的轉(zhuǎn)錄因子，名稱(chēng)為Brassican即usWRINKLEDl(BnWRIl)，來(lái)源于蕓薹屬甘藍(lán)型油菜(Brassican即us)，其為下述多肽之一①具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的多肽；②將SEQIDNO:2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有SEQIDN0:2所示的氨基酸序列的多肽的功能由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的多肽衍生的多肽。本發(fā)明還提供了編碼上述多肽的基因BnWRIl，(Brassican即usWRINKLEDl)，其為下述核苷酸序列之一①序列表中SEQIDNO:1所示的DNA序列;②編碼序列表中SEQIDNO:2的DNA序列；③與序列表中SEQIDNO:1限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有調(diào)控植物種子光合作用和脂肪酸合成代謝功能的核苷酸序列；④在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQIDNO:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1XSSPE(或0.1XSSC)、0.1%SDS的溶液中，65。C條件下雜交并洗膜。含有上述的基因BnWRIl的表達(dá)載體及細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增上述的基因BnWRIl中任一片段的引物也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明還提供了編碼上述多肽的基因組基因，是下述核苷酸序列之一(1)序列表中SEQIDNO:3所示的DNA序列;(2)與序列表中SEQIDNO:1限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有調(diào)控植物種子光合作用和脂肪酸合成代謝功能的核苷酸序列；4(3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQIDNO:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1XSSPE(或0.1XSSC)、0.1%SDS的溶液中，65。C條件下雜交并洗膜。本發(fā)明還提供了一種調(diào)控植物種子光合作用和脂肪酸含量的方法，是利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的編碼調(diào)控植物光合作用和脂肪酸合成代謝轉(zhuǎn)錄因子的基因BnWRI1或與BnWRI1具有90%以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官，再將轉(zhuǎn)化的植物組織、細(xì)胞或器官培育成植株，植物種子光合作用能力和油脂含量獲得調(diào)控。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植株進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所使用的植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入植物可選擇性標(biāo)記或?qū)股?、除草劑的抗性?biāo)記。使用BnWRIl或其同源序列構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種組成型、增強(qiáng)型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。作為優(yōu)選，所述的組織特異型啟動(dòng)子可為種子特異表達(dá)啟動(dòng)子。本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)錄因子可用于提高植物種子光合作用能力和種子油脂含量。作為優(yōu)選，所述的植物選自(但不限于)十字花科、豆科、禾本科。作為再優(yōu)選，所述的植物包括(但不限于)油菜、擬南芥、大豆、水稻、向日葵、橄欖樹(shù)、花生、棉花、蓖麻、煙草等。通過(guò)將轉(zhuǎn)化有本發(fā)明編碼調(diào)控植物光合作用和脂肪酸合成代謝轉(zhuǎn)錄因子的基因BnWRIl或與BnWRIl具有90%以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行繼代培養(yǎng)后，可從中進(jìn)一步篩選出基因純合的轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株種子光合作用效率、光能利用能力和油脂含量提高。另一方面，通過(guò)將轉(zhuǎn)化有本發(fā)明編碼調(diào)控植物光合作用和脂肪酸合成代謝轉(zhuǎn)錄因子的基因BnWRI1或與BnWRI1具有90%以上同源性且編碼相同蛋白的DNA序列的轉(zhuǎn)基因植株與其他品種的植物進(jìn)行雜交、并對(duì)獲得的雜交后代植株進(jìn)行培養(yǎng)和檢測(cè)，可從中進(jìn)一步篩選出種子光合作用效率、光能利用能力和油脂含量提高的植株。本發(fā)明的其它方面由于本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。本發(fā)明由于采用了上述的技術(shù)方案，轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因?qū)τ谥参锱嘀差I(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，其能使植物對(duì)光合作用和脂肪酸合成代謝可以協(xié)同調(diào)控，并提高種子光合作用和油脂積累能力，從而提高植物產(chǎn)量和含油量、改良相關(guān)性狀。圖1為BnWRIl與已知其它物種間的同源基因的進(jìn)化關(guān)系。圖2為BnWRIl基因組基因結(jié)構(gòu)示意。圖3為BnWRIl種子特異超表達(dá)載體NAPINPr::BnWRIl結(jié)構(gòu)示意。圖4為擬南芥NAPINPr::BnWRIlT4代轉(zhuǎn)基因株系和ColO野生型莢果基因表達(dá)水平比較。T-15和T-45是兩個(gè)擬南芥獨(dú)立轉(zhuǎn)化株系，擬南芥轉(zhuǎn)化植株和野生型對(duì)照在相同條件下培養(yǎng)，在進(jìn)行基因表達(dá)水平的半定量分析時(shí)，以Actin2基因?yàn)閮?nèi)參。圖5為擬南芥NAPINPr::BnWRIlT3代轉(zhuǎn)基因株系和Co10野生型種子含油量比較。A為油脂含量占籽粒干重的百分比。B為單粒種子油脂含量。虛線(xiàn)所示為ColO野生型種子含油量值。圖6為油菜NAPINPr::BnWRIlT2代轉(zhuǎn)化株系和非轉(zhuǎn)化受體材料種子含油量比較。圖中所示為各株系10個(gè)單株成熟種子含油量的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。0BnW-368和0BnW_369為兩個(gè)NAPINPr::BnWRIl油菜轉(zhuǎn)化株系。N-CON為未轉(zhuǎn)化的受體品種對(duì)照。圖7為擬南芥NAPINPr::BnWRIlT3代轉(zhuǎn)基因株系和Co1O野生型種子千粒重比較。虛線(xiàn)所示為ColO野生型種子千粒重值。圖8為油菜NAPINPr::BnWRIlT2代轉(zhuǎn)基因植株和未轉(zhuǎn)基因油菜種子大小比較。A為當(dāng)?shù)赝茝V品種的成熟種子；B、C為兩個(gè)NAPINPr::BnWRIlT2代轉(zhuǎn)基因植株的成熟種子。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。需要指出的是，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中如無(wú)特別說(shuō)明均按常規(guī)條件或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。實(shí)施例1、調(diào)控植物光能利用及油脂積累轉(zhuǎn)錄因子基因BnWRIl的克隆1.1用Trizol試劑(購(gòu)自Invitrogen公司)提取甘藍(lán)型油菜(Brassican即us)未成熟種子的總RNA，以oligo-d(T)18為引物，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)將獲得的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以所合成的cDNA為模板，以引物對(duì)BnWRIl-l(5'-ATGAAGAGACCCTTAACCACTTC-3')和BnWRI1-2(5'-CCTTCAGACAGAATAGTTCCAAG-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以L(fǎng)A-Taq(大連TaKaRa公司)擴(kuò)增所述的cDNA，PCR反應(yīng)條件為94。C，5min，1次循環(huán)；94。C，30sec，58。C，40sec，72。C，90sec，33次循環(huán)；72。C，10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到載體pMD18-T(大連TaKaRa公司)，得到含有擴(kuò)增片段的重組質(zhì)粒，命名為pMD-B亟Il經(jīng)測(cè)序，獲得的PCR產(chǎn)物序列如SEQIDNO:1所示，由1242個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5'端第1-1242位，其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列表如SEQIDNO:2所示。將上述核苷酸序列和氨基酸序列采用Blastn程序在GenBank中進(jìn)行同源性比對(duì)，該基因與擬南芥WRIl基因及WRI1所編碼的蛋白質(zhì)的同源性分別為84%和79%，與其它AP2/EREBP家族轉(zhuǎn)錄因序列同源性均較低，說(shuō)明BnWRIl是擬南芥WRIl在甘藍(lán)型油菜中的同源基因(圖l)。1.2以甘藍(lán)型油菜DNA為模板，以引物對(duì)BnWRI1-1和BnWRI1-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以L(fǎng)A-Taq(大連TaKaRa公司)擴(kuò)增所述的DNA，PCR反應(yīng)條件為94。C，5min，1次循環(huán)；94。C，30sec，58。C，40sec，72。C，4min，33次循環(huán)；72。C，10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序，獲得BnWRIl基因組全長(zhǎng)，其序列如SEQIDNO:3所示，由3609個(gè)堿基組成。BnWRIlcDNA和DNA序列比較顯示該基因包含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子(圖2)。實(shí)施例2、BnWRI1種子特異表達(dá)載體NAPINPr::BnWRI1的構(gòu)建2.1首先以油菜基因組DNA為模板，用引物對(duì)n即in5(5'-AAGCTTTCTTCATCGGTGATTGA-3，)禾Pn即in3(5，-TCGTGTATGTTTTTAATCTTGTTTG-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得油菜n即in啟動(dòng)子(AEi^M)，用該啟動(dòng)子片段置換植物表達(dá)載體pFGC5941中酶切位點(diǎn)EcoRI-BamHI間包含35S啟動(dòng)子的DNA片段，獲得中間載體pFGC-NAPIN。用BamHI和EcoRV雙酶切將編碼BnWRIl的DNA片段從質(zhì)粒pMD-BnWRIl中切出，與經(jīng)BamHI和Smal雙酶切后回收的pFGC-NAPIN載體片段相連接。2.2連接產(chǎn)物用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用含50mg/L卡那霉素的LB抗性平板篩選，陽(yáng)性克隆用引物對(duì)BnWRI1_1和BnWRI1_2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。挑取PCR陽(yáng)性的克隆，用堿裂解法(參見(jiàn)《分子克隆》)提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切鑒定，選取酶切正確的克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，構(gòu)建成BnWRIl種子特異表達(dá)載體NAPINPr::BnWRIl，載體結(jié)構(gòu)如圖3所示。實(shí)施例3、BnWRIl轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得3.1將實(shí)施例2構(gòu)建的種子特異表達(dá)載體NAPINPr::BnWRI1用熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105，在含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的LB抗性平板上2『C進(jìn)行培養(yǎng)。挑取單克隆經(jīng)PCR驗(yàn)證后用于植物轉(zhuǎn)化。挑取含質(zhì)粒NAPINPr::BnWRIl的農(nóng)桿菌單菌落接種于5ml含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YEP培養(yǎng)液，28°C150rpm振蕩培養(yǎng)2d。按1:50的比例在新鮮的YEP液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(菌液0De。。"1.5)。3000rmp離心10min，棄上清。將沉淀重新懸浮于滲透培養(yǎng)液，(組成為含5%蔗糖，44慮6-芐氨基嘌呤和0.05%SilwetL-77的1/2MS液體培養(yǎng)基)，調(diào)0D600=0.8。用Floraldip法(CloughSJetal，1998.PlantJ16:735-43)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，即將擬南芥(ArabidopsisthalianaCol-0)的花序全部在轉(zhuǎn)化液中浸泡l-2min，并輕輕搖晃，轉(zhuǎn)化后的擬南芥植株保鮮膜覆蓋保濕12天。隔4-5天后按上述方法重復(fù)轉(zhuǎn)化，共轉(zhuǎn)化3-4次。收獲成熟種子(Tl代)。3.2擬南芥抗性植株篩選。將實(shí)施例3.1中收獲的擬南芥Tl代種子播種于盆缽中，播種后7-10天，噴1:3000體積比稀釋的有效濃度18.5%的除草劑Bastar，每周2次，噴3-4次。篩選出的抗性植株用引物對(duì)n即in52(5'-GATCGCCATGCAAATCTC-3')禾PBnWR11-2(5'-CCTTCAGACAGAATAGTTCCAAG-3')進(jìn)行PCR檢測(cè)，分單株收獲成熟種子(T2代)，獲得了30個(gè)NAPINPr::BnWRIl基因擬南芥轉(zhuǎn)化植株。各單株繼續(xù)按上述方法種植，獲得30個(gè)NAPINPr::BnWRI1基因轉(zhuǎn)化株系(T3代)。實(shí)施例4、RT-PCR檢測(cè)BnWRIl轉(zhuǎn)基因擬南芥脂肪酸合成、光合作用相關(guān)基因表達(dá)水平的檢測(cè)4.1將實(shí)施例3所獲得的擬南芥T3代轉(zhuǎn)化植株和哥倫比亞野生型(Col_0)的種子懸浮于O.1%的瓊脂溶液中，41:春化2天后播種于土壤(蛭石、草炭和珍珠巖按體積比6:2:l混合)，在溫度22t:、i6小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗光周期條件下培養(yǎng)。4.2對(duì)主花序開(kāi)花時(shí)期進(jìn)行標(biāo)記，莢果分開(kāi)花后1-6天和7-12天兩個(gè)時(shí)期分別取樣，在液氮中研磨，按說(shuō)明書(shū)所述方法用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取總RNA，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。以oligo-d(T)18為引物，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)合成cDNA第一鏈。4.3以實(shí)施例4.2中獲得的cDNA為模板，用擬南芥actin2基因?yàn)閮?nèi)參進(jìn)行RT-PCR，調(diào)整各cDNA樣品濃度。用半定量RT-PCR方法分析擬南芥NAPINPr::BnWRI1轉(zhuǎn)化株系和野生型對(duì)照在不同發(fā)育期莢果基因表達(dá)水平，所用引物對(duì)見(jiàn)表1，結(jié)果如圖4所示。BnWRIl在擬南芥莢果中的表達(dá)在1-6天較弱，7-12天表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，這樣的表達(dá)模式與n即in啟動(dòng)子的表達(dá)特性相一致。BnWRIl在擬南芥種子中的超表達(dá)可同時(shí)提高脂肪酸合成關(guān)鍵酶ACCase的BCCP亞基編碼基因BCCP2和光合作用關(guān)鍵基因捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白LHCII基因的表達(dá)水平，而且這些基因表達(dá)提高程度與導(dǎo)入的油菜BnWRIl基因表達(dá)水平具有相同的趨勢(shì)，證明轉(zhuǎn)錄因子BnWRIl對(duì)莢果發(fā)育過(guò)程中脂肪酸合成和光能吸收相關(guān)基因具有協(xié)同調(diào)控的功能。表1.NAPINPr::BnWRIl轉(zhuǎn)化株系基因表達(dá)分析擴(kuò)增基因正向引物(5'-3')反向引物(5'-3')AGAGATTCAGATGCCCAGAACGATTCCTCCACCTGCCTAAGTCTTGTTCCCATCATACTCATGAAGAGACCCTTAACCACTTCCACAACAACACCATCGCAACGATTGTAGGATATTCAGATCTCAGACCAAATAGTTACAAGAAGGAGGTTGCGTGCAACAACTAGAGCTGGAGGCATTGAAAAG丄UTGCGTTTTCCCTGAGCTATTCGTTCTTGAGCTCCTTCACC實(shí)施例5、BnWRIl轉(zhuǎn)基因擬南芥莢果葉綠素含量的變化葉綠素含量是光合作用強(qiáng)度的重要生理指標(biāo)。按實(shí)施例4的方法，擬南芥BnWRIl轉(zhuǎn)基因植株及野生型對(duì)照莢果分開(kāi)花后1-6天和7-12天兩個(gè)時(shí)期分別取樣。按每一樣品約0.2克取樣后準(zhǔn)確稱(chēng)重，分別放入研缽，加入少量石英砂及2-3ml95%乙醇，研成勻漿，轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶，用少量乙醇沖洗研缽、研棒數(shù)次，連同殘?jiān)黄鸬谷肴萘科恐校詈笥靡掖级ㄈ葜?0ml。樣品4t:黑暗放置1小時(shí)，期間將容量瓶中倒轉(zhuǎn)混合數(shù)次。提取液6000g、4t:離心2分鐘，吸取上清即為各樣品葉綠素提取液。以95X乙醇為空白，在波長(zhǎng)665nm、649nm下測(cè)定葉綠素提取液吸光度。按下列公式計(jì)算葉綠素a和葉綠素b的濃度(Ca、Cb:mg/L)，二者之和為總?cè)~綠素的濃度:Ca=13.95A665_6.88A649，Cb=24.96A649_7.32A665。最后根據(jù)下式求出各植物組織中葉綠素的含量葉綠素的含量(mg/g)=[葉綠素的濃度X提取液體積X稀釋倍數(shù)]/樣品鮮重。每一處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每一樣品重復(fù)測(cè)定2次。表2擬南芥NAPINPr::BnWRIlT4代轉(zhuǎn)基因植株和Co1O野生型莢果葉綠素含量比較8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>T-15和T-45是兩個(gè)BnWRIl種子特異超表達(dá)擬南芥轉(zhuǎn)化株系。用于葉綠素含量測(cè)定的是T4代轉(zhuǎn)化株系。表中所示為3組樣品重復(fù)測(cè)定的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差從表2可以看出，在擬南芥中轉(zhuǎn)入BnWRI1種子特異超表達(dá)載體可提高轉(zhuǎn)化株系莢果葉綠素含量，顯示光能吸收能力增強(qiáng)。特別是開(kāi)花后7-12天轉(zhuǎn)入的BnWRIl基因表達(dá)水平較高時(shí)，葉綠素含量提高也更顯著。實(shí)施例6、BnWRI1種子特異超表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥種子含油量的測(cè)定擬南芥種子含油量的測(cè)定采用種子直接甲酯化后氣相色譜分析的方法(LiYH.etal.2006.OilcontentofArabidopsisseeds:Theinfluenceofseedanatomy,lightandplant-to-plantvariation.Phytochemistry，67:904-915)，以C17:0月旨肪酸(Sigma)作為內(nèi)標(biāo)。對(duì)30個(gè)轉(zhuǎn)化株系和野生型對(duì)照的種子含油量測(cè)定結(jié)果如圖5所示，不論是以油脂占種子干重百分比還是單粒種子含油量計(jì)，NAPINPr::BnWRIl結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化株系的種子含油量總體均較野生型明顯提高。實(shí)施例7、BnWRIl種子特異超表達(dá)轉(zhuǎn)基因油菜的獲得7.1油菜種子用0.1%HgCl2消毒8min，無(wú)菌水沖洗56次，置于MS固體培養(yǎng)基上，25t:條件下發(fā)芽，生成無(wú)菌苗。將56天苗齡無(wú)菌苗下胚軸切成0.51.Ocm的切段，置于MS+lmg/L6-BA+lmg/L2，4_D預(yù)培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)后作為轉(zhuǎn)基因受體材料。7.2將實(shí)施例3.1中獲得的含種子特異表達(dá)載體NAPINPr::BnWRIl的農(nóng)桿菌EHA105菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，將預(yù)培養(yǎng)過(guò)的下胚軸切段浸于制備好的菌液中5min。取出外植體并吸干多余的菌液，置于MS+2mg/L6-BA培養(yǎng)基上共培養(yǎng)。7.3共培養(yǎng)2天后，將外植體在含有300mg/L頭孢霉素的無(wú)菌水中清洗2次，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基1:MS+2mg/L6-BA+O.5mg/LNAA+20iimol/LAgN03+500mg/L羧節(jié)青霉素上培養(yǎng)。4天后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基2:MS+2mg/L6-BA+O.5mg/LNAA+20iimol/LAgN03+20mg/LPPT+500mg/L羧芐青霉素上培養(yǎng)。外植體在上述分化培養(yǎng)基上每隔21天用原培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)1次。待分化出綠色小芽后轉(zhuǎn)入新鮮分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1421d。7.4待分化出的綠芽長(zhǎng)到3cm左右時(shí)，移入生根培養(yǎng)基MS+0.2mg/LNAA+20mg/LPPT+500mg/L羧芐青霉素中生根，2周后出根長(zhǎng)成完整小植株，經(jīng)過(guò)逐步煉苗后，移栽入土中，植株可進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育并產(chǎn)生種子。所有的油菜轉(zhuǎn)化過(guò)程均在25t:，光照強(qiáng)度30001x，光照時(shí)間16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的條件下進(jìn)行。7.5油菜抗性植株的PCR檢測(cè)用CTAB法提取油菜葉片DNA，用引物對(duì)n即in52(5'-GATCGCCATGCAAATCTC-3')和BnWRIl-2(5'-CCTTCAGACACAGAATAGTTCCAAG-3')進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化植株分單株收獲種子。實(shí)施例8、BnWRIl種子特異超表達(dá)轉(zhuǎn)基因油菜種子含油量的測(cè)定BnWRIl轉(zhuǎn)基因油菜和未轉(zhuǎn)化受體對(duì)照種子含油量測(cè)定采用索氏提取法(魏紅等。中國(guó)油脂，2004，29(6):52-54.)，每一株系各取10個(gè)單株的種子分別測(cè)定含油量。其基本步驟如下把濾紙包放入(105士2)t:烘箱中干燥2小時(shí)，取出放入干燥器中冷卻至室溫稱(chēng)重(A);將lg油菜種子粉碎，過(guò)40目篩后裝入上述稱(chēng)重過(guò)的紙包，封好包口放入(105士2rC烘箱中干燥3小時(shí)，移至干燥器中冷卻至室溫稱(chēng)重(B);包有樣品的紙包在乙醚中浸泡過(guò)夜后抽提8小時(shí)。抽提完畢，移去上部冷凝管，取出濾紙包，在通風(fēng)櫥內(nèi)晾干。抽提后的濾紙包置于烘箱105t:干燥3小時(shí)，移至干燥器中冷卻至室溫稱(chēng)重(C)。含油量(％)=(B-C)/(B-A)X100%。未轉(zhuǎn)化受體對(duì)照和兩個(gè)BnWRIl轉(zhuǎn)基因油菜種子含油量測(cè)定結(jié)果如圖6所示。兩個(gè)轉(zhuǎn)化株系的平均含油量從未轉(zhuǎn)化材料的50.553%分別提高到了52.073%和52.4%，方差分析證明0BnW-2與對(duì)照的含油量提高達(dá)極顯著水平，OBnW-l與對(duì)照含油量提高也達(dá)顯著水平，并且獲得了一些種子含油量達(dá)54%左右的油菜種質(zhì)資源。實(shí)施例9、BnWRIl種子特異超表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥、油菜種子千粒重的測(cè)定9.lBnWRIl種子特異超表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥種子千粒重的測(cè)定BnWRIl種子特異超表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代和野生型對(duì)照在相同條件下種植，每盆3株，待種子成熟后按株系分別收獲。各株系用分析天平分別精確稱(chēng)量3X200粒成熟種子的重量。30個(gè)擬南芥株系的種子千粒重測(cè)定結(jié)果如圖7所示，NAPINPr::BnWRIl結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化株系的種子千粒重總體較野生型提高。9.2BnWRI1種子特異超表達(dá)轉(zhuǎn)基因油菜種子千粒重的測(cè)定BnWRIl種子特異超表達(dá)轉(zhuǎn)基因油菜T2代和受體品種及當(dāng)?shù)赝茝V品種對(duì)照在相同條件下種植，各轉(zhuǎn)化株系及對(duì)照分別收獲IO個(gè)以上單株的種子，按單株分開(kāi)收獲。各單株用分析天平分別精確稱(chēng)量3X100粒成熟種子的重量。對(duì)各轉(zhuǎn)化株系及受體品種千粒重比較，差異未達(dá)顯著水平。但有些轉(zhuǎn)化單株種子千粒重提高顯著，有些單株千粒重>6.5克，最高達(dá)7.1克，而一般推廣品種的千粒重約在4.04.5克，表明通過(guò)BnWRIl基因在油菜種子特異表達(dá)可培育出千粒重增加明顯的油菜育種材料。序列表〈110〉浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院〈120〉調(diào)節(jié)植物光能利用及油脂積累的基因及其應(yīng)用〈160>3〈210>1〈211>12420089]〈212>DNA0090]〈213〉蕓薹屬甘藍(lán)型油菜0091]〈400>10092]3tg朋g3g3Cccttaaccacttctccttcttcctcctcttctacttcttcttcggcctgt600093]atecttccgactcaatcagag3CtCC33ggCCC3皿Cg3gCC33皿gggC1200094]tctctgcgttctgatgttaacccaccagtcctgcctccacC3g3CgC3gC1800095]tctatctecagaggagtcactggac鄉(xiāng)gagatecg^gctcatctatgg2400096]cgtggaattcgattcag^ctctgggagca3000097]tetgacagcg3gg朋gC3gCtacgatctagctgctctcaagtactggggt3600098]CCC33C3CC3tcttgaactttccggttgaggg卿tgcag4200099]tttggcttctctccgccgcc卿gragtggtttctctaga4800100]ggcgtctcta朋tetcgcggcgtcgccaggcatcaccataatgga卿tggg啷ctcgg5400101]3ttgg朋gggtgtttgga朋caagtacttgtacctcggcacctataatac6000102]gctgcagctgcatatgacatggcggcteteg3gtecagaggtgc皿acgc6600103]ttcgacattggtaactecatcgaccggttagtgtcttcccgttccccgtg7200104]agctgttcttgCtg皿3CC37800105]g朋gagccteC3g朋g朋gtg卿C3gtgtgtcg皿a^gag^gag^g8400106]aacaacaaca卿agtggagg鄉(xiāng)cggtgatcacttgctgcattgattct■0107]tC3g3g3gC3atgagctggcttgggacttctgtetgatggattcagggtttgctccgttt9600108]ttgactgattcaaatctctcgagtg卿atcccattgagtatcctgagcttttcaatgag10200109]atgggttttgaggat^cattgacttcatggg^gc^gactgcttgagc10800110]ttggag朋tcttgattgttgcgatggtgttgttgtggtggga卿g卿gcccaacttca11400111]ttgtcgtcttctccgttgtcctgcttgtctactgactctgcttcatcaac12000112]gcaacaacagteacctctgtttcttggaactettctgtctga12420113]〈210>20114]〈211>4130115]〈212>PRT0116]〈213〉蕓薹屬甘藍(lán)型油菜0117]〈400>20118]MetLysArgProLeuThrThrSerProSerSerSerSerSerThrSerSerSer0119]510150120]AlaCyslieLeuProThrGinSerGluThrProArgProLysArgAlaLysArg0121]202530350122]AlaLysLysSerSerLeuArgSerAspValLysProGinAsnProThrSerPro0123]4045500124]AlaSerThrArgArgSerSerlieTyrArgGlyValThrArgHisArgTrpThr0125]556065700126]GlyArgTyrGluAlaHisLeuTrpAspLysSerSerTrpAsnSerlieGinAsn0127]758085900128]LysLysGlyLysGinValTyrLeuGlyAlaTyrAspSerGluGluAlaAlaAla0129]951001050130]HisThrTyrAspLeuAlaAlaLeuLysTyrTrpGlyProAsnThrlieLeuAsn0131]1101201251300132]PheProValGluThrTyrThrLysGluLeuGluGluMetGinArgCysThrLys0133]1351401450134]GluGluTyrLeuAlaSerLeuArgArgGinSerSerGlyPheSerArgGlyVal0135]1501551601650136]SerLysTyrArgGlyValAlaArgHisHisHisAsnGlyArgTrpGluAlaArg0137]1701751801850138]lieGlyArgValPheGlyAsnLysTyrLeuTyrLeuGlyThrTyrAsnThrGin0139]1901952000140]GluGluAlaAlaAlaAlaTyrAspMetAlaAlalieGluTyrArgGlyAlaAsn0141]2102152202250142]AlaValThrAsnPheAsplieGlyAsnTyrlieAspArgLeuLysLysLysGly0143]2302352400144]ValPheProPheProValSerGinAlaAsnHisGinGluAlaValLeuAlaGlu0145]2452502552600146]ThrLysGinGluValGluAlaLysGluGluProThrGluGluValLysGinCys0147]2652702752800148]ValGluLysGluGluAlaLysGluGluLysThrGluLysLysGinGinGinGlu0149]2852902950150]ValGluGluAlaVallieThrCysCyslieAspSerSerGluSerAsnGluLeu0151]3003053103150152]AlaTrpAspPheCysMetMetAspSerGlyPheAlaProPheLeuThrAspSer0153]3203253300154]AsnLeuSerSerGluAsnProlieGluTyrProGluLeuPheAsnGluMetGly0155]3353403453500156]PheGluAspAsnlieAspPheMetPheGluGluGlyLysGinAspCysLeuSer0157]3553603653700158]LeuGluAsnLeuAspCysCysAspGlyValValValValGlyArgGluSerPro0159]3753803850160]ThrSerLeuSerSerSerProLeuSerCysLeuSerThrAspSerAlaSerSer0161]3903954004050162]ThrThrThrThrAlaThrThrValThrSerVa:—SerTrpAsnTyrSerVal0163]4104154200164]〈210>20165]〈211>36090166]〈212>DNA12:0167]:0168]〈213〉蕓薹屬甘藍(lán)型油菜〈400>3ccttaaccacttctccttcttcctcctcttctecttcttcttcggcctgt60atecttccgactcaatcagag3CtCC33ggCCC3皿Cg3gCC33皿gggC120tctctgcgttctgatgttaacccaccagtcctgcctccacC3g3CgC3gC180tctatctecagaggagtcacteggttg卿attcttttag240atttgatttgggttatgttttttttttttttttttcteaactgcatttcgattgcatgtt300ctcatctetgggac^^gctcgtggaatt360cgattcag^c^ga^ggcctteatttttac^^^cccatcttgatt420gatctggccttttttttgttttgttttaatctgattttggtttctgttgt480ttgatctcaacctcactgcctcactctgcgccttgttcttctactcatcagtttetctgg540gteattttttteattgag^gtttg3tttggtC33g3gg3600gaatctcaactgctctgacgccgtaattgcaggagcatetgacagcgagg^gC3gC3gC660acatacgtacgatctagctgctctcaagtactggggtcccaacaccatcttgaactttcc720ttgattgattgatgcatgtttgttcttgtt780tCC^3C3ggC3C3皿gg3gCtgg3gg3g3tgrag卿tg840gagtetttggcttctctccgccgccagagcagtggtttctct卿ggcgt■ctctaaatatcgcggcgtcgccaggttctctcttttttctttttctttaattacgtgttt960gtttttaatttgatttggtatttccttttc1020cgcatttttttteategggtggtgacteaga^^g^^1080aatgtgattttttggaaattgactttttcataagatttgcttttegaatt1140tttetctctctctctctctctetcateattaacttttgttteagtecttgtcctgcaatt1200gagatgtttettgteatttgategctetegcttgattttc1260catttetcaaacattttttgttetttctttcccattttet1320ttgcaaatteggcatcaccateatgg皿gatggg皿gctc1380ggattgg皿gggtgtttggatgtecctcggcacctetegtacgtecatcc1440ttgactctttatcagattea1500tcattetcgtttec皿gggcateacggatc1560ctggtetttgagatettecaatgttttgagttegtttete1620ctttetectectettttctecgagttttetattetecttgtgatteagca1680tgtttegttggtc皿ttegatgggg郷ragtgagtgggggtttecacac1740cgagagttttgacatcatgtcccctcacttcatecteattgatttttetc1800gcattttcagagtettetttaactetctgacccctgcateattecctttt1860aaattctgcattttgtggatccaatectctctgcag皿gg1920g皿tetteacaccaactcttteatecteccctttttcaattcttttgatc1980gggtcctteggttetteatggatcttectt2040aagatgtttttegagtttctcggattcagtteteggcagtgtteteac皿2100皿gggC3C3tattettcagattttattttt皿皿teggag3gCC3gg3gC2160gtegt卿tgteteg皿teatgteacgtte222012/12頁(yè)ggcgcgtgtegcgcgtegctcacgtggteacactctcctctcacttcate2280皿皿ggac皿attegttcag皿gggctegg3CC皿3CCCgaggtcgatctggtctecttt2340tttttgtttgggtggtggtttggtttteagagttgagtctgttctcagte2400gC3gtC3Cg3gccctcacgtgcatgtttcatctctctctctctcteccatatctttcatc2460ttgtcctcagtggtctgctttgcaaattettgtcttcate2520tttettetgtgtteategtgcgtetteggagcttegagtt2580gacacteggttggtetttttatttgcteactegtcagteattgtecgttcgtgteattet2640ttetetettgttgcatttgttteagctecaaacttggactctttttegcgttt卿gcgg2700cgg卿gtgg3gtega皿tggtctcgtccacgcctcaactctetecgcatCtC3C3C3CC2760tetegtgteaccctegttgtccccacteacacgtcaccteattccctttggttttttgtc2820tttetteggcatecatectg2880ttggtg皿gtaactgttectgctgactttg2940tttggttgtgcagatacgca,ggagg皿gctgcagctgcatatgacatggcggctetegag300tec卿ggtgC皿3CgC3gtgaccaacttcgacattggteactecatcgaccggtte皿g3060tcttcccgttccccgtgagccaagcteatcatc皿g皿gctgttcttgct3120皿g皿gtggaagcte皿g皿gagcctecaggcagtgtgtc3180皿gcte皿gagag皿皿皿c皿c皿c皿ga3gtgg郷ag3240gcggtgatracttgctgcattgattcttcagagagc皿tgagctggcttgggacttctgt3300atgatggattcagggtttgctccgtttttgactgattcaaatctctcgagtgagaatccc3360attgagtetcctgagcttttc皿tgagatgggttttgaggateacattgacttcatgttc3420g郷皿gggaagc皿gactgcttgagcttggag皿tcttgattgttgcgatggtgttgtt3480gtggtggg皿gagagagcccaacttcattgtcgtcttctccgttgtcctgcttgtctect3540gactctgctt3c皿c3gteacctctgtttcttggaactet3600tctgtctga36091權(quán)利要求調(diào)控植物種子光合作用和脂肪酸合成代謝的轉(zhuǎn)錄因子，其為下述多肽之一①具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列的多肽；②將SEQIDNO2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列的多肽的功能由SEQIDNO2所示的氨基酸序列的多肽衍生的多肽。2.編碼權(quán)利要求1所述的調(diào)控植物種子光合作用和脂肪酸合成代謝的轉(zhuǎn)錄因子的基因，其為下述核苷酸序列之一①序列表中SEQIDNO:1所示的DNA序列；②編碼序列表中SEQIDNO:2的DNA序列；③與序列表中SEQIDNO:1限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有調(diào)控植物種子光合作用和脂肪酸合成代謝功能的核苷酸序列；④在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQIDNO:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述的基因的堿基序列如SEQIDNO:l所示。4.含有權(quán)利要求2所述基因的表達(dá)載體。5.含有權(quán)利要求2所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。6.擴(kuò)增權(quán)利要求2所述基因中任一片段的引物。7.編碼權(quán)利要求1所述的調(diào)控植物種子光合作用和脂肪酸合成代謝的轉(zhuǎn)錄因子的基因組基因，是下述核苷酸序列之一①序列表中SEQIDNO:3所示的DNA序列；②與序列表中SEQIDNO:1限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有調(diào)控植物種子光合作用和脂肪酸合成代謝功能的核苷酸序列；③在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQIDNO:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。8.調(diào)控植物種子光合作用和脂肪酸含量的方法，是利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將權(quán)利要求2所述基因?qū)胫参锝M織、細(xì)胞或器官，再將轉(zhuǎn)化的植物組織、細(xì)胞或器官培育成植株，植物種子光合作用能力和油脂含量獲得調(diào)控。9.根據(jù)權(quán)利要求9所述的調(diào)控植物種子光合作用和脂肪酸含量的方法，其特征在于對(duì)所使用的植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，加入植物可選擇性標(biāo)記或?qū)股亍⒊輨┑目剐詷?biāo)記。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的調(diào)控植物種子光合作用和脂肪酸含量的方法，其特征在于使用權(quán)利要求2所述的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種組成型、增強(qiáng)型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的調(diào)控植物種子光合作用和脂肪酸含量的方法，其特征在于轉(zhuǎn)基因的植株進(jìn)行繼代培養(yǎng)后，從中進(jìn)一步篩選出基因純合的轉(zhuǎn)基因植株；或者，轉(zhuǎn)基因的植株與其他品種的植物進(jìn)行雜交，對(duì)獲得的雜交后代植株進(jìn)行培養(yǎng)和檢測(cè)，從中進(jìn)一步篩選出種子光合作用效率、光能利用能力和油脂含量提高的植株。12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的調(diào)控植物種子光合作用和脂肪酸含量的方法，其特征在于所述的植物為十字花科、豆科或禾本科；優(yōu)選的植物為油菜、擬南芥、大豆、水稻、向日葵、橄欖樹(shù)、花生、棉花、蓖麻或煙草。全文摘要本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及到一種AP2/EREBP類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子BnWRI1基因及其在調(diào)節(jié)植物種子光合作用及油脂合成代謝中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的調(diào)控植物種子光合作用和脂肪酸合成代謝的轉(zhuǎn)錄因子，來(lái)源于蕓薹屬甘藍(lán)型油菜，其為下述多肽之一具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列的多肽；將上述的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有上述的氨基酸序列的多肽的功能由上述的氨基酸序列的多肽衍生的多肽。本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因?qū)τ谥参锱嘀差I(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，其能使植物對(duì)光合作用和脂肪酸合成代謝可以協(xié)同調(diào)控，并提高種子光合作用和油脂積累能力，從而提高植物產(chǎn)量和含油量、改良相關(guān)性狀。文檔編號(hào)C12N5/10GK101747417SQ20081016365公開(kāi)日2010年6月23日申請(qǐng)日期2008年12月22日優(yōu)先權(quán)日2008年12月22日發(fā)明者何海燕,吳學(xué)龍,柯麗萍,胡張華,薛紅衛(wèi),許永漢,邢梅青,黃銳之申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院