專利名稱：甄別活性單增李斯特菌的實時熒光pcr試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甄別活性單核細胞增生李斯特菌(Z^tenb 簡稱單增李斯特菌)的實時熒光PCR試劑盒及^f企測方法。
(二)
背景技術(shù)：
李斯特菌在微生物分類中歸革蘭氏陽性無芽孢桿菌中的位置不定屬， 該屬內(nèi)共有7種菌(單增李斯特菌丄.mowx^togewes,綿羊李斯特菌 丄./wa"w7、英諾克李斯特菌丄./朋ocwa,威爾斯李斯特菌丄.we/s/7/附eW，西爾 李斯特菌Z."e/^eW，格氏李斯特菌丄.grqy/,默氏李斯特菌丄.mz^r，)，其 中僅單核細胞增生李斯特菌對人有致病性。單核細胞增生李斯特菌廣泛存 在于土壤、水、植物、人和動物的糞便中，中毒癥狀嚴重，除了常見的嘔 吐、腹瀉等胃腸道表現(xiàn)外，還可以侵蝕人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)(主要表現(xiàn)腦膜 炎、敗血癥、流產(chǎn)等疾病)，對機體造成極大地傷害，并且死亡率極高， 容易引起李斯特菌病的大暴發(fā)。畜禽產(chǎn)品、蛋、乳制品、蔬菜及各種肉類 食品是單增李斯特菌主要的污染源。該致病菌還被列為90年代威脅食品安 全的四大致病菌(單增李斯特菌，致病性大腸桿菌，肉毒梭菌，親水氣單 胞菌)之一。由于單增李斯特菌在4。C的環(huán)境中仍能正常生長繁殖，經(jīng)常 污染冷凍食品，因此也是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。
目前常規(guī)鑒定單增李斯特菌的方法仍然以常規(guī)培養(yǎng)方法為主，根據(jù)生 化特性、致病力及協(xié)同溶血試驗等進行鑒定，鑒定周期需要5 10天。一 些分子生物學技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到了致病菌的檢測領(lǐng)域。實時熒光定量 PCR技術(shù)具有快速、準確、可定量等優(yōu)點。目前對于食品安全中致病菌診斷所采用的方法均是針對致病菌的基因組DNA，缺點是無法對食品中
致病菌的死活狀態(tài)進行準確甄別，這樣會導致在解決食品安全問題過程 中，數(shù)據(jù)不完整，引發(fā)一系列不必要預(yù)防和治療措施。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是根據(jù)單增李斯特菌溶血素A基因設(shè)計引物和TaqMan 探針，提供一種甄別活性單增李斯特菌的實時熒光PCR試劑盒及檢測方 法，可實現(xiàn)對單增李斯特菌快速、準確、特異檢測，并能夠有效甄別菌體 的死活狀態(tài)。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
一種甄別活性單核細月包增生李斯特菌(丄&ter/a mo"oc_ytogew^ )的實 時熒光PCR試劑盒，主要包括特異性引物和熒光探針、PCR緩沖液、脫 氧三磷酸核香混合物和DNA聚合酶，所述特異性引物和熒光探針序列如 下
上游引物5'-CGGAGGTTCCGCAAAAGATG-3' 下游引物5'- CCTCCAGAGTGATCGATGTT隱3' 熒光4笨4十5 '陽FAM- AAATCATCGACGGCAACCTC畫TAMRA-3' 其中FAM為熒光才艮告基團，TAMRA為熒光淬滅基團。 本發(fā)明關(guān)鍵在于特異性引物和熒光探針序列的設(shè)計及檢測方法，試劑 盒中其他組成，可按本領(lǐng)域常規(guī)進行選擇，該試劑盒可用作單增李斯特菌 的定性檢測，也可加入標準菌抹標準品進行定量檢測。
為達到定量檢測的效果，所述試劑盒還包括單核細胞增生李斯特菌標 準菌林RNA標準品。以梯度濃度的單增李斯特菌標準菌抹(CMCC 54001 )RNA溶液在與樣品RNA相同條件下進行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增反應(yīng)， 以單增李斯特菌標準菌林(CMCC 54001 )濃度的對數(shù)值為橫坐標、Ct值為縱坐標繪制標準曲線；才艮據(jù)樣品測得的Ct值，對照標準曲線，則可
獲得樣品單增李斯特菌的濃度。
本發(fā)明還涉及一種甄別活性單核細胞增生李斯特菌的實時熒光PCR -險測方法，所述方法包括
(1) 按照常規(guī)方法提取待測樣品RNA;提取可采用市購RNA提取 試劑盒，如采用promage ^>司的試劑盒SV Total RNA Isolation Z3100等，操作按照試劑盒標示進行即可。
(2) 按照本領(lǐng)域常規(guī)方法對樣品RNA迸行反轉(zhuǎn)錄，得到樣品cDNA; 反轉(zhuǎn)錄是以RNA為模板合成DNA的過程，也稱逆轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)可以利用01igo(dT;h5或隨機引物引導。如果需要由 3，Poly(A)區(qū)域引導，選用01igo(dT:h5引物；如果需要引導全 長RNA，選用隨機引物。
本發(fā)明中，樣品RNA反轉(zhuǎn)錄方法如下取2.5 jag總RNA與1.0 pL 的10mM脫氧三磷酸核苷混合物和1.0iiL的隨機引物(0.5^g/VL)
(寶生物大連有限公司，D3801 )混勻后將反應(yīng)體積用DEPC (焦碳 酸二乙酯)水補充至10pL, 65。C孵浴5分鐘后立即置水浴3分鐘，力口 入10 x反轉(zhuǎn)錄緩沖液2 (iL， 25 mM MgCl2 4.0 pL， 0.1 M二硫蘇糖醇 2.0 pL， RNA酶抑制劑(寶生物大連有限7>司，D2310A) 1.0 混 勻后42。C將浴2分鐘。力口入l.0 fiL Reverse Transcriptase XL (AMV )
(寶生物大連有限公司，D2620 ) ( 5U/|iL ),混勻后42。C孵浴50分鐘， 7(TC將浴15分鐘終止反應(yīng)后冰浴，得到cDNA分裝，-20。C保存，待用。 10 x反轉(zhuǎn)錄緩沖液表示其組分終濃度為l x反轉(zhuǎn)錄緩沖液的10倍(1
x反轉(zhuǎn)錄緩沖液組成為10mMTris-HCl[pH9.0, 25°C], 50mMKCl， 0.1% Triton X-100)。
6(3)以樣品cDNA為模板，與特異性引物和熒光探針、PCR緩沖液、 脫氧三磷酸核香混合物和DNA聚合酶混合配制PCR反應(yīng)體系， 進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物置于定量PCR儀進行熒光檢測； 所述特異性引物和熒光4笨針序列如下 上游引物5'-CGGAGGTTCCGCAAAAGATG-3' 下游引物5'- CCTCCAGAGTGATCGATGTT隱3' 熒光探針5 '-FAM- AAATCATCGACGGCAACCTC -TAMRA-3' 其中FAM為熒光l艮告基團，TAMRA為熒光淬滅基團； (4 )擇熒光檢測模式FAM熒光，基線調(diào)整取3 ~ 15個循環(huán)的熒光信 號，以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設(shè)定闊值線；若 待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈良好的對數(shù)增長，則 判斷為陽性，即樣本中存在活的單核細胞增生李斯特菌。 所述陰性對照品可按本領(lǐng)域常規(guī)方法選擇,通常選擇不含靶基因的非 輩巴細菌，如副溶血性弧菌、志賀菌、沙門菌等。
定量檢測時，同時以梯度濃度的單增李斯特菌標準菌林RNA溶液在 與樣品RNA相同條件下進行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物置于定 量PCR儀進行熒光檢測，以單核細胞增生李斯特菌標準菌林濃度的對數(shù) 值為橫坐標、Ct值為縱坐標繪制標準曲線；根據(jù)待測樣品測得的Ct值， 對照標準曲線，獲得待測樣品單核細胞增生李斯特菌的濃度。
所述步驟(3) PCR反應(yīng)體系可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法配制，本發(fā)明中 PCR反應(yīng)體系終濃度組成如下
PCR緩沖液 終濃度為lx
脫氧三磷酸核苷混合物 各0.2 mmol/L
MgCl2 5mmol/L上游引物 O.5(imol/L
下游引物 O.5pmol/L
探針 O.5fmiol/L DNA聚合酶 0.5U/反應(yīng) 模板cDNA 10 102ng/pL
溶劑為ddH20。
所述PCR反應(yīng)條件可按參照本領(lǐng)域常規(guī)熒光定量PCR方法，具體的， 步驟(3 ) PCR反應(yīng)條件如下93°C預(yù)變性5min; 93°C 20s， 55°C 30s, 共40個循環(huán)。
本發(fā)明建立了利用TaqMan熒光定量PCR技術(shù)甄別活性單增李斯特 菌的方法，并經(jīng)檢測模擬雙盲食品污染樣本，表明該方法切實可行。由于 本方法采用了反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增技術(shù)，^r測的菌體RNA，因此能夠準確 的甄別菌體的死活狀態(tài)，同時使得細菌的檢測敏感性大大提高，而且由于 熒光探針的應(yīng)用，使得其特異性亦大大提高，降低了常規(guī)PCR擴增的假 陽性率，使得我們可以在極少的標本中獲得足夠的信息。
本發(fā)明采用了反轉(zhuǎn)錄和特異性熒光探針雜交定量PCR檢測技術(shù)，在 保持高敏感性的前提下盡量減少假陽性干擾，同時本發(fā)明能夠有效的甄別 菌體的死活狀態(tài)。在實時熒光定量PCR檢測技術(shù)出現(xiàn)之前，人們對PCR 模板的定量不論是直接PCR還是竟爭性PCR,基本上都要通過PCR產(chǎn)物 電泳，再將電泳結(jié)果經(jīng)計算機圖像處理，根據(jù)電泳條帶的亮度來確定最終 PCR產(chǎn)物量的多少，或?qū)擞浀腜CR產(chǎn)物以ELISA的方式進4f4全測， 再由此推測起始模板的量，但這些方法實際上都屬于半定量水平，因為即 使PCR條件已最優(yōu)化，電泳及后續(xù)步驟的操作的不穩(wěn)定性仍會給結(jié)果分 析帶來影響，從而影響定量這一目的。隨著實時熒光定量PCR技術(shù)的出
8現(xiàn)，人們可以真正地做到對PCR模板的精確定量，這種定量不僅保持了
常規(guī)PCR的高靈敏性，而且由于特異性熒光探針雜交技術(shù)的應(yīng)用，使得 被檢測基因的特異性大大提高。而且，目前很多的熒光定量PCR技術(shù)均 是檢測細菌的DNA,因為DNA不容易降解，因此無法對菌體的死活狀 態(tài)進行區(qū)分，使得檢測的結(jié)果不全面。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在能夠有效的甄別細菌死活狀態(tài)，而且 細菌的檢測敏感性高，特異性好，降低了常規(guī)PCR擴增的假陽性率；可 實現(xiàn)對活性單增李斯特菌進行快速、準確、特異檢測。
(四)


圖1為反轉(zhuǎn)錄結(jié)合實時熒光定量PCR標準菌林檢測單核增生李斯 特菌實時熒光定量PCR標準菌林(CMCC 54001 )檢測結(jié)果，從左至右 分別為107、 106、 105、 104、 103、 102、 10'CFU/mL標準品。
圖2為實時熒光定量PCR標準曲線。標準曲線為Y = -3.047xX + 41.456 ， Y:對應(yīng)的CT值；X:細菌的CFU的對數(shù)值。
圖3為20例模擬雙盲食品污染樣本反轉(zhuǎn)錄結(jié)合熒光定量PCR檢測結(jié)果。
(五)
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述,但本發(fā)明的保護范圍 并不僅限于此
實施例1:特異性引物、熒光探針 1、材料
纟田菌RNA提耳又試劑購自promega 7>司(SV Total RNA Isolation Z3100 ); Taq DNA聚合酶購自美國Promega公司，377型測序儀及7000型定量PCR儀均為美國ABI公司產(chǎn)品。 2、引物及探針設(shè)計與合成
以單核增生李斯特菌溶血素A基因序列(注冊號為EU372055 )為模 板，使用Primer Express (V2.0，美國ABI公司)軟件分析TaqMan引 物和探針位點，從中選擇最佳組合。
上游引物5'-CGGAGGTTCCGC AAAAGATG畫3'
下游引物5 '畫CCTCCAGAGTGATCGATGTT陽3'
熒光才笨針5 '-FAM- AAATCATCGACGGCAACCTC -TAMRA-3' 其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團。
均由大連寶生物工程有限公司合成。
實施例2:熒光定量PCR法檢測模擬食品污染單核增生李斯特菌 1、樣本4企測
用標準菌株(CMCC 54001 )制備20例雙盲食品樣本，經(jīng)生理鹽水 洗滌后離心，采用細菌RNA提取試劑提取RNA，分別取2.5 做模板 進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后用檢測用上下游引物及探針在ABI公司7000型定 量PCR儀上進行PCR擴增。 (1)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)如下①取2.5嗎總RNA與1.0 (iL的10 mM脫氧三磷 酸核苷混合物和l.O(iL的隨機引物(0.5嗎/pL)(寶生物大連有限公司， D3801 )混勻后將反應(yīng)體積用DEPC(焦碳酸二乙酯)水補充至10pL。 65°C 孵浴5分鐘后立即置水浴3分鐘。②加入10 x反轉(zhuǎn)錄緩沖液2 pL, 25 mM MgCl24.0nL， 0.1 M二硫蘇糖醇2.0 |iL, RNA酶抑制劑(寶生物大連有 限公司，D2310A) 1.0 pL，混勻后42。C卵孚浴2分鐘。加入1.0 ReverseTranscriptase XL (AMV)(寶生物大連有P艮公司，D2620 ) (5U/nL)，混 勻后42。C孵浴50分鐘。70。C孵浴15分鐘終止反應(yīng)后冰浴，獲得cDNA。 (2)實時熒光定量PCR反應(yīng)
PCR反應(yīng)液通常按如下組成配制(終濃度)包括lxPCR緩沖液， 0.2 mmol/L脫氧三磷酸核苷混合物，5mmol/L MgCl2,上游引物 0.5plmol/L，下游引物O.5pmol/L,探針0.5pmol/L， DNA聚合酶0.5U, 模板cDNA ( 102 ng/ ju L ) 2(iL，用ddH20補足至20jaL。
PCR反應(yīng)條件93°C預(yù)變性5min; 93 °C 20s， 55°C 30s,共40個 循環(huán)。
以非輩巴細菌(副溶血性弧菌、志賀菌、沙門菌)為陰性對照于相同 條件下進行反轉(zhuǎn)錄和PCR檢測，以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高 點設(shè)定閾值線；若待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈良好的對數(shù)增 長，則判斷為陽性。
同時在相同條件下以不同濃度標準菌林標準品進行檢測，并繪制標 準曲線。
待測樣本的測定結(jié)果經(jīng)儀器處理根據(jù)標準曲線計算出檢測樣本中的 單核增生李斯特菌的數(shù)量。 2、 樣品檢測結(jié)果
標準菌抹制備標準品的檢測結(jié)果參見圖1,標準曲線參見圖2。 結(jié)果顯示雙盲樣本中IO份;險測出存在活性單核增生李斯特菌，另外 IO傷"險測結(jié)果為陰性。上述結(jié)果與制備雙盲樣本的結(jié)果完全一致，其中 檢測陰性的樣本中包括5份失活的單增李氏菌、1份綿羊李斯特菌、1份 希爾李斯特菌、l份格雷氏李斯特菌、l份志賀氏菌、l份沙門氏菌。本發(fā)明是結(jié)合最佳實施例進行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi) 容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同 樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。SEQUENCE LISTING <110>浙江省疾病預(yù)防控制中心
<120>甄別活性單增李斯特菌的實時熒光PCR試劑盒及檢測方法
<130>
<160> 3
<170> Patentln version 3.4
<210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown
<220>
<223>人工序列 <400> 1
cggaggttcc gcaaaagatg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223>人工序列
<400> 2
cctccagagt gatcgatgtt 20
<210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown
<220>
<223>人工序列 <400> 3
aaatcatcga cggcaacctc 20
權(quán)利要求
1. 一種甄別活性單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的實時熒光PCR試劑盒，主要包括特異性引物和熒光探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特異性引物和熒光探針序列如下上游引物5′-CGGAGGTTCCGCAAAAGATG-3′下游引物5′-CCTCCAGAGTGATCGATGTT-3′熒光探針5′-FAM-AAATCATCGACGGCAACCTC-TAMRA-3′其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團。
2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括單核細胞 增生李斯特菌標準菌抹的RNA標準品。
3. —種甄別活性單核細胞增生李斯特菌的實時熒光PCRJ企測方法，所述 方法包括(1) 提取待測樣品RNA;(2) 對樣品RNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到樣品cDNA;(3) 以樣品cDNA為模板，與特異性引物和熒光探針、PCR緩沖液、 脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶混合配制PCR反應(yīng)體系， 進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物置于定量PCR儀進行熒光檢測； 所述特異性引物和熒光探針序列如下上游引物5 '-CGGAGGTTCCGCAAAAGATG隱3' 下游引物5'- CCTCCAGAGTGATCGATGTT-3' 焚光4笨針5 '-FAM- AAATCATCGACGGCAACCTC -TAMRA-3' 其中FAM為焚光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團； (4 )擇熒光檢測模式FAM熒光，基線調(diào)整取3 ~ 15個循環(huán)的熒光信號，以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設(shè)定閾值線；若待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈良好的對數(shù)增長，則判斷 為陽性，即樣本中存在活的單核細胞增生李斯特菌。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法同時以梯度濃度的單 核增生李斯特菌標準菌抹RNA溶液在與樣品RNA相同條件下進行反 轉(zhuǎn)錄和PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物置于定量PCR儀進行熒光檢測，以單 核細胞增生李斯特菌標準菌林濃度的對數(shù)值為橫坐標、Ct值為縱坐標 繪制標準曲線；根據(jù)待測樣品測得的Ct值，對照標準曲線，獲得待測 樣品單核細胞增生李斯特菌的濃度。
5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟(3 )中PCR反應(yīng)體系 終濃度組成如下PCR緩沖液 脫氧三磷酸核苷混合物 MgCl2 上游引物 下游引物 探針DNA聚合酶 模板cDNA 溶劑為ddH20。
6. 如權(quán)利要求3所述的方法， 如下93°C預(yù)變性5min;終濃度為lx 各0.2 mmol/L5mmol/L 0.5jimol/L 0,5|imol/L 0.5拜ol/L 0.5U/反應(yīng)10~102ng/VL其特征在于所述步驟(3 )中PCR反應(yīng)條件 93 °C 20s， 55°C 30s,共40個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種甄別活性單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的實時熒光PCR試劑盒，主要包括特異性引物和熒光探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特異性引物和熒光探針序列如下上游引物5′-CGGAGGTTCCGCAAAAGATG-3′下游引物5′-CCTCCAGAGTGATCGATGTT-3′熒光探針5′-FAM-AAATCATCGACGGCAACCTC-TAMRA-3′其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在能夠有效的甄別細菌死活狀態(tài)，而且細菌的檢測敏感性高，特異性好，降低了常規(guī)PCR擴增的假陽性率；可實現(xiàn)對活性單增李斯特菌進行快速、準確、特異檢測。
文檔編號C12Q1/68GK101463387SQ20081016376
公開日2009年6月24日 申請日期2008年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月31日
發(fā)明者政 張, 梅玲玲, 程蘇云, 金大智 申請人:浙江省疾病預(yù)防控制中心