專(zhuān)利名稱：：磷脂酶和其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及水解磷脂的方法，生產(chǎn)磷脂酶的方法，制作干酪(cheese)的方法，和磷脂酶。
背景技術(shù)：
：Soragni,E.等(2001)EMBOJ.20:5079-5090公開(kāi)了來(lái)自Tuberborchii的磷脂酶(TbSPl)和編碼它的基因的cDNA核苷酸序列。下面的肽序列發(fā)表在所示的資源中，來(lái)源于所示的生物體COGEME植物致病(Phytopathogenic)真菌和OomyceteEST數(shù)據(jù)庫(kù)，UnisequenceID:VD0100C34，大麗花輪支孢(Verticilliumdahliae)。NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，gi:18307435，粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，gi:16519372，Helicosporumsp.HN1WO0056762,序列號(hào)5954，米曲霉(Aspergillusoryzae)TREMBL蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，EAA28927，粗糙脈孢菌美國(guó)6399121公開(kāi)了磷脂酶在干酪制造中的應(yīng)用。發(fā)明概述發(fā)明者們分析了真菌組XIII磷脂酶A2的已知的序列資料，并且從發(fā)表的序列資料或者通過(guò)篩選自然資源中相關(guān)序列，他們鑒定了額外的序列。通過(guò)在合適的宿主體內(nèi)表達(dá)編碼真菌組XIII磷脂酶A2，他們發(fā)現(xiàn)表達(dá)的序列包括在N-末端或C-末端或兩側(cè)偶聯(lián)了肽序列的核心肽，并且在合適的宿主體內(nèi)表達(dá)基因可以導(dǎo)致表達(dá)的肽斷裂以獲得核心肽，此核心肽在N-末端或C-末端沒(méi)有任何肽延長(zhǎng)。他們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)沒(méi)有任何肽延長(zhǎng)的核心肽比連接有肽延長(zhǎng)者具有明顯更高的磷脂酶活性。最后，他們發(fā)現(xiàn)用此方法發(fā)現(xiàn)的核心肽在長(zhǎng)度和序列上與//e/z'co^oWwm(Wakatsuki,S.etal.(2001)Biochim.Biophys.Acta1522:74-81)的未知功能的已知成熟肽相似，也和缺乏肽延長(zhǎng)(extension)而不是分泌信號(hào)的細(xì)菌組XIII磷脂酶A2相似(Sugiyama，M.etal.(2002)J.Biol.Chem.277:20051-20058)。發(fā)明者們也發(fā)現(xiàn)與真菌組XIII磷脂酶A2有活性位點(diǎn)序列相似性和其半胱氨酸殘基保守性的磷脂酶在干酪制造中是有用的。此外，發(fā)明者從鑲片鐮孢A3/5中發(fā)現(xiàn)并分離了編碼新磷脂酶的基因，鐮孑包屬菌種A3/5最4刀寸呆藏為禾本牙+鐮孑包(F"S(3"w附gn3m/"earwm)ATCC20334，最近被重新分類(lèi)為鐮孢霉菌，被Yoder和Christianson,1998,FungalGeneticsandBiology23:62-80;和O，Do鬆ll等，1998,FungalGeneticsandBiology23:57-67。磷脂酶屬于真菌/細(xì)菌組XIIIPLA2,其由Soragni等定義Soragnietal.，TheEMBOJournal,20(2001),5079-5090。發(fā)明者也將新的磷脂酶編碼基因克隆到大腸桿菌株，并用克隆的基因制備在米曲霉中表達(dá)鐮孢屬(Fusarium)磷脂酶基因的構(gòu)建體。發(fā)明者將米曲霉用此構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，并從曲霉屬(Aspergillus)細(xì)胞中分離磷脂酶。因此，發(fā)明提供生產(chǎn)磷脂酶的方法，其包括加工(processing)表達(dá)的真菌肽以從C-末端和/或從N-末端裂解掉肽以獲得核心肽(cornpeptide),其中核心肽包才舌a)下列給出的氨基酸序列SEQIDNO:l的氨基酸146-153,SEQIDNO:3的氨基酸87-94，或SEQIDNO:12的氨基酸79-86;或除了用另一個(gè)氨基酸取代單個(gè)氨基酸外與任何這些氨基酸序列等同的序歹寸；禾pb)位于a)給出的序列的N-末端一側(cè)的至少兩個(gè)半胱氨酸殘基；和c)位于a)給出的序列的C-末端一側(cè)的至少兩個(gè)半胱氨酸殘基。發(fā)明也提供用本發(fā)明的磷脂酶水解磷脂的方法。而且發(fā)明提供通過(guò)將干酪用乳(cheesemilk)或干酪用乳的成分(fraction)與磷脂酶接觸并從干酪用乳(cheesemilk)生產(chǎn)干酪的方法。最后，發(fā)明提供磷脂酶，其是與某些特定序列具有至少80%氨基酸序列同一性的多肽。具體地，本發(fā)明涉及如下方面(1)生產(chǎn)磷脂酶的方法，其包括加工被表達(dá)的真菌肽以從C-末端裂解肽和/或從N-末端裂解肽以獲得有磷脂酶活性的核心肽，其中核心肽包括a)下列給出的氨基酸序列SEQIDNO:l的氨基酸146-153，SEQIDNO:3的氨基酸87-94,或SEQIDNO:12的氨基酸79-86;或除了用另一個(gè)氨基酸取代單個(gè)氨基酸外與這些氨基酸序列任何一個(gè)相同的序列；和b)位于a)給出的序列的N-末端側(cè)的至少兩個(gè)半胱氨酸殘基；和c)位于a)給出的序列的C-末端側(cè)的至少兩個(gè)半胱氨酸殘基。(2)(l)的方法，其中被表達(dá)的肽在用編碼被表達(dá)肽的DNA轉(zhuǎn)化的絲狀真菌宿主細(xì)胞中表達(dá)。(3)(2)的方法，其中宿主細(xì)胞是曲霉屬，鐮孢屬或木霉屬，特別是米曲霉，黑曲霉，鑲片鐮孢或里氏木霉。(4)(2)的方法，其中表達(dá)的肽被宿主細(xì)胞在體內(nèi)加工。(5)(1)-(4)的方法，其中核心肽長(zhǎng)度為100-150個(gè)氨基酸。(6)(1)-(5)的方法，其中磷脂酶具有特定的磷脂酶活性，其是表達(dá)的肽加工前活性的至少2倍。(7)(1H6)的方法，其中被表達(dá)的肽源自塊菌屬(Tuber)，輪枝孢屬，脈孑包菌屬，曲霉屬,或Helicosporum,4爭(zhēng)另ll是T.borchii，T.albidum，大麗花輪支孑包,V.tenerum，粗糙脈孢菌，米曲霉或HelicosporiumspHN1。(8)(1)-(7)的方法，其中當(dāng)完全表達(dá)的肽序列與SEQIDNO:l,SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10，和SEQIDNO:12給出的序列同時(shí)比對(duì)時(shí)，被表達(dá)的肽在與SEQIDNO:1氨基酸97-101比對(duì)的序列的N-末端側(cè)0-18氨基酸內(nèi)裂解。(9)(1)-(8)的方法，其中當(dāng)完全表達(dá)的肽序列與SEQIDNO:l，SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10，和SEQIDNO:12給出的序列同時(shí)比對(duì)時(shí)，被表達(dá)的肽在與SEQIDNO:1氨基酸204-209比對(duì)的序列的C-末端側(cè)0-11氨基酸內(nèi)裂解。(10)(1)-(9)的方法，其中被表達(dá)的肽的裂解在Kex2加工位點(diǎn)的10個(gè)氨基酸內(nèi)或FG序列的11個(gè)氨基酸內(nèi)或兩者。(11)水解磷脂的方法，其包括將磷脂與(1)-(10)的方法生產(chǎn)的磷脂酶接觸。(12)生產(chǎn)干酪的方法，其包括將干酪用乳或干酪用乳的成分與磷脂酶接觸，其中磷脂酶包括a)下列給出的氨基酸序列SEQIDNO:l的氨基酸146-153，SEQIDNO:3的氨基酸87-94，或SEQIDNO:12的氨基酸79-86;或除了用另一個(gè)氨基酸取代單個(gè)氨基酸外與任何這些氨基酸序列等同的序列；和b)位于a)給出的序列的N-末端側(cè)的至少兩個(gè)半胱氨酸殘基；和c)位于a)給出的序列的C-末端側(cè)的至少兩個(gè)半胱氨酸殘基。(13)生產(chǎn)干酪的方法，其包括將干酪用乳或干酪用乳的成分與(I)-(IO)的方法生產(chǎn)的磷脂酶接觸。(14)磷脂酶，其是具有與下列序列至少有80%同一性的氨基酸序列的多肽SEQIDNO:10(T.albidum)中的氨基酸91-210，SEQIDNO:1(T.borchii)中的氨基酸92-211,SEQIDNO:12(V.tenerum)中的氨基酸30-137,SEQIDNO:3(大麗花輪支孢)中的氨基酸38-145，SEQIDNO:4(粗糙脈孢菌)中的氨基酸44-151,SEQIDNO:7(米曲霉)中的氨基酸37-157，或者SEQIDNO:8(粗糙脈孢菌)中的氨基酸58-168。(15)磷脂酶，其包括a)由克隆到質(zhì)粒中的DNA序列的編碼磷脂酶部分編碼的多肽，其中質(zhì)粒在保藏號(hào)DSM15442的大腸桿菌中；或b)多肽，其包括SEQIDNO:16的氨基酸29-149的氨基酸序列，或包括可以將其通過(guò)取代，缺失，和/或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸而獲得的氨基酸序列；或c)(a)或(b)定義的多肽的類(lèi)似物，其i)與該肽具有至少80%同源性，或ii)與抗該純化形式的多肽的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，或iii)是該多肽的等位基因變體；或d)由核酸序列編碼的多肽，該核酸序列在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼成熟多肽的SEQIDNO:15核酸133-495的核酸序列的互補(bǔ)鏈雜交，或者其具有至少100個(gè)核苷酸的亞序列。(16)(15)的磷脂酶，其是天然的鐮孢屬的菌抹，特別是鑲片鐮孢。(17)核酸序列，其包括編碼(15)或(16)的磷脂酶的核酸序列。(18)核酸序列，其包括7a)克隆到DSM15442大腸才干菌中質(zhì)4立上的編碼成熟的4，脂酶的部分DNA序列，b)SEQIDNO:15核酸133-495的編碼成熟磷脂酶的部分DNA序列，c)(a)或(b)定義的序列的類(lèi)似物，其編碼磷脂酶并且i)與所述DNA序列具有至少80%同源性，或ii)與所述DNA序列的互補(bǔ)鏈高嚴(yán)謹(jǐn)雜交或其具有至少100個(gè)核苷酸的亞序列，iii)是它們的等位基因變體；或d)a),b)或c)的互補(bǔ)鏈。(19)核酸構(gòu)建體，其包括(17)或(18)的核酸序列，其可操作性地連接于在合適表達(dá)宿主內(nèi)能夠指導(dǎo)磷脂酶表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)控制序列。(20)重組表達(dá)載體，其包括(19)的核酸構(gòu)建體，啟動(dòng)子，和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。(21)包括(20)的核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞。(22)生產(chǎn)磷脂酶的方法，其包括在利于磷脂酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)(21)的宿主細(xì)胞，和回收磷脂酶。(23)制備面團(tuán)或從面團(tuán)制作烘烤的產(chǎn)品的方法，其包括向面團(tuán)中加入(15)的磷脂酶。(24)包括(1"的磷脂酶的面團(tuán)組合物。(25)包括表面活性劑和(15)的磷脂酶的去污劑組合物。(26)減少植物油中磷含量的方法，其包括在水存在的情況下將油與(15)的磷脂酶接觸，和然后從油中分離水相。(27)生產(chǎn)干酪的方法，其包括用磷脂酶處理乳組合物，和從乳組合物生產(chǎn)干酪，其中磷脂酶是(15)的磷脂酶。(28)生產(chǎn)干酪的方法，其包括用磷脂酶處理乳組合物，和從乳組合物生產(chǎn)干酪，其中磷脂酶選自真菌的/細(xì)菌的組XfflPLA2磷脂酶。發(fā)明詳述表達(dá)的肽發(fā)明使用表達(dá)的真菌肽其屬于由活性位點(diǎn)序列相似性所定義的組，并且在Somgni，E.，etal.(2001)EMBOJ.20:5079-5090給出的組"真菌/細(xì)菌組xm磷脂酶A2"定義中使用半胱氨酸殘基保守性。肽是真菌的，例如源自Tuber，輪枝孢屬(Verticillium)，脈孑包菌屬(Neurospora),Helicosporum，或曲霉屬，特別是T.borchii，T.albidum,大麗花輪支孢(V.dahliae),V.tenerum,粗糙脈孑包菌(N.crassa)，Helicosporiumsp.HN1或米曲霉。肽可以具有磷脂酶活性，例如磷脂酶A活性，例如磷脂酶Al和/或磷脂酶A2活性。一些具體地例子是具有下面序列表中列出的氨基酸序列的已知肽。也說(shuō)明了源生物體和參考文獻(xiàn)SEQIDNO:1.Tuberborchii.Soragni,E.,etal.(2001)EMBOJ.20:5079-5090SEQINNO:3.大麗花輪支孢，COGEME植物致病真菌和OomyceteEST數(shù)據(jù)庫(kù)，UnisequenceID:VD0100C34.SEQIDNO:4.粗糙脈孢菌，NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，gi:18307435。SEQIDNO:5.Helicosporumsp.HN1.NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，gi:16519372。SEQIDNO:7.米曲霉，WO0056762,SEQIDNO:5954。SEQIDNO:8.粗糙脈孢菌，TREMBL蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，EAA28927。進(jìn)一步，發(fā)明者從天然來(lái)源分離具有所示序列的下面的真菌磷脂酶，這些天然來(lái)源購(gòu)自公共保藏庫(kù)或保藏在所示的國(guó)家和年代SEQIDNO:10.Tuberalbidum.購(gòu)自CentraalbureauvoorSchimmel-cultures，Utrecht,荷蘭，分離CBS272.72SEQIDNO:12.Verticilliumtenemm.愛(ài)爾蘭，1996發(fā)明者將從T.albidum(SEQIDNO:9)來(lái)的基因插入大腸桿菌中并按照布達(dá)佩斯條約(BudapestTreaty)于2003年2月12日保藏克隆。在德國(guó)DeutsceSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen(DSMZ),MascheroderWeglb,D-38124Braunschweig進(jìn)4亍〗呆藏，并i己錄為寸呆藏物號(hào)DSM154化發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中提供磷脂酶，其是與以下氨基酸序列具有至少80%，例如85%,優(yōu)選90%,更優(yōu)選至少95%氨基酸序列同一性的多肽與SEQIDNO:10(T.albidum)中的氨基酸91-210，SEQIDNO:1(T.borchii)中的氨基酸92-211，SEQIDNO:12(V.tenerum)中的氨基酸30-137，SEQIDNO:3(大麗花輪支孢)中的氨基酸38-145，SEQIDNO:4(粗糙脈孢菌)中的氨基酸44-151,SEQIDNO:7(米曲霉)中的氨基酸37-157，或者SEQIDNO:8(粗糙脈孢菌)中的氨基酸58-168。肽加工通過(guò)分析序列表中的磷脂酶序列，發(fā)明者發(fā)現(xiàn)每個(gè)表達(dá)的氨基酸序列由下述組成，信號(hào)肽，核心肽，和附加在核心肽C-或N-末端，或兩端的功能未知的額外肽序列。核心肽核心肽特點(diǎn)是相同的活性位點(diǎn)序列相似性和半胱氨酸殘基保守性，其由Soragni，E.,etal.(2001)EMBOJ.20:5079-5090在真菌的/細(xì)菌的組XIII磷脂酶A2觀察到。在發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中核心肽包括a)下列給出的序列SEQIDNO:l的氨基酸146-153,SEQIDNO:3的氨基酸87-94,或SEQIDNO:12的氨基酸79-86;或除了用另一個(gè)氨基酸取代單個(gè)氨基酸與這些氨基酸序列任何一個(gè)相同的序列；和b)位于a)給出的序列的N-末端側(cè)的兩個(gè)半胱氨酸殘基；和c)位于a)給出的序列的C-末端側(cè)的兩個(gè)半胱氨酸殘基。位于a)給出的序列的N-末端側(cè)的半胱氨酸殘基之一可以與a)給出的序列相隔例如0-5個(gè)氨基酸，例如0-3個(gè)氨基酸，優(yōu)選0-2個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選1個(gè)氨基酸。位于a)給出的序列的N-末端一側(cè)的另一個(gè)半胱氨酸殘基可以與a)給出的序列相隔例如14-20個(gè)氨基酸，例如15-19個(gè)氨基酸，優(yōu)選16-18個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選17個(gè)氨基酸。位于a)給出的序列的C-末端側(cè)的半胱氨酸殘基之一可以與a)給出的序列相隔例如22-29個(gè)氨基酸，例如23-28個(gè)氨基酸，優(yōu)選24-27個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選25-26個(gè)氨基酸。位于a)給出的序列的C-末端一側(cè)的另一個(gè)半胱氨酸殘基可以與a)給出的序列相隔例如27-49個(gè)氨基酸，例如29-46個(gè)氨基酸，優(yōu)選30-43個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選32-42個(gè)氨基酸，且最優(yōu)選35-40個(gè)氨基酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中核心肽包括四個(gè)半胱氨酸殘基，當(dāng)完整表達(dá)的磷脂酶序列與SEQIDNO:l,SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10，和SEQIDNO:12給出的序列同時(shí)比對(duì)(aglin)時(shí)，四個(gè)半胱氨酸殘基分別與SEQIDNO:l氨基酸128，144，180,和194的半胱氨酸殘基比對(duì)(aligning)。按照本發(fā)明，將表達(dá)的多肽裂解以從附加肽上分離核心肽。裂解可以通過(guò)將其在合適的絲狀真菌宿主內(nèi)表達(dá)而在體內(nèi)進(jìn)行，或者在體外，例如通過(guò)用合適的蛋白酶如Kex2處理。可以在FG序列的11個(gè)氨基酸里或Kex2位點(diǎn)序列的10個(gè)氨基酸里發(fā)現(xiàn)斷裂點(diǎn)。Kex2位點(diǎn)是例如RR,KR，KK或RK。在一個(gè)實(shí)施方案中核心肽長(zhǎng)度100-150氨基酸，例如110-140個(gè)氨基酸,115-133個(gè)氨基酸，118-129個(gè)氨基酸，或118-126個(gè)氨基酸。在發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)完整表達(dá)的磷脂酶序列與SEQIDNO:l,SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10，和SEQIDNO:12給出的序列同時(shí)比對(duì)時(shí)，將表達(dá)的磷脂酶在與SEQIDNO:1的氨基酸97-101比對(duì)的序列的N-末端側(cè)0-18氨基酸中裂解，例如3-16氨基酸，優(yōu)選5-14氨基酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)完整表達(dá)的磷脂酶序列與SEQIDNO:l,SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:10,和SEQIDNO:12給出的序列同時(shí)比對(duì)時(shí)，將表達(dá)的磷脂酶在與SEQIDNO:1的氨基酸204-209比對(duì)的序列的C-末端側(cè)0-11氨基酸內(nèi)裂解，例如0-9氨基酸，優(yōu)選0-7氨基酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，加工后的磷脂酶具有特異的磷脂酶活性，其比表達(dá)肽加工前的活性高，例如，在一個(gè)實(shí)施方案中特異的磷脂酶活性至少是表達(dá)肽加工前的特異磷脂酶活性的2倍，更優(yōu)選至少5倍，最優(yōu)選至少10倍。在發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中表達(dá)的肽在加工前沒(méi)有測(cè)定到磷脂酶活性。磷脂酶活性例如可以用在pH8.0和40°C水解大豆卵磷脂(L-a-磷脂酰膽堿)2分鐘的LEU實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定。磷脂酶活性表示為相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)，保持恒定的pH必需的滴定消耗(0.1MNaOH)速度。在絲狀真菌宿主細(xì)胞中表達(dá)絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是例如下列的細(xì)胞支頂孢霉屬(Acremonium),曲霉屬，鐮孢屬(Fusarium)，腐殖霉屬(Humicola)，毀絲霉屬(Myceliophthora),脈孢菌屬(Neurospora),青霉屬(Penicillium)，才艮毛霉屬(Rhizomucor),嗜熱霉屬(Thermomyces)，梭孢殼屬(Thielavia)，彎頸霉屬(Tolypocladium)，或木霉屬(Trichoderma),特別是泡盛曲霉(A.awamori),臭曲霉(A.foetidus)，曰本曲霉(A.japonicus),構(gòu)巢曲霉(A.nidulans),黑曲霉(A.niger)，米曲霉，桿孑包狀鐮孑包(F.bactridioides),禾谷鐮孑包(F.cerealis)，庫(kù)威鐮孑包(F,crookwellense)，大刀鐮孑包(F.culmorum),禾谷鐮孑包(F.gramineamm)，禾赤鐮孑包(F.graminum)，異孢鐮孢(Rheterosporum),合歡木鐮孢(F.negundi)，尖鐮孢(F.oxyspor腿)，多枝鐮孢(Rreticulatum)，玫瑰色鐮孢(F.roseum),接骨木鐮孢(F.sambucinum),月夫色錄孑包(F.sarcochroum),扣乂分斗支孑包鐮孑包(F.sporotrichioides),硫色鐮孢(Rsulphureum)，圓鐮孢(F.torulosum),擬絲孢鐮孢(F.trichothecioides)，鑲片鐮孢，特異腐質(zhì)霉(H.insolens),嗜熱毀絲霉(M.therm叩hila),粗糙脈孢菌(N.crassa),產(chǎn)紫青霉(P.purpurogenum)，曼赫根毛霉(R.miehei),細(xì)毛嗜熱霉(Thermomyceslanuginosus)，土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)，哈茨木霉(Trichodermaharzianum),康亍木霉(Trichodermakoningii),長(zhǎng)枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)，里氏木霉(Trichodermareesei),綠色木霉(Trichodermaviride)。在優(yōu)選實(shí)施方案中宿主生物體是曲霉屬，鐮孢霉屬，或木霉屬的菌抹，特別是黑曲霉，米曲霉，鑲片鐮孢，接骨木曲霉或Rcerealis?？梢酝ㄟ^(guò)傳統(tǒng)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)，表達(dá)，回收，例如通過(guò)EP238023，EP305216,WO9600787,EP244234或T.Christensenetal.,BioTechnology，第6巻，1988年12月，1419-22描述的一般方法。磷脂酶多肽和DNA在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及有磷脂酶活性的多肽，并且其中多肽包括，優(yōu)選由與SEQIDNO:16(即成熟多肽)的氨基酸29-149有一定程度同一性的氨基酸序列組成，該同一性程度至少80%,例如至少85%,甚至更優(yōu)選至少卯％,最優(yōu)選至少95%,例如至少96。/。，例如至少97%，甚至最〈尤選至少98%,例如至少99%。優(yōu)選地，多肽包括SEQIDNO:16的氨基酸序列；它們的等位基因變體；或具有磷脂酶活性的它們的片段。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包括SEQIDNO:16的氨基酸29-149。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽由SEQIDNO:16的氨基酸29-149組成。本發(fā)明也涉及多核苷酸其包括，優(yōu)選由與SEQIDNO:15的核苷酸133-495至少80%同源的核苦酸序列組成。優(yōu)選地，核苷酸序列與SEQIDNO:15的核苦酸133-495具有至少85%同源性，例如至少90%同源性，甚至更優(yōu)選至少95%同源性，例如至少96%同源性，例如至少97%同源性，甚至最優(yōu)選至少98%同源性，例如至少99%同源性。優(yōu)選地，核苷酸序列編碼具有磷脂酶活性的多肽。在本申請(qǐng)中使用以DNA序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的探針，磷脂酶可以源自鐮孢霉屬的菌林，特別是鑲片鐮孢。在一個(gè)實(shí)施方案中磷脂酶具有磷脂酶A的活性。磷脂酶的生產(chǎn)可以通過(guò)用編碼磷脂酶的DNA序列轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，在允許酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的微生物，并從培養(yǎng)物中回收酶。宿主微生物優(yōu)選是真核細(xì)胞，特別是真菌細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞或絲狀真菌細(xì)胞，例如下列菌屬的菌抹曲霉屬，鐮孢霉屬，木霉屬或酵母屬，特別是黑曲霉，米曲霉，鑲片鐮孢，接骨木曲霉，F(xiàn).cerealis或釀酒酵母，例如黑曲霉的產(chǎn)生葡萄糖淀粉酶的菌抹，例如US3677902中描述的那些或它們的變體。在這樣宿主生物體中磷脂酶的生產(chǎn)可以通過(guò)EP238,023(NovoNordisk)，WO96/00787(NovoNordisk)或EP244,234(Alko)描述的一般方法進(jìn)行。發(fā)明的表達(dá)載體通常包括作為啟動(dòng)子功能的控制序列，翻譯起始信號(hào)，和，可選擇地包括篩選標(biāo)記，轉(zhuǎn)錄終止子，阻遏基因或各種激活基因。載體可以是自主復(fù)制載體，或者它可以被整合到宿主基因組中。序列比對(duì)和同源性核苦酸序列的比對(duì)可以使用VectorNT1ProgramSuite7.0的AlignX應(yīng)用軟件進(jìn)行，使用默認(rèn)設(shè)置，其使用改良的ClustalW運(yùn)算法則(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.,andGibsonT丄(1994)Nuc.AcidRes.22:4673-4680),swgapdnarnt4尋分(score)矩陣,空"f立開(kāi)》文罰分(gapopeningpenalty)15和空^[立延伸罰分(gapextensionpenalty)6.66。氨基酸序列的比對(duì)可以使用VectorNT1ProgramSuitev8的AlignX應(yīng)用軟件進(jìn)行，使用默認(rèn)設(shè)置，其使用改良的ClustalW運(yùn)算法則(Thompson,J.D.,Higgins，D,G"andGibsonT.J.1994)，blosum62mt2得分矩陣，空位開(kāi)放罰分15和空位延伸罰分0.1。在發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，序列的比對(duì)和同源性得分的計(jì)算使用Lipman陽(yáng)Pearson方法進(jìn)行(Lipman，D丄andW.R.Pearson(1985)Rapidandsensitiveproteinsimilaritysearches.Science227:1435-1441)，使用PAM250殘基weighttable(Dayhoff,M.O.,R.M.Schwartz,andB.C.Orcutt(1978)Amodelofevolutionarychangeinproteins.InDayhoff，M.O.(ed.)，AtlasofProteinSequenceandStructure.NationalBiomedicalResearchFoundation.Washington,D.C.Vol5.Suppl.3:pp.345-358)并用Lasergene軟件包中MegAlign程序v4.03的默認(rèn)設(shè)置(DNASTARInc.,1228SouthParkStreet,Madison,Wisconsin53715)。默認(rèn)設(shè)置是K-tuple為2,空位罰分(gappenalty)為4,和空位長(zhǎng)度罰分(gaplengthpenulty)為12。磷脂水解可以將發(fā)明用于任何磷脂例如卵磷脂，腦磷脂或inositide的水解。通過(guò)替換磷脂酶，可以將發(fā)明用作類(lèi)似于以前的現(xiàn)有技術(shù)的方法和加工領(lǐng)域中，例如用于烘烤產(chǎn)品(WO0032758，W09953769)和蛋黃醬(GB1525929,US4034124)的生產(chǎn)，或植物油的處理(US5264367)。磷脂酶的應(yīng)用可以將發(fā)明的磷脂酶用于磷脂酶的各種工業(yè)應(yīng)用，例如下面所描述的。用于烘烤可以將發(fā)明的磷脂酶用于面團(tuán)，面包和蛋糕的制備，例如改善面包或蛋糕的彈性。因此，可以將磷脂酶用在制作面包的過(guò)程中，包括向面團(tuán)成分中添加磷脂酶，捏制面團(tuán)和將面團(tuán)烘烤以制成面包。這可以按類(lèi)似于US4567056或WO99/53769進(jìn)行。用于去污劑中可以將變體用作去污劑的添加物，例如以每克去污劑中0.001-10(例如0.01-l)mg的濃度(表示為純的酶蛋白)，或每升洗滌液中0.001-100(例如0.01-10)mg的濃度?？梢詫l(fā)明的去污劑組合物配制成例如手洗或機(jī)洗去污劑組合物，其包括適于染色織物預(yù)處理的洗衣添加劑組合物和加有織物軟化劑(softener)組合物的漂洗劑，或配制成用于普通家用硬表面清洗操作的去污劑組合物。在洗衣去污劑中，變體對(duì)去除脂肪漬，保持白色和污漬清除是有效的。洗衣去污劑組合物可以按照GB2247025，WO9901531或WO9903962描述的配制。作，例如按照GB2,247,025(Unilever)或WO99/01531(Procter&Gamble)描述的。在餐具洗滌(dishwashing)組合物中，變體對(duì)下列可能是有效的去除油污/油漬，防止餐具和洗碗機(jī)的塑料成分被高度著色成分染色或脫色，和避免鈣皂在餐具上的沉積。其他應(yīng)用可以將發(fā)明的磷脂酶用于改善水溶液或糖漿的過(guò)濾性，其通過(guò)將水溶液或糖漿用磷脂酶處理。這特別適用于含有淀粉水解物的漿液，尤其是小麥淀粉水解物，因?yàn)樗请y以過(guò)濾并使濾過(guò)物混法。處理可以按類(lèi)似于EP219,269(CPC國(guó)際的)進(jìn)行。進(jìn)一步，可以將發(fā)明的磷脂酶用于磷脂，優(yōu)選卵磷脂的部分水解，以獲得改善的磷脂乳化劑。這一應(yīng)用在Ullmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry(Publisher:VCHWeinheim(1996))，日本專(zhuān)利2794574,和JP-B6-087751中有進(jìn)一步描述。進(jìn)一步，可以將發(fā)明的磷脂酶用于動(dòng)物飼料生產(chǎn)的加工，其包括將磷脂酶與伺料原料和至少一種磷脂混合。這可以按類(lèi)似于EP743017進(jìn)行。甚至進(jìn)一步可以將發(fā)明的磷脂酶用于減少食用油中磷脂成分的加工，包括用磷脂酶處理油以水解大部分磷脂，并從油中分離含有水解的磷脂的水相。該過(guò)程適用于任何含有磷脂的食用油的純化，例如植物油如大豆油，油菜籽油和向日葵油。可以將磷脂酶用于例如JP-A2-153997和US5264367描述的加工過(guò)程。生產(chǎn)干酪的方法可以將發(fā)明的磷脂酶按類(lèi)似于US6399121給出的方法用于生產(chǎn)干酪。在發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，干酪的生產(chǎn)通過(guò)將干酪用乳或干酪用乳的成分與發(fā)明的磷脂酶接觸并從干酪用乳生產(chǎn)干酪。在進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方案中，干酪的生產(chǎn)通過(guò)將干酪用乳或干酪用乳的成分與磷脂酶接觸，其中磷脂酶包括a)下列給出的氨基酸序列SEQIDNO:l的氨基酸146-153，SEQIDNO:3的氨基酸87-94，或SEQIDNO:12的氨基酸79-86;或其除了用另一個(gè)氨基酸取代單個(gè)氨基酸外與這些氨基酸序列任何一個(gè)相同的序列，；和b)位于a)給出的序列的N-末端側(cè)的至少兩個(gè)半胱氨酸殘基；和c)位于a)給出的序列的C-末端側(cè)的至少兩個(gè)半胱氨酸殘基。在發(fā)明全文中短語(yǔ)干酪用乳意思是包括用于干酪生產(chǎn)的任何以乳為基礎(chǔ)的組合物。干酪用乳的成分可以是干酪用乳的任何部分，例如奶油，脫脂乳，牛奶，酪乳，黃油或乳脂肪。在優(yōu)選實(shí)施方案中將干酪用乳或干酪用乳的成分與足量的發(fā)明的磷脂酶才妄觸，該量足以減少干酪中去油效應(yīng)和/或增加干酪產(chǎn)量。去油效應(yīng)(oiling-off)是干酪在貯存和/或融化時(shí)形成游離油的傾向。發(fā)明的一個(gè)方面涉及生產(chǎn)干酪的加工過(guò)程，其包括用發(fā)明的磷脂酶處理乳制品組合物并從乳制品組合物生產(chǎn)干酪。發(fā)明的另一個(gè)方面涉及生產(chǎn)干酪的加工過(guò)程其包括用磷脂酶處理乳制品組合物并從乳制品組合物生產(chǎn)干酪，其中磷脂酶選自真菌/細(xì)菌組XIIIPLA2磷脂酶。在發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中真菌/細(xì)菌組XinPLA2來(lái)自真菌，更優(yōu)選來(lái)自屬于(Ascomycetes)的真菌。屬于真菌/細(xì)菌組XI11PLA2的磷脂酶可以是Y壬何屬于Soragnietal.,TheEMBOJournal,20(2001),5079-5090所定義的該組的磷脂酶，并且可以是例如從以下菌屬Tuber屬，例如T.borchii,《連霉菌屬，例如S,coelicor,輪枝孑包屬(Verticillium)，例如大麗花輪枝孢(v.danhliae)，曲霉屬，例如米曲霉，脈孢菌屬，例如粗糙脈孢菌，或Helicosporum。按照發(fā)明的乳制品組合物可以是任何包含乳成分的組合物。乳成分可以是乳的任何組分，例如乳脂肪，乳蛋白，酪蛋白，乳清蛋白質(zhì)，和乳糖。乳級(jí)分(fraction)可以是乳的任何級(jí)分例如脫脂乳，黃油乳，乳清，奶油，奶粉，全脂奶粉，脫脂奶粉。在發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中乳制品組合物包括乳，脫脂乳，黃油乳，全乳乳清，奶油，或它們的任何組合。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中乳制品組合物由乳，例如脫脂乳，全乳，奶油，黃油，或它們的任4可組合組成。16發(fā)明的加工過(guò)程中酶處理的進(jìn)行可以通過(guò)將磷脂酶分散在乳制品組合物中，并允許酶反應(yīng)發(fā)生在合適的溫度并保持合適的時(shí)間。用磷脂酶處理可以在按照本領(lǐng)域熟知原則選擇的適合所選用酶的條件下完成?？梢栽谌魏魏线m的pH進(jìn)行酶反應(yīng)，例如在2-10的范圍，例如在pH4-9或5-7。在一個(gè)實(shí)施方案中磷脂酶處理在3-60。C進(jìn)行，例如在25-45。C(例如至少5分鐘，例如至少10分鐘或至少30分鐘，例如5-120分鐘)。將磷脂酶以合適的量加入以生產(chǎn)具有目的特性的干酪。優(yōu)選地，將磷脂酶以有效減少干酪去油效應(yīng)和/或增加干酪產(chǎn)量的量加入。磷脂酶的合適劑量通常在每克乳脂肪中0.001-0.5mg酶蛋白的范圍，優(yōu)選每克乳脂肪中0.01-0.3mg酶蛋白，更優(yōu)選地，每克乳脂肪中0.02-0.1mg酶蛋白。按本發(fā)明方法生產(chǎn)的干酪包括所有種類(lèi)的干酪，例如Campesino，Chester,Danbo，Drabant,Herregard，Manchego,Provolone,SaintPaulin專(zhuān)欠干酪(Softcheese),Svecia,Taleggio，白干酪(whitecheese),包4舌通過(guò)干酪凝塊的凝乳酶凝固(rennet-coagulation)生產(chǎn)的凝乳酶凝干酪；成熟干酪例如Cheddar,Colby,Edam,Muenster,Gruyere，Emmenthal,Camembert,Parmesan牙口Romano;青纟丈奶酪(bluecheese),例長(zhǎng)口丹麥青纟丈4巧酪(Danishbluecheese);新鮮干酪例如Feta;酸凝干酪例如奶油干酪，Neufchatel,Quarg，CottageCheese,和QuesoBlanco。在優(yōu)選實(shí)施方案中發(fā)明涉及生產(chǎn)pastafilata干酪例如Mozzarella和Pizza干酪的方法。通過(guò)在熱水中新鮮凝塊的獨(dú)特的塑型和捏制處理，Pastafilata或stretched凝乳，干酪通常是不一^:的，該處理賦予成品干酪特有的纖維結(jié)構(gòu)和融化和延伸特性，參考例如PaulS.Kindstedt的"MozzarellaandPizzacheese，，,Cheese:Chemistry,physicsandmicrobiology,第2巻MajorCheesegroups,第2版,337-341頁(yè)，Chapman&Hall。序列表和微生物保藏本申請(qǐng)包含序列表中的信息，其附屬于本申請(qǐng)并且也隨本申請(qǐng)以數(shù)據(jù)載體提交。此外，本申請(qǐng)?zhí)峒氨２氐奈⑸铩?shù)據(jù)載體的內(nèi)容和保藏的微生物在此全部引入以作參考。生物材料的保藏下列生物材并+已經(jīng)4妄照Budapest條約保藏在DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,MascheroderWeglb,D-38124Braunschweig,德國(guó)，并給出下列保藏號(hào)保藏物保藏號(hào)大腸桿菌DSM15441大腸桿菌DSM15442保藏曰2003年2月12日2003年2月12日材料與方法培養(yǎng)基YP+2%G培養(yǎng)基10g酵母提取物20g蛋白胨加水至1升于121。C高壓滅菌20分鐘加入100ml20%無(wú)菌葡萄糖溶液RA孢子形成培養(yǎng)基50g琥珀酸12.1g硝酸鈉lg葡萄糖20ml50xVogel，s鹽(Davis,R.H.andF.J.deSerres(1970),Meth.Enzymol.17A:79-143)將成分在1升蒸餾水中混勻并過(guò)濾除菌BrittonRobinson緩沖液0.023M磷酸0.023M乙酸0.023M硼酸用NaOH或HC1滴定到目的pH方法磷脂酶活性(XEU)將卵磷脂在恒定pH和溫度下水解，磷脂酶活性測(cè)定為中和游離脂肪酸過(guò)程中滴定(0.1NNaOH)消耗的速度。底物是大豆卵磷脂(L-a-磷脂酰膽堿)，條件是pH8.00，40.0°C,反應(yīng)時(shí)間2分鐘。單位是相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)來(lái)定義的。實(shí)施例實(shí)施例1:米曲霉中源于Tuberalbidum的磷脂酶A2表達(dá)將Soragni等(出處同上)公開(kāi)的DNA序列用于設(shè)計(jì)從基因組DNA進(jìn)行TbSPlPCR擴(kuò)增的引物，向引物末端加入適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c(diǎn)以利于PCR產(chǎn)物(SEQIDNO:13和14)的克隆。從CBS(CentraalbureauvoorSchi匪el-cultures,Utecht，荷蘭)獲得Tuberalbidum株，CBS272.72,并按CBS培養(yǎng)物表1996上建議的于20。C培養(yǎng)在X-瓊脂上。從板的表面去除菌絲體，并按照生產(chǎn)商的說(shuō)明4吏用FastDNASpinKit(BIO101,Inc.,Vista,CA)分離總DNA。用ExtensorHi-FidelityPCRMasterMix(ABgene,Surrey,U.K.)按照生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并在最初5個(gè)循環(huán)使用52。C的退火溫度，后面25個(gè)循環(huán)使用62。C退火。獲得了單一PCR產(chǎn)物，并且將序列進(jìn)行測(cè)定并表示為SEQID9，其排除了添加的合成的限制性位點(diǎn)?；蚪M序列與E.Soragni等提交的cDNA序列對(duì)比顯示有單個(gè)內(nèi)含子。當(dāng)將內(nèi)含子去除，從T.albidumCBS272.72來(lái)的核苷酸序列與E.Soragni等使用的菌抹T.borchiiATCC96540的序列92.5%同一性。從T.albidumCBS272.72基因序列預(yù)測(cè)的相應(yīng)的肽與Soragni等報(bào)道的肽序列93.8%同一性。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將PCR片段用BamHI和XhoI限制性酶切并克隆到曲霉屬表達(dá)載體pMStr57中。表達(dá)載體pMStr57含有與pCaHj483(WO98/00529)相同的元件，具有對(duì)曲霉屬NA2啟動(dòng)子的最少^畛飾，并有用于在大腸桿菌中篩選和繁殖的序列，和用于在曲霉屬中篩選和表達(dá)的序列。具體地，通過(guò)構(gòu)巢曲霉的amdS基因使在曲霉屬中篩選變得容易，其允許使用乙酰胺作為唯一的氮源。在曲霉屬菌種中的表達(dá)由來(lái)自黑曲霉的修飾的中性淀粉酶II(NA2)啟動(dòng)子介導(dǎo)，該啟動(dòng)子被融合到來(lái)自構(gòu)巢曲霉的丙糖磷酸異構(gòu)酶(tpi)編碼基因的5'前導(dǎo)序列，并且終止子來(lái)自黑曲霉的淀粉葡萄糖苷酶的編碼基因。將所得到曲霉屬菌種表達(dá)構(gòu)建體pMStr57的磷脂酶A2編碼基因測(cè)序，并將序列與以前測(cè)定的未克隆的PCR片段SEQID9對(duì)比。發(fā)現(xiàn)在終止密碼的下游52bp處一個(gè)T突變成C。使用Christensen,T.etal.,(1988),Biotechnology6,1419-1422描述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用pMStr57轉(zhuǎn)化米曲霉。將轉(zhuǎn)化體在YP+2°/。G培養(yǎng)基中于30°C，振蕩275RPM培養(yǎng)，并用SDS-PAGE監(jiān)測(cè)Tuber磷脂酶A2，TbPLA2的表達(dá)。蛋白鑒定SDS-PAGE顯示大約分子量為25和16kDa的兩條帶。將上清在SP-瓊脂糖柱上用離子交換層析純化,柱用50mM乙酸鹽緩沖液平衡，用1MNaClpH5.0洗脫。兩種蛋白質(zhì)洗脫在兩個(gè)不同的組分中。用Roche的ProteinAssayESL測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。用LEU實(shí)驗(yàn)測(cè)定活性。分子量kDa濃度mg/ml活性LEU/ml比活性LEU/mgPool123-251.326146Pool2160.42272648將蛋白質(zhì)進(jìn)行N-末端測(cè)序。發(fā)現(xiàn)Pool1(23-25kDa帶)的N-末端序列相應(yīng)于SEQIDNO:10的氨基酸32-50。Pool2(16kDa帶)的印跡顯示具有N陽(yáng)末端序列分別相應(yīng)于氨基酸86-98和91-103的兩條帶。兩條帶的質(zhì)譜分析顯示質(zhì)量分別為13934和14348Da，分別與SEQIDNO:10的氨基酸86-210和91-210序列的計(jì)算值相差5Da以內(nèi)。實(shí)施例2:在米曲霉中表達(dá)的兩種形式的T.albidiumPLA2的純化方法在實(shí)施例1描述的產(chǎn)生T.albidumPLA2的米曲霉轉(zhuǎn)化體的大多數(shù)發(fā)酵物純化過(guò)程中^r測(cè)到兩種類(lèi)型的酶。一種類(lèi)型在SDS-PAGE中電泳在22-23kDa并相應(yīng)于Somgni等(出處同上)才艮道的肽。此外，^^測(cè)到一種新類(lèi)型，其電泳在SDS-PAGE的16-17kDa并具有高度比活性和高等電點(diǎn)。22-23kDa肽的純化將來(lái)自在米曲霉中表達(dá)的含有源于T.albidium的磷脂酶的(實(shí)施例1中制備的)發(fā)酵上清過(guò)濾除菌，其使用購(gòu)自SeitzSchenkBadKreuznach,Bettringerstrasse42，GermanyD-73550,Waldstetten的EKS濾器。然后調(diào)節(jié)無(wú)菌過(guò)濾的上清至pH8和離子強(qiáng)度在4mSi以下。陰離子交換層析純化的第一步使用購(gòu)自AmershamPharmacia的50mlFastflowqTm球脂糖柱上陰離子交換層析進(jìn)行。將柱用50mMTris乙酸鹽緩沖液pH8預(yù)平衡。然后將無(wú)菌過(guò)濾的發(fā)酵液加在柱上，并將柱用同樣緩沖液洗滌直至所有未結(jié)合物質(zhì)被洗掉。將結(jié)合的蛋白質(zhì)用含有1M氯化鈉pH8的相同緩沖液以5ml/min的流速洗脫，并且最終體積達(dá)500ml總緩沖液。以每5ml—個(gè)級(jí)分用級(jí)分收集器收集，所有級(jí)分含有的磷脂酶活性使用購(gòu)自Sigma產(chǎn)品號(hào)P-5638的L-a-磷脂酰膽堿以卵磷脂作為底物定性測(cè)定，并且測(cè)定活性使用購(gòu)自德國(guó)WakoChemicalsGmbH，NissanStrasse2,41468Neuss的NEFAC試劑盒。詳細(xì)的測(cè)定描述如下。用不同緩沖液制備含有10mg/ml卵磷脂底物的底物溶液，例如用含有購(gòu)自Flukachemicals的2mMCaCb和0.1%TritonX-100的50mM乙酸鹽pH5或50mMHepespH7或50mMTris乙酸鹽pH9作為緩沖液。通過(guò)攪拌并加溫成5CTC使底物乳化，然后冷卻至4(TC并用作底物?；钚缘臏y(cè)定如下進(jìn)行用300n1底物乳化劑與25p1酶級(jí)分在40。C保溫20分鐘，然后將30jul測(cè)定混合物轉(zhuǎn)移至按生產(chǎn)商描述制備的300julNEFAC顯色試劑A，并于37。C保溫10分鐘，向混合物加入600jul顯色試劑NEFACB溶液并再保溫10分鐘。然后將所形成的藍(lán)色在分光光度計(jì)上于505nm測(cè)定。蛋白鑒定然后將含有活性的級(jí)分混合，并用SDS-PAGE電泳分析分子量特征，電泳葉吏用購(gòu)自美國(guó)InvitrogenLifeTechnologies,CarlsbadCA92008的NovexPrecastedgels4-20%Tris匿甘氨酸凝膠。才企測(cè)和印跡了22-23kDa的蛋白質(zhì)并用AppliedBiosystem測(cè)序4義進(jìn)行N-末端分析。測(cè)定了N-末端的前19個(gè)氨基酸殘基并發(fā)現(xiàn)具有SEQIDNO:10的氨基酸32-50序列。16-17kDa肽的純4匕將來(lái)自表達(dá)在米曲霉中T.albidium的過(guò)濾除菌發(fā)酵上清調(diào)節(jié)至pH4.7并將離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)至4mSi以下。陽(yáng)離子交換層析SP-sepharoseTMfastflow購(gòu)自AmershamPharmacia?！氛嫜b50ml的柱并用50mM乙酸鹽緩沖液pH4.7平衡，然后將發(fā)酵上清加在柱上，并將未結(jié)合物質(zhì)用同樣緩沖液洗去。將具有高等電點(diǎn)的結(jié)合蛋白質(zhì)用含有IM氯化鈉的pH4.7的50mM乙酸鹽緩沖液進(jìn)行線性鹽梯度洗脫。級(jí)分和流速與用于低等電點(diǎn)類(lèi)型磷脂酶的相同。在級(jí)分中的磷脂酶活性按照上面用NEFA試劑盒定性測(cè)定。將含有磷脂酶活性的級(jí)分混合并按照上面描述的進(jìn)行SDS-PAGE。觀察16-17kDa蛋白質(zhì)其具有高等電點(diǎn)，在9以上。蛋白質(zhì)印跡后使用AppliedBiosystem測(cè)序儀進(jìn)行蛋白質(zhì)的N-末端分析，其顯示出完全不同于Soragni等(出處同上)發(fā)表的N-末端。因此，發(fā)現(xiàn)T.albidumPLA2具有兩種類(lèi)型，其源自不同的N-末端加工，具有分別相應(yīng)于SEQIDNO:10氨基酸86-105和91-110的N-末端序列。實(shí)施例3:用T.albidum磷脂酶的干酪制作使用巴氏殺菌的，非均質(zhì)奶油(北卡羅來(lái)納州大學(xué)乳品廠(NorthCarolinaStateUniversityDairyPlant)將五百克巴氏殺菌的，非均質(zhì)脫脂乳(北卡羅來(lái)納州大學(xué)乳品廠)標(biāo)準(zhǔn)化為3.5。/。脂肪因此生產(chǎn)全脂mozzarella干酪。將每個(gè)實(shí)驗(yàn)用的干酪用乳或者用按照實(shí)施例2制備的16-17kDaT.albidum磷脂酶，或者用商業(yè)磷脂酶Lecitase10L(NovozymesA/S,Bagsvaerd,丹麥)處理，并放置在35。C水浴中直至平衡至該溫度。測(cè)量干酪用乳的起始pH并加入0.01。/。(w/w)引子培養(yǎng)物。監(jiān)測(cè)pH直至pH達(dá)到6.4。將250jli1凝乳酶(rennet)(Novozym89L)用去離子水稀釋至9ml總?cè)芤?，?ml該溶液加入干酪用乳中并用力攪拌干酪用乳3分鐘。取出攪拌子并允許凝乳酶凝的乳品放置于35°C。上面的處理之后，當(dāng)將抹刀(spatula)插入可以看見(jiàn)明顯的邊界時(shí)則凝乳準(zhǔn)備好進(jìn)行切割。干酪的切割通過(guò)把刀壓下并且當(dāng)觸到燒杯時(shí)快速反轉(zhuǎn)刀具(cutter)并最后將刀拔出進(jìn)行。允許凝乳放置5分鐘然后用匙輕輕攪動(dòng)。溫度升至41。C伴隨間斷的輕輕攪動(dòng)-45分鐘或直至pH降至6.0-5.9。將凝乳用干酪用粗棉布瀝干然后放回?zé)胁⒈３衷?rc水浴中，根據(jù)需要倒出乳清。當(dāng)凝乳達(dá)到pH5.3時(shí)，將盛有凝乳的不銹鋼碗在69。C水浴中浸泡(flood)5分鐘然后用手拉伸。將凝乳在冷的冰水中處理(temper)30分鐘。將干酪凝乳用紙巾干燥，稱重并冷藏過(guò)夜。除了不加磷脂酶，對(duì)照干酪制作實(shí)驗(yàn)用同一批號(hào)乳品按照同樣程序進(jìn)行。實(shí)際干酪產(chǎn)量計(jì)算為相對(duì)于干酪用乳總重量拉伸(stretch)后干酪的重量。調(diào)節(jié)過(guò)濕度的干酪產(chǎn)量表示為調(diào)節(jié)至標(biāo)準(zhǔn)恒定濕度水平的實(shí)際產(chǎn)量。調(diào)節(jié)過(guò)濕度的產(chǎn)量通過(guò)實(shí)際產(chǎn)量乘以實(shí)際濕度對(duì)標(biāo)準(zhǔn)濕度比來(lái)計(jì)算，并按照下面/>式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>其中Yad」=調(diào)節(jié)過(guò)濕度的干酪產(chǎn)量，Yaet=實(shí)際干酪產(chǎn)量，Maet=實(shí)際濕度分?jǐn)?shù)&Mstd=標(biāo)準(zhǔn)濕度分?jǐn)?shù)(0.48)所有實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的調(diào)節(jié)過(guò)濕度的干酪產(chǎn)量如表1所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實(shí)施例4:源于Fusariumvenenatum的磷脂酶(FvPLA2)在米曲霉中克隆和表達(dá)將鑲片鐮孢A3/5的細(xì)胞(最初保藏為禾谷鐮孢ATCC20334,最近被重新分類(lèi)為Fusariumvenenatum:被Yoder和Christianson,1998,FungalGeneticsandBiology23:62-80;和O，Donnell等，1998，F(xiàn)ungalGeneticsandBiology23:57-67.)在Vogel，s最低限度培養(yǎng)基(Davis,R.H.andF.J.deSerres(1970),Meth.Enzymol.17A:79-143)中于28。C震蕩培養(yǎng)生長(zhǎng)兩天，用無(wú)菌Miracloth(Calbiochem，圣地亞哥，加利福尼亞，美國(guó))過(guò)濾，并轉(zhuǎn)移至"RA孢子形成培養(yǎng)基，，中，將其于28。C再搖動(dòng)培養(yǎng)保溫24小時(shí)。離心收集細(xì)胞和孢子并裂解，4是取RNA并轉(zhuǎn)錄成cDNA，將該cDNA按WO00/56762描述的方法克隆到pZErO-2中。擴(kuò)增前此文庫(kù)中獨(dú)立克隆的數(shù)目是2.5x105，其中92%含有插入序列，其大小從550-2500bp不等。對(duì)大約1000個(gè)隨機(jī)選擇克隆進(jìn)行局部DNA測(cè)序測(cè)定，并將序列按照WO00/56762描述的方法存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)中。E.Soragni等2001年報(bào)道了編碼一種Tuberborchii的磷脂酶A2-TbSPl的cDNA核苷酸序列，和相應(yīng)翻i,的肽。用TFASTXY程序，3.3t08版(Pearsonetal.,1997)將該翻譯的肽與Fusariumvenenatum部分cDNA序列的翻i奪產(chǎn)物對(duì)比。鑲片鐮孢序列的一個(gè)翻譯產(chǎn)物與TbSPl具有125個(gè)氨基酸重疊的42%同源性。測(cè)定相應(yīng)克隆FM0700的cDNA插入子全序列，并用SEQIDNO:15顯示，從此序列翻譯的肽，F(xiàn)vPLA2用SEQIDNO:16顯示。將此序列用作設(shè)計(jì)從FM0700PCR擴(kuò)增編碼FvPLA2的基因的引物FvPLAl和FvPLA2.2，其有加于引物末端的合適的限制性位點(diǎn)以利于PCR產(chǎn)物的亞克隆。FvPLAl:CTGGGATCCTCAAGATGAAGTTCAGCGFvPLA2.2:GACCTCGAGACCCGCCATTTAAGATT4吏用ExtensorHi-FidelityPCRMasterMix(AB-gene,Surrey,U.K.)4會(huì)照生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并使用52。C的退火溫度和60。C的延伸溫度進(jìn)行20個(gè)〗盾環(huán)。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將PCR片段用BamHI和XhoI限制性酶切并克隆到曲霉屬表達(dá)載體pMStr57中。表達(dá)載體pMStr57含有與pCaHj483(WO98/00529)相同的元件，并如WO01/12794中對(duì)載體pMT2188所描述的具有對(duì)曲霉屬NA2啟動(dòng)子的最少修飾，并有在大腸桿菌中篩選和繁殖的序列，和在曲霉屬中篩選和表達(dá)的序列。具體地，通過(guò)構(gòu)巢曲霉的amdS基因使在曲霉屬中篩選變得容易，其允許使用乙酰胺作為唯一的氮源。在曲霉屬(Aspergillus)中的表達(dá)由來(lái)自黑曲霉的修飾的中性淀粉酶II(NA2)啟動(dòng)子介導(dǎo)，該啟動(dòng)子被融合到來(lái)自構(gòu)巢曲霉的丙糖磷酸異構(gòu)酶(tpi)編碼基因的5，前導(dǎo)序列，并且終止子來(lái)自黑曲霉的淀粉葡萄糖苷酶的編碼基因。將所得到曲霉屬表達(dá)構(gòu)建體pMStr77的磷脂酶編碼基因測(cè)序，序列與以前測(cè)定的FM0700的插入子完全一致。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Christensen,T.etal.,1988)用pMStr57轉(zhuǎn)化米曲霉菌抹BECh2(WO00/39322)。將轉(zhuǎn)化體在YP+2%G培養(yǎng)基中于30°C,275RPM搖動(dòng)培養(yǎng)，并用SDS-PAGE監(jiān)測(cè)FvPLA2的表達(dá)。發(fā)明者將含有從鑲片鐮孢來(lái)的磷脂酶編碼基因的大腸桿菌(Eschericiacoli)菌株才姿照Budapest條約的條款保藏，DeutsceSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen(DSMZ),MascheroderWeglb,D-38124Braunschweig,德國(guó)，貯存日期為2003年2月12日，登錄號(hào)為DSM15442。實(shí)施例5:FvPLA2的純化和序列比對(duì)將從實(shí)施例4發(fā)酵物的FvPLA2在SP-瓊脂糖柱上用離子交換層析純化，其中柱用50mM乙酸鹽緩沖液pH4.7平tf并用lMNaClpH4.7洗脫。級(jí)分用SDS-PAGE分析，將含有14kDa蛋白質(zhì)的級(jí)分混合。純的蛋白質(zhì)的同一性通過(guò)測(cè)定N-末端序列來(lái)確認(rèn)，其與SEQIDNO:16的氨基酸(aa)29-40序列相同。此外，由于從SDS-PAGE估計(jì)的表觀大小，14kDa,小于通過(guò)加工SEQIDNO:16中理i侖肽而預(yù)測(cè)的肽的大小，所以用質(zhì)譜分析判斷肽的質(zhì)量。發(fā)現(xiàn)純化的，激活的FvPLA2質(zhì)量為13336kDa。此分子質(zhì)量意味著在C-末端的另外的加工，并與SEQIDNO:16中氨基酸149和150間的斷裂一致，因?yàn)閺陌被?9到149的肽序列具有理論質(zhì)量13335,66Da。加工成熟的肽(SEQIDNO:16的氨基酸29-149)與已知序列的比對(duì)顯示最接近的本領(lǐng)域的以前序列是從UnisequenceID:VD0100C34翻譯的大麗花4侖支孢的磷脂酶，其中UnisequenceID:VD0100C34屬于COGEME植物致病真菌和OomyceteEST數(shù)據(jù)庫(kù)版本1.2(http:〃cogeme.ex.ac.uk/)(Soanesetal.(2002)Genomicsofphytopathogenicfungiandthedevelopmentofbioinformaticresources.MolPlantMicrobeInteract.15(5):421-7)。通過(guò)與發(fā)現(xiàn)的FvPLA2加工對(duì)比估計(jì)從大麗花輪支孢序列預(yù)測(cè)的部分肽的加工。計(jì)算SEQIDNO:16的氨基酸29-149與大麗花^"支孢磷脂酶成熟肽的估計(jì)序列的同源性為77%。實(shí)施例6:FvPLA2的物理特性催化活性對(duì)實(shí)施例4的FvPLA2用LEU實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定作為酶濃度函數(shù)的磷脂酶活性。結(jié)果如表l所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>溫度模式測(cè)定濃度5.3Mg/ml酶溶液的作為溫度函數(shù)的酶活性。其他條件同LEU實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>pH穩(wěn)定性將酶在30°C，特定pH用BrittonRobinson緩沖液稀釋30分鐘。進(jìn)一步用水稀釋后用LEU實(shí)驗(yàn)測(cè)定催化活性。結(jié)果如表3所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>熱穩(wěn)定性將酶在pH3和10時(shí)分別用BrittonRobinson緩沖液稀釋?zhuān)趐H7時(shí)用30%山梨醇稀釋。在特定溫度保溫30分鐘后，將溶液冷卻至反應(yīng)溫度并用LEU實(shí)驗(yàn)測(cè)定。結(jié)果如表4所示；活性表示為相對(duì)于最高測(cè)定的活性。表4.作為PH和溫度函數(shù)的相對(duì)活性(％)__<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>實(shí)施例7:用FvPLA2制作干酪用巴氏殺菌的，非均質(zhì)奶油(北卡羅來(lái)納州大學(xué)乳品廠)將五百克巴氏殺菌的，非均質(zhì)脫脂乳(北卡羅來(lái)納州大學(xué)乳品廠)標(biāo)準(zhǔn)化為3.5%脂肪因此生產(chǎn)全月旨mozzarella干酪。將每個(gè)實(shí)驗(yàn)用的干酪用乳或者用按照實(shí)施例5制備的鑲片鐮孢磷脂酶(FvPLA2),或者用商業(yè)磷脂酶Lecitase⑧10L(NovozymesA/S,Bagsvaerd,丹麥)處理，并放置在35。C水浴中直至平衡至該溫度。測(cè)量干酪用乳的起始pH并加入0.0P/o(w/w)引子培養(yǎng)物。監(jiān)測(cè)pH直至pH達(dá)到6.4。將250ju1凝乳酶(Novozym89L)用去離子水稀釋至9ml總?cè)芤?，將lml該溶液加入干酪用乳中并用力攪拌干酪用乳3分鐘。取出攪拌子并允許凝乳酶凝的乳品放置于35°C。上面的處理之后，當(dāng)將抹刀插入可以看見(jiàn)明顯的邊界時(shí)則凝乳準(zhǔn)備好被切割。干酪的切割通過(guò)^l巴刀壓下并且當(dāng)觸到杯(beaker)時(shí)快速轉(zhuǎn)刀具并最后將刀拔出進(jìn)行。允許凝乳放置5分鐘然后用匙輕輕攪動(dòng)。溫度升至4rc伴隨間斷的輕輕攪動(dòng)~45分鐘或直至pH降至60,5.9。將凝乳用干酪用粗棉布瀝干然后放回杯中并保持在41°C水浴中，根據(jù)需要倒出乳清。當(dāng)凝乳達(dá)到pH5.3時(shí)，將盛有凝乳的不銹鋼^5宛在69。C水浴中浸泡5分鐘然后用手4i伸(handstretched)。將凝乳在冷的冰水中回火30分鐘。將干酪凝乳用紙巾干燥，稱重并冷藏過(guò)夜。除了不加磷脂酶，對(duì)照干酪制作實(shí)驗(yàn)用同一批號(hào)乳品按照同樣程序進(jìn)行。實(shí)際干酪產(chǎn)量計(jì)算為拉伸后干酪的重量相對(duì)于干酪用乳總重量。濕度調(diào)節(jié)過(guò)的干酪產(chǎn)量表示為調(diào)節(jié)至標(biāo)準(zhǔn)恒定濕度水平的實(shí)際產(chǎn)量。調(diào)節(jié)過(guò)濕度的產(chǎn)量通過(guò)實(shí)際產(chǎn)量乘以實(shí)際濕度對(duì)標(biāo)準(zhǔn)濕度比來(lái)計(jì)算，并按照下面/^式Y(jié)adj=Yactx(l-Mact)/(l-Mstd)其中Yadj"周節(jié)過(guò)濕度的干酪產(chǎn)量，Yaet-實(shí)際干酪產(chǎn)量，Mact=實(shí)際濕度分?jǐn)?shù)&Mstd=標(biāo)準(zhǔn)濕度分?jǐn)?shù)((U8)所有實(shí)驗(yàn)和對(duì)照的調(diào)節(jié)過(guò)濕度的干酪產(chǎn)量如表5所示。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實(shí)施例8:用FvPLA2制作干酪將乳于72。C巴氏殺菌15秒，然后冷卻至l(TC以下。將乳用奶油標(biāo)準(zhǔn)化至2.4°/。脂肪。標(biāo)準(zhǔn)化后將乳在熱交換儀中于34.5。C的成熟前溫度預(yù)加熱。每個(gè)干酪缸中倒入150克乳并加入15克培養(yǎng)物(F-DVSST-M6)。將實(shí)施例5的^#脂酶以5LEU/g脂肪的劑量加入，并且將乳于34.5。C保溫1小時(shí)。加入凝乳酶(Chy-MaxPlus,200IMCU)并繼續(xù)攪動(dòng)不超過(guò)4分鐘。大約60分鐘后，當(dāng)斷定凝固物好了時(shí)將其用10mm刀切割。將攪拌子放回缸內(nèi)并在10分鐘后通過(guò)在30分鐘內(nèi)升溫至4rC起動(dòng)熱燹(scalding)。-當(dāng)達(dá)到4rC后繼續(xù)攪拌大約20分鐘直至達(dá)到0.15-0.16%的可滴定酸度。允許凝塊^:置在缸中，瀝干乳清。將凝塊切成均勻一致的塊，并將塊反轉(zhuǎn)(tum)并堆成2個(gè)一組。隨后，每間隔10分鐘，將凝塊反轉(zhuǎn)并堆成2個(gè)一組。在pH大約5.15-5.20時(shí)，將凝塊在碾磨機(jī)(millingmachine)上打磨。凝塊中加入2%鹽(重量/重量)。打磨后將所有凝塊加入含有70L預(yù)熱至74。C水的stretcher中。將大約20L熱水轉(zhuǎn)移到上面格子(chamber)中并加入干酪。當(dāng)凝塊溫度達(dá)到62。C時(shí)，終止拉伸并將凝塊移至擠壓機(jī)。將干酪擠壓成8-9個(gè)干酪塊，每個(gè)2.3kg，并在5-7。C水中冷卻20分鐘。將冷卻的干酪移至飽和鹽水中并在5-6'C腌漬1.5小時(shí)。鹽水的制作通過(guò)混合120公斤水，加入鹽至22Be,750克CaCl2(34。/。溶液)并調(diào)節(jié)至pH5.1。腌漬后將每塊干酪干燥大約30分鐘，并于真空包裝前稱重。在冷藏室貯存大約l周后，進(jìn)行樣品的pH和成分分析(濕度，鹽，脂肪和蛋白質(zhì))。將實(shí)際產(chǎn)量(AY)調(diào)節(jié)成干酪中濕度為48%。調(diào)節(jié)的產(chǎn)量(AdjYield)=AYxnOO—。/。濕度)100—48表6<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>實(shí)施例9:在米曲霉中米曲霉PLA2(AoPLA2)的it^達(dá)培養(yǎng)基llgMgS04.7H20lgKH2P042g檸檬酸，一水化物30g麥芽糊精6gK3P04.3H200.5g酵母提取物0.5ml痕量金屬溶液lmlPluronicPE6100(BASF,Ludwigshafen，德國(guó))將各成分混合于1升蒸餾水中并分裝在燒瓶中，每150ml部分加入250mgCaCO3。將培養(yǎng)基高壓滅菌。冷卻后向1升培養(yǎng)基中加入下列物質(zhì)23ml50%w/v(NH4)2HP04，過(guò)濾除菌33ml20。/。乳酸，過(guò)濾除菌疾量^4溶濕6.8gZnCl22.5gCuS045H200.24gNiCl26H2013.9gFeS047H208.45gMnS04H203g檸檬酸，一水化物將各成分混合在1升蒸餾水中。編碼米曲霉磷脂酶A2的cDNA的克隆和局部測(cè)序描述于WO00/56762?？寺。珹S3812的全長(zhǎng)序列，列于SEQIDNO:6。將此序列用于設(shè)計(jì)引物AoPLAl，其在從AS3812進(jìn)行PLA2編碼基因的PCR擴(kuò)增中與載體引物pYESrev—起使用，其有加于引物末端的合適的限制性位點(diǎn)以利于PCR產(chǎn)物的亞克隆。AoPLAl:TGAGGATCCATCATGAAGAACATCTTCGFvPLA2.2:gggcgtgaatgtaagcgtgac30使用ExtensorHi-FidelityPCRMasterMix(AB-gene，Surrey,U.K.)4要照生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并在前5個(gè)循環(huán)中使用52X:的退火溫度，后25個(gè)循環(huán)4吏用62。C的退火溫度，延伸時(shí)間1.5分^t。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將PCR片段用BamHI和XhoI限制性酶切并克隆到曲霉屬表達(dá)載體pMStr57中(實(shí)施例1中描述的)。將所得到曲霉屬表達(dá)構(gòu)建體pMStr71的磷脂酶編碼基因測(cè)序，序列與以前測(cè)定的AS3812的插入子完全一致。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(T.Christensen,etal,，1988)用pMStr71轉(zhuǎn)化米曲霉菌抹BECh2(WO00/39322)。將轉(zhuǎn)化體在DAP2C-1培養(yǎng)基中于37°C,270RPM搖動(dòng)培養(yǎng)，并且用SDS-PAGE監(jiān)測(cè)磷脂酶的表達(dá)。實(shí)施例10:加工肽的純化和測(cè)定將來(lái)自實(shí)施例9發(fā)酵物的米曲霉磷脂酶用購(gòu)自Pall公司(PallSeitzSchenkFiltersystemsGmbHPianigerStr.137D-55543BadKreuznach,Germany)的0.22nm除菌濾器Seitz-EKS過(guò)濾除菌。然后用稀乙酸調(diào)節(jié)無(wú)菌過(guò)濾的溶液至pH4.7。然后調(diào)節(jié)發(fā)酵物上清的離子強(qiáng)度以使鹽濃度降低并且離子強(qiáng)度在4mSi以下。使用購(gòu)自AmershamPharmaciaSP-sepharoseTMfastflow,通過(guò)陽(yáng)離子交換層析獲得目的PLA2蛋白的純化。用50mM乙酸鹽緩沖液pH4.7(緩沖液A)將陽(yáng)離子交換基質(zhì)在購(gòu)自AmershamPharmacia的XK26柱上填裝、洗滌和預(yù)平衡。然后將調(diào)節(jié)了pH和離子強(qiáng)度的含有目的PLA2的發(fā)酵物上清加在柱上。將未結(jié)合物質(zhì)用緩沖液A洗去，直至所有吸收UV物質(zhì)被洗去，其用附加于級(jí)分收集器裝置的紫外光檢測(cè)儀監(jiān)測(cè)。然后將結(jié)合的蛋白質(zhì)用緩沖液B線性鹽梯度洗脫，其中緩沖液B為在pH4.7的50mM乙酸鹽緩沖液含有1M氯化鈉的鹽。線性梯度達(dá)到1M鹽濃度的總體積大約是500ml(10倍柱體積)。在洗脫中每10ml收集為一個(gè)級(jí)分。用購(gòu)自Sigmachemicals的卯磷脂作底物測(cè)定所有級(jí)分的磷脂酶活性。與磷脂酶保溫時(shí)從卵磷脂釋放的脂肪酸用購(gòu)自Wacochemicals的NEFAC試劑盒檢測(cè)。用標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE技術(shù)檢查含有磷脂酶活性級(jí)分的蛋白質(zhì)純度。將含有顯示出分子量大約16kDa單一條帶的目的PLA2的級(jí)分混合，其中分子量的測(cè)定通過(guò)與購(gòu)自Amersham-Pharmacia的分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比。純的蛋白質(zhì)的同一性通過(guò)測(cè)定N-末端序列來(lái)確認(rèn)，其中與SEQIDNO:7的氨基酸(aa)37-45序列相同。此外，用質(zhì)譜分析判斷肽的質(zhì)量。純的活化的曲霉屬PLA2有兩種質(zhì)量，14114和14242Da。這些分子質(zhì)量意味著在C-末端的另外的加工，并與SEQIDNO:7中氨基酸121和122間的斷裂一致，因?yàn)閺陌被?7到121的肽序列具有理i侖質(zhì)量14114.11Da，和在氨基酸122和123間斷裂，預(yù)計(jì)從氨基酸37-123的肽序列理論質(zhì)量為14242.29Da。實(shí)施例11:源于米曲霉和Fusariumvenenatum不完全加工的磷脂酶的表達(dá)米曲霉PLA2(AoPLA2)和鑲片鐮孢PLA2(FvPLA2)在N-和C-末端兩端的加工發(fā)生在單個(gè)或多個(gè)基本殘基上(賴氨酸或精氨酸)，是經(jīng)常負(fù)責(zé)前肽加工的Kexin-樣成熟酶的典型斷裂位點(diǎn)(Jalving,R.，etal.(2000)Appl.Environ.Microbiol.66:363-368)。為了測(cè)定加工對(duì)AoPLA2和FvPLA2活性的影響，將酶在Kexin缺陷米曲霉株中表達(dá)。然后用SDS-PAGE評(píng)價(jià)加工，測(cè)定野生型和Kexin缺陷型本底(background)表達(dá)AoPLA2和FvPLA2的菌株培養(yǎng)物的磷脂酶活性。通過(guò)本領(lǐng)域建立的方法，例如WO98/12300和US6013452描述的破壞米曲霉的kexB基因(EMBL:AB056727)構(gòu)建Kexin缺陷的米曲霉菌抹(kexB—)。KexB的破壞通過(guò)Southern印跡分析和通過(guò)監(jiān)測(cè)已知由kexB負(fù)責(zé)其成熟的肽的表達(dá)確認(rèn)。將KexB—菌抹用實(shí)施例9描述的AoPLA2表達(dá)構(gòu)建體和實(shí)施例4描述的FvPLA2表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。將這些菌才朱，連同實(shí)施例9和4描述的kexB+的AoPLA2和FvPLA2表達(dá)菌抹在YP+2%G中于3(TC發(fā)酵，并用未轉(zhuǎn)化的菌抹作為對(duì)照。將AoPLA2表達(dá)菌株于200RPM搖動(dòng)培養(yǎng)4天，而將FvPLA2表達(dá)菌抹搖動(dòng)275RPM培養(yǎng)3天。用SDS-PAGE評(píng)價(jià)磷脂酶的表達(dá)和加工。SDS-PAGE分析中，分辨出AoPLA2在kexB+和kexB—的菌林中都為清晰的單一條帶。當(dāng)表達(dá)在kexB+菌株時(shí)，AoPLA2電泳在ca.l6kDa處，與前面觀察到的完全加工的AoPLA2(實(shí)施例10)遷移一致，而在kexB—菌抹，AoPLA2電泳在ca.27-28kDa處，與缺乏加工或不完全加工的一致。當(dāng)表達(dá)在kexB+菌株時(shí)，分辨出FvPLA2為表觀分子量17kDa和14kDa的兩條帶。14kDa條帶相應(yīng)于完全加工的肽(實(shí)施例5)，而17kDa肽是部分加工的形式。當(dāng)表達(dá)在kexB—菌抹時(shí)，F(xiàn)vPLA2泳在ca.l8-19kDa的單一條帶，大小與不完全加工的一致。來(lái)自未轉(zhuǎn)化的菌抹的任何對(duì)照樣品未觀察到相似條帶。相對(duì)的條帶強(qiáng)度表明AoPLA2在kexB-菌林中的表達(dá)是其在kexB+菌抹表達(dá)水平的1/5至1/10，而FvPLA2在kexB—菌抹中的表達(dá)與其在kexB+菌抹表達(dá)水平相同至1/2。用LEU實(shí)驗(yàn)判斷每種菌株產(chǎn)生的磷脂酶的活性并表示于表7。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><110>諾維信公司(NovozyraesA/S)<120>磷脂酶表達(dá)<130>10342.504-W0<騰16<170>Patentlnversion3.2序列表<210><211〉<212><213>1211PRTTuberborchii<■〉ValMet1LysAlaAlaAlalieAlaAlalielieLeuLeuMetGlylieLeuAlaAsn51015lie20SerAsnAlaGluVallieAlaGlu35ThrGinlieThrGluProThr5055ProValSerGluProAlaAlaLeuAsnLysArgGlyAspValProAspPheAsn45AspArgGlyAspValAlaGin40Pro25ThrAspGluThrAsnLeuSerThrAsplie6570GlyAspGluGlyGlyValPro75AspPheAspValGluThrGluAlaArgGly60Ala80SerPheAlaAlaSerSerValSerAlaAlaLeuSerProVal8590Ser95LysSerAspArgAla105AspThrAspArgLeuLeuTyrSerThrAlaMetProAlaPheLeuThrAla100105110CysCysAsn115LysAsnProGlyAsnLeuAspTrp120SerAsp125LysSerProAspArgProAlaGlyPheAsn130135PheLeu140Leu110AspAspGlySerCysLys145ArgHisAspPhe■ThrGluAlaAsnGly150Arg165LysTyrAsnGluCysAlaLysCys180TyrArgTyrArgAsnTyrLysLysGinHisArg155lieAspAspAsnPheLys170SerGlyLeuGluSerTrpPhe160LysAspLeu175Gly185Lys190GlyValAlaCysArgLyslieAlaAsnThrTyrTyrAsp195200GlyTrpLeu210AlaVal205ArgThrPhe〈210〉2〈211〉588<212>DNA〈213〉大麗花輪枝孢(Verticilliuffldahliae)<220>〈221>misc_feature<222>(25〉..(26)〈223>n為a，c，g,或t〈220><221>CDS〈222〉(72).,(587)<400〉2cagtttgaagtcccagcccctgctnntcctcctgcttctccccgtccagtctttgggatt60ttcctctcatcatgaagttcaacgcaattetcctggccetcgtgcctgcc110MetLysPheAsnAlalieLeuLeuAlaLeuValProAla1510gccctggetctgcccaccaccgacgaggcgcagacccccaagetcgccAlaLeuAlaLeuProThrThrAspGluAlaGinThrProLysLeuAla152025158gcgAla30cgcArgcagGinageSeratelieacgThr35gccAlagtcValThrgacAspagectgSerLeu40tecSerttcPhetecSerctgLeu45206acgThrctgLeucctProcagGinttcPhe50ThracgThrcgcArgcgcArgAsn55aaccgcAsnArgAsnProgccAla60254AsnetcgactggagetecgacggctgcacaacgtctcctgacaacccattcLeuAspTrpSerSerAspGlyCysThrThrSerProAspAsnProPhe657075302ggattcccctttgtgccggcctgccaccgccacgac"tttggctaccac350GlyPheProPheValProAlaCysHisArgHisAspPheGlyTyrHis808590aacttccgcgcccagacccgcttcaccgagageaacaagetccgcate398AsnPheArgAlaGinThrArgPheThrGluSerAsnLysLeuArglie95100105gacaaccagttcaggaccgatctgaggttccagtgccagtcttegage446AspAsnGinPheArgThrAspLeuArgPheGinCysGinSerSerSer110115120125gtgcgcggcgtgtgcaacgccctggcggacgtctactactctgccgtc494ValArgGlyValCysAsnAlaLeuAlaAspValTyrTyrSerAlaVal130135140egggcgUcggcggtgacgacgccacccccggcaagagggacgagcac542ArgAlaPheGlyGlyAspAspAlaThrProGlyLysArgAspGiuHis145150155tcggaaetcgtcggcatetacgacgagaaggtcggcatetacgata588SerGluLeuValGlylieTyrAspGluLysValGlylieTyrAsp160165170<210〉3<211〉172<212〉PRT<213〉大麗花輪枝孢(Verticilliumdahliae)〈400〉3MetLysPheAsnAlalieLeuLeuAlaLeuValProAlaAlaLeuAla151015LeuProThrThrAspGluAlaGinThrProLysLeuAlaAlaArgGin202530SerlieThrAlaValThrAspSerLeuSerPheSerLeuThrLeuPro354045GinPheThrThrArgArgAsnAsnArgAsnProAlaAsnLeuAspTrp505560SerSerAspGlyCysThrThrSerProAspAsnProPheGlyPhePro65707580PheValProAlaCysHisArgHisAspPheGlyTyrHisAsnPheArg859095AlaGinThrArgPheThrGluSerAsnLysLeuArglieA印AsnGin100105110PheArgThrAspLeuArgPheGinCysGinSerSerSerValArgGly115120125ValCysAsnAlaLeuAlaAspValTyrTyrSerAlaValArgAlaPhe130135140GlyGlyAspAspAlaThrProGlyLysArgAspGluHisSerGluLeu145150155160ValGlylieTyrAspGluLysValGlylieTyrA印165170<210>4<211>185<212>PRT<213>粗糙脈孢霉(Neurosporacrassa)<400>4MetLysPhePheSerAlaLeuAlaLeuSerSerLeuLeuProThrAla151015AlaTrpAlaTrpThrGlySerGluSerAspSerThrGlyAlaAspSer202530LeuPheArgArgAlaGluThrlieGinGinThrThrAspArgTyrLeu354045PheArglieThrLeuProGinPheThrAlaTyrArgAsnAlaArgSer505560ProAlaThrLeuAspTrpSerSerAspSerCysSerTyrSerProAsp65707580AsnProLeuGlyPheProPheSerProAlaCysAsnArgHisAspPhe859095GlyTyrArgAsnTyrLysAlaGinSerArgPheThrAspAsnAsnLys100105110LeuLyslieAspGlyAsnPheLysThrAspLeuTyrTyrGinCysAsp115120125ThrHisGlyTyrGlySerThrCysHisAlaLeuAlaAsnValTyrTyr130135140AlaAlaValArgGluPheGlyArgThrLysGlyGluLeuGinGluGlu145150155160TyrAspLeuLeuLeuAlaHisTyrAsnGluLeuValAlaGluAlalie165170175AlaLysGlyGluAspProLeuTyrTyr180185<210〉5<211〉169<212>PRT<213>Helicosporiumsp.<400>5Met1AlaAla10Ser15LysSerPheThrPheValValLeuAlaLeuLeuProPheSerSer5LeuThrlieProPhe20GluGlu35GlyThrLeuThrPheHisArg25AspThrLeu40GlyGlylieAlaSerArgAla30LeuPheSerThrProlieAla45GinPheGluAlaAlaArg50Ser65SerAspGlyPheLeuSerSerLysGinPheLysAsnArg100ThrAsp115AsnAlaGin55AsnProSerThrLeuAspTrp60AspCysSerSerSerProAspAspProPheGlyPhe70Asp75CysHisArgHisAspPheGly8590PheThrMetTyrThrArgAlaAlaCysLys130AlaProAsn105AsnGinCys120AlaValAla135TyrLysAlaArgAsnThrGluArglieSer125Asp80AsnTyrLys95AspThrAsn110AsnliePheAsplieTyrTyrGluAlaVal140145ThrPheGlySerLys150LysArgAlaAlaGluAlaLeuAlaAla155GinMetGluGluAsnValAlaLysAla165160<210〉6<211〉942<212〉隨<213>米曲霉(Aspergillusoryzae)<220〉<221>CDS〈222〉(61).,(726)〈400〉6cgcaagcatcacatctacttcttattgcctattctgtccgagtgctagccacttatcatcatgMet1LysAsn￡ttClieUcPhe5gttgccAlasetThrttgLeuGly10ctgLeuUcPhegccAlagC3AlagttVal15tcgSer60薦tctSergccAlattgLeuPro20t3caca3CCTyrThrThrcctProgtcVal25AsngacAspProa_tclie30tctSergetAla156LeuGingcaAla35cgcArggcgAlaThrThrtgcCys40tcgSergccAla33gLysgccAlaacgThr45gatAspAsnetcLeu204atettcaaggtctecatgaagaccttccagaaggcgcgcaaggccaag252liePheLysValSerMetLysThrPheGinLysAlaArgLysAlaLys505560aacccctecaagtgcaactggteateggacaactgctecaagteaccc300AsnProSerLysCysAsnTrpSerSerAspAsnCysSerLysSerPro65707580gataagcccgatggatacaacttcatecccagetgccaaagacacgat348AspLysProAspGlyTyrAsnPhelieProSerCysGinArgHisAsp859095ttcggctaceggaacacgaagaagcagaagcgcttcacaaaggccatg396PheGlyTyrArgAsnThrLysLysGinLysArgPheThrLysAlaMet100105110a^gaagcgcattgacgac犯cttcaagaaggatetctacaagtactgc444LysLysArglieAspAspAsnPheLysLysAspLeuTyrLysTyrCys115120125agecaaUctegggctggageteatggaagggagtggagtgccgtcgc492SerGinPheSerGlyTrpSerSerTrpLysGlyValGluCysArgArg130135140cttgcggatgtctactatactgetgtccgccactttggcaagcgtgat540LeuAiaAspValTyrTyrThrA〗aVa〗ArgHisPheGlyLysArgAsp145lbo155160gaagcgcUgagtttgaccctgaggttgagUcgagaagcgtgatgag588GluAlaLeuGluPheAspProGluValGluPheGluLysArgAspGlu165170175gtggccgatgtccagcctgacgaatttgataac"tttgacggttctgaa636ValAlaAspValGinProAspGluPheAspAsnPheAspGlySerGlu180185190gttgaccctgatategagggccaggtcattcccgaagttcttgaaga/t684ValAspProAsplieGluGlyGinVallieProGluValLeuGluAsp195200205gatggagtggatgtggagaacetcgacgatattgaaaacctg726AspGlyValAspValGluAsnLeuAspAsplieGluAsnLeu210215220taggttttcggcattggctctacactttgcaaatgggtcgtcataatccattggaagccg786gaggaggagggaaatcaaggcatcttttggttg"tcagtaactttgagtgcctagtttgtg846aattgttttttgaggttctatttgaattctgcttttgttcaatcttatagcttcctacgt906tgttgtcatttaaaaatggacaggagtatctgtgag942〈210〉7<211>222〈212>PRT<213>米曲霉(Aspergillusoryzae)<400〉7MetLysAsnliePheValAlaThrLeuGlyLeuPheAlaAlaValSer151015SerAlaLeuProTyrThrThrProValAsnAspAsnProlieSerAla202530LeuGinAlaArgAlaThrThrCysSerAlaLysAlaThrAspAsnLeu354045liePheLysValSerMetLysThrPhe5055GinLysAlaArgLysAlaLys60AsnProSerLysCysAsnTrpSerSerAspAsnCysSerLysSerPro65707580AspPheLeu145GlyLysProAspGlyTyrAsnPhelieProSerCysGinArgHisAsp859095TyrArgAsnThrLysL>ysGin100105ArglieAspAsp115AsnPheLys120SerGinPheSerGlyTrpSerSerTrp130135ThrAlaValAlaAspValTyrTyr150LysArgPheThrLysAlaMet110LysAspLeuTyrLysTyrCys125LysGlyValGluCysArgArg140ArgHisPheGlyLysArgAsp155160GluAlaLeuGluPheAspProGluVal165GluPheGluLysArgAspGlu170175ValAlaAspValGinProAsp180ValAspProAsplieGluGly195GluGin200PheAspAsnPheAspGlySerGlu185190VallieProGluValLeuGluAsp205AspGlyValAspValGluAsnLeuAsp210215AsplieGluAsnLeu220〈210〉8〈211〉249<212〉PRT<213>粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa〉〈400>8MetLysProPhePheLeulieSerLeuLeuValThrValPheMetSer151015LeuMetLeuAlaThrThrAlaGinProSerLeuProLeuAsnAsnArg202530ArgGluLeuAlaGluHisProProValLysGlyAsnProProAsnThr354045GlyTyrAlaLeuAspTrpCysLysTyrThrAlaGlyMetLeuPheGin505560TrpAspLeuProThrPhelieLysHisArgGluAlaAsnPheSerLeu65707580GlyArgLeuThrTrpAspTrpSerSerAspGlyCysThrHisValPro859095AspAsnProVaiGlyPheProPheLysProAlaCysGinArgHisAsp100105110PheGlyTyrArgAsnTyrGinValGinPheHisPheThrProArgAla115120125ArgTrpLyslieAspGluAsnPheLeuLysGluMet匕ysPheGinCys130135140lieGlyHisAsnliePheAsnAlaCysHisPheMetAlaHisValTyr145HisSerSerAsnLeu225TrpGluAspPro210AlaGlyProVal195TyrArgValArg165SerHis180PheAspLeuSerTyrAsn150ThrPheLysMetGlyMetGluGlu215LysCys230TyrMetAsp200LysValLysAsp185AlaThrGluGly170ThrAspLysGlu155HisGluGinTyrMetValAlaGluAlaGluAla235Tyr220MetArg205TyrAlaArg175160GluSer190GluSerAspAlaLeuAspGinArgGlyAlalie240AspLeuGinLysTyr245TrpAlaAlaPhe<210〉〈211〉<212>〈213〉9832DNATuberalbidum<220〉<221〉CDS<222〉(2)..(426)<220>〈221>CDS<222>(476)..(680)<400>aatgMet19gtcaagattgetgccattgtcetcetaatgggaattetagccaatValLyslieAlaAlalieValLeuLeuMetGlylieLeuAlaAsn5101549getgccgccatecctgtcagegagccagcagccctggcgaagcgtggaAlaAlaAlalieProValSerGluProAlaAlaLeuAlaLysArgGly20253097aacgetgaggtcattgetgaacaaactggtgatgtcccggatttcaacAsnAlaGluVallieAlaGluGinThrGlyAspValProAspPheAsn354045145actcaaattacaga_gccaactggggagggagaccgtggggatgtggtcThrGinlieThrGluProThrGlyGluGlyAspArgGlyAspValVal505560193gacgaaaccgatttgtecacggatattgtcccagagaccgaggetgetAspGluThrAspLeuSerThrAsplieValProGluThrGluAlaAla65707580241tecSerttcPhegccAlagetAlaagtSer85teaSerValtctSergcaAlagccAla90teaSerProgcaAlatctSergacAsp95Thr289gacAspaggArgcttLeuetcLeu100tacTyrteaSerThrtecSerMet105ProgccAlattcPhettgLeuactThr110getAla卿337cgcArgAsn朋gLys115AsnProggcGlyAsnttgLeu120g3CAsptggTrpageSergatAspAsp125ggaGlytgcCysageSer385aactecccggacaggcctgcagggtttaacttccttgactc426AsnSerProAspArgProAlaGlyPheAsnPheLeuAspSer130135140gtaagtcctccttcatttatgctatctacattcactaatattcgaacagctgcaag482Cys匕yscgtcacgacttcgggtaccgcaactacaagaagcagcgccgcttcaca530ArgHisAspPheGlyTyrArgAsnTyrLysLysGinArgArgPheThr145150155160gagcctaatcgcaagcgcattgatgacaatttcaagaaggacetatat578GluProAsnArgLysArglieAspAspAsnPheLysLysAspLeuTyr165170175aatgagtgcgccaagtactctggcetccaatectggaaaggtgttgcc626AsnGluCysAlaLysTyrSerGlyLeuGinSerTrpLysGlyValAla180185190tgccgcaaaategcgaacacttactacgatgetgtacgctecttcggt674CysArgLyslieAlaAsnThrTyrTyrAspAlaValArgSerPheGlylb5200205tggttgtaaatgtgcggaagagatatcaagtgggatcgaggaagaggatggtgaaa730TrpLeu210gagctgagaggtggatttctttaca/ttccgcaatggctactacagaagaactgtgctcct790caaatttaatctcatttttgtgtctatctatccactctagaa832<210〉10〈211〉210<212〉PRT<213〉Tuberalbidum<400〉10MetValLyslieAlaAlalieValLeuLeuMetGlylieLeuAlaAsn151015AlaAlaAlalieProValSerGluProAlaAlaLeuAlaLysArgGly202530AsnAlaGluVallieAlaGluGinThrGlyAspValProAspPheAsn354045ThrGinlieThrGluProThrGlyGluGlyAspArgGlyAspValVal505560AspGluThrAspLeuSerThrAsplieValProGluThrGluAlaAla65707580SerPheAlaAlaSerSerValSerAlaAlaSerProAlaSerAspThr859095AspArgLeuLeuTyrSerThrSerMetProAlaPheLeuThrAlaLys100105110ArgAsnLysAsnProGlyAsnLeuAspTrpSerAspAspGlyCysSer115120125AsnSerProAspArgProAlaGlyPheAsnPheLeuAspSerCysLys130135140ArgHisAspPheGlyTyrArgAsnTyrLysLysGinArgArgPheThr14515015516042GluProAsnArgLysArglieAspAspAsnPheLysLysAspLeuTyr165170175AsnGluCysAlaLysTyrSerGlyUuGinSerTrpLysGlyValAla180185190CysArgLyslieAlaAsnThrTyrTyrAspAlaVal八rgSerPheGly195200205TrpLeu210<210〉11<211〉961<212>陽(yáng)<213>Verticilliujntenerum<220〉<221>CDS〈222〉(5)..(628)<400〉11caacatgaagaccaccgetgttetctecetcgccatgetccaggccacc49MetLysThrThrAlaValLeuSerLeuAlaMetLeuGinAlaThr151015"tgggcctcgcccgtggccaagcgccagaacgacgtctecetcgtcgac97TrpAlaSerProValAlaLysArgGinAsnAspValSerLeuValAsp202530aactacatgttcggcatetcgctgcccaccttctecaaccaccactec145AsnTyrMetPheGlylieSerLeuProThrPheSerAsnHisHisSer354045aacaggaacccccctcgcctggactggaccaccgacggctgcacctcg193AsnArgAsnProProArgLeuAspTrpThr丁hrAspGlyCysThrSer505560tcgcccaacaacccgetcggcttccccttcctgcccgcctgccaccgc241SerProAsnAsnProLeuGlyPheProPheLeuProAlaCysHisArg657075cacgactttggctaccagaacttccgcatxcagagecgcttcacccag289HisAspPheGlyTyrGinAsnPheArglieGinSerArgPheThrGin80859095ageaacaagetccgcategacgacaagttcaaggaggateetctaccac337SerAsnLysLeuArglieAspAspLysPheLysGluAspLeuTyrHis100105110cagtgcgacggccactgggcctgggttgcctgcgetgccetcgccgag385GinCysAspGlyHisTrpAlaTrpValAlaCysAlaAlaLeuAlaGlu115120125gtctactacgccgccgtccgcgccttcggcggtggtgacgccaccccg433ValTyrTyrAlaAlaValArgAlaPheGlyGlyGlyAspAlaThrPro130135140ggacgcatgcacgtcgccgtcttcggccagacccaggccgagcacgac481GlyArgMetHisValAlaValPheGlyGinThrGinAlaGluHisAsp145150155gccetcgtctecatetacgaggagaagetcgcggcctacgaggetgcc529AlaLeuValSerlieTyrGluGluLysLeuAlaAlaTyrGluAlaAla160165170175gtcgccgaggccgaggcccgcggcgagateccccacgtcgaggagacc577<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><210>13<211>29<212〉DNA<213>人工的〈220><223〉TbPLAl引物<220><221〉misc—feature<222>(4).「(9)<223>BaraHI位點(diǎn)〈400>13caa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