專利名稱：在同一基底操縱多種粘附細(xì)胞的裝置和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在同一基底上粘附并操縱多種細(xì)胞的裝置及粘附方法。
背景技術(shù)：
目前基于僅僅對(duì)一種細(xì)胞觀察和操縱的體外研究系統(tǒng)，已無(wú)法滿足基礎(chǔ)細(xì)胞生物學(xué) 和病理學(xué)研究的需要，人們常常需要在模仿生命體條件下，體外觀察和操縱兩種或多種 細(xì)胞，通過(guò)考察它們之間的相互作用來(lái)了解生命體發(fā)育、疾病產(chǎn)生和發(fā)展的過(guò)程，并進(jìn) 一步進(jìn)行藥物篩選和干預(yù)。
現(xiàn)在接近生命體條件下，可用于研究?jī)煞N細(xì)胞相互作用的裝置，市場(chǎng)上可購(gòu)買到 Transwe 11 Chamber。該商品利用帶孔的薄膜將兩種細(xì)胞分隔成上下兩層培養(yǎng)，只能觀察 上層細(xì)胞向下的侵襲，而無(wú)法觀測(cè)它們之間的相互運(yùn)動(dòng)，并且只能觀察兩種細(xì)胞之間的 作用，對(duì)多種細(xì)胞相互作用無(wú)法研究。
在文獻(xiàn)1: Li， Y., Bo, Y" Ji, H.， Han, D., Chen, S., Tian, F., Jiang, X., Angew. Chem. Int. Ed., 2007, 46 (7)， 1094-1096中，蔣興宇研究小組結(jié)合納米尺度的自組裝單分子膜、電化 學(xué)以及微流控技術(shù)，把本來(lái)不能使細(xì)胞粘附的基底表面某些區(qū)域選擇性"活化"，使得不 同種細(xì)胞在指定空間粘附。該小組同時(shí)申請(qǐng)專利，申請(qǐng)?zhí)枮?00710098280.4 (其在先申 請(qǐng)?zhí)?00610089251.7，在先申請(qǐng)日為2006.08.11)的申請(qǐng)構(gòu)建了一種將多種細(xì)胞粘附到同 一基底上的裝置及粘附方法；但是它的不足之處在于把不同種細(xì)胞要有序粘附在同一表 面，需要長(zhǎng)時(shí)間的電化學(xué)解吸附過(guò)程，不利于此方法的推廣。
本申請(qǐng)人的申請(qǐng)?zhí)枮?00710117815.8，申請(qǐng)日2007年6月25日的發(fā)明專利申請(qǐng)構(gòu) 建了將多種細(xì)胞以有序陣列方式粘附到同一基底上的裝置及粘附方法，此方法過(guò)程簡(jiǎn)單， 但無(wú)法構(gòu)建連續(xù)距離變化的有序多細(xì)胞排列。
本申請(qǐng)人的申請(qǐng)?zhí)枮?00710119999.1(申請(qǐng)日2007年8月6日)和200710U9997.2(申 請(qǐng)日2007年8月6日)的兩項(xiàng)發(fā)明專利申請(qǐng)構(gòu)建連續(xù)距離變化的有序多細(xì)胞排列，并利 用電化學(xué)解吸方法和聚(L-賴氨酸)-聚乙二醇-聚(L-賴氨酸)的嵌段共聚物的性質(zhì)實(shí)現(xiàn)了多 種細(xì)胞在同一基底上的同時(shí)束縛、釋放和選擇性釋放，但是上述兩種方法在裝置制備時(shí)需要對(duì)聚二亞甲基硅氧烷印章表面進(jìn)行親水化處理，該處理方法在一般生物實(shí)驗(yàn)室難以 實(shí)現(xiàn)；同時(shí)在選擇性釋放時(shí)，使用的聚(L-賴氨酸)-聚乙二醇-聚(L-賴氨酸)的嵌段共聚物 性質(zhì)不穩(wěn)定，進(jìn)而降低了方法的穩(wěn)定性，因此上述裝置和方法不利于在通常生物實(shí)驗(yàn)室 推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種在同一基底操縱多種粘附細(xì)胞的裝置和方法，裝置簡(jiǎn)單 易操作、并且可在同一基底粘附并控制不同種細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng)，以便研究不同種細(xì)胞間相 互作用。
本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明提供的在同一基底上粘附和操縱多種細(xì)胞的裝置，包括
一基底；所述基底上表面上蒸鍍有一層鈦粘附層或鉻粘附層，所述鈦粘附層或鉻粘 附層上蒸鍍有一層金層；
一下表面上具有至少一微凹槽單元的聚二亞甲基硅氧垸印章；所述聚二亞甲基硅氧烷 印章的下表面貼覆于所述基底的金層上；和
一負(fù)極連通于所述基底，電壓為1. 0 1. 4V的電源；
所述微凹槽單元由從左至右依次排列的六條凹槽組成；
其中，位于左側(cè)三條凹槽為等截面的凹槽，該左側(cè)三條凹槽的中間段相互平行，所述 左側(cè)第一條凹槽中間段之外的兩端段由該凹槽中間段的兩端垂直折向左側(cè)0. 5 0. 8 cm，然 后再垂直折向中部0.3 0.5 cm;所述左側(cè)第二條凹槽中間段之外的兩端段由該凹槽中間 段的兩端垂直折向左側(cè)0. 8 1. 5 cm;所述左側(cè)第三條凹槽中間段之外的兩端段由該凹槽 中間段的兩端以30 60度斜角折向左側(cè)0. 5 0. 8 cm;
所述左側(cè)第四條凹槽的中間段分為上、中、下三段，所述左側(cè)第四條凹槽的中間段 中段凹槽截面寬度向右側(cè)寬于左側(cè)第四條凹槽的中間段上段凹槽截面寬度100 300 pm; 所述左側(cè)第四條凹槽的中間段下段凹槽截面寬度向右側(cè)寬于左側(cè)第四條凹槽的中間段中 段凹槽截面寬度100 300 而且該左側(cè)第四條凹槽中間段之外的兩端段以30 60度 斜角折向右側(cè)0.5 0.8 cm;
所述左側(cè)第五條凹槽為等截面凹槽，其中間段分為上、中、下三段，所述左側(cè)第五 條凹槽的中間段上段凹槽與左側(cè)第四條凹槽的中間段上段凹槽平行；所述左側(cè)第五條凹 槽的中間段中段凹槽垂直折向右側(cè)100 300 nm，且與所述左側(cè)第四條凹槽的中間段中 段凹槽的右側(cè)邊平行；所述左側(cè)第五條凹槽的中間段下段凹槽垂直折向右側(cè)0.8 1.5 cm，且與所述左側(cè)第四條凹槽的中間段下段凹槽的右側(cè)邊平行；該左側(cè)第五條凹槽中間段之外的兩端段由該凹槽中間段的兩端垂直折向右側(cè)0. 5 0. 8 cm;
所述左側(cè)第六條凹槽為等截面凹槽，其中間段分為上、中、下三段，所述左側(cè)第六條 凹槽的中間段上段凹槽與左側(cè)第五條凹槽的中間段上段凹槽平行；所述左側(cè)第六條凹槽的 中間段中段凹槽垂直折向右側(cè)100 300 |_im，且與所述左側(cè)第五條凹槽的中間段中段凹槽 的右側(cè)邊平行；所述左側(cè)第六條凹槽的中間段下段凹槽垂直折向右側(cè)0.8 1.5cm，且與 所述左側(cè)第五條凹槽的中間段下段凹槽的右側(cè)邊平行；該左側(cè)第六條凹槽中間段之外的兩 端段垂直折向右側(cè)0.5 0.8 cm，之后再垂直折向中部0.3 0.5 cm;
所述六條凹槽的槽端處分別設(shè)有與相應(yīng)的凹槽相通的垂向通孔；所述六條凹槽之間 的間距為100 500um;所述六條凹槽長(zhǎng)度在l. 2 1.8cm范圍內(nèi)，寬度在20 1000ym 范圍內(nèi)；
所述聚二亞甲基硅氧烷印章的下表面貼覆于所述基底的金層上，在聚二亞甲基硅氧 烷印章與所述金表面之間形成六條封閉的微流道，所述微流道內(nèi)的金表面通過(guò)1 5 mM 硫醇的乙醇溶液自組裝而被修飾成抗細(xì)胞粘附的惰性區(qū)域；或者
部分微流道內(nèi)的金表面通過(guò)1 5 mM硫醇的乙醇溶液自組裝而被修飾成抗細(xì)胞粘附 的惰性區(qū)域，另一部分微流道內(nèi)的金表面利用細(xì)胞外基質(zhì)被修飾成促進(jìn)細(xì)胞粘附的活性 區(qū)域。
所述的鈦粘附層厚度均為2 10nm;所述的鉻粘附層厚度均為2 10nm;所述的金層 厚度為20 50nm。
本發(fā)明提供的在同一基底上粘附和操縱多種細(xì)胞的方法，包括如下的步驟
1) 在一干凈玻璃基底上表面上先蒸鍍2 10 nm厚的鈦粘附層或鉻粘附層，然后再 在所述鈦粘附層或鉻粘附層上蒸鍍20 50 nm厚的金層；
2) 使用光刻技術(shù)，在一硅片上制備至少一組凸型線型微結(jié)構(gòu)單元，該凸型線型微結(jié) 構(gòu)單元由六條凸型條組成；
其中，位于右側(cè)三條凸型條為等截面凸型條，該右側(cè)三條凸型條的中間段相互平行， 所述右側(cè)第一條凸型條中間段之外的兩端段由該凸型條中間段的兩端垂直折向右側(cè)0.5 0.8 cm，然后再垂直折向中部0.3 0.5 cm;所述右側(cè)第二條凸型條中間段之外的兩端段 由該凸型條中間段的兩端垂直折向右側(cè)0.8 L5 cm;所述右側(cè)第三條凸型條中間段之外 的兩端段由該凸型條中間段的兩端以30 60度斜角折向右側(cè)0.5 0.8 cm;
所述右側(cè)第四條凸型條的中間段分為上、中、下三段，所述右側(cè)第四條凸型條的中 間段中段凸型條截面寬度向左側(cè)寬于所述右側(cè)第四條凸型條的中間段上段凸型條截面寬 度100 300 pin;所述右側(cè)第四條凸型條的中間段下段凸型條截面寬度向左側(cè)寬于右側(cè)第 四條凸型條的中間段中段凸型條截面寬度100 300jam;而且該右側(cè)第四條凸型條中間段之外的兩端段以30 60度斜角折向左側(cè)0.5 0.8 cm;
所述右側(cè)第五條凸型條為等截面凸型條，其中間段分為上、中、下三段，所述右側(cè) 第五條凸型條的中間段上段凸型條與所述右側(cè)第四條凸型條的中間段上段凸型條平行；所 述右側(cè)第五條凸型條的中間段中段凸型條垂直折向左側(cè)100 300 pm，且與所述右側(cè)第四 條凸型條的中間段中段凸型條的左側(cè)邊平行；所述右側(cè)第五條凸型條的中間段下段凸型條 垂直折向左側(cè)0.8 1.5 cm，且與所述右側(cè)第四條凸型條的中間段下段凸型條的左側(cè)邊平 行；所述右側(cè)第五條凸型條中間段之外的兩端段由該凸型條中間段的兩端垂直折向左側(cè) 0.5—0.8 cm;
所述右側(cè)第六條凸型條為等截面凸型條，其中間段分為上、中、下三段，所述右側(cè)第 六條凸型條的中間段上段凸型條與右側(cè)第五條凸型條的中間段上段凸型條平行；所述右側(cè) 第六條凸型條的中間段中段凸型條垂直折向左側(cè)100 300 pm，且與所述右側(cè)第五條凸型 條的中間段中段凸型條的左側(cè)邊平行；所述右側(cè)第六條凸型條的中間段下段凸型條垂直折 向左偵!l0.8 1.5cm，且與所述右側(cè)第五條凸型條的中間段下段凸型條槽的左側(cè)邊平行；所 述右側(cè)第六條凸型條中間段之外的兩端段由該凸型條中間段的兩端垂直折向左側(cè)0.5 0.8 cm，之后再垂直折向中部0.3 0.5cm;
所述六條凸型條之間的間距為100 500ym，
所述六條凸型條長(zhǎng)度均在1.2 1.5 cm范圍內(nèi)；所述六條凸型條寬度均在20 300 y m 范圍內(nèi)；
3)用聚二亞甲基硅氧垸對(duì)步驟2)得到的具有至少一組凸型線型微結(jié)構(gòu)單元進(jìn)行翻 膜，得到一與所述凸型線型微結(jié)構(gòu)單元相對(duì)應(yīng)的具有至少一組微凹型單元的聚二亞甲基 硅氧烷印章；該聚二亞甲基硅氧垸印章下表面上的微凹槽單元由從左至右依次排列的六條 凹槽組成；
其中，位于左側(cè)三條凹槽為等截面的凹槽，該左側(cè)三條凹槽的中間段相互平行，所述 左側(cè)第一條凹槽中間段之外的兩端段由該凹槽中間段的兩端垂直折向左側(cè)0. 5 0. 8 cm，然 后再垂直折向中部0.3 0.5 cm;所述左側(cè)第二條凹槽中間段之外的兩端段由該凹槽中間 段的兩端垂直折向左側(cè)0. 8 1. 5 cm;所述左側(cè)第三條凹槽中間段之外的兩端段由該凹槽 中間段的兩端以30 60度斜角折向左側(cè)0. 5 0. 8 cm;
所述左側(cè)第四條凹槽的中間段分為上、中、下三段，所述左側(cè)第四條凹槽的中間段 中段凹槽截面寬度向右側(cè)寬于左側(cè)第四條凹槽的中間段上段凹槽截面寬度100 300 所述左側(cè)第四條凹槽的中間段下段凹槽截面寬度向右側(cè)寬于左側(cè)第四條凹槽的中間段中 段凹槽截面寬度100 300jam;而且該左側(cè)第四條凹槽中間段之外的兩端段以30 60度 斜角折向右側(cè)0.5 0.8 cm;所述左側(cè)第五條凹槽為等截面凹槽，其中間段分為上、中、下三段，所述左側(cè)第五 條凹槽的中間段上段凹槽與左側(cè)第四條凹槽的中間段上段凹槽平行；所述左側(cè)第五條凹 槽的中間段中段凹槽垂直折向右側(cè)100 300 pm，且與所述左側(cè)第四條凹槽的中間段中 段凹槽的右側(cè)邊平行；所述左側(cè)第五條凹槽的中間段下段凹槽垂直折向右側(cè)0.8 1.5 cm，且與所述左側(cè)第四條凹槽的中間段下段凹槽的右側(cè)邊平行；該左側(cè)第五條凹槽中間 段之外的兩端段由該凹槽中間段的兩端垂直折向右側(cè)0. 5 0. 8 cm;
所述左側(cè)第六條凹槽為等截面凹槽，其中間段分為上、中、下三段，所述左側(cè)第六條 凹槽的中間段上段凹槽與左側(cè)第五條凹槽的中間段上段凹槽平行；所述左側(cè)第六條凹槽的 中間段中段凹槽垂直折向右側(cè)100 300 jam,且與所述左側(cè)第五條凹槽的中間段中段凹槽 的右側(cè)邊平行；所述左側(cè)第六條凹槽的中間段下段凹槽垂直折向右側(cè)0.8 1.5cm，且與 所述左側(cè)第五條凹槽的中間段下段凹槽的右側(cè)邊平行；該左側(cè)第六條凹槽中間段之外的兩 端段垂直折向右側(cè)0.5 0.8 cm，之后再垂直折向中部0.3 0.5 cm;
所述六條凹槽的槽端處分別設(shè)有與相應(yīng)的凹槽相通的垂向通孔；所述六條凹槽之間 的間距為100 500nm;所述六條凹槽長(zhǎng)度在l. 2 1.8cm范圍內(nèi)，寬度在20 1000pm
范圍內(nèi)；
然后把聚二亞甲基硅氧垸印章的具有微凹型單元的面朝上，高壓消毒；
4) 將步驟3)經(jīng)高壓消毒后的無(wú)菌聚二亞甲基硅氧烷印章取出后，把具有微凹型單 元的面朝下與步驟1)所述基底金層進(jìn)行接觸性連接，在聚二亞甲基硅氧垸印章與基底金 層之間形成封閉的六條微流管道；所述聚二亞甲基硅氧烷印章的下表面貼覆于所述基底 的金層上，在聚二亞甲基硅氧垸印章與所述金表面之間形成六條封閉的微流道，所述微流 道內(nèi)的金表面通過(guò)1 5 mM硫醇的乙醇溶液自組裝而被修飾成抗細(xì)胞粘附的惰性區(qū)域； 或者，部分微流道內(nèi)的金表面通過(guò)1 5 raM硫醇的乙醇溶液自組裝而被修飾成抗細(xì)胞粘 附的惰性區(qū)域，另一部分微流道內(nèi)的金表面用50 200叫/ml細(xì)胞外基質(zhì)被修飾成促進(jìn) 細(xì)胞粘附的活性區(qū)域；孵育1 3 h;
5) 制備不同種類的粘附細(xì)胞的懸浮溶液，細(xì)胞密度為106個(gè)/ml，然后把不同種細(xì)胞 通入相應(yīng)設(shè)計(jì)培養(yǎng)細(xì)胞的流通管腔中，再放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，在37 'C， 二氧化碳體積濃度 5%，培養(yǎng)30 60min，細(xì)胞粘附在微流管道內(nèi)的金表面上；揭掉聚二亞甲基硅氧烷印章， 將生長(zhǎng)有細(xì)胞的金表面放入普通細(xì)胞培養(yǎng)液中，12 24h后，細(xì)胞在各自限定區(qū)域內(nèi)生 長(zhǎng)，以完成多種細(xì)胞粘附于同一基底上并束縛在各自的區(qū)域內(nèi)；
6) 若操縱基底上全部種類的細(xì)胞都可以自由移動(dòng)，則在步驟5)中揭掉聚二亞甲基 硅氧烷印章，將生長(zhǎng)有細(xì)胞的金表面放入普通細(xì)胞培養(yǎng)液后，在金表面上通負(fù)電極，培 養(yǎng)液通正電極，電壓為1.0 1.4V，通電時(shí)間為30 60s，破壞金表面上的硫醇分子與金的結(jié)合，從而除去硫醇分子，使其束縛的細(xì)胞釋放，所有種類細(xì)胞均自由移動(dòng)；
7) 若操縱基底上的部分種類細(xì)胞移動(dòng)，而其余種類細(xì)胞在原位固定，則在步驟4) 中把50 200 y g/ml細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的PBS磷酸緩沖液通入設(shè)計(jì)培養(yǎng)細(xì)胞的微流管道中； 然后在設(shè)計(jì)需要原位固定細(xì)胞的微流管道兩側(cè)管腔中通入1 5 mM硫醇溶液；而設(shè)計(jì)細(xì)
胞移動(dòng)的管腔兩側(cè)管腔中通入PBS溶液進(jìn)行分隔；孵育1 3 h;
8) 制備不同種類的粘附細(xì)胞的懸浮溶液，細(xì)胞密度為1()6個(gè)/ml，然后把不同種細(xì)胞 通入相應(yīng)設(shè)計(jì)培養(yǎng)細(xì)胞的微流管道中，再放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，在37'C， 二氧化碳體積濃度 5%，培養(yǎng)30 60min，細(xì)胞粘附在微流管道內(nèi)的金表面上；揭掉聚二亞甲基硅氧烷印章， 將生長(zhǎng)有細(xì)胞的金表面放入普通細(xì)胞培養(yǎng)液中，4 8h后，被固定的細(xì)胞在各自限定區(qū) 域內(nèi)生長(zhǎng)，而用PBS分隔的細(xì)胞開(kāi)始移動(dòng)，以完成選擇性操縱細(xì)胞移動(dòng)和固定的目的。
所述步驟2)的硫醇是HS(CH2) (0CH20CH2)60H 、 HS(CH2)u(0CH20CH2)s0H或 HS (CH2) (0CH20CH2)30H。
所述步驟7)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白為纖維結(jié)合蛋白、膠原蛋白或?qū)诱尺B蛋白。
本發(fā)明上述裝置和方法可粘附和操縱多種細(xì)胞于同一基底，粘附的細(xì)胞間通過(guò)分泌 的可溶性生物分子相互作用。
本發(fā)明的上述裝置和方法將多種細(xì)胞粘附和操縱于同一基底可以用于藥物篩選，在 粘附的細(xì)胞培養(yǎng)的條件下加入待篩選的藥物，與沒(méi)有加入藥物的樣品進(jìn)行比較，可以了 解哪種藥物可以影響這幾種細(xì)胞之間的相互作用；也可以用于進(jìn)行電解吸，觀察全部種
類細(xì)胞的移動(dòng)；或者選擇性固定一種或幾種細(xì)胞，觀察其余細(xì)胞的移動(dòng)，從而為新藥篩 選，提供一種極為便利的方法；
本發(fā)明提供的方法首先是在基底表面先用金表面與PDMS中的微流管道形成可修飾的 管道表面和不可修飾的封閉表面。以細(xì)胞外基質(zhì)、PBS和寡乙二醇為末端的單層膜將可修 飾表面劃分成細(xì)胞可粘附區(qū)域和細(xì)胞不可粘附區(qū)域，使多種細(xì)胞固定在各個(gè)區(qū)域；或者 利用電化學(xué)反應(yīng)，解除單層膜在金表面的吸附，使得全部種類的細(xì)胞都可移動(dòng)；或者選 擇性修飾各種細(xì)胞兩側(cè)，進(jìn)而選擇性固定和釋放一種或多種細(xì)胞，以達(dá)到可以粘附和操 縱任意一種或多種細(xì)胞的目標(biāo)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于
1、 本發(fā)明利用表面化學(xué)和微流控的結(jié)合，來(lái)構(gòu)筑復(fù)雜的細(xì)胞培養(yǎng)體系，可以讓多種 細(xì)胞在可調(diào)控的空間和時(shí)間，有序地在表面的粘附、生長(zhǎng)。
2、 在不同種細(xì)胞有序固定在基底表面后，也可以進(jìn)行電解吸檢測(cè)幾種細(xì)胞之間互相 爬動(dòng)的影響。3、 控制幾種細(xì)胞使之局限于一定區(qū)域完全不能移動(dòng)；也可以使部分種類細(xì)胞移動(dòng)， 其余種類細(xì)胞不移動(dòng)；也可以使所有細(xì)胞都移動(dòng)。
4、 這幾種細(xì)胞的密度和相間的距離可以精確調(diào)控，以便檢測(cè)幾種細(xì)胞之間的反應(yīng)。
因?yàn)榭梢钥刂萍?xì)胞密度、幾種細(xì)胞之間的間隔，所以分析的精度是前所未有。
5、 在這種方法得到的粘附了多種細(xì)胞的基底為細(xì)胞生物學(xué)、組織生物學(xué)的基本研究
提供了平臺(tái)，可以單細(xì)胞水平高精度的在時(shí)間和空間上對(duì)細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)行分析，同時(shí)， 還可以作為基于細(xì)胞和細(xì)胞之間作用的藥物檢測(cè)，為發(fā)現(xiàn)藥物和有毒物質(zhì)的分析提供了 新的途徑。
6、 可以讓細(xì)胞之間僅僅通過(guò)溶液中的物質(zhì)進(jìn)行信號(hào)交換而相互作用；也可以讓細(xì) 胞直接接觸進(jìn)行信號(hào)交相互作用。
7、 對(duì)多種細(xì)胞粘附、全釋放和部分釋放的操作方法更加簡(jiǎn)便易行。
8、 對(duì)粘附和操縱細(xì)胞裝置的制作進(jìn)行改進(jìn)，使之更加適用于生物實(shí)驗(yàn)室的日常操作。


圖l為本發(fā)明的在同一基底操縱多種粘附細(xì)胞的裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式
圖1為本發(fā)明的在同一基底上粘附和操縱多種細(xì)胞裝置的結(jié)構(gòu)示意圖，由圖1可知， 本發(fā)明提供的在同一基底上粘附和操縱多種細(xì)胞的裝置，包括
一基底；所述基底上表面上蒸鍍有一層鈦粘附層或鉻粘附層，所述鈦粘附層或鉻粘 附層上蒸鍍有一層金層；
一下表面上具有至少一微凹槽單元的聚二亞甲基硅氧垸印章；所述聚二亞甲基硅氧烷 印章的下表面貼覆于所述基底的金層上；和
一負(fù)極連通于所述基底，電壓為1.0 1.4V的電源；
所述微凹槽單元由從左至右依次排列的六條凹槽組成；
其中，位于左側(cè)三條凹槽為等截面的凹槽，該左側(cè)三條凹槽的中間段相互平行，所述 左側(cè)第一條凹槽中間段之外的兩端段由該凹槽中間段的兩端垂直折向左側(cè)0. 5 0. 8 cm，然 后再垂直折向中部0.3 0.5 cm;所述左側(cè)第二條凹槽中間段之外的兩端段由該凹槽中間 段的兩端垂直折向左側(cè)0. 8 1. 5 cm;所述左側(cè)第三條凹槽中間段之外的兩端段由該凹槽 中間段的兩端以30 60度斜角折向左側(cè)0.5 0.8 cm;
所述左側(cè)第四條凹槽的中間段分為上、中、下三段，所述左側(cè)第四條凹槽的中間段 中段凹槽截面寬度向右側(cè)寬于左側(cè)第四條凹槽的中間段上段凹槽截面寬度100 300 pm;所述左側(cè)第四條凹槽的中間段下段凹槽截面寬度向右側(cè)寬于左側(cè)第四條凹槽的中間段中 段凹槽截面寬度100 300|_im;而且該左側(cè)第四條凹槽中間段之外的兩端段以30 60度 斜角折向右側(cè)0. 5 0. 8 cm;
所述左側(cè)第五條凹槽為等截面凹槽，其中間段分為上、中、下三段，所述左側(cè)第五 條凹槽的中間段上段凹槽與左側(cè)第四條凹槽的中間段上段凹槽平行；所述左側(cè)第五條凹 槽的中間段中段凹槽垂直折向右側(cè)100 300 pm，且與所述左側(cè)第四條凹槽的中間段中 段凹槽的右側(cè)邊平行；所述左側(cè)第五條凹槽的中間段下段凹槽垂直折向右側(cè)0.8 1.5 cm,且與所述左側(cè)第四條凹槽的中間段下段凹槽的右側(cè)邊平行；該左側(cè)第五條凹槽中間 段之外的兩端段由該凹槽中間段的兩端垂直折向右側(cè)0. 5 0. 8 cm;
所述左側(cè)第六條凹槽為等截面凹槽，其中間段分為上、中、下三段，所述左側(cè)第六條 凹槽的中間段上段凹槽與左側(cè)第五條凹槽的中間段上段凹槽平行；所述左側(cè)第六條凹槽的 中間段中段凹槽垂直折向右側(cè)100 300 )am，且與所述左側(cè)第五條凹槽的中間段中段凹槽 的右側(cè)邊平行；所述左側(cè)第六條凹槽的中間段下段凹槽垂直折向右側(cè)0.8 1.5cm，且與 所述左側(cè)第五條凹槽的中間段下段凹槽的右側(cè)邊平行；該左側(cè)第六條凹槽中間段之外的兩 端段垂直折向右側(cè)0.5 0.8 cm，之后再垂直折向中部0.3 0.5 cm;
所述六條凹槽的槽端處分別設(shè)有與相應(yīng)的凹槽相通的垂向通孔；所述六條凹槽之間 的間距為100 500um;所述六條凹槽長(zhǎng)度在l. 2 1.8cm范圍內(nèi)，寬度在20 1000um 范圍內(nèi)；
所述聚二亞甲基硅氧垸印章的下表面貼覆于所述基底的金層上，在聚二亞甲基硅氧 烷印章與所述金表面之間形成六條封閉的微流道，所述微流道內(nèi)的金表面通過(guò)1 5 mM 硫醇的乙醇溶液自組裝而被修飾成抗細(xì)胞粘附的惰性區(qū)域；或者
部分微流道內(nèi)的金表面通過(guò)1~5 mM硫醇的乙醇溶液自組裝而被修飾成抗細(xì)胞粘附 的惰性區(qū)域，另一部分微流道內(nèi)的金表面利用細(xì)胞外基質(zhì)被修飾成促進(jìn)細(xì)胞粘附的活性 區(qū)域。
所述的鈦粘附層厚度均為2 10nm;所述的鉻粘附層厚度均為2 10nm;所述的金層 厚度為20 50nm。
實(shí)施例1、
1) 在一干凈的玻璃載波片(厚度O. 15腿)表面蒸鍍5nm的鈦粘附層，然后再在其 上蒸鍍30 nm厚的金層，制得一實(shí)驗(yàn)所需要的基底；
2) 把步驟l)的基底切成2x2 cm2的小塊，備用；
3) 使用光刻技術(shù)在一硅片上制備出至少一組凸型線型微單元，首先用作圖軟件L-edit設(shè)計(jì)出所要圖形六條并排的凸型條，其中，位于右側(cè)三條凸型條為等截面的凸型 條，該右側(cè)三條凸型條的中間段相互平行，所述右側(cè)第一條凸型條中間段之外的兩端段 由凸型條中間段的兩端垂直折向右側(cè)0.7 cm，然后再垂直折向中部0.4 cm;所述右側(cè)第 二條凸型條中間段之外的兩端段由凸型條中間段的兩端垂直折向右側(cè)1.2 cm;所述右側(cè) 第三條凸型條中間段之外的兩端段由凸型條中間段的兩端以45度斜角折向右側(cè)0.7 cm; 所述右側(cè)第四條凸型條的中間段分為上、中、下三段，所述中間段中段凸型條截面寬度 向左側(cè)寬于中間段上段凸型條截面寬度200 所述中間段下段凸型條截面寬度向左側(cè) 寬于中間段中段凸型條截面寬度200 nm;而且該右側(cè)第四條凸型條中間段之外的兩端段 以45度斜角折向左側(cè)0. 7 cm;所述右側(cè)第五條凸型條為等截面凸型條，其中間段分為上、 中、下三段，所述中間段上段凸型條與右側(cè)第四條凸型條的中間段上段凸型條平行；所述 中間段中段凸型條垂直折向左側(cè)200 jam,且與所述右側(cè)第四條凸型條的中間段中段凸型 條的左側(cè)邊平行；所述中間段下段凸型條垂直折向左側(cè)1.2 cm,且與所述右側(cè)第四條凸 型條的中間段下段凸型條的左側(cè)邊平行；該右側(cè)第五條凸型條中間段之外的兩端段由凸型 條中間段的兩端垂直折向左側(cè)0.7cm;所述右側(cè)第六條凸型條為等截面凸型條，該中間段 分為上、中、下三段，所述中間段上段凸型條與右側(cè)第五條凸型條的中間段上段凸型條平 行；所述中間段中段凸型條垂直折向左側(cè)200 pm，且與所述右側(cè)第五條凸型條的中間段中 段凸型條的左側(cè)邊平行；所述中間段下段凸型條垂直折向左側(cè)1.2cm，且與所述右側(cè)第五 條凸型條的中間段下段凸型條槽的左側(cè)邊平行；該右側(cè)第六條凸型條中間段之外的兩端段 垂直折向左側(cè)0.7 cm，之后再垂直折向中部0.4 cm;
所述六條凸型條的端處分別設(shè)有與相應(yīng)的凸型線相通的垂向通孔；本實(shí)施例的六條凸 型條長(zhǎng)為1.5cm，寬度為100nm;然后打印為分辨率為3600dpi的膠片；接著再涂膠(SU-8 系列負(fù)膠)，利用甩膠機(jī)均勻地將光刻膠，涂在硅片上，經(jīng)高溫烘烤硬化后，把膠片垂直放 在涂有光刻膠的基板上，顯影曝光后就在涂有光刻膠的硅片上制成了所述的凸型線型微結(jié)構(gòu) 單元；
4)用聚二亞甲基硅氧垸(PDMS)對(duì)步驟3)得到的凸型線型微結(jié)構(gòu)單元進(jìn)行翻膜， 得到一與上述微結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的、具有至少一組微凹槽單元的PDMS印章；然后把印章有微 凹槽的面向上，進(jìn)行高壓滅菌；
所述微凹槽單元由從左至右依次排列的六條凹槽組成；
其中，位于左側(cè)三條凹槽(圖l中標(biāo)號(hào)l、 2或3所示的凹槽)為等截面的凹槽，該左 側(cè)三條凹槽的中間段相互平行，所述左側(cè)第一條凹槽(圖l中標(biāo)號(hào)l所示的凹槽))中間段 之外的兩端段由該凹槽中間段的兩端垂直折向左側(cè)O. 5 0. 8 cm，然后再垂直折向中部O. 3 0.5 cm;所述左側(cè)第二條凹槽(圖1中標(biāo)號(hào)2所示的凹槽)中間段之外的兩端段由該凹槽中間段的兩端垂直折向左側(cè)0. 8 1. 5 cm;所述左側(cè)第三條凹槽(圖1中標(biāo)號(hào)3所示的凹 槽)中間段之外的兩端段由該凹槽中間段的兩端以30 60度斜角折向左側(cè)0. 5 0.8 cm;
所述左側(cè)第四條凹槽(圖1中標(biāo)號(hào)4所示的凹槽)的中間段分為上、中、下三段， 所述左側(cè)第四條凹槽的中間段中段凹槽截面寬度向右側(cè)寬于左側(cè)第四條凹槽的中間段上 段凹槽截面寬度100 300 所述左側(cè)第四條凹槽的中間段下段凹槽截面寬度向右側(cè) 寬于左側(cè)第四條凹槽的中間段中段凹槽截面寬度100 300 |_im;而且該左側(cè)第四條凹槽 中間段之外的兩端段以30 60度斜角折向右側(cè)0. 5 0. 8 cm;
所述左側(cè)第五條凹槽(圖l中標(biāo)號(hào)5所示的凹槽)為等截面凹槽，其中間段分為上、 中、下三段，所述左側(cè)第五條凹槽的中間段上段凹槽與左側(cè)第四條凹槽的中間段上段凹 槽平行；所述左側(cè)第五條凹槽的中間段中段凹槽垂直折向右側(cè)100 300 pm，且與所述 左側(cè)第四條凹槽的中間段中段凹槽的右側(cè)邊平行；所述左側(cè)第五條凹槽的中間段下段凹 槽垂直折向右側(cè)0.8 1.5 cm，且與所述左側(cè)第四條凹槽的中間段下段凹槽的右側(cè)邊平 行；該左側(cè)第五條凹槽中間段之外的兩端段由該凹槽中間段的兩端垂直折向右側(cè)0.5 0.8 cm;
所述左側(cè)第六條凹槽(圖1中標(biāo)號(hào)6所示的凹槽)為等截面凹槽，其中間段分為上、 中、下三段，所述左側(cè)第六條凹槽的中間段上段凹槽與左側(cè)第五條凹槽的中間段上段凹槽 平行；所述左側(cè)第六條凹槽的中間段中段凹槽垂直折向右側(cè)100 300 pm，且與所述左側(cè) 第五條凹槽的中間段中段凹槽的右側(cè)邊平行；所述左側(cè)第六條凹槽的中間段下段凹槽垂直 折向右側(cè)0.8 1.5cm，且與所述左側(cè)第五條凹槽的中間段下段凹槽的右側(cè)邊平行；該左 側(cè)第六條凹槽中間段之外的兩端段垂直折向右側(cè)0. 5 0. 8 cm，之后再垂直折向中部0. 3 0. 5 cm;
所述六條凹槽的槽端處分別設(shè)有與相應(yīng)的凹槽相通的垂向通孔；所述六條凹槽之間 的間距為100 500um;所述六條凹槽長(zhǎng)度在l. 2 1.8cm范圍內(nèi)，寬度在20 1000ym 范圍內(nèi)；
5) 將步驟4)經(jīng)高壓滅菌后PDMS印章取出后，把具有微凹槽單元的面向下與步驟2) 的基底金表面緊密接觸，在PDMS印章與基底金表面之間形成封閉的六條微流道；然后把 100 P g/ml細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(纖維結(jié)合蛋白(f ibronection))的PBS磷酸緩沖液(pH 7. 4) 通入特定的管腔中；其余管腔通入3 mM硫醇溶液；孵育2 h;
6) 制備不同種的粘附細(xì)胞——Hela細(xì)胞和NIH 3T3細(xì)胞的懸浮溶液，細(xì)胞密度均為 106個(gè)/ml，然后把Hela細(xì)胞的懸浮溶液通入第二管腔中，將NIH 3T3細(xì)胞的懸浮溶液通 入第五管腔中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，于37'C、 二氧化碳濃度5% (體積濃度)，培養(yǎng)40min，細(xì)胞粘附在管腔內(nèi)的金表面上；把PDMS印章揭掉，把長(zhǎng)有細(xì)胞的金表面放入普通細(xì)胞培 養(yǎng)液(胎牛血清濃度10% )中，24h后，細(xì)胞就會(huì)長(zhǎng)滿各自的限定區(qū)域，得到一粘附并 固定了兩種細(xì)胞的基底。
同樣的方法和步驟可以得到粘附和固定多種細(xì)胞的基底。
實(shí)施例2
1) 在一干凈的玻璃載波片(厚度O. 12 mm)表面蒸鍍IO nm的鉻作為粘附層，然后 再在其上蒸鍍50 nm厚的金層，制得一實(shí)驗(yàn)所需要的基底；
2) 把步驟l)的基底切成2x2 cm2的小塊，備用；
3) 使用光刻技術(shù)在硅片上制備出至少一組凸型線型微結(jié)構(gòu)單元，首先用作圖軟件 L-edit設(shè)計(jì)出所要圖形六條并排的凸型線，該六條并排的凸型線包括由左向右共計(jì)六 條凸型線；其中右側(cè)三條凸型線在中間位置平行，所述右側(cè)第一條凸型線在平行段的兩 端垂直折向右側(cè)0.5 cm，然后垂直折向中部0.3 cm;所述右側(cè)第二條凸型線在平行段的 兩端垂直折向右側(cè)0.8 cm;所述右側(cè)第三條凸型線在平行段的兩端以斜角30度角折向左 側(cè)0.5cm;所述右側(cè)第四條凸型線在中間平行段再分為三段，每段向左加寬100pm，并 且平行段的兩端以斜角30度角折向左側(cè)0.5 cm;所述右側(cè)第五條凸型線在中間平行段再 分為三段，依據(jù)所述右側(cè)第四條凸型線依次垂直折向左側(cè)100pm，平行段的兩端垂直折 向右側(cè)0.8 cm;所述右側(cè)第六條凸型線在中間平行段再分為三段，依據(jù)所述右側(cè)第五條 凸型線依次垂直折向左側(cè)100pm，平行段的兩端垂直折向左側(cè)0.5cm，然后垂直折向中 部0.3 cm;所述六條凸型線的端處分別設(shè)有與相應(yīng)的凸型線相通的垂向通孔(凸型線長(zhǎng) 為1.2 cm);寬度為寬20um (凸型線寬為20um);然后打印為分辨率為3600 dpi的膠片； 接著再涂膠(SU-8系列負(fù)膠)，利用甩膠機(jī)均勻地將光刻膠，涂在硅片基底上，經(jīng)高溫烘烤 硬化后，把膠片垂直放在涂有光刻膠的基板上，顯影曝光后就在涂有光刻膠的硅片上制成了 所述的凸型線型微結(jié)構(gòu)單元;；
4) 用聚二亞甲基硅氧垸(PDMS)對(duì)步驟3)得到的凸型線型微結(jié)構(gòu)單元進(jìn)行翻膜， 得到一與上述微結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的、具有凹型圖案的PDMS印章；然后把印章有凹型圖案的面 向上，高壓滅菌；
5) 將步驟4)中的印章取出后，把有凹型圖案的面向下與步驟2)的金表面的基底 接觸，形成封閉的管腔；然后把100 yg/ml細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(纖維結(jié)合蛋白
(fibronection))的PBS磷酸緩沖液(pH7.4)通入特定的管腔中；其余管腔通入3 mM 硫醇溶液；孵育2 h;
6) 制備不同種的粘附細(xì)胞——3T6細(xì)胞和NIH 3T3細(xì)胞的懸浮溶液，細(xì)胞密度均為胞的懸浮溶液通入第一管腔中，將3T6細(xì)胞的懸浮溶液通 入第二管腔中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，于37 °C、 二氧化碳濃度5%(體積濃度)，培養(yǎng)30min， 細(xì)胞粘附在管腔內(nèi)的金表面上；把PDMS印章揭掉，把長(zhǎng)有細(xì)胞的金表面放入普通細(xì)胞培 養(yǎng)液(胎牛血清濃度10 % )中，24 h后，細(xì)胞就會(huì)長(zhǎng)滿各自的限定區(qū)域，得到一粘附 并固定兩種細(xì)胞的基底。
7)在步驟6)中的細(xì)胞兩側(cè)基底的金表面上通負(fù)電極，培養(yǎng)液通正電極，電壓為1.4 V，通電時(shí)間為45s，破壞金表面上的硫醇分子與金的結(jié)合，從而除去硫醇分子，使其束 縛的3T6和NIH 3T3細(xì)胞釋放，達(dá)到兩種類細(xì)胞均可自由移動(dòng)的目的。
同樣的方法和步驟可以得到粘附固定，然后釋放多種細(xì)胞的目的。
實(shí)施例3
1) 在一干凈的玻璃載波片(厚度0.15mm)表面蒸鍍2nm的鈦?zhàn)鳛檎掣綄?，然后?在其上蒸鍍20 nm厚的金層，制得一實(shí)驗(yàn)所需要的基底；
2) 把步驟l)的基底切成2x2 cm2的小塊，備用；
3) 使用光刻技術(shù)在硅片上制備出至少一組凸型線型微結(jié)構(gòu)單元，首先用作圖軟件 L-edit設(shè)計(jì)出所要圖形六條并排的凸型線，該六條并排的凸型線包括由左向右共計(jì)六 條凸型線；其中右側(cè)三條凸型線在中間位置平行，所述右側(cè)第一條凸型線在平行段的兩 端垂直折向右側(cè)0.8 cm，然后垂直折向中部0.5 cm;所述右側(cè)第二條凸型線在平行段的 兩端垂直折向右側(cè)1.5 cm;所述右側(cè)第三條凸型線在平行段的兩端以斜角60度角折向左 側(cè)0.8 cm;所述右側(cè)第四條凸型線在中間平行段再分為三段，每段向左加寬300 pm，并 且平行段的兩端以斜角60度角折向左側(cè)0.8 cm;所述右側(cè)第五條凸型線在中間平行段再 分為三段，依據(jù)所述右側(cè)第四條凸型線依次垂直折向右側(cè)300Mm，平行段的兩端垂直折 向左側(cè)1.5 cm;所述右側(cè)第六條凸型線在中間平行段再分為三段，依據(jù)所述右側(cè)第五條 凸型線依次垂直折向右側(cè)300 pm，平行段的兩端垂直折向右側(cè)0.8cm，然后垂直折向中 部0.5 cm;所述六條凸型線的端處分別設(shè)有與相應(yīng)的凸型線相通的垂向通孔(凸型線長(zhǎng) 為1.5 cm);寬度為寬300 ixm (凸型線寬為300u m);然后打印為分辨率為3600 dpi的膠 片；接著再涂膠(SU-8系列負(fù)膠)，利用甩膠機(jī)均勻地將光刻膠，涂在硅片基底上，經(jīng)高溫 烘烤硬化后，把膠片垂直放在涂有光刻膠的基板上，顯影曝光后就在涂有光刻膠的硅片上制 成了所述的凸型線型微結(jié)構(gòu)單元；
4) 用聚二亞甲基硅氧烷(PDMS)對(duì)步驟3)得到的凸型線型微結(jié)構(gòu)單元進(jìn)行翻膜， 得到一與上述微結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的、具有凹型圖案的PDMS印章；然后把印章有凹型圖案的面 向上，在等離子清洗器中氧化2 min，形成具有親水表面的PDMS印章；5) 將步驟4)中的印章取出后，把有凹型圖案的面向下與步驟2)的金表面的基底 接觸，形成封閉的管腔；然后把100 Ug/ml細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(纖維結(jié)合蛋白
(fibronection))的PBS磷酸緩沖液(pH 7.4)通入62和65的管腔中；61和63管 腔通入3 mM硫醇溶液；64和66管腔通入PBS溶液；孵育2 h;
6) 制備不同種的粘附細(xì)胞——3T6細(xì)胞和NIH 3T3細(xì)胞的懸浮溶液，細(xì)胞密度均為
106個(gè)/ml，然后把NIH 3T3細(xì)胞的懸浮溶液通入62管腔中，將3T6細(xì)胞的懸浮溶液通入
65管腔中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，于37 'C、 二氧化碳濃度5 % (體積濃度)，培養(yǎng)30 min，
細(xì)胞粘附在管腔內(nèi)的金表面上；把PDMS印章揭掉，把長(zhǎng)有細(xì)胞的金表面放入普通細(xì)胞培
養(yǎng)液(胎牛血清濃度IO % )中，2 h后，3T6細(xì)胞開(kāi)始移動(dòng)逐漸爬出65管腔的位置，
而NIH3T3細(xì)胞仍被束縛在62管腔中，達(dá)到一種細(xì)胞固定，另一種細(xì)胞自由移動(dòng)的目的。 同樣的方法和步驟可以得到粘附固定，然后選擇釋放多種細(xì)胞的目的。
權(quán)利要求
1、一種在同一基底上粘附和操縱多種細(xì)胞的裝置，包括一基底；所述基底上表面上蒸鍍有一層鈦粘附層或鉻粘附層，所述鈦粘附層或鉻粘附層上蒸鍍有一層金層；一下表面上具有至少一微凹槽單元的聚二亞甲基硅氧烷印章；所述聚二亞甲基硅氧烷印章的下表面貼覆于所述基底的金層上；和一負(fù)極連通于所述基底，電壓為1.0～1.4V的電源；所述微凹槽單元由從左至右依次排列的六條凹槽組成；其中，位于左側(cè)三條凹槽為等截面的凹槽，該左側(cè)三條凹槽的中間段相互平行，所述左側(cè)第一條凹槽中間段之外的兩端段由該凹槽中間段的兩端垂直折向左側(cè)0.5～0.8cm，然后再垂直折向中部0.3～0.5cm；所述左側(cè)第二條凹槽中間段之外的兩端段由該凹槽中間段的兩端垂直折向左側(cè)0.8～1.5cm；所述左側(cè)第三條凹槽中間段之外的兩端段由該凹槽中間段的兩端以30～60度斜角折向左側(cè)0.5～0.8cm；所述左側(cè)第四條凹槽的中間段分為上、中、下三段，所述左側(cè)第四條凹槽的中間段中段凹槽截面寬度向右側(cè)寬于左側(cè)第四條凹槽的中間段上段凹槽截面寬度100～300μm；所述左側(cè)第四條凹槽的中間段下段凹槽截面寬度向右側(cè)寬于左側(cè)第四條凹槽的中間段中段凹槽截面寬度100～300μm；而且該左側(cè)第四條凹槽中間段之外的兩端段以30～60度斜角折向右側(cè)0.5～0.8cm；所述左側(cè)第五條凹槽為等截面凹槽，其中間段分為上、中、下三段，所述左側(cè)第五條凹槽的中間段上段凹槽與左側(cè)第四條凹槽的中間段上段凹槽平行；所述左側(cè)第五條凹槽的中間段中段凹槽垂直折向右側(cè)100～300μm，且與所述左側(cè)第四條凹槽的中間段中段凹槽的右側(cè)邊平行；所述左側(cè)第五條凹槽的中間段下段凹槽垂直折向右側(cè)0.8～1.5cm，且與所述左側(cè)第四條凹槽的中間段下段凹槽的右側(cè)邊平行；該左側(cè)第五條凹槽中間段之外的兩端段由該凹槽中間段的兩端垂直折向右側(cè)0.5～0.8cm；所述左側(cè)第六條凹槽為等截面凹槽，其中間段分為上、中、下三段，所述左側(cè)第六條凹槽的中間段上段凹槽與左側(cè)第五條凹槽的中間段上段凹槽平行；所述左側(cè)第六條凹槽的中間段中段凹槽垂直折向右側(cè)100～300μm，且與所述左側(cè)第五條凹槽的中間段中段凹槽的右側(cè)邊平行；所述左側(cè)第六條凹槽的中間段下段凹槽垂直折向右側(cè)0.8～1.5cm，且與所述左側(cè)第五條凹槽的中間段下段凹槽的右側(cè)邊平行；該左側(cè)第六條凹槽中間段之外的兩端段垂直折向右側(cè)0.5～0.8cm，之后再垂直折向中部0.3～0.5cm；所述六條凹槽的槽端處分別設(shè)有與相應(yīng)的凹槽相通的垂向通孔；所述六條凹槽之間的間距為100～500μm；所述六條凹槽長(zhǎng)度在1.2～1.8cm范圍內(nèi)，寬度在20～1000μm范圍內(nèi)；所述聚二亞甲基硅氧烷印章的下表面貼覆于所述基底的金層上，在聚二亞甲基硅氧烷印章與所述金表面之間形成六條封閉的微流道，所述微流道內(nèi)的金表面通過(guò)1～5mM硫醇的乙醇溶液自組裝而被修飾成抗細(xì)胞粘附的惰性區(qū)域；或者部分微流道內(nèi)的金表面通過(guò)1～5mM硫醇的乙醇溶液自組裝而被修飾成抗細(xì)胞粘附的惰性區(qū)域，另一部分微流道內(nèi)的金表面利用細(xì)胞外基質(zhì)被修飾成促進(jìn)細(xì)胞粘附的活性區(qū)域。
2、 如權(quán)利要求l所述的在同一基底上粘附和操縱多種細(xì)胞的裝置，其特征在于所 述的鈦粘附層厚度均為2 10rnn;所述的鉻粘附層厚度均為2 10nm;所述的金層厚度為 20 50nm。
3、 一種在同一基底上粘附和操縱多種細(xì)胞的方法，包括如下的步驟1) 在一干凈玻璃基底上表面上先蒸鍍2 10 nm厚的鈦粘附層或鉻粘附層，然后再 在所述鈦粘附層或鉻粘附層上蒸鍍20 50 nm厚的金層；2) 使用光刻技術(shù)，在一硅片上制備至少一組凸型線型微結(jié)構(gòu)單元，該凸型線型微結(jié) 構(gòu)單元由六條凸型條組成；其中，位于右側(cè)三條凸型條為等截面凸型條，該右側(cè)三條凸型條的中間段相互平行， 所述右側(cè)第一條凸型條中間段之外的兩端段由該凸型條中間段的兩端垂直折向右側(cè)0.5 0.8 cm，然后再垂直折向中部0.3 0.5 cm;所述右側(cè)第二條凸型條中間段之外的兩端段 由該凸型條中間段的兩端垂直折向右側(cè)0.8 1.5 cm;所述右側(cè)第三條凸型條中間段之外 的兩端段由該凸型條中間段的兩端以30 60度斜角折向右側(cè)0.5 0.8 cm;所述右側(cè)第四條凸型條的中間段分為上、中、下三段，所述右側(cè)第四條凸型條的中 間段中段凸型條截面寬度向左側(cè)寬于所述右側(cè)第四條凸型條的中間段上段凸型條截面寬 度100 300pm;所述右側(cè)第四條凸型條的中間段下段凸型條截面寬度向左側(cè)寬于右側(cè)第 四條凸型條的中間段中段凸型條截面寬度100 300)am;而且該右側(cè)第四條凸型條中間段 之外的兩端段以30 60度斜角折向左側(cè)0.5 0.8 cm;所述右側(cè)第五條凸型條為等截面凸型條，其中間段分為上、中、下三段，所述右側(cè) 第五條凸型條的中間段上段凸型條與所述右側(cè)第四條凸型條的中間段上段凸型條平行；所 述右側(cè)第五條凸型條的中間段中段凸型條垂直折向左側(cè)100 300 nm，且與所述右側(cè)第四 條凸型條的中間段中段凸型條的左側(cè)邊平行；所述右側(cè)第五條凸型條的中間段下段凸型條 垂直折向左側(cè)0.8 1.5 cm，且與所述右側(cè)第四條凸型條的中間段下段凸型條的左側(cè)邊平行；所述右側(cè)第五條凸型條中間段之外的兩端段由該凸型條中間段的兩端垂直折向左側(cè) 0.5~0.8 cm;所述右側(cè)第六條凸型條為等截面凸型條，其中間段分為上、中、下三段，所述右側(cè)第 六條凸型條的中間段上段凸型條與右側(cè)第五條凸型條的中間段上段凸型條平行；所述右側(cè) 第六條凸型條的中間段中段凸型條垂直折向左側(cè)100 300 jam，且與所述右側(cè)第五條凸型 條的中間段中段凸型條的左側(cè)邊平行；所述右側(cè)第六條凸型條的中間段下段凸型條垂直折 向左側(cè)0.8 1.5cm，且與所述右側(cè)第五條凸型條的中間段下段凸型條槽的左側(cè)邊平行；所 述右側(cè)第六條凸型條中間段之外的兩端段由該凸型條中間段的兩端垂直折向左側(cè)0.5~0.8 cm,之后再垂直折向中部0.3 0.5 cm;所述六條凸型條之間的間距為100 500um，所述六條凸型條長(zhǎng)度均在1.2 1.5 cm范圍內(nèi)；所述六條凸型條寬度均在20 300ix m 范圍內(nèi)；3)用聚二亞甲基硅氧垸對(duì)步驟2)得到的具有至少一組凸型線型微結(jié)構(gòu)單元進(jìn)行翻 膜，得到一與所述凸型線型微結(jié)構(gòu)單元相對(duì)應(yīng)的具有至少一組微凹型單元的聚二亞甲基 硅氧烷印章；該聚二亞甲基硅氧烷印章下表面上的微凹槽單元由從左至右依次排列的六條 凹槽組成；其中，位于左側(cè)三條凹槽為等截面的凹槽，該左側(cè)三條凹槽的中間段相互平行，所述 左側(cè)第一條凹槽中間段之外的兩端段由該凹槽中間段的兩端垂直折向左側(cè)0. 5 0. 8 cm，然 后再垂直折向中部0.3 0.5 cm;所述左側(cè)第二條凹槽中間段之外的兩端段由該凹槽中間 段的兩端垂直折向左側(cè)0. 8 1. 5 cm;所述左側(cè)第三條凹槽中間段之外的兩端段由該凹槽 中間段的兩端以30 60度斜角折向左側(cè)0. 5 0. 8 cm;所述左側(cè)第四條凹槽的中間段分為上、中、下三段，所述左側(cè)第四條凹槽的中間段中段凹槽截面寬度向右側(cè)寬于左側(cè)第四條凹槽的中間段上段凹槽截面寬度100 300 pm;所述左側(cè)第四條凹槽的中間段下段凹槽截面寬度向右側(cè)寬于左側(cè)第四條凹槽的中間段中段凹槽截面寬度100 300 而且該左側(cè)第四條凹槽中間段之外的兩端段以30 60度斜角折向右側(cè)0.5 0.8 cm;所述左側(cè)第五條凹槽為等截面凹槽，其中間段分為上、中、下三段，所述左側(cè)第五 條凹槽的中間段上段凹槽與左側(cè)第四條凹槽的中間段上段凹槽平行；所述左側(cè)第五條凹槽的中間段中段凹槽垂直折向右側(cè)100 300 pm，且與所述左側(cè)第四條凹槽的中間段中 段凹槽的右側(cè)邊平行；所述左側(cè)第五條凹槽的中間段下段凹槽垂直折向右側(cè)0.8 1.5 cm，且與所述左側(cè)第四條凹槽的中間段下段凹槽的右側(cè)邊平行；該左側(cè)第五條凹槽中間 段之外的兩端段由該凹槽中間段的兩端垂直折向右側(cè)0. 5 0. 8 cm;所述左側(cè)第六條凹槽為等截面凹槽，其中間段分為上、中、下三段，所述左側(cè)第六條 凹槽的中間段上段凹槽與左側(cè)第五條凹槽的中間段上段凹槽平行；所述左側(cè)第六條凹槽的 中間段中段凹槽垂直折向右側(cè)100 300(im，且與所述左側(cè)第五條凹槽的中間段中段凹槽 的右側(cè)邊平行；所述左側(cè)第六條凹槽的中間段下段凹槽垂直折向右側(cè)0.8 1.5 cm，且與 所述左側(cè)第五條凹槽的中間段下段凹槽的右側(cè)邊平行；該左側(cè)第六條凹槽中間段之外的兩 端段垂直折向右側(cè)O. 5 0.8 cm，之后再垂直折向中部0.3 0.5 cm;所述六條凹槽的槽端處分別設(shè)有與相應(yīng)的凹槽相通的垂向通孔；所述六條凹槽之間 的間距為100 500網(wǎng)；所述六條凹槽長(zhǎng)度在1. 2 1.8 cm范圍內(nèi)，寬度在20 1000，范圍內(nèi)；然后把聚二亞甲基硅氧烷印章的具有微凹型單元的面朝上，高壓消毒；4) 將步驟3)經(jīng)高壓消毒后的無(wú)菌聚二亞甲基硅氧垸印章取出后，把具有微凹型單 元的面朝下與步驟1)所述基底金層進(jìn)行接觸性連接，在聚二亞甲基硅氧垸印章與基底金 層之間形成封閉的六條微流管道；所述聚二亞甲基硅氧烷印章的下表面貼覆于所述基底 的金層上，在聚二亞甲基硅氧垸印章與所述金表面之間形成六條封閉的微流道，所述微流 道內(nèi)的金表面通過(guò)1 5 mM硫醇的乙醇溶液自組裝而被修飾成抗細(xì)胞粘附的惰性區(qū)域； 或者，部分微流道內(nèi)的金表面通過(guò)1 5 mM硫醇的乙醇溶液自組裝而被修飾成抗細(xì)胞粘 附的惰性區(qū)域，另一部分微流道內(nèi)的金表面用50 200嗎/ml細(xì)胞外基質(zhì)被修飾成促進(jìn) 細(xì)胞粘附的活性區(qū)域；孵育1 3 h;5) 制備不同種類的粘附細(xì)胞的懸浮溶液，細(xì)胞密度為106個(gè)/ml，然后把不同種細(xì)胞 通入相應(yīng)設(shè)計(jì)培養(yǎng)細(xì)胞的流通管腔中，再放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，在37 'C， 二氧化碳體積濃度 5%，培養(yǎng)30 60min，細(xì)胞粘附在微流管道內(nèi)的金表面上；揭掉聚二亞甲基硅氧垸印章， 將生長(zhǎng)有細(xì)胞的金表面放入普通細(xì)胞培養(yǎng)液中，12 24h后，細(xì)胞在各自限定區(qū)域內(nèi)生 長(zhǎng)，以完成多種細(xì)胞粘附于同一基底上并束縛在各自的區(qū)域內(nèi)；6) 若操縱基底上全部種類的細(xì)胞都可以自由移動(dòng)，則在步驟5)中揭掉聚二亞甲基 硅氧烷印章，將生長(zhǎng)有細(xì)胞的金表面放入普通細(xì)胞培養(yǎng)液后，在金表面上通負(fù)電極，培 養(yǎng)液通正電極，電壓為1.0 1.4V，通電時(shí)間為30 60s，破壞金表面上的硫醇分子與 金的結(jié)合，從而除去硫醇分子，使其束縛的細(xì)胞釋放，所有種類細(xì)胞均自由移動(dòng)；7) 若操縱基底上的部分種類細(xì)胞移動(dòng)，而其余種類細(xì)胞在原位固定，則在步驟4) 中把50 200 y g/ml細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的PBS磷酸緩沖液通入設(shè)計(jì)培養(yǎng)細(xì)胞的微流管道中； 然后在設(shè)計(jì)需要原位固定細(xì)胞的微流管道兩側(cè)管腔中通入1 5 mM硫醇溶液；而設(shè)計(jì)細(xì) 胞移動(dòng)的管腔兩側(cè)管腔中通入PBS溶液進(jìn)行分隔；孵育1 3 h;8) 制備不同種類的粘附細(xì)胞的懸浮溶液，細(xì)胞密度為1Q6個(gè)/ml，然后把不同種細(xì)胞通入相應(yīng)設(shè)計(jì)培養(yǎng)細(xì)胞的微流管道中，再放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，在37'C, 二氧化碳體積濃度 5%，培養(yǎng)30 60min，細(xì)胞粘附在微流管道內(nèi)的金表面上；揭掉聚二亞甲基硅氧烷印章， 將生長(zhǎng)有細(xì)胞的金表面放入普通細(xì)胞培養(yǎng)液中，4 8h后，被固定的細(xì)胞在各自限定區(qū) 域內(nèi)生長(zhǎng)，而用PBS分隔的細(xì)胞開(kāi)始移動(dòng)，以完成選擇性操縱細(xì)胞移動(dòng)和固定的目的。
4、 如權(quán)利要求3所述的在同一基底上粘附和操縱多種細(xì)胞的方法，其特征在于所 述步驟 2) 的硫醇是 HS(CH2) (0CH20CH2)60H 、 HS (CH2) (0CH20CH2) 50H 或 HS (CH2) u (0CH20CH2) 30H。
5、 如權(quán)利要求3所述的在同一基底上粘附和操縱多種細(xì)胞的方法，其特征在于所 述步驟7)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白為纖維結(jié)合蛋白、膠原蛋白或?qū)诱尺B蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及將多種細(xì)胞粘附到同一基底并對(duì)其操縱的裝置和方法，其為在基底金表面用PDMS的微流管道將其劃分成可修飾和不可修飾區(qū)域。不同管道區(qū)域通入不同分子修飾，使其劃分成細(xì)胞可粘附和不可粘附區(qū)域。在可粘附不同區(qū)域接種不同細(xì)胞，拿開(kāi)PDMS，幾種細(xì)胞便有序吸附在表面。電化學(xué)解吸，破壞不可粘附區(qū)域中分子與金的結(jié)合，使所有種類細(xì)胞自由移動(dòng)。另外，選擇性修飾一種或幾種細(xì)胞兩側(cè)成為不可粘附區(qū)域，其余細(xì)胞利用PBS分隔，去除PDMS，被選擇的細(xì)胞被固定，其余細(xì)胞可自由移動(dòng)。該方法和裝置簡(jiǎn)單易操作，且可控制不同種細(xì)胞固定、全部運(yùn)動(dòng)或者部分運(yùn)動(dòng)，達(dá)到任意操縱多種細(xì)胞的目的，可用于研究多種細(xì)胞間相互作用，并可用于藥物篩選。
文檔編號(hào)C12M3/00GK101624569SQ20081011624
公開(kāi)日2010年1月13日 申請(qǐng)日期2008年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月7日
發(fā)明者勇 李, 蔣興宇, 陳振玲 申請(qǐng)人:國(guó)家納米科學(xué)中心