專利名稱::缺陷假單胞菌在降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的應(yīng)用及制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明涉及缺陷假單胞菌(yas'ezy^7服;瓜wf/./孤7w/;s)在降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用,以及利用該菌株制備的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的降解制劑。(二)
背景技術(shù):
:擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是模擬天然的除蟲菊酯而合成,含有多個苯環(huán)結(jié)構(gòu)的-類殺蟲劑,具有廣譜高效、低毒、耐光、熱等特點,其品種數(shù)和使用量僅次于有機磷農(nóng)藥,占殺蟲劑市場的第二位,在茶葉、蔬菜等經(jīng)濟作物害蟲防治中得到廣泛應(yīng)用,常用的有聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯等。但是這類農(nóng)藥普遍具有對環(huán)境穩(wěn)定、降解速度慢、降解率低,殘留過高,帶來了食品安全問題,特別是我國加入WTO后,"關(guān)稅壁壘"隨之拆除,國外針對我國入關(guān)而頒布的農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥的最大殘留量(MRL)標準帶有明顯的"技術(shù)壁壘"傾向,特別是針對茶葉,農(nóng)藥檢測范圍大幅度擴大,擬除蟲菊酯類農(nóng)藥MRL標準明顯降低,使我國茶葉等農(nóng)產(chǎn)品出口面臨著更為嚴峻的挑戰(zhàn)。農(nóng)藥殘留是吸附、降解和遷移等綜合作用后結(jié)果,其中降解是制約其殘留量的關(guān)鍵過程,控制農(nóng)藥殘留有多種途徑,包括禁用農(nóng)藥、化學(xué)處理方法和微生物降解等。大量研究表明微生物對土壤和水環(huán)境中的農(nóng)藥降解起著關(guān)鍵作用,研究發(fā)現(xiàn)了大批能降解或轉(zhuǎn)化農(nóng)藥的微生物類群,如細菌、放線菌、真菌和藻類,在對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解研究中發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬(/^e"GbM/7ss.sp)、腸桿菌屬(f力terofecte.sp)、產(chǎn)堿桿菌屬C4Jcah'ge/7es.sp)和芽孢桿菌屬(^3"'77z/s.sp)等對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥具有降解作用。但大多數(shù)微生物降解針對某一或少數(shù)幾個農(nóng)藥,而同時能降解多種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的微生物報道較少。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供可同時降解多種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的微生物菌種——缺陷假單胞菌(Asew7b,;/MsJ/瓜/m"a)在降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用,以及利用該菌株制備的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解制劑。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是缺陷假單胞菌(AeW/offl0/;asA'歷/w"a)在降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用。具體的,所述缺陷假單胞菌用于同時降解聯(lián)苯菊酯(CAS:83322-02-5)、甲氰菊酯(CAS:39515-11-8)和氯氰菊酯(CAS:5231.507-8)三種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留。發(fā)明人進行了長期的研究,從擬除蟲菊酯類農(nóng)藥生產(chǎn)車間下水道馴化過的污泥中分離得到1株能同時降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的高效菌M5R14,經(jīng)SherlockMIS系統(tǒng)鑒定為假單胞菌菌屬(Ae,W湖o朋s.sp)中的缺陷假單胞菌(/75,e(/fio/anasc/j'/Hi/7〖/ta)。該降解菌M5R14具有如下特性(1)該菌為球菌,好氧型,大小O.5X1.21.7um,革蘭氏陰性,能夠以3種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥為唯一碳源生長。(2)根據(jù)SherlockMIS軟件系統(tǒng)對菌M5R14脂肪酸定性和定量的分析生成的脂肪酸圖譜,對比Library數(shù)據(jù)庫,初步鑒定菌株M5R14為假單胞菌菌屬(psew/off/OTas'.sp)中的缺陷假單胞菌(/入sewi9/"0/7ssrf/啦'/7,"a),相似指數(shù)SI為0.926。(3)在通氣、p朋.0~7.0、30°C、0D4J.2、農(nóng)藥濃度100mgL人轉(zhuǎn)速180rmin1條件下,對含有聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的混合培養(yǎng)基,培養(yǎng)3天,3種農(nóng)藥的降解率分別為43.78%,43.91%,43.75%。(1)降解過程符合一級動力學(xué)方程模型,三種農(nóng)藥的降解半衰期~2為97.6,106.6,101.9h。降解率與接菌量(0D1l5ra)、通氣量、振蕩速率呈正相關(guān)。具體的,所述降解在通空氣或氧氣、pH6.07.0、2530°C、OD化J.10.2、各農(nóng)藥濃度(指單一農(nóng)藥的濃度)50100mg*L—'的條件下進行。優(yōu)選的,所述降解在通空氣或氧氣、pH7.0、30°C、OD415n0.2、各農(nóng)藥濃度lOOmg'L—]的條件下進行。經(jīng)大量實驗篩選驗證,獲得菌株M5R14對三種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的最佳降解條件如下(1)接種量的影響聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的濃度均為100mg*L—'的混合培養(yǎng)基,分別接種不同初始OD仙J直的菌液培養(yǎng)3天,發(fā)現(xiàn)3種農(nóng)藥的降解率與菌液接種量0D化^值呈正相關(guān);接種量以O(shè)D涵值0.15或0.2為宜。(2)農(nóng)藥濃度的影響聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的各自濃度分別為25,50,100,150,200,250mg*L—'的混合培養(yǎng)基,接種量0U.2,培養(yǎng)3天,發(fā)現(xiàn)各農(nóng)藥濃度為50、100mgL—'的混合培養(yǎng)基中,菌株M5R14對3種農(nóng)藥的降解率相對較高,降解率〉40%;農(nóng)藥濃度增加,農(nóng)藥的降解率下降。(3)溫度的影響聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的濃度為100mg'L—'的混合培養(yǎng)基,接種0D4l5nm0.2菌種,于不同溫度培養(yǎng)3天,發(fā)現(xiàn)30。C時菌株M5R14對3種農(nóng)藥的降解效果最好,降解率分別達到43.78%,43.91%,43.75%。(4)酸度的影響聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的濃度為100mg*L—'的混合培養(yǎng)基,接種0D化J).2菌種,于不同pH培養(yǎng)3天,發(fā)現(xiàn)p朋.(T7.0,菌株M5R14對3種農(nóng)藥的降解率最高。pH7.0時菌株M5R14對3種農(nóng)藥的降解率分別為43.78%,43.91%,43.75%。(5)振蕩速率的影響聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的濃度為100mg*L—'的混合培養(yǎng)基,接種0DwJ).2菌種,于不同搖床轉(zhuǎn)速培養(yǎng)3天,發(fā)現(xiàn)3種農(nóng)藥降解率與振蕩速率呈正相關(guān)。(6)裝液量的影響聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的濃度為100mg*L—'的混合培養(yǎng)基,接種OD化J).2菌種,不同裝液量培養(yǎng)3天,發(fā)現(xiàn)菌株M5R14對3種菊酯農(nóng)藥的降解率與裝液量呈負相關(guān),與通氣量呈正相關(guān)。(7)菌株M5R14生長(0D415M)與降解3種農(nóng)藥的關(guān)系曲線在菌株生長的對數(shù)期(1248h)和穩(wěn)定期內(nèi)(4884h),農(nóng)藥降解率迅速,與菌株生長表現(xiàn)出正相關(guān)。隨著菌株生長進入衰亡期(84h以后),3種農(nóng)藥降解率增長趨勢也趨向減緩。揭示菌株M5R14確實能夠降解3種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥,并以其為唯一碳源進行生長。(8)菌株M5R14對三種農(nóng)藥的降解動力學(xué)分析用一級動力學(xué)方程對三種擬除蟲菊酯農(nóng)藥的降解進行擬合,相關(guān)系數(shù)^分別為0.9511,0.9506,0.9414。菌株M5R14對3種農(nóng)藥的降解動力學(xué)方程分別為y:9.1798e-。薩,y=7.8731e-。。。65t,y=8.9173e-。。艦t,降解速率常數(shù)A分別為0.0071,0.0065,0.068h—',半衰期分別為97.6,106.6,101.9h。本發(fā)明還涉及一種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解制劑,含有所述的缺陷假單胞菌,所述降解制劑可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法獲得。優(yōu)選的,所述擬蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解制劑為缺陷假單胞菌菌粉。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在篩選得到一株能同時降解聯(lián)苯菊酯、甲lfl菊酯、氯氰菊酯三種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的高效降解菌株,為控制農(nóng)產(chǎn)品中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留提供了研究基礎(chǔ),具有一定應(yīng)用潛力。圖1為缺陷假單胞菌M5R14的電鏡照片(放大50000倍);圖2為不同條件對缺陷假單胞菌M5R14同時降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影響(A:0D值;B:農(nóng)藥濃度;C:溫度;D:pH;E:振蕩速率;F:裝液圖3為缺陷假單胞菌M5R14生長量(0D^m)與降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的關(guān)系曲線。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述,但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例l:降解菌株的篩選與鑒定1.1培養(yǎng)基和試劑富集培養(yǎng)基蛋白胨10g,NaCll.Og,KH2P(U.0g,H201000mL,葡萄糖l.Og,pH7.0;基礎(chǔ)培養(yǎng)基:歸03l.OOg,MgS04.7H200.5g,(NH4)2S040.5g,KH2P040.5g,NaCl0.5g,K2HP041.5g,H201000mL,pH7.0;基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入1.5%瓊脂和100mgL—1的聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯即配成相應(yīng)的含農(nóng)藥固體培養(yǎng)基;50mgL"的聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯乳液。1.2菌株對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯降解效能的測定將純化后的單個菌株以菌量00^,二0.2接種到lOOmL含聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酉旨、氯氰菊酯各100mgi;'的無菌液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,以不接菌的培養(yǎng)液作對照,在3(TC,180r'min—'的恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)3天。培養(yǎng)結(jié)束后,吸取2mL培養(yǎng)液,加入4,4,3mL的石油醚萃取3次,加入無水硫酸鈉吸水,并定容至10mL,用氣相色譜檢測。氣相色譜檢測條件Agilent6890GC(G1530N/G3172A)氣相色譜儀,HP-5(30mmX0.25臓X0.25um)色譜柱,ECD檢測器,檢測溫度280。C,柱溫260。C,進樣口溫度28(TC,柱流l.OmL'min—',分流比為I:IO,載氣為N2(99.999%),進樣量為luL。降解率(%)=(對照樣品殘留量-處理樣品殘留量)X100/對照樣品殘留量1.3優(yōu)勢降解菌株選育1.3.1菌株來源采集杭州農(nóng)藥廠擬除蟲菊酯類農(nóng)藥生產(chǎn)車間下水道處馴化過的污泥。1.3.2降解菌株的分離、純化和篩選從每份污泥土樣中取10g,在無菌的條件下,分別加到含聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mg'L'的100mL無菌液體富集培養(yǎng)基的250mL三角瓶中.在3(TC下180rmin'搖床上培養(yǎng)7天后,按10%接種量轉(zhuǎn)移到下一批富集培養(yǎng)基上(三種農(nóng)藥梯度依次為IOO,150,200,250mg*L—),同條件馴化培養(yǎng)7天。然后再按10%接種量轉(zhuǎn)接到含聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各250mgL—'的無菌液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)7天,連續(xù)轉(zhuǎn)接2次后從農(nóng)藥濃度為250mgL—'基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,取O.lmL基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵液反復(fù)進行平板劃線分離、純化,直到篩選得到單個菌落,將純菌落接種到斜面上,于4。C冰箱內(nèi)保存。1.3.3菌株鑒定菌株鑒定采用美國MIDI公司的Sherlockmicrobialidentitysystem(MIS)軟件系統(tǒng),該系統(tǒng)將在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)的菌株按照MIDI公司的操作規(guī)范要求進行脂肪酸甲酯的提取和分析,定性(種類)和定量(含量)地分析微生物的脂肪酸甲酯成份并生成一個脂肪酸圖譜,利用該圖譜和數(shù)據(jù)庫(Library)進行比對,鑒定未知的菌種。1.3.4菌株形態(tài)特征觀察及生理生化特性測定將菌株接種在固體培養(yǎng)基中,48h后電鏡觀察菌株形態(tài)特征;取純化的菌株生長的對數(shù)期進行革蘭氏、鞭毛、結(jié)晶紫簡單莢膜等染色;生理生化特性測定參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》(東秀珠,2001)。2.結(jié)果2.1菌株的分離與篩選經(jīng)分離、純化、篩選獲得l株能同以聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯為碳源并保持較高和較穩(wěn)定降解率的細菌,命名為M5R14,其它菌株降解力都不同程度地衰退,培養(yǎng)3天,對三種農(nóng)藥的降解率分別為43.78%,43.91%,43.75%。2.2菌株的鑒定2.2.1菌株M5R14基本形態(tài)及生理生化特征該菌為球菌,無芽孢、無鞭毛,大小0.5X1.21.7pm(圖l),在固體培養(yǎng)基上,菌落圓形、隆起,表面光滑、濕潤,邊緣完整,呈灰黃色,半透明,革蘭氏染陰性,乙酰甲基甲醇生成試驗(V-P)反應(yīng)陽性,氧化酶和過氧化氫酶陽性,不能水解淀粉,能液化明膠,其他生理生化特性見表l。表l:菌株M5R14的生理生化特性<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注+陽性反應(yīng);-陰性反應(yīng)2.2.2菌株M5R14鑒定根據(jù)SherlockMIS軟件系統(tǒng)對菌M5R14脂肪酸定性和定量的分析生成的月:肪酸圖譜,對比Library數(shù)據(jù)庫,初步鑒定菌株M5R14為假單胞菌菌屬(/^ew/o/zW7as1.5"/)中的缺陷f^單胞菌(psewGb/Z7o/as力'yM7wte),相4以指數(shù)SI(similarityindex)為0.926。3結(jié)論從擬除蟲菊酯類農(nóng)藥生產(chǎn)車間下水道馴化污泥中分離得到1株能同時降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的高效菌M5R14,經(jīng)SherlockMIS系統(tǒng)鑒定為假單胞菌屬(Ae〃t/cw。朋51.sp)的缺陷假單胞菌(z入se,油膨朋5"fa)。實施例2:降解條件的優(yōu)化1材料與方法1.1培養(yǎng)基和試劑富集培養(yǎng)基蛋白胨10g,NaCll.Og,肌P0".0g,H20誦mL,葡萄糖l.Og,pH7.0;基礎(chǔ)培養(yǎng)基NH臭1.00g,MgS04.7H200.5g,(NH4)2S040.5g,野040.5g,NaCl0.5g,K2HPO41.5g,H力1000mL,pH7.0;基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入1.5%瓊脂和100mgL—'的聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯即配成相應(yīng)的含農(nóng)藥固體培養(yǎng)基;50mgL—'的聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯乳液。1.2菌株對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解的最佳條件在裝有100mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角瓶中,混合加入聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mgL—M乍為碳源,接種量0D仙^0.2、30°C、pH7.0、振蕩速率180r.min1、裝液量100mL(250mL三角瓶)。最佳條件降解試驗通過分別改變基本條件中的接種量(0D倫為0.05,0.1,0.15,0.2,0.4)、農(nóng)藥濃度(50,100,150,200,250mg'L—')、溫度(15,25,30,35,45°C)、pH值(3.0,4.0,5.0,6,0,7.0,8.0,9.0,0.0)、振蕩速率(O,60,120,180,220rmin—')或裝液量(25,50,100,150,200mL),保持其他條件不變,培養(yǎng)3天,進行單因素條件試驗,各單因素設(shè)計以不接種為對照,每個處理設(shè)3個重復(fù),按照實施例1方法測定菌株同時對3種菊酯農(nóng)藥的降解率。1.2.1接種量的影響聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的濃度均為100mg*L—'的混合培養(yǎng)基,分別接種初始菌液OD^,值為0.05,0.1,0.15,0.2,0.3的量,培養(yǎng)3天。1.2.2農(nóng)藥濃度的影響聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的濃度分別為25,50,100,150,200,250mgL—'的混合培養(yǎng)基,接種量0a^0.2,培養(yǎng)3天。1.2.3溫度的影響聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的濃度為100mg,L—'的混合培養(yǎng)基,接種OD化J).2菌種,于不同溫度培養(yǎng)3天。1.2.4酸度的影響聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的濃度為100mg*L—'的混合培養(yǎng)基,接種0D415nm0.2菌種,于不同pH培養(yǎng)3天。1.2.5振蕩速率的影響聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的濃度為100mgL—'的混合培養(yǎng)基,接種OD化J).2菌種,于不同搖床轉(zhuǎn)速培養(yǎng)3天。1.2.6裝液量的影響聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的濃度為100mgL—'的混合培養(yǎng)基,接種0D化J).2菌種,不同裝液量培養(yǎng)3天。1.3菌株生長量(0D415nm)和降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯關(guān)系曲線的將菌株等量置于含100mgL—'的聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯100mL的混合基礎(chǔ)培養(yǎng)基,于30。C、衡'min1搖床上培養(yǎng),分別在12,24,36,48,60,72,84,96,108h測定菌株對三種農(nóng)藥的降解率,并取樣過的發(fā)酵離心液取等量菌體適當(dāng)稀釋測ODw(培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液需先離心8000rmin',5min,再用無菌水重懸后測定),測定菌株生長量與降解率的關(guān)系。2.結(jié)果2.1菌株M5R14對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解的最佳條件2.1.1接種量對菌株M5R14同時降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影響含聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各IOO呢L—'的混合培養(yǎng)基分別接種不同初始菌液量,培養(yǎng)3天后,3種菊酯農(nóng)藥的降解率見圖2(A)。由圖2(A)可以看出,菌株M5R14對100mg,L—'的聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解率隨接種量的增加而增加,3種菊酯農(nóng)藥的降解率與菌液接種量0D札^值呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.92,0.9129,0.9238,但接種量0仏^大于0.2時,降解率增加幅度降低,這可能是由于隨著接種量的增加,微生物生長所需的碳源相對不足,微生物間相互競爭導(dǎo)致有效菌源相差不多,因此從降解效果及降解率與菌量比值的降解率看,接種量以O(shè)D仏^值0.15或0.2為宜。2.1.2農(nóng)藥濃度對產(chǎn)菌株M5R14同時降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影響在甲氰菊酯,聯(lián)苯菊酯,氯氰菊酯不同濃度梯度的混合培養(yǎng)基中,接種量0D化,0.2,培養(yǎng)3d后,3種農(nóng)藥的降解率見圖2(B)。結(jié)果表明,3種菊酯農(nóng)藥濃度分別為50,100mgL—1時的混合培養(yǎng)基中,菌株M5R14對3種菊酯農(nóng)藥的同時降解率相對較高,降解率在43%以上,之后隨著3種菊酯農(nóng)藥濃度的增加,菌株M5R14對3種菊酯農(nóng)藥的降解率下降。可見較高或較低農(nóng)藥濃度降可導(dǎo)致解菌株M5R14效率降低,這可能在低濃度時碳源不足導(dǎo)致菌株生長受限制及高濃度又會對菌體產(chǎn)生毒害作用之故。2.1.3溫度對菌株M5R14同時降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影響含有聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mgL—1的混合培養(yǎng)基接種0D^力.2菌種后,不同溫度梯度下培養(yǎng)3天,3種農(nóng)藥的降解率如圖2(C)所示。結(jié)果表明,菌株M5R14在溫度3(TC時對對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯同時降解效果最好,分別達到43.78%,43.91%,43.75%,溫度高于或低于30°C時,菌株M5R14對3種菊酯同時降解效果受到抑制,降解率下降,這可能因為低溫延長菌株進入對數(shù)增長期,高溫不利于菌株存活,表明該菌株為中溫型生活環(huán)境的細菌。2.1.4pH值對菌株M5R14同時降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影響不同pH梯度下,含有聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mgL'的混合培養(yǎng)基接種OD扎^0.2菌量,培養(yǎng)3天后,3種農(nóng)藥的降解率見圖2(D)。結(jié)果表明在pH3.(TlO.0之間菌株M5R14對3種農(nóng)藥的同時降解率隨培養(yǎng)溫度變化存在較大差異,最適宜降解溫度在pH6.(T7.0,此時菌株M5R14對3種農(nóng)藥同時降解效率最大。以培養(yǎng)pH7.0為例,菌株M5R14對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解率分別43.78%,43.91%,43.75%,pH值低于或高于6.0~7.0時,菌株M5R14對3種農(nóng)藥降解效果受到抑制,降解率下降,表明該菌株為中性菌,在此條件下可能有助于降解酶的合成與表達,降解效率最高。2.1.5振蕩速率對菌株M5R14同時降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影響不同搖床轉(zhuǎn)速下,對含有聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mgL—'的混合培養(yǎng)基接種OD^m0.2菌種,培養(yǎng)3天。3種農(nóng)藥的降解率見圖2(E)。結(jié)果表明,隨著振蕩速率加快,瓶內(nèi)溶解氧也增加,菌株M5R14對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯同時降解能力相應(yīng)增強,3種農(nóng)藥降解率與振蕩速率呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.9856,0.9464,0.9551,表明該菌株為好氧型菌,振蕩速率加快,瓶內(nèi)溶解氧增加有利于菊酯農(nóng)藥的降解。2.1.6裝液量對菌株M5R14同時降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影響于250mL三角瓶中,裝不同量含有聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mgL—'且接種OD化n力.2菌量的混合培養(yǎng)基,培養(yǎng)3天。3種農(nóng)藥的降解率見圖2(F)。由圖2(F)可知,菌株M5R14對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解率與裝液量呈負相關(guān),與通氣量呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.9273,0.9681,0.9397,這也表明該菌株為好氧型,瓶中裝液量的增加導(dǎo)致通氣體積的減少不利于菌株M5R14對3種農(nóng)藥的降解。2.2菌株M5R14生長(OD仙nm)與同時降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的關(guān)系菌株生長和農(nóng)藥降解率的關(guān)系曲線(圖3)表明,菌株生長的對數(shù)期12、8h;穩(wěn)定期在4884h之間,在菌株生長的對數(shù)期和穩(wěn)定期內(nèi),農(nóng)藥降解率增長率迅速,與菌株生長近乎成正相關(guān),隨著菌株生長進入衰亡期(84h以后),農(nóng)藥降解率增長趨勢也趨向減緩,揭示菌株M5R14能夠有效同時降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯農(nóng)藥,并以該農(nóng)藥為唯一碳源進行生長。2.3菌株M5R14對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解的動力學(xué)分析為了解菌株M5R14對3種菊酯農(nóng)藥的降解行為,研究中采用一級動力學(xué)模型,對農(nóng)藥殘留量(C)和時間U)進行擬合,降解動力學(xué)方程為G=GXe"(其中G為t時間3種農(nóng)藥的殘留量,G為初始濃度,A為降解速率常數(shù)),半衰期7Vf7772/A(ChangetsZ,2005;Yuaneta丄,2004),擬合結(jié)果如表2。由表2可知,菌株M5R14對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、甲氰菊酯的同時降解符合一級動力學(xué)方程,相關(guān)系數(shù)("分別為0.9511、0.9506、0.9414。通過計算得出菌株M5R14對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、甲氰菊酯的降解速率常數(shù)(A)分別為0.0071,0.0065,0.068h',半衰期(")為97.6,106.6,101.9h。表2:菌株M5R14對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解的動力學(xué)參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>3、討論微生物降解或生物轉(zhuǎn)化有機污染物是有機污染物污染環(huán)境修復(fù)的核心,獲得高效降解菌是開展生物修復(fù)工作的前提。雖然微生物降解有機污染物的受到有微生物自身、農(nóng)藥結(jié)構(gòu),以及環(huán)境條件(pH、溫度、底物濃度等)對的影響,但微生物降解或生物轉(zhuǎn)化仍是有機物污染環(huán)境修復(fù)的首選手段。丁海濤等(2003)從活性污泥的富集培養(yǎng)物中分離得到能明顯地去除氰戊菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯農(nóng)藥的菌株qw5,其最佳降解環(huán)境條件是在通氣、pH78、溫度3(TC左右,培養(yǎng)5天,分別含氰戊菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯的培養(yǎng)基中對應(yīng)農(nóng)藥降解率分別為53.8%、41.2%和61.7。/。。本發(fā)明篩選的缺陷假單胞菌菌株M5R14對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯同時降解結(jié)果證明其具有降解菊酯類農(nóng)藥的高效和廣譜性,研究結(jié)果同樣也證明其降解效率受到通氣、PH、溫度、接種量、農(nóng)藥濃度、轉(zhuǎn)速等環(huán)境條件的影響。在確定的最佳環(huán)境條件下,培養(yǎng)3天后,菌株M5R14對100mg,L—'聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的同時降解率分別為43.78%、43.91%和43.75%,且能夠以3種菊酯為唯一碳源生長。研究結(jié)果表明菌株M5R14對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯待降解率與通氣量、振蕩速率、接種量呈正相關(guān),表明該菌株為好氧型菌株。農(nóng)藥除被微生物降解外,還能光解、化學(xué)分解,因此只有當(dāng)菌株的生長和農(nóng)藥的降解出現(xiàn)同步關(guān)系時,才能確定農(nóng)藥被微生物降解了(王兆守,2003)。本研究結(jié)果表明(圖2),在缺陷假單胞菌菌株M5R14生長的對數(shù)期和穩(wěn)定期內(nèi),農(nóng)藥降解率和菌株生長近乎呈正相關(guān),隨著菌株生長進入衰亡期,受周圍不利因素(代謝物積累等)影響,仍存活的細胞,降解力受到抑制,農(nóng)藥降解率增長趨勢也趨向減緩,菌株的生長和農(nóng)藥的降解呈現(xiàn)出良好的同步關(guān)系。同時發(fā)現(xiàn)菌株M5R14對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解過程滿足一級動力學(xué)方程模型,半衰期",2)為97.6,106.6,101.9h,與Grante"丄(2002;2003)從使用過擬除蟲菊酯的菜園和農(nóng)田土壤的混和土樣中分離出熒光假單胞菌和普城沙雷菌兩株優(yōu)勢菌,于25。C、80r'min—'條件下培養(yǎng)14天,對250mgL—'的氯氰菊酯去除率約為66.7%的結(jié)果相比,表明本研究分離篩選的缺陷假單胞菌菌株M5R14是一株可同時對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解的高效菌株,降解半衰期短,表明其在控制農(nóng)產(chǎn)品中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留方面具有一定的應(yīng)用潛力。4、結(jié)論1)菌株M5R14在通氣量、pH6.07.0、溫度30。C、OD倫O.2、農(nóng)藥濃度100mg'L—'、轉(zhuǎn)速180r'min—'環(huán)境條件下降解效果最好,菌株降解效果與菌量(0D415m),通氣量、振蕩速率呈正相關(guān),且能夠以3種為唯一碳源生長。2)在最佳降解環(huán)境條件下,菌株M5R14對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解過程滿足一級動力學(xué)方程模型,降解速率常數(shù)A分別為0.0071,0.0065,0.068h—',半衰期"/2)為97.6,106.6,101.9h。以上的所述乃是本發(fā)明的具體實施例及所運用的技術(shù)原理,若依本發(fā)明的構(gòu)想所作的改變,其所產(chǎn)生的功能作用仍未超出說明書及附圖所涵蓋的精神時,仍應(yīng)屬本發(fā)明的保護范圍。權(quán)利要求1.缺陷假單胞菌(pseudomonasdiminuta)在降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用。2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于所述缺陷假單胞菌用于同時降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯三種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留。3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用,其特征在于所述降解在通空氣或氧氣、pH6.07.0、2530°C、OD415nm0.10.2、各農(nóng)藥濃度50100mgl/1的條件下進行。4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用,其特征在于所述降解在通空氣或氧氣、pH7.0、3(TC、OD415nm0.2、各農(nóng)藥濃度lOOmg'L—'的條件下進行。5.—種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解制劑,含有如權(quán)利要求1所述的缺陷假單胞菌。6.如權(quán)利要求5所述的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解制劑,其特征在于所述擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解制劑為缺陷假單胞菌菌粉。全文摘要本發(fā)明提供了一株可同時降解多種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的微生物菌種——缺陷假單胞菌(pseudomonasdiminuta)在降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留中的應(yīng)用,以及利用該菌株制備的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解制劑。本發(fā)明篩選得到一株能同時降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯三種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的高效降解菌株,并對其進行了分析鑒定和降解特性研究,以期揭示該菌株對農(nóng)藥降解的基本規(guī)律,為控制擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留提供了科學(xué)依據(jù)。文檔編號C12R1/38GK101434923SQ200810122350公開日2009年5月20日申請日期2008年11月20日優(yōu)先權(quán)日2008年11月20日發(fā)明者敏廖,謝曉梅申請人:浙江大學(xué)