專利名稱：：來(lái)源于小金海棠的啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物啟動(dòng)子及其應(yīng)用，特別是涉及一種來(lái)源于小金海棠的啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：?jiǎn)?dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控因子中最重要的因子，它基本決定一個(gè)基因是否表達(dá)、何時(shí)表達(dá)和何處表達(dá)。按作用方式和功能，啟動(dòng)子大體可以分為組成型啟動(dòng)子、特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子三大類[王關(guān)林，方宏筠，2002，植物基因工程原理與技術(shù)(第二版)，北京，科學(xué)技術(shù)出版社]。這種分類方式基本上反映了不同類型啟動(dòng)子各自的功能特點(diǎn)，但在某些情況下，一種類型的啟動(dòng)子往往兼有其它類型啟動(dòng)子的特性。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(induciblepromoter)是指其控制的基因在某些特定的物理、化學(xué)和生物信號(hào)(統(tǒng)稱為"誘導(dǎo)子"或"誘導(dǎo)因子")的刺激下，可以大幅度地增加轉(zhuǎn)錄水平。其特征為，該類型啟動(dòng)子控制的基因在沒(méi)有誘導(dǎo)因子存在的條件下不表達(dá)或者只有非常低的表達(dá)(也稱為"本底表達(dá)")，但一旦受到誘導(dǎo)因子的誘導(dǎo)，基因的表達(dá)量迅速并且大幅度增加。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子常常根據(jù)其誘導(dǎo)信號(hào)來(lái)分類和命名，例如激素誘導(dǎo)啟動(dòng)子[XuD等，1993，PlantMolBiol，22(4):573-588;TaylorJE等，1995,PlantJ,7(1):129-134]、化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子(WilliamsS等，1992，Biol/Technol,10:540—543;綜述見(jiàn)PadidamM，2003，CurrOpinioninPlantBiol,6169-177)、光誘導(dǎo)啟動(dòng)子[SheenJY等，1987，PlantMolBiol,8(3):227-238;MatsuokaM等，1994，PlantJ，6(3):311-319]、熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子[Schoff1F等，1989，MolGenGenet，217(2-3):246-53]、創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子[FarmerEE等，1992,PlantCell,4:129-134;CarreraE等，1998，PlantJ，15(6):765-771]、真菌誘導(dǎo)啟動(dòng)子(FukudaY等，1994，PlantMolBiol,24(3):485-493)和共生細(xì)菌誘導(dǎo)啟動(dòng)子(MiaoGH等，1993，PlantCell,5:781-786)等。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子往往也多少具有器官和/或組織特異性，例如煙草水楊酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子PR-la主要驅(qū)動(dòng)基因在葉片中表達(dá)(UknesS等，1993，PlantCell,5:159-169)。三價(jià)鐵還原酶(FerricReductase,FRO)是雙子葉植物和非禾本科單子葉植物應(yīng)答鐵脅迫的關(guān)鍵酶之一，其主要作用是將根表皮細(xì)胞質(zhì)膜上的Fe、螯合物還原成Fe2+，并通過(guò)二價(jià)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中(Bienfait，1985，JournalofBioenergeticsandBiomembranes,17:73-83)。目前已從玉米(PaoloBandPaoloP,1995，JournalofExperimentalBotany,46:1497-1503)、豌豆(Watersetal.,2002，PlantPhysiol.，129:85-94)、番茄(Lietal"2004，PlantMolecularBiology,54(l):125-36)、擬南芥(Wuetal.,2005，PlantCellPhysiology,46(9):1505-14)、水稻(Ishimaruetal.，2006，PlantJournal,45(3):335-346)、黃瓜(Watersetal"2007,PlantphysiolBiochem.,45(5):293-301)等物種中克隆得到了基因。在擬南芥基因組中，三價(jià)鐵還原酶FRO是一個(gè)多基因家族，由八個(gè)基因編碼。盡管各FRO基因在序列上具有很高的同源性，但由于上游調(diào)控序列的差異使得各成員具有特異的時(shí)空表達(dá)模式(Wuetal"2005，PlantCellPhysiol"46(9):1505-14;Mukherjeeetal"2006，Planta,223(6):1178-90)。在對(duì)FRO同源基因的時(shí)空表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)，在不同植物中其表達(dá)模式有所不同。番茄Zei^(97在根、葉、花、子葉和幼果中均有表達(dá)；但丄eFi(9/在根部隨缺鐵處理時(shí)間的增加表達(dá)加強(qiáng)，而在葉片中穩(wěn)定表達(dá)、不受缺鐵脅迫的誘導(dǎo)(Lietal.,2004，PlantMolecularBiology,54(l):125-36)。豌豆i^F70/基因在根和葉片中均受缺鐵脅迫誘導(dǎo)表達(dá)(Waterseta1.,2004)。擬南芥中j^702和」^T05在根中表達(dá)，AFi05主要在新梢表達(dá)，v4^7(96和^Wi07則主要在綠色組織里表達(dá)(Mukherjeeetal.，2006,Planta,223(6):1178-卯)。這些差異不僅反映了植物各組織器官在鐵的吸收、分配和利用過(guò)程中的分工與合作關(guān)系，也反映了植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中為了適應(yīng)不同的環(huán)境而產(chǎn)生的啟動(dòng)子序列的差異。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種來(lái)源于小金海棠的啟動(dòng)子。本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子，是至少含有自序列表中序列1的5'端第1476—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和3'端延長(zhǎng)，長(zhǎng)度為259至1738bp的脫氧核苷酸片段。所述啟動(dòng)子為至少含有自序列表中序列1的5'端第1454—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和/或3'端延長(zhǎng)，長(zhǎng)度為281至1738bp的脫氧核苷酸片段。所述啟動(dòng)子為至少含有自序列表中序列1的5'端第1348—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和/或3'端延長(zhǎng)，長(zhǎng)度為387至1738bp的脫氧核苷酸片段。所述啟動(dòng)子為至少含有自序列表中序列1的5'端第1293—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和/或3'端延長(zhǎng)，長(zhǎng)度為442至1174bp的脫氧核苷酸片段。所述啟動(dòng)子為至少含有自序列表中序列1的5'端第1094—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和/或3'端延長(zhǎng)，長(zhǎng)度為641至1738bp的脫氧核苷酸片段。所述啟動(dòng)子為至少含有自序列表中序列1的5'端第967—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和/或3'端延長(zhǎng)，長(zhǎng)度為768至1738bp的脫氧核苷酸片段。所述啟動(dòng)子為至少含有自序列表中序列1的5'端第736—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和/或3'端延長(zhǎng)，長(zhǎng)度為999至1738bp的脫氧核苷酸片段。所述啟動(dòng)子，它的核苷酸序列優(yōu)選為下述序列之一1)序列表中序列1的核苷酸序列；2)自序列表中序列1的5'端第1476—1734位核苷酸序列；3)自序列表中序列1的5'端第1454—1734位核苷酸序列；4)自序列表中序列1的5'端第1348—1734位核苷酸序列；5)自序列表中序列1的5'端第1293—1734位核苷酸序列；6)自序列表中序列1的5'端第1094—1734位核苷酸序列；7)自序列表中序列1的5'端第967—1734位核苷酸序列；8)自序列表中序列1的5'端第736—1734位核苷酸序列；9)與1)-8)中任意所述的核苷酸序列具有90%或90%以上同源性并且具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列；7)與具有l(wèi))-8)中任意所述的序列的核苷酸在嚴(yán)格雜交條件下能夠雜交的核苷酸序列。序列表中序列l(wèi)，由1738個(gè)核苷酸組成；自序列表中序列1的5'端第1467—1472位核苷酸為光響應(yīng)元件G-Box，自序列表中序列1的5'端第339—344位核苷酸為生長(zhǎng)素應(yīng)答元件，自序列表中序列1的5'端第270—273、1216—1219和1428一1431位核苷酸為銅元素響應(yīng)元件，自序列表中序列1的5'端第1533—1540位核苷酸為TATA-Box，自序列表中序列1的5'端第1482—1487位核苷酸為CAAT-Box。含有上述啟動(dòng)子的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、工程菌和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的啟動(dòng)子可以利用現(xiàn)有分子生物學(xué)的方法構(gòu)建控制功能基因表達(dá)的表達(dá)載體，如瞬時(shí)表達(dá)載體pFul(圖譜如圖2所示)。本發(fā)明的啟動(dòng)子可以在缺鐵誘導(dǎo)下表達(dá)，通過(guò)構(gòu)建的表達(dá)，載體轉(zhuǎn)入植物中可在植物中控制目的基因，如三價(jià)鐵還原酶基因的表達(dá)，從而提高植物應(yīng)答鐵脅迫的能力等。圖1為啟動(dòng)子全長(zhǎng)的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖2為瞬時(shí)表達(dá)載體pFul的物理圖譜圖3為pFul構(gòu)建示意圖圖4為pFul及Ful的5'端缺失突變啟動(dòng)子表達(dá)載體(pDl-7)的瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果圖5為植物表達(dá)載體pFul-zh的物理圖譜圖6從pFul上游缺失序列的植物表達(dá)載體構(gòu)建示意圖圖7為Ful啟動(dòng)子的在正常供鐵和缺鐵條件下的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果具體實(shí)施例方式實(shí)施例l、小金海棠月W基因啟動(dòng)子的獲得蘋果屬小金海棠是一種鐵高效基因型(Hanetal.，1995,ActaHorticulturaeSinica,22(4):313-317)，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)從小金海棠上克隆到1個(gè)三價(jià)鐵還原酶基因即小金海棠月W基因。該小金海棠月W基因在根及葉片中均受缺鐵脅迫誘導(dǎo)而加強(qiáng)表達(dá)。根據(jù)其序列克隆其上游的啟動(dòng)子序列。具體方法如下一、基因組DNA酶切產(chǎn)物與接頭序列的連接采用CTAB法，以lg小金海棠葉片為材料，提取小金海棠的總DNA，用BamHI酶切基因組DNA(100-200ul體系)，參照TaKaRa公司LAPCRTMinvitroCloningKit回收酶切產(chǎn)物并與相應(yīng)Saw3AI接頭連接16-20h。用lOul蒸餾水溶解連接產(chǎn)物，置-2(TC冰箱保存?zhèn)溆谩６?、染色體步移法擴(kuò)增小金海棠FiW基因啟動(dòng)子(Ful)1、第一次巢式PCR根據(jù)小金海棠/^W基因組序列設(shè)計(jì)第一對(duì)巢式引物SI-1和S2-l。引物Sl-1:5'-AGCAGAGCAACTTCTCCTGCCACATTCG-3';引物S2-1:5，-TGATTAGTGCTCCCCCAATAGACTACG-3'。(1)第一輪擴(kuò)增以步驟一獲得的連接產(chǎn)物為模板，引物SI-1和TaKaRa公司LAPCRTMinvitroCloningKit里的接頭引物CI為引物，進(jìn)行第一輪擴(kuò)增。引物Cl:GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA。擴(kuò)增體系為以步驟一獲得的連接產(chǎn)物8.75ul(lug)，10XLABufferII(Mg2+Plus)1.25ul，M腦L47^0.5ul，dNTPMixture(10mM)0.5ul，引物CI0.25ul(10-15ng),引物S1-10.25ul(10-15ng)，加水至12.5ul。PCR程序?yàn)?4。C熱啟動(dòng)3min;94。C預(yù)變性3min;94。C變性30s，66。C退火2min;72。C延伸4rain，5個(gè)循環(huán)；94。C變性30s，55。C退火2min;72。C延伸4min，30個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。(2)第二輪擴(kuò)增將步驟(1)的PCR產(chǎn)物稀釋100倍，以此作為模板。以S2-1和C2為引物，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。引物C2:CGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA。擴(kuò)增體系為步驟(1)的PCR產(chǎn)物稀釋液，肌，10XLABufferII(Mg2+Plus)2.5叱，7^*araWA《1PL，dNTPMixture(lOmM)1HL，引物C20.5化(25-30ng)，引物S2-10.5叱(25-30ng)，加水至12.5ul。PCR程序?yàn)?94。C預(yù)變性3min;94。C變性30s，69。C退火2min;72。C延伸4min，5個(gè)循環(huán)；94。C變性30s，59。C退火2min;72。C延伸4min，30個(gè)循環(huán)；72。C延伸10min。2、第二次巢式PCR步驟l的產(chǎn)物克隆測(cè)序后，根據(jù)其靠近5'端的序列設(shè)計(jì)第二對(duì)巢式引物Sl-2和S2-2。引物S1-2:5，-AATGCAAAAGTGAACTGGTAATGTGAAGGC-3';引物S2-2:5'-AAACCAAATAGAGGTCATTGGAGATGCCGA-3';以步驟一獲得的連接產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二次巢式PCR。(1)第一輪擴(kuò)增以步驟一獲得的連接產(chǎn)物為模板，引物S1-2和TaKaRa公司LAPCRTMinvitroCloningKit里的接頭引物Cl為引物，進(jìn)行第一輪擴(kuò)增。其中擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序同步驟l的步驟(1)。(2)第二輪擴(kuò)增將步驟(1)的PCR產(chǎn)物稀釋100倍，以此作為模板。以S2-2和C2為引物，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。其中擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序同步驟2的步驟(2)。3、擴(kuò)增啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列步驟2的步驟(2)的產(chǎn)物測(cè)序、比對(duì)、拼接后，通過(guò)染色體步移的方法獲得總長(zhǎng)約3.2kb的小金海棠FiW基因啟動(dòng)子序列。設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物ps4和引物prl，擴(kuò)增啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列，即其中1738bp的片段。引物ps4:5'-TATGTAGCCATCATCATCAGC—3，；引物prl:5，—CTGCTATAGAAAAGAGGTTTGC—3，。反應(yīng)體系為小金海棠總DNA，肌(0.05-0.lug)，10XPyrobestBuffer(Mg2+Plus)2.5叱，7aAaraPyrobest0.6叱，dNTPMixture(10mM)0.5叱，引物ps4(50-60ng)，引物prll叱(50-60ng)，加水至25叱。PCR程序?yàn)?94。C預(yù)變性3min;94。C變性30s，56。C退火30s;72。C延伸3min30s，IO個(gè)循環(huán);94。C變性30s，54。C退火30s;72。C延伸3min30s，20個(gè)循環(huán);72。C延伸7min。然后在上述反應(yīng)液中加入dATPlul，Taq酶O.5ul，72。C延伸30min。上述擴(kuò)增得到1738bp左右的產(chǎn)物，將其進(jìn)行T-A克隆測(cè)序，結(jié)果表明，該片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，即小金海棠尸yW基因的啟動(dòng)子，將其命名為Ful。擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖如圖1所示，泳道1為DL2000Marker,泳道2為D1，泳道3為Ful。將小金海棠尸V^基因的啟動(dòng)子(Ful)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)用McPromoter軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)。擬南芥FRO家族8個(gè)成員(除AtFR06以外)和Ful中潛在的順式元用PLACE軟件和PlantCARE軟件進(jìn)行分析。網(wǎng)址如下McPromoterhttp:〃tools.genome,duke.edu/generegulation/McPromoter厶PLACEhttp://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html;PlantCAREhttp://bioinfonnatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/;通過(guò)McPromoter在線預(yù)測(cè)了小金海棠尸^基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，表明其可能位于自序列表中序列1的5'端第1563位的堿基T。通過(guò)PLACE和PlantCARE預(yù)測(cè)得出自序列表中序列1的5'端第1467—1472位核苷酸為光響應(yīng)元件G-Box,自序列表中序列1的5'端第339—344位核苷酸為生長(zhǎng)素應(yīng)答元件，自序列表中序列1的5'端第270—273、1216—1219和1428—1431位核苷酸為銅元素響應(yīng)元件，自序列表中序列1的5'端第1533—1540位核苷酸為TATA-Box，自序列表中序列1的5'端第1482—1487位核苷酸為CAAT-Box。實(shí)施例2、小金海棠FRO基因啟動(dòng)子(Ful)及其5'端缺失突變獲得的啟動(dòng)子的功能驗(yàn)證根據(jù)實(shí)施例l獲得的Ful啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)引物構(gòu)建5'端缺失突變啟動(dòng)子，并驗(yàn)證它們的啟動(dòng)子功能。1、以Ful啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列或5'端缺失突變啟動(dòng)子啟動(dòng)GFP表達(dá)的重組表達(dá)載體的構(gòu)建1)Ful啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列啟動(dòng)GFP表達(dá)的重組表達(dá)載體的構(gòu)建將實(shí)施例1中的步驟二的步驟3獲得啟動(dòng)子(Ful)pMD19-T載體連接，測(cè)序鑒定，將鑒定表明含有Ful啟動(dòng)子片段的重組載體命名為pT-Ful。用Sphl和BamHI酶切pT-Ful，回收含有Ful啟動(dòng)子片段的酶切片段，連接到經(jīng)Sphl和BamHI消化去除了35s啟動(dòng)子和NFS2片段的pBI221載體片段(原pBI221載體含有35s啟動(dòng)子和一個(gè)NFS2基因片段，并帶有一個(gè)GFP基因位于BamHI位點(diǎn)一側(cè))上，測(cè)序鑒定，將鑒定表明含有Ful啟動(dòng)子片段和其下游連接的GFP基因的重組表達(dá)載體命名為pFul(pFul的構(gòu)建流程圖如圖2所示)，pFul中GFP基因只能在Ful啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)。2)Ful5'端缺失突變啟動(dòng)子啟動(dòng)GFP表達(dá)的重組表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)擴(kuò)增Ful5'端缺失突變啟動(dòng)子的上游引物，分別與引物prl-5'-CTGCTATAGAAAAGAGGTTTGC-3'組成引物對(duì)，分別擴(kuò)增Ful5'端缺失突變啟動(dòng)子。引物序列如下所述Psl:5'-TATGTAGCCATCATCATCAGC-3'(與prl組成擴(kuò)增具有自序列表中序列1的5'端第736—1734位核苷酸序列(即序列8)的片段的引物對(duì)，)；Ps3:5'-CTAGAATGTTAATAGGGTCAACT-3，(與prl組成擴(kuò)增具有自序列表中序列l(wèi)的5'端第967—1734位核苷酸序列(即序列7)的片段的引物對(duì)，)；prol:5'-CATTGGAAGGAACACTGAGA-3'(與prl組成擴(kuò)增具有自序列表中序列1的5'端第1094—1734位核苷酸序列(即序列6)的片段的引物對(duì)，)；pro2:5'-TCACCCGGCCTTCACATTAC-3'(與prl組成擴(kuò)增具有自序列表中序列1的5'端第1293—1734位核苷酸序列(即序列5)的片段的引物對(duì))；pro3:5'-ATAAGGGCGACCTCAAGTC-3'(與prl組成擴(kuò)增具有自序列表中序列1的5'端第1348—1734位核苷酸序列(即序列4)的片段的引物對(duì))；Pro4:5'-AAAAGGCTATTTCCACGACT-3'(與prl組成擴(kuò)增具有自序列表中序列1的5'端第1454—1734位核苷酸序列(即序列3)的片段的引物對(duì))；pro5:5'-ACCTCACAATAGAGCAACCG-3'(與prl組成擴(kuò)增具有自序列表中序列1的5'端第1476—1734位核苷酸序列(即序列2)的片段的引物對(duì))。分別將以上述引物Psl、Ps3、prol、pro3、Pro4或pro5與prl組成的引物對(duì)為引物，以pT-Ful為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增Ful5'端缺失突變啟動(dòng)子，并對(duì)擴(kuò)增的片段與pMD19-T連接，組成重組表達(dá)載體，并進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序鑒定表明含有自序列表中序列8的核苷酸序列的重組表達(dá)載體命名為pT-Dl，將該自序列表中序列8的核苷酸序列所示的啟動(dòng)子命名為Dl;將測(cè)序鑒定表明含有自序列表中序列7的核苷酸序列重組表達(dá)載體命名為pT-D2，將該自序列表中序列7的核苷酸序列所示的啟動(dòng)子命名為D2;將測(cè)序鑒定表明含有自序列表中序列6的核苷酸序列重組表達(dá)載體命名為pT-D3，將該自序列表中序列6的核苷酸序列所示的啟動(dòng)子命名為D3;將測(cè)序鑒定表明含有自序列表中序列5的核苷酸序列重組表達(dá)載體命名為pT-D4，將該自序列表中序列5的核苷酸序列所示的啟動(dòng)子命名為D4;將測(cè)序鑒定表明含有自序列表中序列4的核苷酸序列重組表達(dá)載體命名為pT-D5，將該自序列表中序列4的核苷酸序列所示的啟動(dòng)子命名為D5;將測(cè)序鑒定表明含有自序列表中序列3的核苷酸序列的重組表達(dá)載體命名為pT-D6，將該自序列表中序列3的核苷酸序列所示的啟動(dòng)子命名為D6;將測(cè)序鑒定表明含有自序列表中序列2的核苷酸序列的重組表達(dá)載體命名為pT-D7，將該自序列表中序列2的核苷酸序列所示的啟動(dòng)子命名為D7。將上述測(cè)序表明正確的含有上述引物擴(kuò)增的Ful的5'端缺失突變啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體pT-Dl、pT-D2、pT-D3、pT-D4、pT-D5、pT-D6或pT-D7分別經(jīng)印/zI和5函HI酶切，回收擴(kuò)增的Ful5'端缺失突變啟動(dòng)子片段(Dl、D2、D3、D4、D5、D6或D7)，分別與Sp/zl和BamHI消化后去除了35s啟動(dòng)子和NFS2片段的pBI221載體片段連接，篩選得到重組表達(dá)載體，將重組表達(dá)載體分別進(jìn)行測(cè)序鑒定。將測(cè)序鑒定表明含有D1和連接于其下游的GFP基因的重組表達(dá)載體命名為pDl(pDl中GFP基因只能在D1的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)，如圖3中pDl所示)；將測(cè)序鑒定表明含有D2和連接于其下游的GFP基因的重組表達(dá)載體命名為pD2(pD2中GFP基因只能在D2的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)，如圖3中pD2所示)；將測(cè)序鑒定表明含有D3和連接于其下游的GFP基因的重組表達(dá)載體命名為pD3(pD3中GFP基因只能在D3的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)，如圖3中pD3所示)；將測(cè)序鑒定表明含有D4和連接于其下游的GFP基因的重組表達(dá)載體命名為pD4(pD4中GFP基因只能在D4的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)，如圖3中pD4所示)；將測(cè)序鑒定表明含有D5和連接于其下游的GFP基因的重組表達(dá)載體命名為pD5(pD5中GFP基因只能在D5的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)，如圖3中pD5所示)；將測(cè)序鑒定表明含有D6和連接于其下游的GFP基因的重組表達(dá)載體命名為pD6(pD6中GFP基因只能在D6的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)，如圖3中pD6所示)；將測(cè)序鑒定表明含有D7和連接于其下游的GFP基因的重組表達(dá)載體命名為pD7(pD7中GFP基因只能在D7的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)，如圖3中pD7所示)。pBI221載體用J力aI和^MH消化后，回收大片段，用Klenow(DNA聚合酶I大片段，補(bǔ)平DNA片段)37度處理半小時(shí)，然后用T4連接酶連接。轉(zhuǎn)化即可得到去除了NFS2片段的對(duì)照質(zhì)粒，將其命名為pD0，pD0中GFP基因的上游去除了NFS2片段并且沒(méi)有插入Ful或者它的5'端缺失突變啟動(dòng)子。2、Ful啟動(dòng)子及它的5'端缺失突變啟動(dòng)子控制GFP基因在擬南芥原生質(zhì)體里的瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證1)擬南芥原生質(zhì)體的提取和轉(zhuǎn)化①取4周后抽苔前的擬南芥Co1-0葉片，切成lmm寬的長(zhǎng)條，置于甘露醇溶液(稱1.82克D—甘露醇于20ml雙蒸水)中，共切葉片約90片。葉片切條撈出，置于酶解液(含有質(zhì)量百分濃度為15。/。的cellulaseRIO，質(zhì)量百分含量為0.30%的MacerozymeRIO，1.09g/L甘露醇(Mannitol)，0.3MKC1，0.3MMES，0.15MCaCl"0.75mM(3-巰基乙醇(p-merc即toethanol)的溶液)中，避光，23°C，40-50rpm搖床上酶解3小時(shí)。②將步驟①獲得的擬南芥葉片酶解液用100-200目孔徑的過(guò)濾器過(guò)濾，收集濾液，置于15ml離心管(直徑約lcm)中，均分為兩管。于4。C，60g，離心15min收集沉淀，即為擬南芥葉片原生質(zhì)體。③原生質(zhì)體用冰冷的W5溶液(含有154mMNaCl，125mMCaCl2，5mMKC1，5mMglucose,質(zhì)量百分含量為0.03%的MES，pH為5.8的溶液)輕柔洗滌，每管4ml，然后在4。C，100g離心lmin。棄上清液，沉淀用冰冷的W5溶液輕柔懸浮，每管4ral，冰上放置30min。然后，于23。C，100g離心lmin，離心強(qiáng)度(brake)設(shè)為4-5，棄上清液，每管沉淀用0.5mlMaMg溶液(取lMMgCl2l.5ml，MES0.1g，甘露醇(mannitol)7.3g溶于水中，用KOH調(diào)pH二5.6，用水定容至100ml，高壓滅菌)重懸得到原生質(zhì)體溶液。④分別取約10-20ugpBI221、pDO(對(duì)照)、pFul、pDl、pD2、pD3、pD4、pD5、pD6或pD7質(zhì)粒于1.5mlEP管中，分別加100ul步驟③中的原生質(zhì)體溶液。用剪去前端的200ul槍頭輕柔混勻。加入110ulPEG/Ca溶液，輕柔混勻，放置20-30min。⑤加入0.44mlW5溶液，來(lái)回顛倒混勻。23°C，lOOg，lmin，brake設(shè)為4-5。棄上清，加100ulW5溶液，混勻。再加入900ulW5溶液，混勻。⑥上述混合液體置于六孔板內(nèi)，23°C，弱光，孵育6-18小時(shí)。2)共聚焦顯微鏡觀察和圖像處理將步驟l)得到的轉(zhuǎn)pDO(對(duì)照)、pFul、pDl、pD2、pD3、pD4、pD5、pD6或pD7質(zhì)粒的擬南芥原生質(zhì)體在ZeissLSM510META型共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察。用488nmargon-ion激光激發(fā)，545nm分光境過(guò)濾，505-530nm檢測(cè)GFP綠色熒光信號(hào)，560nm以上檢測(cè)葉綠素自發(fā)熒光信號(hào)。圖像先經(jīng)LSM5ImageBrowser(Zeiss)處理，后用AdobePhotoshope8.0軟件系統(tǒng)處理。上述實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示，對(duì)照pDO轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體(圖4中pD0)中的GFP熒光充滿整個(gè)細(xì)胞質(zhì)。pBI221中的擬南芥y^。基因是一個(gè)位于葉綠體基質(zhì)的半胱氨酸脫硫酶(L6on等，2002，BiochemicalJournal,366:557-564)，因此對(duì)照pBI221中GFP的熒光僅充滿整個(gè)葉綠體(圖4中pBI221)。除轉(zhuǎn)pD3原生質(zhì)體(圖4中pD3)未出現(xiàn)發(fā)出綠色熒光現(xiàn)象外，所有的缺失體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體(轉(zhuǎn)pDl、pD2、pD3、pD4、pD5、pD6或pD7質(zhì)粒的原生質(zhì)體)GFP均發(fā)生細(xì)胞質(zhì)發(fā)光現(xiàn)象(圖4中pDl、pD2、pD4、pD5、pD6、pD7)，轉(zhuǎn)pFul原生質(zhì)體在細(xì)胞膜出現(xiàn)熒光現(xiàn)象(圖4中pFul)，因此推測(cè)自序列表中序列1的5'端第967一1093位之間含有潛在的負(fù)調(diào)控元件。同時(shí)，pD7具備轉(zhuǎn)錄活性，說(shuō)明自序列表中序列1的5'端第1476—1734位的區(qū)域?yàn)榫邆鋯?dòng)子功能的基本元件，與預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。圖4中pFul、pDO、pDl、pD2、pD3、pD4、pD5、pD6、pD7和pBI221中自上而下的四個(gè)原生質(zhì)體圖分別為轉(zhuǎn)pFul原生質(zhì)體、轉(zhuǎn)pDO原生質(zhì)體、轉(zhuǎn)pDl原生質(zhì)體、轉(zhuǎn)pD2原生質(zhì)體、轉(zhuǎn)pD3原生質(zhì)體、轉(zhuǎn)pD4原生質(zhì)體、轉(zhuǎn)pD5原生質(zhì)體、轉(zhuǎn)pD6原生質(zhì)體、轉(zhuǎn)pD7原生質(zhì)體和轉(zhuǎn)pBI221原生質(zhì)體的488nmargon-ion激光激發(fā)照片，545mn分光境過(guò)濾照片，505-530ran檢測(cè)GFP綠色熒光信號(hào)照片以及560nm以上檢測(cè)葉綠素自發(fā)熒光信號(hào)的照片。實(shí)施例2、小金海棠FRO基因啟動(dòng)子(Ful)及其5'端缺失突變獲得的啟動(dòng)子的在轉(zhuǎn)基因植物中啟動(dòng)GUS基因的組織特異性檢測(cè)1、含有小金海棠FRO基因啟動(dòng)子(Ful)及其5'端缺失突變獲得的啟動(dòng)子與位于其控制之下的下游GUS基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建將實(shí)施例l的步驟l獲得的重組表達(dá)載體pT-Ful、pT-D3、pT-D4、pT-D5、pT-D6、pT-D7分別用HindIII和BaraHI消化，回收含有小金海棠FRO基因啟動(dòng)子(Ful)或其5'端缺失突變獲得的啟動(dòng)子的序列(D3、D4、D5、D6或D7)，插入到pZHOl載體(載體圖譜如圖5所示，其BamHI酶切位點(diǎn)下游有一個(gè)GUS基因；Hua-LinZhou，Si-J"ieHe，Yang-RongCao，TaoChen,Bao-XingDu，Cheng-CaiChu,Jin-SongZhangandShou-YiChen.OsGUJl，aputativemembrane-boundendo-1，4-P-D-glucanasefromrice，affectsplantinternodeelongation.PlantMolecularBiology(2006)60:137-151;中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué))的A'/7dlII和ia/fiHI酶切位點(diǎn)之間，進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定。將測(cè)序鑒定表明含有自序列表中序列1的核苷酸序列和連接與其下游的GUS基因的重組表達(dá)載體命名為pZFul(pZFul中GUS基因只能在具有自序列表中序列1的核苷酸序列的啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)，如圖6中pZFul所示)；將測(cè)序鑒定表明含有D3和連接于其下游的GUS基因的重組表達(dá)載體命名為pZD3(pZD3中GUS基因只能在D3的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)，如圖6中pZD3所示)；將測(cè)序鑒定表明含有D4和連接于其下游的GUS基因的重組表達(dá)載體命名為pZD4(pZD4中GUS基因只能在D4的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)，如圖6中pZD4所示)；將測(cè)序鑒定表明含有D5和連接于其下游的GUS基因的重組表達(dá)載體命名為pZD5(pZD5中GUS基因只能在D5的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)，如圖6中pZD5所示)；將測(cè)序鑒定表明含有D6和連接于其下游的GUS基因的重組表達(dá)載體命名為pZD6(pZD6中GUS基因只能在D6的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)，如圖6中pZD6所示)；將測(cè)序鑒定表明含有D7和連接于其下游的GUS基因的重組表達(dá)載體命名為pZD7(pZD7中GUS基因只能在D7的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)，如圖6中pZD7所示)。2農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆鑒定按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)所述的方法制備農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞。采用凍融法用步驟1制備的質(zhì)粒pZFul、pZD3、pZD4、pZD5、pZD6或pZD7轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3皿。轉(zhuǎn)化子在含有利福平(50mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的YEB固體培養(yǎng)基上篩選。挑取平板上的單克隆，接種于YEB液體培養(yǎng)基中，28。C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定，將PCR鑒定含有pZFul、pZD3、pZD4、pZD5、pZD6和pZD7的根癌農(nóng)桿菌GV3101分別命名為GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7。3農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥1)種植野生型擬南芥Co1-0，到植株長(zhǎng)至莖高3cm時(shí)，去除其頂生花序，以刺激葉生花序的生長(zhǎng)。去除其頂生花序5-7d后可用于轉(zhuǎn)化，此時(shí)葉生花序已長(zhǎng)出，其下部的花已經(jīng)有授粉的出現(xiàn)。轉(zhuǎn)化前一天要澆透水，剪掉角果和已開(kāi)的花。2)準(zhǔn)備GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7菌液。將GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7分別接種于5mlYEB(含lmg/L卡那霉素和lmg/L利福平)液體培養(yǎng)基中，28'C培養(yǎng)24-36h，以1:50的比例轉(zhuǎn)接到200mlYEB培養(yǎng)基，搖至OD,為1.2-1.6。然后于6000rpm，15min集菌，沉淀用適量滲透培養(yǎng)基(含有質(zhì)量百分含量為5%的蔗糖和質(zhì)量百分含量為0.02%的SilwetL-77)充分懸浮至OD,為0.6-0.8。3)將步驟2)獲得的GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7懸浮液分別倒在一個(gè)小燒杯中，分別將取擬南芥植株，將擬南芥植株的花浸入懸浮液中3-5min，保證蓮座葉以上部分浸沒(méi)于液體中，浸泡5rain，可見(jiàn)植株上有一層薄膜。將植株橫放避光浸泡16-24h。取出植株，將其放正，綁住松散花芽。培育至結(jié)實(shí)，收獲成熟種子(T。代)，即得到轉(zhuǎn)GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7的T。代擬南芥植株。4.轉(zhuǎn)基因純合體的篩選(1)將轉(zhuǎn)GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7的T。代擬南芥植株收獲后的種子分別播種于含50Pg/ml卡那霉素的1/2Ms培養(yǎng)基上。4°。春化2-3天，22'C培養(yǎng)。將抗性植株移至土中生長(zhǎng)，成熟后分單株收獲種子(T,代)即得到轉(zhuǎn)GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7的1\代擬南芥植株。(2)收取的轉(zhuǎn)GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7的T。代擬南芥植株種子分單株同樣在含卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，看分離比，挑取接近3:1的轉(zhuǎn)基因株系分單株收獲種子(T2代)。在T2代觀察轉(zhuǎn)基因植株的分離情況，挑取接近3:1的轉(zhuǎn)基因株系繼續(xù)種到T3代。分單株將T3種子播種于含卡那霉素選擇培養(yǎng)基上，從T3代的分離情況來(lái)推測(cè)T2代哪些單株為純合體植株。即得到單拷貝插入的轉(zhuǎn)GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7的擬南芥純合體株系。將這些純和株系用正向引物pro5和反向引物pr1進(jìn)行PCR鑒定。篩選得到PCR鑒定陽(yáng)性的轉(zhuǎn)GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7的擬南芥純合體株系。5、小金海棠i^O基因啟動(dòng)子的組織檢測(cè)1)GUS組織化學(xué)染色檢測(cè)按照上述方法將pZHOl轉(zhuǎn)入擬南芥Col-0野生植株獲得PCR鑒定陽(yáng)性的轉(zhuǎn)pZHOl擬南芥。將PCR鑒定陽(yáng)性的轉(zhuǎn)GV-pZFul擬南芥純合體株系、轉(zhuǎn)pZHOl擬南芥以及擬南芥Col-0野生植株的種子分別置于MS培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)一周。然后將培養(yǎng)后各取一部分植株按照下述方法進(jìn)行GUS染色檢測(cè)GUS活性，另一部分植株轉(zhuǎn)移到缺鐵的培養(yǎng)基(不含有鐵素的MS培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基配制時(shí)不加鐵成分))上繼續(xù)生長(zhǎng)，3天后再次檢測(cè)GUS活性。上述檢測(cè)GUS活性的方法為將植株放入1.5ml離心管中，加入GUS緩沖特異性液(含有50mol/L的磷酸氫鈉緩沖液(pH7.0)，10mmol/LEDTA，0.1%TritonX-100，2mmol/L鐵氰化鉀，2mmo1/L亞鐵氰化鉀的溶液)浸沒(méi)，再加入5%(體積百分比)的GUS染色液，混勻后于37'C溫育過(guò)夜，用70%的乙醇脫色后在體視鏡下觀察照相。結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明，在正常供鐵的培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基)中生長(zhǎng)一周(圖7A)及繼續(xù)生長(zhǎng)3天后(圖7D)的轉(zhuǎn)GV-pZFul擬南芥植株，GUS染色均不顯藍(lán)色，GUS報(bào)告基因不表達(dá)，此結(jié)果與擬南芥Col-0野生植株以及轉(zhuǎn)pZHOl擬南芥GUS染色的結(jié)果相同。將轉(zhuǎn)GV-pZFul擬南芥同一株系的其他植株轉(zhuǎn)移到缺鐵的MS培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)3天后再次檢測(cè)GUS活性的結(jié)果表明，■GUS基因能在根部和地上部表達(dá)(GUS染色顯藍(lán)色)，而轉(zhuǎn)pZHOl擬南芥和擬南芥Col-0野生植株在缺鐵培養(yǎng)基上生長(zhǎng)后沒(méi)有GUS活性(GUS染色不顯藍(lán)色)。這一結(jié)果表明該Ful啟動(dòng)子在缺鐵條件的誘導(dǎo)下，啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)。圖7中A為MS培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)一周的轉(zhuǎn)GV-pZFul擬南芥，B為MS培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)一周的轉(zhuǎn)pZH01擬南芥，C為MS培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)一周的擬南芥Col-0野生植株，D為MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一周后繼續(xù)生長(zhǎng)3天的轉(zhuǎn)GV-pZFul擬南芥，E為MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一周后轉(zhuǎn)移至缺鐵MS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)3天的轉(zhuǎn)GV-pZFul擬南。序列表〈160〉8〈210〉1〈211>1738〈212>DNA〈213〉蘋果屬小金海棠(Afa/t^x/aq/!'朋m/s)〈400>1tatgtagccatcatcatcagccatggcacttgatcatttgctgaaa^caatgaggtatat60aatattcatatatttgcatgcaccttcttaattacttactgaaaatcggt120acaccaaatgtcataataataca已gtggttgaat已cttaaaagaaattcaaccttgtatt180atgacatttggtatagcggactgttttgcgcactgaaaatttctccgctcacacatcaca240taatccctctaaactgtaatgtt3tttatgtactatttttggccggagtggccggacgag300ctttcattgtatcaagttgtctttcggtttgaagaaccgtcgttaatcacatgagctctt360agtt肌gttaaaagctatggtaattaactggaatgtttta420ctattgcttactgagtgaagttatgcattagagaattcaataatctatcgcatgtggtccaMaacct已gttegtagatatagggtgttggatttatatccatccgttcctggttcgaaei540ctcttctttcttaa^ttattctaatagttttgaaccctctcctccccttaatgttataaa600tgagatatgaa^tgggcatg660tgcctcctaatcaatgtagttcctagttttacattttgttacggattcacaacctccctc720attttceigtELcccttgttccacaccaatgtgacgttattta^ccgtataa780acttcacaatcag3a^tcgttttttttttatcatcatctaaa&atcat11tttaaagtgc840atattcatttgatgtg8.ctatttagtcattcatatgtgtcga^csa^tcaataattc■tgataacgagtaactacctcatgatgatccatttatgaattctcttgattaagagt33tt960taagatctagaatgttaMaattcagaagtaaagagattaaatacttgga1020tcataaaaga^caaacatatatgtatgcaaatg^ttgggg^tgggC犯3catgtetttta1080tgcc犯ag3CctgcattggaaggaacactgeigertceLgtattcggcatctc1140caatgacctctatttggttttcactccacctcacccggccttcacattaccagttcactt1200ttgcattcacaatttgtacatcgaaattattcatttatctttatgatttg1260gcttcatatttataatatttataacgtcgtgttttcatta1320gaacgtatctttata^tata^gggcgacctcaagtcaaaaagactctct1380actttgcgcgagtcggggga鄧ggg犯gggggggggg組gtttattgtacacagcttta1440ttcttactttgcasaaaggctatttccacgactcgaacctcaca^tagagcaaccgttcc1500gttacgcc3agactcgaacccatgaatctttatatataaatagcaaatattgtctttttt1560tttctattcaatttacacgtgaattcactgaagatttgacta^gtttatgtttttcattg1620gacaaaMttgta^tsttttcatttcccaaaatcagataaaagttcgtg168017<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>gggggggggga^cgactcg38ctgaagatttcca犯aagttaatgtttattgtacacagctttattcttaccctcacaatagagcaaccgttccgttacgcaaatagcaaatattgtctttttttttctatgactaagtttatgtttttcattggacaaaa3^aa^tca^ga^a^agttcgtgct3aaa^tttgcaaaaacaagactcgatcaMttaca"tttgtaasta^attgcaagctggctatttcccgtgaattcattttcatttc120180240300360<210>5〈211〉442〈212〉腿〈213〉蘋果屬小金海棠(Ma/w;a'"q/7we"^)〈400〉5aa^tgsaataacgtcgtgttttcattaaa3tt犯ga^gaacgtatctttata^tatataa60gggcgacctc犯gtcaaaaagactctctactttgcgcgagtcgggggaaggggaaggggg120ggggg犯tgttt3ttgt:acacagctttattcttactttgca^a^aggctatttccacgac180tcgaacctcacaatagagcaaccgttccgttacgccaagactcgaacccatgaatcttta240tatataaatagcaaatattgtctttttttttctattcaatttacacgtgaattcactgaa300gatttgactaagtttatgtttttcattggacaaaatttgtaaatattttxatttcccaaa360aagttaaaaaatcagataaaagttcgtgctaaaaaMtgcaagctatataaagatatcaa420gcaaacctcttttctatagcag442〈210〉6〈211〉641〈212〉DNA〈213〉蘋果屬小金海棠(M"/w)〈400〉6ttgacaactgcattggaaggaacactgagatcagtattcggcatctccaatgacctctat60ttggttttcactccacctcacccggccttcacattaccagttcacttttgcattcacaat120ttgtaca犯tgctatattcgaaattatteatttatctttatgatttgtagaataaaggct180tcatatttataatatttgtaacgtcgtgtt11cattaaaatta^g￡Ltg^240cgtatctttatata/tataagggcgacctcaagtcaaaaagactctctactttgcgcgagt300cgggggaagggg犯gggggggggg滅gUtattgtacacagctttattcttactttgea360a^aa^ggcta^tttccacgactcgaacctcacaata^gc33ccgttccgttacgccaagaic420tcgaacccatgaatctttatctttttttttctattcaatt480ta^cELCgtgaattcactgaag3tttgact^gtttatgtttttcattggaca^aatttgtd540^tattttcdtttcccaa^agttcgtgcta3aa犯ttgca600agctatataacaaacctct1:ttctatagcag641〈210>7〈211〉768〈212>薩<213〉蘋果屬小金海棠(她/iw'固"'s)<■>7ctagaatgttaatagggtcetactaattcag3agtaaagagatta犯tacttggatcataa60aagacaaacatatatgtatgcaaatgaa^ttgggg犯tgggca犯catgtatttatgccaa120叫3C^gttgacaactgcattgg卿g認(rèn)actgagatcagtattcggcatctccaatga180cctctatttggttttcactcCElCCtcaCCCggccttcacattaccagttcactt"ttgcat240tcacaatttgta^ca^tgctatattcga^ttattcatttatctttatgatttgtagaat300肌aggcttcateitttataatatttgtaaaatga^ataaLcgtcgtgttttcatt￡iaaatta360agatgaacgtatctttatatat3t犯gggcgacctcaagtcaaaaagactctctactttg420cgcgagtcggggg卿ggg3aggggggggggaatgttt￡Lttgtacacagctttattctta480ctttgcaa犯aggctatttcC3Cg3CtCg3acctcacaatagagcaaccgttccgttacg540ccaagactcga^cccatga3tctttatatataaatagc33atattgtctttttttttcta600ttcaatttacacgtgaattcactg犯g已tttgacteiagtttatgtttttcattggaca肪660atttgtaaatattttcatttcccaaaaagttaaaaaatcagataaaagttcgtgcta肌a720aattgcaagctatataaagatatcaagcaaacctcttttctatagcag768<210〉8〈211〉999〈212〉醒〈213〉蘋果屬小金海棠(ikfo/wsx/ao力力era^)<400〉8g^tgcccttgttcc已caccaatgtgacgttatttaaccgtataaacttcscaatC3gaa60atcgttttttttttatcatcatc"taaaaatcattttttaaagtgcatattcatttgatgt120gaagactatttagtcattca"tatgtgtcgaacaaatcaat犯ttctgataacgagtaact180acctcatgatgatccatttatgaattctcttgattaagagtctagaatgt240taatagggtcaact犯ttcagaagtaaagattggatcata300atatatgtatgceiaatg肌ttgggg船tgggcaaacatgtatttatgccaa3g3caagtt360gacaactgcattggaaggaacactgagatcagtattcggcatctccaatgacctctattt420ggttttcactccacctcacccggccttcacattaccagttcacttttgcattcacaattt480tatattcgaaattattcattta"tctttatgatttgtaga已taaaggcttc540atatttataatatttgtaaaatga^taacgtcgtgttttcattaaaattaagatgaacg600tatctttatatatataagggcgacctcaagtcaaaaagactctctactttgcgcgagtcg660ggggaaggggaaggggggggggaatgtttattgtacacagctttattcttactttgcaaa720aaggctatttccacgactcgaacctcacaatagagcaaccgttccgttacgccaagactc780gaacccatgaatctttatatataaatagcaaatattgtctttttttttctattcaattta840cacgtgaMtcactg犯gatttgactaagtttatgtttttcattggacaaaatttgtaaa900tattttcatttcccaaaaagttaaaaaatcagataaaagttcgtgctaaaaaattgcaag960ctatataaagatatcaagcaaacctcttttctatagcag999權(quán)利要求1、一種植物啟動(dòng)子，是至少含有自序列表中序列1的5′端第1476-1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5′端和3′端延長(zhǎng)，長(zhǎng)度為259至1738bp的脫氧核苷酸片段。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的啟動(dòng)子，其特征在于所述啟動(dòng)子為至少含有自序列表中序列1的5'端第1454—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和/或3'端延長(zhǎng)，長(zhǎng)度為281至1738bp的脫氧核苷酸片段。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的啟動(dòng)子，其特征在于所述啟動(dòng)子為至少含有自序列表中序列1的5'端第1348—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和/或3'端延長(zhǎng)，長(zhǎng)度為387至1738bp的脫氧核苷酸片段。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的啟動(dòng)子，其特征在于所述啟動(dòng)子為至少含有自序列表中序列1的5'端第1293—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和/或3'端延長(zhǎng)，長(zhǎng)度為442至1174bp的脫氧核苷酸片段。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的啟動(dòng)子，其特征在于所述啟動(dòng)子為至少含有自序列表中序列1的5'端第1094—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和/或3'端延長(zhǎng)，長(zhǎng)度為641至1738bp的脫氧核苷酸片段。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的啟動(dòng)子，其特征在于所述啟動(dòng)子為至少含有自序列表中序列1的5'端第967—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和/或3'端延長(zhǎng)，長(zhǎng)度為768至1738bp的脫氧核苷酸片段。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的啟動(dòng)子，其特征在于所述啟動(dòng)子為至少含有自序列表中序列1的5'端第736—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和/或3'端延長(zhǎng)，長(zhǎng)度為999至1738bp的脫氧核苷酸片段。8、根據(jù)權(quán)利要求l-7任意一項(xiàng)所述的啟動(dòng)子，其特征在于所述啟動(dòng)子，它的核苷酸序列為下述序列之一1)序列表中序列1的核苷酸序列；2)自序列表中序列1的5'端第1476—1734位核苷酸序列；3)自序列表中序列1的5'端第1454—1734位核苷酸序列；4)自序列表中序列1的5'端第1348—1734位核苷酸序列；5)自序列表中序列1的5'端第1293—1734位核苷酸序列；6)自序列表中序列1的5'端第1094—1734位核苷酸序列；7)自序列表中序列1的5'端第967—1734位核苷酸序列；8)自序列表中序列1的5'端第736—1734位核苷酸序列；9)與1)-8)中任意所述的核苷酸序列具有90%或90%以上同源性并且具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列；7)與具有l(wèi))-8)中任意所述的序列的核苷酸在嚴(yán)格雜交條件下能夠雜交的核苷酸序列。9、含有權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述啟動(dòng)子的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、工程菌、或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種來(lái)源于小金海棠的啟動(dòng)子及其應(yīng)用。該啟動(dòng)子，是至少含有自序列表中序列1的5′端第1476-1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5′端和3′端延長(zhǎng)，長(zhǎng)度為259至1738bp的脫氧核苷酸片段。本發(fā)明的啟動(dòng)子可以利用現(xiàn)有分子生物學(xué)的方法構(gòu)建控制功能基因表達(dá)的表達(dá)載體，通過(guò)構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物中可在植物中控制特定功能基因表達(dá)，從而達(dá)到控制植物性能，如提高植物產(chǎn)量等的目的。文檔編號(hào)C12N1/19GK101302522SQ20081011630公開(kāi)日2008年11月12日申請(qǐng)日期2008年7月8日優(yōu)先權(quán)日2008年7月8日發(fā)明者瑾孔,張新忠,靜文,李天忠,憶王,許雪峰,韓振海申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)