專利名稱：：一種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解混合菌劑及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解混合菌劑及其在同時降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯三種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留中的應用。(二)
背景技術(shù)：
：擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是模擬天然的除蟲菊酯而合成，含有多個苯環(huán)結(jié)構(gòu)的一類殺蟲劑，具有廣譜高效、低毒、耐光、熱等特點，其品種數(shù)和使用量僅次于有機磷農(nóng)藥，占殺蟲劑市場的第二位，在茶葉、蔬菜等經(jīng)濟作物害蟲防治中得到廣泛應用，常用的有聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯等。但是這類農(nóng)藥普遍具有對環(huán)境穩(wěn)定、降解速度慢、降解率低，殘留過高，帶來了食品安全問題，特別是我國加入WTO后，"關(guān)稅壁壘"隨之拆除，國外針對我國入關(guān)而頒布的農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥的最大殘留量(MRL)標準帶有明顯的"技術(shù)壁壘"傾向，特別是針對茶葉，農(nóng)藥檢測范圍大幅度擴大，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥MRL標準明顯降低，使我國茶葉等農(nóng)產(chǎn)品出口面臨著更為嚴峻的挑戰(zhàn)。農(nóng)藥殘留是吸附、降解和遷移等綜合作用后結(jié)果，其中降解是制約其殘留量的關(guān)鍵過程，控制農(nóng)藥殘留有多種途徑，包括禁用農(nóng)藥、化學處理方法和微生物降解等。大量研究表明微生物對土壤和水環(huán)境中的農(nóng)藥降解起著關(guān)鍵作用，研究發(fā)現(xiàn)了大批能降解或轉(zhuǎn)化農(nóng)藥的微生物類群，如細菌、放線菌、真菌和藻類，在對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解研究中發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬(/^ew^/^/7ss.sp)、腸桿菌屬(fi^erofe"e.sp)、產(chǎn)堿桿菌屬(J/csh>e/es.sp)和芽孢桿菌屬(^3Ci^M.sp)等對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥具有降解作用。但大多數(shù)微生物降解針對某一或少數(shù)幾個農(nóng)藥，而同時能降解多種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的微生物報道較少。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供同時降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯三種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的混合菌劑，及其在同時降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯三種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留中的應用。木發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解混合菌劑，含有產(chǎn)氣腸桿菌(&^r。力a"erseroge"es)和缺陷假單胞菌(p,sewibyz70/ayd/ffl/"〃ts)。本申請發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將產(chǎn)氣腸桿菌和缺陷假單胞菌混合用于同時降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯三種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留，在相同接種總量(0D4l5,ra)下，混合菌株的降解率要明顯高于單一菌株，增效倍數(shù)在1.O(Tl.23之間。本發(fā)明發(fā)明人進行了長期的研究，從擬除蟲菊酯類農(nóng)藥生產(chǎn)車間下水道馴化過的污泥中分離得到2株能同時降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的高效菌M6R9和M5R14。經(jīng)SherlockMIS系統(tǒng)鑒定為M6R9產(chǎn)氣腸桿菌屬(Z^eroAscter.5/3)中的產(chǎn)氣腸桿菌(fetoroAgc&raarage^es)，M5R14為假單胞菌菌屬(AS'e〃t/o服W(3S.57)中的缺陷假單胞菌(ASe〃fl^7OA9St///7./w"<3)。具有如下特性(1)該混合菌為菌株M6R9與菌株M5R14。其中，菌株M6R9為產(chǎn)氣腸桿菌(^fero6scfar譜-。g,s)，長0.81.9/im、寬0.51.0菌株M5R14為缺陷假單胞菌(p鄉(xiāng)c/畫朋'scZ/瓜f/7"te)，大小0.5X1.21.7um;均為好氧型，都能夠以3種農(nóng)藥為唯一碳源生長。(2)菌株M6R9、M5R14對3種農(nóng)藥的降解率與接菌量(0D肌飾)正相關(guān)。(3)在相同接種總量(OD^)下，混合菌株的降解率要明顯高于單菌株，增效倍數(shù)在1.0(Tl.23之間。(4)菌株M6R9和M5R14的最佳接種量比值為0.1:0.1。100mgL—'農(nóng)藥的混合基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，3種農(nóng)藥的降解率分別達到67.43%，73.39%和70.96%。具體的，所述混合菌劑由產(chǎn)氣腸桿菌菌粉和缺陷假單胞菌菌粉組成，其質(zhì)量比優(yōu)選為1:0.52。更為優(yōu)選的，所述產(chǎn)氣腸桿菌菌粉與缺陷假單胞菌菌粉質(zhì)量比為1:1。本發(fā)明還涉及所述混合菌劑在同時降解聯(lián)聯(lián)苯菊酯(CAS:83322-02-5)、甲氰菊酯(CAS:39515-41-8)和氯氰菊酯(CAS:523i507-8)三種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留中的應用，所述降解在通空氣或氧氣、pH6.07.0、25~30°C、產(chǎn)氣腸桿菌接種量0D4ISnm0.10.2、陷假單胞菌接種量OD服,，J).TO.2、各農(nóng)藥濃度(單一農(nóng)藥濃度)5(Tl00mgL—1的條件下進行。優(yōu)選的，所述降解在通空氣或氧氣、pH7.0、3(TC、產(chǎn)氣腸桿菌和缺陷假單胞菌接種量(ODw,)比為0.1:0.1、各農(nóng)藥濃度100mgL—'的條件下進行。本發(fā)明的有益效果牛.要體現(xiàn)在篩選得到能同時降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯三種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的高效降解混合菌劑，為控制農(nóng)產(chǎn)品中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留提供了研究基礎(chǔ)，具有一定應用潛力。圖1為產(chǎn)氣腸桿菌M6R9的電鏡照片(放大50000倍)；圖2為缺陷假單胞菌M5R14的電鏡照片(放大50000倍)；圖3菌株M6R9(圖A)、M5R14(圖B)對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解率與接種量(0D4l5J的曲線關(guān)系；圖4為不同接種比例下混合菌對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解效能的影響。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例l:降解菌株的篩選與鑒定1材料與方法1.1培養(yǎng)基和試劑富集培養(yǎng)基蛋白胨10g，NaClLOg，KH2P041.0g，H20誦mL，葡萄糖l.Og，pH7.0;基礎(chǔ)培養(yǎng)基N,丄00g，MgS04.7H200.5g，(NH4)2S040.5g，K,40.5g，NaCl0.5g，1(2線1.5g，H20lOOOmL，pH7.0;基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入15gL—'瓊脂和100mgL—'的聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯即配成相應的含農(nóng)藥固體培養(yǎng)基；50gL一'的聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯乳液。1.2優(yōu)勢降解菌株選育1.2.1菌株來源采集杭州農(nóng)藥廠擬除蟲菊酯類農(nóng)藥生產(chǎn)車間下水道處馴化過的污泥。1.2.2降解菌株的分離、純化和篩選從每份污泥土樣中取10g，在無菌的條件下，分別加到含聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mgL—'的lOOmL無菌液體富集培養(yǎng)基的250mL三角瓶中.在3(TC下180r.min—'搖床上培養(yǎng)7天后，按10%接種量轉(zhuǎn)移到下一批富集培養(yǎng)基上(三種農(nóng)藥梯度依次為IOO，150，200，250mg'L—')，同條件馴化培養(yǎng)7天。然后再按10。/。接種量轉(zhuǎn)接到含250mg.L—'的聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯無菌液體的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)7天，連續(xù)轉(zhuǎn)接2次后從農(nóng)藥濃度為250mgL'基礎(chǔ)培養(yǎng)基屮，取O.lmL基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵液反復進行平板劃線分離、純化，直到篩選得到單個菌落，將純菌落接種到斜面上，于4'C冰箱內(nèi)保存。1.2.3菌株鑒定菌株鑒定采用美國MIDI公司的Sherlockmicrobialidentitysystem(MIS)軟件系統(tǒng)，該系統(tǒng)將在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)的菌株按照MIDI公司的操作規(guī)范要求進行脂肪酸的提取和分析]，定性(種類)和定量(含量)地分析微生物的脂肪酸成份并生成一個脂肪酸圖譜，禾擁該圖譜和數(shù)據(jù)庫(Libraiy)進行比對，鑒定未知的菌種。1.2.4菌株形態(tài)特征觀察及生理生化特性測定將菌株接種在固體培養(yǎng)基中，48h后電鏡觀察菌株形態(tài)特征；取純化的菌株生長的對數(shù)期進行革蘭氏、結(jié)晶紫簡單莢膜等染色；生理生化特性測定參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》(東秀珠，2001)。2結(jié)果與分析2.1菌株的分離篩選與降解效能測定通過微生物的降解或生物轉(zhuǎn)化，把有害污染物轉(zhuǎn)變或降解為無毒無害的物質(zhì)，是有機污染物污染環(huán)境修復的核心，而分離得到農(nóng)藥高效降解菌是開展農(nóng)藥污染生物修復工作的重要前提。經(jīng)分離、純化、篩選獲得2株能同以聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯為碳源并保持較高和較穩(wěn)定降解率的細菌，命名為M6R9和M5R14，其它菌株降解力都不同程度地衰退，在30。C，pH7.0、180rmin1條件下培養(yǎng)3天，發(fā)現(xiàn)M6R9和M5R14對100mg.L—'聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解率分別為55.74%，55.11%,56.96%以及43.78%，43.91%，43.75%。2.2菌株M6R9和M5R14的基本形態(tài)及生理生化特征菌株M6R9為桿菌，有周鞭毛，不產(chǎn)胞子且具有小的莢膜，革蘭氏陰性，菌休大小約為長(0.『1.9)um、寬(0.5L0)ym(圖l)，在固體培養(yǎng)基上，菌落圓形，表面凸起、光渭'，邊緣完整，呈灰白色，不透明。乙酰甲基甲醇生成試驗(V-p)反應陽性，吲哚實驗陰性，不能液化明膠，氧化酶陰性，可利用木糖、葡萄糖產(chǎn)酸、丙二酸和乳糖，不能利用衛(wèi)矛醇產(chǎn)酸。菌株M5R14為球菌，無芽孢、無鞭毛，大小(0.5X1.21.7)iim(圖2)，在同體培養(yǎng)基上，菌落圓形、隆起，表面光滑、濕潤，邊緣完整，呈灰黃色，不透明，革蘭氏染陰性，乙酰甲基甲醇生成試驗(v-p)反應陽性，氧化酶和過氧化氫酶陽性，不能水解淀粉，能液化明膠，沒有硝化作用，可利用乙酸鹽、丁酸鹽、D-和L-丙氨酸，不能利用碳水化合物、葡萄糖酸鹽、和組氨酸。其他生理生化特性見表l。表1:菌株M6R9和M5R14的生理生化特性<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注+陽性反應；-陰性反應2.3菌株的鑒定根據(jù)SherlockMIS軟件系統(tǒng)對菌株M6R9和M5R14定性和定量的分析牛成的脂肪酸圖譜，對比Library數(shù)據(jù)庫，初步鑒定菌M6R9為腸桿菌屬(f"tarc^acter.sp)中的產(chǎn)氣腸桿菌(fi^erc^a"orseir^eaes)，相似指數(shù)SI(similarityindex)為0.931，菌株M5R14為假單胞菌菌屬(pA、ew/cr詔s.sp)中的缺陷假單胞菌(/^位/0膨朋6乂//瓜//7〃^3)，相似指數(shù)SI(similarityindex)為0.926。3結(jié)論通過分離篩選得到2株能同時對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯高效降解的產(chǎn)氣腸桿菌(^^erofecteraero併/es)M6R9和缺陷假單胞菌(尸5'ew/湖o朋,s，，在30°C、pH7.0、180rmin'、培養(yǎng)3天條件下對100mgL一'聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解率分別為55.74%，55.11%，56.96%以及43.78%,43.91%，43.75%。實施例2:降解條件的優(yōu)化1材料與方法1.1培養(yǎng)基和試劑富集培養(yǎng)基蛋白胨10g，NaCll.Og，肌P(Xl.Og，1W)lOOOmL，葡萄糖l.Og，pH7.0;基礎(chǔ)培養(yǎng)基,031.OOg，MgSOv7H200.5g，(NH》2S040.5g，KH2PO.,0.5g，NaCl0.5g，K卿41.5g，H201000mL，pH7.0;基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入15gL—'瓊脂和100mgL—'的聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯即配成相應的含農(nóng)藥固體培養(yǎng)基；50mgL'的聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯乳液。1.2菌株對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯降解效能的測定將純化后的單個菌株以菌量OD仏^二0.2接種到100mL含聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mgL—'的無菌液體富集培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，以不接菌的培養(yǎng)液作對照，在30°C,180rmin1的恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)3天。培養(yǎng)結(jié)束后，吸取2mL培養(yǎng)液，加入4，4，3mL的石油醚萃取3次，加入無水硫酸鈉吸水，并定容至10mL，用氣相色譜檢測。氣相色譜檢測條件Agilent6890GC(G1530N/G3172A)氣相色譜儀，HP-5(30mmX0.25mmX0.25um)色譜柱，ECD檢測器，檢測溫度280。C，柱溫26CTC，進樣口溫度280°C，柱流1.OmLmirf1，分流比為1:10，載氣為&(99.999%)，進樣量為1"L。降解率(%)=(對照樣品殘留量-處理樣品殘留量)X100/對照樣品殘留量1.3接種量對菌株單一降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影響在裝有100mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角瓶中，混合加入lOOmgL'聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯作為唯一碳源，分別采用初始菌量0D仏J直為0.05，0.1，0.15，0.2，0.4的接種量，以不接菌為對照，在30。C，pH7.0、180rmin1下振蕩培養(yǎng)3天，萃取，測定菌株降解率，每個處理3個重復。1.5不同接種量比例對菌株混合降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影響含聯(lián)苯菊酯，甲氰菊酯，氯氰菊酯各100mg'i;'的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，按接種量0OuSM6R9:0D^nJ5R14=0.1:0.1，0.1:0.2，0.2:0.1，0.2:0.2，0.2:0.4，0.4:0.2，0.4:0.4，加入M6R9、M5R14兩種菌液，于30°C，180rmirf1條件下振蕩培養(yǎng)3天，萃取，測定降解效果，每個處理3個重復。L4菌株M6R9、M5R14單一及混合對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解的動力學分析在含聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mgL—'的混合培養(yǎng)基分別對單一菌株M6R9、M5R14接種初始菌液0D很J).2，混合菌接種量比值0D化nJ6R9:0DwM5R14二0.1:0.1，于30°C,pH7,0、180rmin'條件下振蕩培養(yǎng)，采用一級動力學模型對(12，24,36，48，60，72，84，96，108)h農(nóng)藥殘留量(G)和時間(0進行擬合，降解動力學方程為G=C。Xe-"(其中G，為t時間3種農(nóng)藥殘留量，G為樣品的初始濃度，A為降解速率常數(shù))，半衰期7V尸^2/^'1—2fi]，分析菌株M6R9、M5R14單一及混合對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解動力學過程。2結(jié)果與分析2.1接種量對單一菌株M6R9或M5R14降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影響含聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mgL—1的混合培養(yǎng)基分別接種初始菌液0Dw師值為0.05，0.1，0.15，0.2，0.4，培養(yǎng)3天后，3種農(nóng)藥的降解率見圖3。由圖3可以看出，菌株M6R9和M5RM對100mg.L—'的3種農(nóng)藥的降解率隨接種量的增加而增加，菌株M6R9和M5R14對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解效率與菌液接種量OD^值呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)(/)分別為0.8882，0.8735，0.9615以及0.8717，0.8668，0.9364。在相同接種量下，菌株M6R9對3種農(nóng)藥的降解率要高于菌株M5R14，但接種量大于0.2時，降解率增加幅度降低，這可能是由于隨著接種量的增加，微生物生長所需的碳源相對不足，微生物間相互競爭導致有效菌源相差不多，由于接種量不同，單位牛物量所對應的基質(zhì)量不同，反應速率會表現(xiàn)出差異，因此從降解效果及降解率與菌量比值的降解率看，接種量以OD倫值0.15或0.2為宜。2.2不同接種比例對混合菌M6R9和M5R14降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影響由圖4可知，不同比例下，混合菌株M6R9、M5R14對3種農(nóng)藥的降解率存在較大差異，但總體趨勢隨接種總量的增加而增加，其中以比例為(0.4:0.4)對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解率最大，分別為81.89%，81.79%，86.14%。在一定接種比例(0.1:0.1，0.1:0.2，0.2:0.1，0.2:0.2)，混合菌株M6R9和M5R14對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解率隨接種總量的增加而明顯加快，在3天內(nèi)的降解率由58.23%，58.5%，59.28%增至76.68%，73.36%，78.69%，增加量分別為8.45%，14.86%，19.41%;當接種比例為0.4:0.2，0.2:0.4，0.4:0.4時，隨接種總量的增加，混合菌株對3種農(nóng)藥降解速率的增加幅度不如之前那么明顯，最大增幅僅為6.67%。同時發(fā)現(xiàn)當菌株M6R9或M5R14接種量一定時，3種農(nóng)藥的降解率隨菌株M5R14或M6R9接種量的增加而增加，菌株M6R9接種量增加時對混合菌降解效率增幅較大。2.3不同接種比例下混合菌對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的理論降解率及增幅作用為了更清楚的了解菌株M6R9、M5R14共存時對3種農(nóng)藥是否存在協(xié)同作用，采用下式計算混合菌的理論降解率:Pm二1-(1-A》(1-A》(1-A》(l-A》(1-Am)，式中Pw表示不同比例下混合菌的理論降解率，A"A2，A.,,^……Aw指各單一菌株在不同接種量下的降解率。同時計算增幅作用，增幅作用=混合菌的實際降解率/混合菌的理論降解率。當增幅作用大于l時，菌株M6R9、M5R14存在協(xié)同作用，當增幅作用小于l時，M6R9、M5R14存在拮抗作用，當增幅作用小于1時，菌株M6R9、M5R14存在加和作用。由表2可知，混合菌處理對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的增效倍數(shù)字1.0廣1.48之間，增幅倍數(shù)大致隨接種總量的增加而降低，較低接種總量對3種農(nóng)藥的增效作用明顯，表現(xiàn)較強的協(xié)同作用，其中以接種比例O.1:0.l增效倍數(shù)最大，分別為1.48，1.31，1.29。較高接種總量的增幅作用差別不顯著，協(xié)同作用較弱，這可能是較高接種總量時微生物間相互競爭底物導致有效菌源降低之故。與單一菌株M6R9或M5R14最佳接種量OD415n0.2對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解率分別為55.74%，55.11%，56.96%和43.78%，43.91%，43.75%的結(jié)果相比(圖3)，在相同接種總量接種比值(0.1:0.1)，混合菌株對3種農(nóng)藥的降解率分別為58.23%，58.5%，59.23%(圖4)，降解率分別增加了2.49%，3.39%，2.27%和14.45%，14.59，15.48%，說明混合菌株對3種農(nóng)藥降解具有協(xié)同作用。這是因為混合菌酶系含量豐富，為對方提供生長所需的條件或消除對方代謝的障礙，使有機物的降解更加有利]，結(jié)合接種總量、增效倍數(shù)和降解效率發(fā)現(xiàn)，混合菌M6R9和M5R14對100mg'L—'的聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解的最佳接種量比值為0.1:0.1。表2:不同接種比例下混合菌對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的實際、理論降解率及增幅作用<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.4菌株M6R9、M5R14單一及混合對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解的動力學分析通過對M6R9、M5R14單一及混合菌株對3種農(nóng)藥的降解行為研究結(jié)果(如表3)發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)實驗數(shù)據(jù)的擬合結(jié)果較好，單一及混合菌株對3種農(nóng)藥降解率的相關(guān)系數(shù)U0在0.92310.9937之間，故可認為用一級動力學方程來描述聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、甲氰菊酯在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的降解過程是合理的。通過計算得出單菌株M6R9、M5R14對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、甲氰菊酯的降解速率分別為0,0106，0.0098，0.0101mgL—'h—'和0.0071，0.0065，0.0068mgL—1h'，半衰期(")分別為65.4，70.7，68.6h和97.6，106.6，101.9h?；旌暇慕到馑俾史謩e為0.0121，0.0124，0.0125mgL—'h—'，半衰期分別為57.3，55.9，55.5h—'，與單一菌株M6R9、M5R14相比，半衰期分別快了8.1，14.8，13.lh和40.3，50.7，46.4h，可見混合菌對3種農(nóng)藥的降解更有利，這也證明菌株M6R9和M5R14對3種農(nóng)藥降解具有協(xié)同作用。表3:菌株M6R9對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解的動力學參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>3討論生物降解的實質(zhì)是酶促反應，然而單一微生物對農(nóng)藥的生物降解不具備生物降解所需要的全部酶的遺傳合成信息，往往產(chǎn)生有毒的代謝物，這些代謝物對微生物的生長有抑制作用，需要其他微生物群落進行消除來實現(xiàn)難降解有機物的部分或徹底降解，自然環(huán)境中多種微生物并存，單-一培養(yǎng)的微生物在實際應用中還面臨生存競爭問題。因此，開展多菌株復合體的微生物降解研究具有重要的理論與實踐意義。與林金科等研究聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯在鐵觀音茶葉新梢上殘留的自然降解動態(tài)發(fā)現(xiàn)3種農(nóng)藥的半衰期分別為6，5，4d的結(jié)果相比，混合菌M6R9和M5R14對3種農(nóng)藥的降解率快了86.7，64.1，40.5h，證明混合菌株對3種農(nóng)藥降解具有協(xié)同作用，使代謝產(chǎn)物不易積累，相互創(chuàng)造力有利的生存環(huán)境，使各菌的代謝活動充分發(fā)揮，提高了2種菌株對3種農(nóng)藥的降解效率，上述結(jié)果也表明混合菌M6R9和M5R14在控制農(nóng)產(chǎn)品中菊酯農(nóng)藥殘留方面具有一定前景。4結(jié)論1)菌株M6R9和M5R14單一及混合對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯農(nóng)藥同時降解效果與接菌量(0D41Snm)呈正相關(guān)，且降解過程均滿足一級動力學方程。單一菌株M6R9或M5R14對3種農(nóng)藥降解的半衰期(t1/2)分別為65.4，70.7，68.6h或97.6，106.6，101.9h，混合菌M6R9和M5R14的半衰期為57.3，55.9，55.5h。2)于含聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mg'L—'的混合培養(yǎng)基中，接種相同菌量(混合菌株M6R9和M5R14的004,5,,分別為0.1，爭一菌株M6R9或M5R14的0D^分別為0.2)，pH7.0、30°C、180rmin'下培養(yǎng)3天，混合菌株對3種農(nóng)藥的同時降解率分別比菌株M6R9或M5R14增加了2.49%，3.39%，2.27%和14.45%，14.59%，15.48%，增效倍數(shù)在1.O廣l.48之間，半衰期分別減少8.1，14.8，13.lh和40.3，50.7、46.4h。表明混合菌株對聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的同時降解效果存在協(xié)同作用，結(jié)合接種總量、增效倍數(shù)和降解效率發(fā)現(xiàn)，菌株M6R9和M5R14的最佳接種量比值為0.1:0.1。以上的所述乃是本發(fā)明的具體實施例及所運用的技術(shù)原理，若依本發(fā)明的構(gòu)想所作的改變，其所產(chǎn)牛的功能作用仍未超出說明書及附圖所涵蓋的精神時，仍應屬本發(fā)明的保護范圍。權(quán)利要求1.一種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解混合菌劑，含有產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)和缺陷假單胞菌(pseudomonasdiminuta)。2.如權(quán)利要求1所述的混合菌劑，由產(chǎn)氣腸桿菌菌粉和缺陷假單胞菌菌粉組成。3.如權(quán)利要求2所述的混合菌劑，其特征在于所述產(chǎn)氣腸桿菌菌粉與缺陷假單胞菌菌粉質(zhì)量比為1:1。4.如權(quán)利要求1所述的混合菌劑在同時降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯三種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留中的應用，其特征在于所述降解在通空氣或氧氣、pH6.07.0、2530°C、產(chǎn)氣腸桿菌接種量OD415nm0.1~0.2、缺陷假單胞菌接種量OD415nm0.1~0.2、各農(nóng)藥濃度SO-lOOmg.I/1的條件下進行。5.如權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于所述降解在通空氣或氧氣、pH7.0、30。C、產(chǎn)氣腸桿菌與缺陷假單胞菌接種量OD化^比為0丄0.1、各農(nóng)藥濃度lOOmg-L—1的條件下進行。全文摘要本發(fā)明提供了可同時降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯三種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的混合菌劑，及其在同時降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯三種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留中的應用。本發(fā)明通過實驗篩選得到能同時降解聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯三種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的高效降解混合菌劑，為控制農(nóng)產(chǎn)品中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留提供了研究基礎(chǔ)，具有一定應用潛力。文檔編號C12R1/38GK101429484SQ200810122359公開日2009年5月13日申請日期2008年11月20日優(yōu)先權(quán)日2008年11月20日發(fā)明者敏廖,謝曉梅申請人:浙江大學