專利名稱：嗜熱脂肪芽孢桿菌及抗生素殘留檢測方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及抗生素的微生物檢測領域，尤其涉及一種嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)及以該菌株為指示菌進行抗生素殘留檢測的方法。

背景技術(shù)：
抗生素是一類由微生物和其他的生物在生命活動過程中合成的代謝產(chǎn)物或其衍生物，其在很低的濃度時就能夠抑制或干擾病原菌、病毒等的生命活動，如青霉素、四環(huán)素、金霉素、鏈霉素、氯霉素、磺胺類藥物等。在醫(yī)學上，抗生素被廣泛的應用于預防和治療多種微生物感染性疾病以及某些癌癥。在奶業(yè)的源頭中，抗生素使用頻率很高，特別是治療牛乳房炎，常常大劑量反復使用。據(jù)統(tǒng)計，約有十多種抗生素以一種或多種聯(lián)合的形式采用粉劑、涂擦劑、注射劑，以及乳導管注入等方式加以應用，導致抗生素殘留相當嚴重，在奶牛飼料中，也含有抗生素添加劑。許多抗生素如青霉素、四環(huán)素、磺胺類藥物及某些氨基糖苷類抗生素等均具有抗原性，能使部分易感人群發(fā)生過敏反應。輕者表現(xiàn)為蕁麻疹、發(fā)熱、關節(jié)腫痛及蜂窩組織炎等，嚴重時可出現(xiàn)喉頭水腫、呼吸困難、過敏性休克，甚至危及生命；有些抗生素具有一定毒性，長期用藥對服用者的肝腎功能具有一定損傷，甚至有致癌、致畸、致突變作用；并且可引起長期攝入者體內(nèi)耐藥菌增加，當有重大疾病需治療時抗菌藥物失效。牛奶中抗生素殘留是當前原料奶中不容忽視的問題，控制殘留的發(fā)生不僅需要對奶源進行有效管理，而且要建立先進的抗生素殘留檢測方法，從而加強奶源質(zhì)量管理。
檢測牛奶及其制品中抗生素殘留有多種方法，如微生物檢測法；理化檢測法；免疫法等。微生物法是抗生素殘留檢測最早采用的方法，目前已有多種商品試劑盒，如Delvotest、CharmScien等，以及我國國標TIC法。國標TIC法費用低但存在的問題也很多，如靈敏度較低，操作繁瑣，試驗菌的制備和使用還沒有統(tǒng)一的規(guī)定，不同菌株耐藥性不同、靈敏度也不同等等。微生物抗生素殘留檢測方法所采用的菌種有嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜熱乳酸鏈球菌、枯草芽孢桿菌以及藤黃八疊球菌等。國際乳品聯(lián)合會推薦的微生物檢測抗生素殘留菌種為嗜熱脂肪芽孢桿菌，它對抑制物質(zhì)的敏感性較高，生長較為快速，所以許多抗生素檢測試劑盒采用的是嗜熱脂肪芽孢桿菌。國外有關嗜熱脂肪芽孢桿菌的試劑盒較多，而國內(nèi)的商品化試劑盒較少，且大量使用商品化試劑盒檢測費用較高，開發(fā)一種操作方便、費用低、可靠、可用于大量檢測樣品中抗生素的檢測方法勢在必行。而其首要一環(huán)是篩選一個對多種抗生素普遍敏感且敏感性穩(wěn)定、檢出限低、生長迅速的指示菌，并抓住其有獨特的生物特性指示其萌發(fā)、生長代謝。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是篩選出不易受雜菌污染影響的、對β-內(nèi)酰胺類抗生素敏感的嗜熱脂肪芽孢桿菌株，并據(jù)此建立一種簡單、快速、靈敏度高、能夠普遍推廣應用的抗生素殘留微生物檢測方法。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 一種嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)2009，其保藏編號為CGMCC NO.3287。
一種抗生素殘留檢測方法，包括以下步驟 (1)菌株活化 將權(quán)利要求1所述的嗜熱脂肪芽孢桿菌CGMCC NO.3287菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為6.8～7.2，并在50～65℃的條件下進行優(yōu)化培養(yǎng)，并進行轉(zhuǎn)種繼代培養(yǎng)； (2)芽孢富集懸浮 加熱離心法將斜面菌種在50～65℃下培養(yǎng)3～5天，用生理鹽水洗下菌苔，轉(zhuǎn)移至無菌容器中，充分振蕩后，過濾，制成懸浮液，于70～80℃下加熱懸浮液10～15min，靜置過夜后，以2000r/min離心10～20min，取上清液，4000r/min離心10～20min，棄去上清液，如此反復離心洗滌4～5次后，用生理鹽水將離心沉淀懸浮成芽孢懸浮液，調(diào)整其OD600值至0.25～0.35，于0～4℃下貯存、備用； (3)紫色培養(yǎng)液配制 以重量百分比計，取葡萄糖、蛋白胨及水為配制成葡萄糖為1％、蛋白胨為1％、pH值為7.0～7.3的培養(yǎng)液，濾膜過濾滅菌后于每100mL營養(yǎng)液中加1.6％的溴甲酚紫溶液0.05～0.07mL； (4)芽孢桿菌的膠體包埋 取瓊脂加熱溶解于紫色培養(yǎng)液中制成瓊脂重量百分含量為1～2％的紫色培養(yǎng)基，取0.1～0.4mL芽孢懸浮液與50～100mL溫度為50～65℃的紫色培養(yǎng)基快速混勻，并迅速分裝于檢測小管中，于0～4℃下直立靜置，密封后0～4℃下保存、備用；瓊脂包埋法的優(yōu)勢在于生物相容性好，有利于芽孢的萌發(fā)及快速生長； (5)樣品檢測 檢測牛奶樣品于80～85℃水浴加熱10min，冷卻至50～60℃，取該檢測牛奶樣品0.05～0.1mL加到所述檢測小管中，密閉封口后于50～65℃水浴培養(yǎng)150min，培養(yǎng)液由藍紫色變?yōu)辄S色為陰性樣品，培養(yǎng)液仍為藍紫色則呈陽性樣品。
在上述抗生素殘留檢測方法中，可用下述溶菌酶法替代步驟(2)中所述加熱離心法 將活化斜面菌種接種到磷酸鹽緩沖液中，70～77℃加熱10min，置于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)18～20h，用生理鹽水洗下菌苔，將菌液移種于芽孢培養(yǎng)基中，于55～65℃下培養(yǎng)4天，用10mL生理鹽水洗下菌苔，并進行充分混合，以4000r/min離心15min，棄去上清液，加入含有溶菌酶的磷酸鹽緩沖液，37℃溫育1h，溫育后離心沉淀，棄上清液，如此反復離心洗滌5～6次，用生理鹽水將離心沉淀懸浮成芽孢懸浮液，將嗜熱脂肪芽孢桿菌懸浮液OD600值調(diào)整到0.25～0.35，在0～4℃條件下貯存、備用。
在上述抗生素殘留檢測方法中，可用下述芽孢桿菌的包埋方法替代所述步驟(4) 取1～4mL芽孢懸浮液與15～20mL 1.5％海藻酸鈉混勻，將其加入100～200mL 5％的CaCl2溶液中，于4℃靜置6h，抽濾出凝膠顆粒，用生理鹽水洗凈，每個檢測小管內(nèi)放入2～3個海藻酸鈣凝膠珠，密封于0～4℃下保存，備用；海藻酸鈣包埋法的優(yōu)勢在于制出的海藻酸鈣凝膠珠疏松多孔，親水性強，機械強度高，包埋量大和穩(wěn)定性好等特點，在生產(chǎn)上則具有成本低，制備工藝簡單和設備投資少等優(yōu)點。
且以下述方法替代所述步驟(5) 原料奶樣品于80～85℃水浴加熱10min，冷卻至50～60℃?zhèn)溆?，檢測時，分別向裝有海藻酸鈣凝膠珠的檢測小管中加入0.2～0.3mL紫色培養(yǎng)液，再加入檢測牛奶樣品0.05～0.1mL，密閉封口，于50～65℃水浴培養(yǎng)150min，培養(yǎng)液由藍紫色變?yōu)辄S色為陰性樣品，培養(yǎng)液仍為藍紫色則呈陽性樣品。
本發(fā)明具有積極有益的效果 1.篩選出的嗜熱脂肪芽孢桿菌CGMCC NO.3287具有以下特點(1)對β-內(nèi)酰胺類抗生素高度敏感；(2)菌株穩(wěn)定，易保存和制備；(3)在培養(yǎng)基中的均一性、分散性好，而且在包被材料中檢測萌發(fā)時擴散性比較強；(4)能夠在65℃左右快速生長，代謝產(chǎn)酸快。
2.建立了嗜熱脂肪芽孢桿菌CGMCC NO.3287的芽孢制備與包埋方法。
3.利用本發(fā)明進行牛奶抗生素殘留的檢測時間為2～3h，短于國內(nèi)同類方法的4h。
4.本發(fā)明方法與TIC法、發(fā)酵試驗方法相比，操作方便，靈敏度高(對青霉素的檢測極限值為0.003IU/mL，對阿莫西林抗生素的檢測極限值為4ug/kg)，結(jié)果易判斷；與商品試劑盒相比，成本低，相當于試劑盒價格的1/7；該方法簡單可行，可在一般實驗室進行操作。
本發(fā)明所述嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)2009，已于2009年9月18日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC NO.3287。

具體實施例方式 實施例1菌種篩選 (1)培養(yǎng)基制備 ①營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化鈉5g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL，將上述成分加入蒸餾水中，攪混均勻，120℃高壓滅菌15min。
②大豆胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基胰蛋白胨17.0g、植物蛋白胨3.0g、氯化鈉10.0g、葡萄糖2.5g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL，將上述成分加入蒸餾水中，攪混均勻，120℃高壓滅菌15min。
③錳鹽營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化鈉5g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL，將上述成分加入蒸餾水中，加入0.5％的硫酸錳溶液1mL，攪混均勻，120℃高壓滅菌15min。
④溴鉀酚紫葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基蛋白胨10g、葡萄糖5g、2％溴鉀酚紫乙醇溶液0.6mL、瓊脂4.0g、蒸餾水1000mL，在蒸餾水中加入蛋白胨、葡萄糖、瓊脂，加熱攪拌至完全溶解，調(diào)節(jié)pH至7.2，然后再加入溴鉀酚紫乙醇溶液，混勻后，115℃高壓滅菌30min。
(2)篩選方法 ①65℃生長能力 2006年4月從河南花花牛乳業(yè)有限公司所屬乳品廠周邊的5cm以下土壤深處采集土樣，制成10％的土壤混懸液，80℃加熱10min，應用生理鹽水進行稀釋分離，并傾注至營養(yǎng)瓊脂平板中，65℃培養(yǎng)12h，隨機挑選白色圓形菌落，轉(zhuǎn)移到大豆胰蛋白胨瓊脂斜面中。初步篩選出8株能夠在65℃以上生長的菌株，分別為S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8。
②抗生素敏感能力 向溴鉀酚紫葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中加入1％的經(jīng)過發(fā)酵試驗判定為含有抗生素殘留的牛奶，并接種上述大豆胰蛋白胨瓊脂斜面中的各菌株，65℃培養(yǎng)12h，觀察培養(yǎng)基顏色變化，各菌株顏色都為紫色，所有菌株對抗生素都有一定的敏感。
③糖發(fā)酵能力 向溴鉀酚紫葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中接種上述大豆胰蛋白胨瓊脂斜面中的各菌株，65℃培養(yǎng)12h，觀察培養(yǎng)基顏色變化(見表1)，挑選顏色變化為黃色的菌株(糖發(fā)酵能力較強的為S6，S8)，轉(zhuǎn)移到大豆胰蛋白胨瓊脂斜面中。
表1在溴鉀酚紫葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中的顏色變化
④抑菌試驗 根據(jù)上述實驗，選定S6，S8進行進一步的抑菌試驗。
芽孢懸浮液的制備將活化斜面菌種接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)18h～20h，用生理鹽水洗下菌苔，將菌液移種于盛有250mL錳鹽營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的克氏瓶內(nèi)，55℃培養(yǎng)4d，用10mL生理鹽水洗下菌苔，并進行充分混合，并用滅菌紗布進行過濾，濾液以4000r/min離心15min，棄上清液，如此重復5～6次，用生理鹽水懸浮芽孢，在0～4℃條件下貯存。
抗生素溶液的配制準確稱取適量青霉素、鏈霉素、卡鈉霉素、慶大霉素，用磷酸鹽緩沖液溶解并定容為5mg/mL的標準溶液，然后稀釋至500ug/mL，50ug/mL，5ug/mL；當天配制，當天使用。
檢驗用平板的制備取90mm滅菌玻璃培養(yǎng)皿，底層加10mL滅菌的抗生素檢測用培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂，凝固后上層加入5mL含有濃度為1×108cfu/mL芽孢的溴鉀酚紫葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基，凝固后備用。
測定將各抗生素溶液0.1mL加入于檢驗用平板上的4個紙片上，65℃培養(yǎng)4h，測量抑菌圈直徑。每個樣品，取三次平行試驗平均值，抑菌實驗結(jié)果見表2。
表2各菌株對抗生素抑菌性指標
實施例2菌株鑒定 對實施例1中所分離的菌株S8，通過生物學特性觀察，進行進一步的形態(tài)鑒定，結(jié)果如下 (1)生理鑒定 在胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)只形成針頭大小的菌落，菌體桿狀，不形成絲狀體，具有周身鞭毛，能運動，芽孢橢圓形，亞端生或端生，通常使孢囊膨大，能夠引起高溫殺菌乳平酸腐敗和甜凝乳等變質(zhì)現(xiàn)象；最低生長溫度為28℃，最適生長溫度為50～65℃，最高生長溫度為70～77℃，在pH6.8～7.2的培養(yǎng)基中生長良好，當pH值接近5時就不能生長。
(2)生化鑒定 65℃培養(yǎng)能夠快速生長葡萄糖，產(chǎn)酸； 沙氏葡萄糖肉湯，陰性； 吲哚，陰性； 硝酸鹽，50～85％的陽性； 靛基質(zhì)為陰性； V-P反應，陰性； 7％NaCl肉湯，陰性； 檸檬酸鹽，陰性； 酸性胰胨，不生長。
從菌株的各項形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和生理生化特征表明該菌株屬芽孢桿菌屬，且其在65℃培養(yǎng)能夠快速生長，所以將該菌株鑒定為嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)，發(fā)明人將其命名為2009。
實施例3一種抗生素殘留檢測方法，包括以下步驟 (1)菌株活化 嗜熱脂肪芽孢桿菌CGMCC NO.3287菌株接種于胰蛋白胨大豆的斜面培養(yǎng)基上，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為7.2，并在65℃的條件下進行優(yōu)化培養(yǎng)，每周轉(zhuǎn)種一次； (2)芽孢富集懸浮 加熱離心法將斜面菌種在65℃下培養(yǎng)4天，用10mL生理鹽水洗下菌苔，轉(zhuǎn)移至內(nèi)裝少量玻璃珠的無菌三角瓶中，振蕩，無菌棉花過濾至無菌容器中，制成一定濃度的懸浮液，將懸浮液在70～80℃加熱10min，靜置過夜，2000r/min離心15min，取上清液，4000r/min離心15min，如此反復離心洗滌4～5次后，用生理鹽水將離心沉淀懸浮成芽孢懸浮液，調(diào)整其OD600值到0.30，貯存于0～4℃。
(3)紫色營養(yǎng)液配制 以葡萄糖、蛋白胨及水為原料，配制成葡萄糖為1％、蛋白胨為1％、pH值為7.0～7.3的營養(yǎng)液，濾膜過濾滅菌后每100mL營養(yǎng)液中加1.6％的溴甲酚紫溶液0.05～0.07mL； (4)芽孢桿菌的膠體包埋 取瓊脂加熱溶解于紫色培養(yǎng)液中制成瓊脂重量百分含量為1～2％的紫色培養(yǎng)基，取0.1mL(芽孢數(shù)為104)芽孢懸浮液與50mL溫度為60℃的紫色培養(yǎng)基快速混勻，并迅速分裝于檢測小管(每管0.5mL)中，于0～4℃下直立靜置，密封后0～4℃下保存、備用； (5)樣品檢測 檢測牛奶樣品于80℃水浴加熱10min，冷卻至55℃，取該檢測牛奶樣品0.05mL加到所述檢測小管中，密閉封口后于65℃水浴培養(yǎng)150min，培養(yǎng)液由藍紫色變?yōu)辄S色為陰性樣品，培養(yǎng)液仍為藍紫色則呈陽性樣品。
實施例4一種抗生素殘留檢測方法，與實施例3基本相同，不同之處在于，以下述溶菌酶法替代步驟(2)中所述加熱離心法 將活化斜面菌種接種到磷酸鹽緩沖液中，75℃加熱10min，置于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)20h，用生理鹽水洗下菌苔，將菌液移種于盛有250mL芽孢培養(yǎng)基的克氏瓶內(nèi)，55℃培養(yǎng)4天，用10mL生理鹽水洗下菌苔，并進行充分混合，以4000r/min離心15min，棄去上清液，加入含有溶菌酶的磷酸鹽緩沖液，37℃溫育1h，溫育后的懸浮液8000r/min離心15min，棄去上清液，如此反復離心洗滌5～6次，用生理鹽水懸浮芽孢，將嗜熱脂肪芽孢桿菌懸浮液OD600值調(diào)整到0.29，在0～4℃條件下貯存?zhèn)溆谩?br> 實施例5一種抗生素殘留檢測方法，與實施例3基本相同，不同之處在于，以下述芽孢桿菌的包埋方法替代所述步驟(4) 取4mL芽孢懸浮液與20mL 1.5％海藻酸鈉混勻，用6號針頭擠入200mL 5％的CaCl2溶液中，于4℃靜置6h，抽濾出凝膠顆粒，用生理鹽水洗凈，每個檢測小管內(nèi)放入2～3個海藻酸鈣凝膠珠，密封0～4℃保存、備用； 且以下述方法替代所述步驟(5) 原料奶樣品于80℃水浴加熱10min，冷卻至55℃?zhèn)溆?，檢測時，分別向裝有海藻酸鈣凝膠珠的檢測小管中加入0.2mL紫色培養(yǎng)液，再加入檢測牛奶樣品0.05～0.1mL，密閉封口，于65℃水浴培養(yǎng)150min，培養(yǎng)液由藍紫色變?yōu)辄S色為陰性樣品，培養(yǎng)液仍為藍紫色則呈陽性樣品。
實施例6包埋芽孢與未包埋芽孢的比較 將同一批次的富集芽孢懸浮液一部分用海藻酸鈣包埋，一部分直接保存在懸浮液中，同時放在0～4℃保存。將保存的芽孢，分別在一周內(nèi)用平板計數(shù)檢測其存活芽孢數(shù)量(個/mL)，見表3。
表3存放時間的比較
從表3中可以看出包埋的芽孢存活數(shù)量在一周內(nèi)變化很小，而未芽孢存活數(shù)量在一周之內(nèi)變化較大，大部分喪失了活力。這表明，包埋的芽孢存放時間較長，便于保存。
實施例7穩(wěn)定性實驗 按實施例3中的方法制備好檢測小管于4℃下依次保存1周、2周、3周、4周，分別進行檢測并記錄其陰性檢測時間，見表4。
表3陰性檢測時間變化
從表4可以看出，由于芽孢有一個衰減的過程，因此芽孢數(shù)量會有一定的減少，陰性檢測時間會隨著時間的延長有所變化；陰性檢測時間變化較小，說明芽孢較為穩(wěn)定，從而能夠保證試驗的穩(wěn)定性。為保證試驗的準確性，每次試驗應做一陰性對照.其準確的檢測判定時間以陰性對照為準。本發(fā)明方法檢測牛奶中抗生素殘留的穩(wěn)定性前三周都穩(wěn)定在136min內(nèi)，到第四周為150min，所以此方法的檢測穩(wěn)定性為一個月。
實施例8與其他檢測方法的對照試驗 制備相同待測樣各40份，分別采取小樣發(fā)酵法、TTC法(國標GB5409-85)、試劑盒法(ECLIPSE50)和試紙條法(青霉素類)與本方法進行對照檢測其靈敏度。檢測結(jié)果見表5。
陽性率分別為小樣發(fā)酵法22.5％，TTC法25％，本方法23.75％，試劑盒法26.25％，試紙條法32.5％。本發(fā)明方法的靈敏度介于小樣發(fā)酵與試劑盒法之間，靈敏度具有可靠性。小樣發(fā)酵法的靈敏度較低，國標TTC法可疑樣品份數(shù)較多，而且操作比較復雜，菌液濃度難以控制；試劑盒法和試紙條法操作都比較簡單，其中試紙條法時間比較短，但它們經(jīng)過商品化，成本較高，一般一個樣品成本在20元左右，廣大奶牛場和乳品廠難以承受；本發(fā)明方法可以使每個樣品的檢測成本控制在5元之內(nèi)，大大降低了檢測成本。
表5各種方法的比較

權(quán)利要求
1.一種嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)2009，其保藏編號為CGMCC NO.3287。
2.一種抗生素殘留檢測方法，包括以下步驟
(1)菌株活化
將權(quán)利要求1所述的嗜熱脂肪芽孢桿菌CGMCC NO.3287菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為6.8～7.2，于50～65℃下進行優(yōu)化培養(yǎng)，并進行轉(zhuǎn)種繼代培養(yǎng)；
(2)芽孢富集懸浮
加熱離心法將斜面菌種在50～65℃下培養(yǎng)3～5天，用生理鹽水洗下菌苔，轉(zhuǎn)移至無菌容器中，充分振蕩后，過濾，制成懸浮液，于70～80℃下加熱懸浮液10～15min，靜置過夜后，以2000r/min離心10～20min，取上清液，4000r/min離心10～20min，棄去上清液，如此反復離心洗滌4～5次后，用生理鹽水將離心沉淀懸浮成芽孢懸浮液，調(diào)整其OD600值至0.25～0.35，于0～4℃下貯存、備用；
(3)紫色培養(yǎng)液配制
以重量百分比計，取葡萄糖、蛋白胨及水為配制成葡萄糖為1％、蛋白胨為1％、pH值為7.0～7.3的培養(yǎng)液，濾膜過濾滅菌后于每100mL營養(yǎng)液中加1.6％的溴甲酚紫溶液0.05～0.07mL；
(4)芽孢桿菌的膠體包埋
取瓊脂加熱溶解于紫色培養(yǎng)液中制成瓊脂重量百分含量為1～2％的紫色培養(yǎng)基，取0.1～0.4mL芽孢懸浮液與50～100mL溫度為50～65℃的紫色培養(yǎng)基快速混勻，并迅速分裝于檢測小管中，于0～4℃下直立靜置，密封后0～4℃下保存、備用；
(5)樣品檢測
檢測牛奶樣品于80～85℃水浴加熱10min，冷卻至50～60℃，取該檢測牛奶樣品0.05～0.1mL加到所述檢測小管中，密閉封口后于50～65℃水浴培養(yǎng)150min，培養(yǎng)液由藍紫色變?yōu)辄S色為陰性樣品，培養(yǎng)液仍為藍紫色則呈陽性樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗生素殘留檢測方法，其特征在于，以下述溶菌酶法替代步驟(2)中所述加熱離心法
將活化斜面菌種接種到磷酸鹽緩沖液中，70～77℃加熱10min，置于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)18～20h，用生理鹽水洗下菌苔，將菌液移種于芽孢培養(yǎng)基中，于55～65℃下培養(yǎng)4天，用10mL生理鹽水洗下菌苔，并進行充分混合，以4000r/min離心15min，棄去上清液，加入含有溶菌酶的磷酸鹽緩沖液，37℃溫育1h，溫育后離心沉淀，棄上清液，如此反復離心洗滌5～6次，用生理鹽水將離心沉淀懸浮成芽孢懸浮液，將嗜熱脂肪芽孢桿菌懸浮液OD600值調(diào)整到0.25～0.35，在0～4℃條件下貯存、備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗生素殘留檢測方法，其特征在于，以下述芽孢桿菌的包埋方法替代所述步驟(4)
取1～4mL芽孢懸浮液與15～20mL 1.5％海藻酸鈉混勻，將其加入100～200mL5％的CaCl2溶液中，于4℃靜置6h，抽濾出凝膠顆粒，用生理鹽水洗凈，每個檢測小管內(nèi)放入2～3個海藻酸鈣凝膠珠，密封于0～4℃下保存，備用；
且以下述方法替代所述步驟(5)
原料奶樣品于80～85℃水浴加熱10min，冷卻至50～60℃?zhèn)溆?，檢測時，分別向裝有海藻酸鈣凝膠珠的檢測小管中加入0.2～0.3mL紫色培養(yǎng)液，再加入檢測牛奶樣品0.05～0.1mL，密閉封口，于50～65℃水浴培養(yǎng)150min，培養(yǎng)液由藍紫色變?yōu)辄S色為陰性樣品，培養(yǎng)液仍為藍紫色則呈陽性樣品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種嗜熱脂肪芽孢桿菌及利用該菌株進行抗生素殘留檢測的方法。所篩選出的菌株保藏編號為CGMCC NO.3287；以該菌株為指示菌所建立的抗生素殘留檢測方法包括菌株復壯、活化；芽孢懸浮液富集制備；紫色培養(yǎng)液配制；芽孢桿菌包埋；樣品檢測等步驟。菌株CGMCC No.3287穩(wěn)定、易保存和制備，對B-內(nèi)酰胺類抗生素高度敏感；在培養(yǎng)基中的均一性、分散性好；可在65℃快速生長，代謝產(chǎn)酸快。本發(fā)明方法與TIC法、發(fā)酵試驗方法相比，操作方便，靈敏度高，耗時為2～3h，短于國內(nèi)同類方法的4h，結(jié)果易判斷；與商品試劑盒相比，成本低，相當于試劑盒價格的1/7；該方法簡單可行，可在一般實驗室進行操作。
文檔編號C12Q1/18GK101724586SQ20091006628
公開日2010年6月9日 申請日期2009年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月28日
發(fā)明者李文獻, 王少武, 李紅, 李永軍, 周霞, 馮利青, 馬偉華, 劉燕, 張偉麗, 劉軍, 王亞昆, 李愛華 申請人:河南花花牛乳業(yè)有限公司