專利名稱：：利用微生物酶改善煙葉膨脹梗絲品質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及煙葉梗絲處理
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說是利用微生物酶改善煙葉膨脹梗絲品質(zhì)的方法。技術(shù)背景隨著巻煙生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展，在主要原料煙絲中添加梗絲可顯著改善巻煙單支重量、吸阻、主流煙氣及感官質(zhì)量等，具體表現(xiàn)為巻煙單支重量、吸阻呈下降趨勢；同時(shí)可達(dá)到降低巻煙主流煙氣總粒相物、焦油和CO量的目的。因此，在巻煙原料中添加一定量梗絲己經(jīng)成為國內(nèi)外巻煙生產(chǎn)企業(yè)為進(jìn)一步提高巻煙品質(zhì)、降焦減害而普遍采用的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)之一。然而，由于梗絲自身的物理性狀與主要化學(xué)成分(主要是纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)、木質(zhì)素等)，導(dǎo)致添加梗絲的巻煙制品在吸食過程中表現(xiàn)出香氣量不足、勁頭下降及木質(zhì)味增加的缺陷，從而阻礙了梗絲在巻煙原料中的有效利用。所以，如何改善梗絲可用性、提高其應(yīng)用效果己經(jīng)成為長期困擾巻煙企業(yè)的技術(shù)難題。針對梗絲在巻煙原料應(yīng)用中存在的一系列問題，首先從生產(chǎn)工藝入手，即利用物理學(xué)原理改善梗絲物理性狀，增加梗絲細(xì)胞和組織空間結(jié)構(gòu)從而促進(jìn)巻煙在燃燒過程中的氧化反應(yīng)，減少了抽吸時(shí)的焦油及有害物質(zhì)釋出量，因此也就減少了每支煙的抽吸口數(shù)，進(jìn)而也大大降低了抽吸時(shí)巻煙焦油及有害物質(zhì)的攝入量。這一梗絲膨脹技術(shù)在一定程度上改善了梗絲的可用性。然而，梗絲的主要成分是纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)、木質(zhì)素。尤其是其中的木質(zhì)素在原始狀態(tài)下經(jīng)吸食過程中的高溫氧化會(huì)產(chǎn)生兒茶酚和垸基兒茶酚，這些熱解成分不但會(huì)產(chǎn)生澀口的不愉快感觀反應(yīng)，同時(shí)具有促癌活性，這一弊端又成為膨脹梗絲進(jìn)一步應(yīng)用的主要障礙。木質(zhì)素是結(jié)構(gòu)復(fù)雜、穩(wěn)定、多樣的無定形三維大分子。在自然界中廣泛存在參與降解木質(zhì)素的微生物種類，如真菌、放線菌和細(xì)菌。其中，真菌能把木質(zhì)素徹底降解為C02和水。為此，利用生物或生物酶技術(shù)適當(dāng)降解梗絲中細(xì)胞壁物質(zhì)，促進(jìn)其向香氣物質(zhì)(或前體)的轉(zhuǎn)化，從而改善梗絲在巻煙生產(chǎn)中的可用性已經(jīng)成為可能。木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有芳香族特性，其結(jié)構(gòu)單元為苯丙垸單體，通過醚鍵和碳-碳鍵連接的復(fù)雜的無定型高聚物。煙草中的木質(zhì)素主要由愈創(chuàng)木基丙烷單體和紫丁香基丙烷單體及對羥基苯丙烷單體所構(gòu)成。在木質(zhì)素生物降解過程中，氧化反應(yīng)占主要地位，同時(shí)需要還原反應(yīng)的輔助。主要包括以下五個(gè)方面的反應(yīng)1、木質(zhì)素化合物的Ca-Cp斷裂參與氧化反應(yīng)的有木質(zhì)素過氧化物酶(Ligninperoxidase,簡稱Lip)、錳過氧化物酶(Mn-d印endentperoxidase，簡稱MnP)、漆酶等酶類和活性氧。通過單電子轉(zhuǎn)移機(jī)制，LiP催化e-l非酚型木質(zhì)素模型化合物為其芳香正離子自由基，經(jīng)Ca-Ce斷裂形成3，4-二甲氧基苯乙醇自由基和質(zhì)子化形式的藜蘆醛。有氧存在時(shí)，前者加氧后再釋放超氧離子形成羰基，或形成醇；無氧存在時(shí)，則溶劑水參與而形成醇。2、藜蘆醇及其衍生物的氧化藜盧醇(VA)被木質(zhì)素過氧化物酶分解，主要產(chǎn)生藜戸醛(70%90%)，其次是開環(huán)產(chǎn)物(約20%)和醌(約10%)，產(chǎn)物的分布受pH值控制。因此可以說藜盧醇在木質(zhì)素降解中起著重要的作用。漆酶是一種含銅的酚氧化酶，它能催化酚型二聚體模型物e-i和e-o-4結(jié)構(gòu)等經(jīng)過Cci-芳烴斷裂，產(chǎn)生甲氧基取代的醌/氫醌。3、Ccr氧化機(jī)制LiP催化P-0-4木質(zhì)素模型化合物的主要反應(yīng)是，Cci-"斷裂形成的藜盧醛和2-甲氧基苯酚，后者在反應(yīng)條件下易于聚合，同時(shí)還有相當(dāng)一部分形成Ca氧化產(chǎn)物。這種氧化產(chǎn)物是正離子自由基中間體失去質(zhì)子或直接失去氫形成的。在活性氧存在時(shí)，后者更容易發(fā)生。4、氧的活化木質(zhì)素氧化的一種普遍現(xiàn)象是，分子氧與羥基取代的苯自由基間的反應(yīng)中，能引起氧的活化，氧被還原成超氧離子，又與質(zhì)子反應(yīng)生成^02與02，這個(gè)過程是發(fā)生在分子氧與苯基自由基中間體之間的純化學(xué)過程。這個(gè)反應(yīng)也出現(xiàn)在木質(zhì)素過氧化物酶的催化循環(huán)中，其結(jié)果是02成為最終的電子受體。5、醌、氫醌的形成漆酶是一種含銅的酚氧化酶，它能催化酚型二聚體模型物e-i和e-0-4結(jié)構(gòu)等經(jīng)過Cci-芳烴斷裂，產(chǎn)生甲氧基取代的醌/氫醌。漆酶催化木質(zhì)素氧化的機(jī)制漆酶在氧氣存在下，能催化苯酚氧化生成苯氧自由基，而且不需要HA參與，對于木質(zhì)素而言，其反應(yīng)包括脫甲氧基、脫羥基、C-C鍵斷裂過程等。根據(jù)這一基本原理，利用生物酶對煙葉梗絲中的木質(zhì)素進(jìn)行降解和還原，可產(chǎn)生一些香味化合物，如香蘭素、苯甲醇、l-苯基乙醇、2-苯基乙醇和其他芳香族化合物。其中，苯甲醇、1-苯基乙醇和2-苯基乙醇具有花香和水果香，可使煙氣柔和。目前，應(yīng)用酶制劑對煙葉和梗絲進(jìn)行處理以提高其質(zhì)量和可用性的報(bào)道和發(fā)明專利主要有廈門巻煙廠和仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院申請的發(fā)明專利(CN1955281)"—種復(fù)合酶制劑及將該復(fù)合酶制劑用于煙梗生產(chǎn)的工藝"，該方法可顯著降低雜氣(25-60%)、剌激性(20-50%)，香氣質(zhì)、香氣量及余味均有改善，然而其酶制劑組成主要為木質(zhì)素酶、果膠酶、纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶及脂酶；云南瑞升煙草技術(shù)(集團(tuán))有限公司發(fā)明專利(CN200610048647.7)"—種降低巻煙煙氣一氧化碳量的復(fù)合添加劑及其應(yīng)用"、"一種降低巻煙煙氣中有害成分的復(fù)合添加劑及其應(yīng)用"(CN200710065703.2)，其添加劑主要成分為煙草提取物、堿金屬鹽、過渡金屬氫氧化物等，這兩個(gè)復(fù)合添加劑主要針對一氧化碳、亞硝銨及稠環(huán)芳烴等有害成分。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用黑曲霉來自然合成LiP酶(鋰依賴過氧化物酶，Li-dependentperoxidase)、MnP酶(f孟依賴過氧化物酶，Mn-dependentperoxidase)禾卩漆酶(Lac)等木質(zhì)素降解酶及纖維素酶，經(jīng)過酶群提取純化及活性保護(hù)，改善煙葉膨脹梗絲品質(zhì)的方法。本發(fā)明的生物酶來源產(chǎn)酶菌株為保藏號CGMCC0571的黑曲霉。黑曲霉(Aspergillusniger)屬半知菌亞門真菌，該菌具有木質(zhì)素降解能力。由于黑曲霉在生長過程中不產(chǎn)生毒素，因此已被許多國家批準(zhǔn)作為食品用酶制劑生產(chǎn)菌，一些國家已實(shí)現(xiàn)黑曲霉制劑商品的工業(yè)化生產(chǎn)。黑曲酶對木質(zhì)素降解是LiP、MnP、漆酶、纖維素酶和半纖維素酶共同作用的結(jié)果。本發(fā)明的技術(shù)方案如下1、木質(zhì)素降解復(fù)合酶的制備1)黑曲霉的活化和培養(yǎng)黑曲霉菌種為保藏號CGMCC0571的黑曲霉，經(jīng)馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基活化培養(yǎng)后接入滅菌后的種子培養(yǎng)基中，于28'C、250rmin"下?lián)u床培養(yǎng)24h;按l(P/。接種量將種子液接入滅菌后的500ml搖瓶中(含產(chǎn)酶培養(yǎng)液100ml)，于25'C進(jìn)行產(chǎn)酶培養(yǎng)96小時(shí)后得發(fā)酵液；2)木質(zhì)素降解復(fù)合酶的提取發(fā)酵液經(jīng)濾紙過濾后，于1500rpm低速離心分離，上清液經(jīng)(NH4)2S04分段鹽析至飽和度為0.7得粗酶液，粗酶液經(jīng)超濾透析(截留分子量20150kD)后得木質(zhì)素降解復(fù)合酶，酶組分活性LiP350U/L;MnPllU/L;Lac5.6U/L;以上所述的種子培養(yǎng)基主要成分(g七—"葡萄糖50，KC10.2,KH2P040.15，MgSO4'7H2O0.12，(NH4)2HPO40.6，酵母膏3，蛋白胨2。以上所述的產(chǎn)酶培養(yǎng)基主要成分葡萄糖10g，酒石酸銨0.1g，MgSCV7H200.5g，KH2P04lg，Na2HPO40.2g，MnSO40.035g，CuS045H200.007g，加蒸餾水IOOOral。初始pH值自然，滅菌條件121°C，23min。2.酶活性測定木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)、錳過氧化物酶(MnP)、漆酶(Lac)活性測定采用畢鑫等的方法進(jìn)行(纖維素科學(xué)與技術(shù)，2002，10(4):41-48)。LiP酶一個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘氧化黎蘆醇產(chǎn)生lwmol黎蘆醛所需的酶量；MnP酶一個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘氧化酚紅產(chǎn)生l11mol產(chǎn)物所需的酶量；Lac酶一個(gè)活單位(U)定義為每小時(shí)600nm吸光度變化O.Ol所需的酶量。3.改善煙葉膨脹梗絲品質(zhì)的方法稱取膨脹梗絲巻煙用，分為兩份。在28。C左右，分別均勻噴施(膨脹梗絲量)0.20.4%木質(zhì)素降解復(fù)合酶液(蒸餾水稀釋)和蒸餾水，至含水率1921%;置密閉容器內(nèi)酶解9597小時(shí)；自然風(fēng)干至含水率12.5%-15%;以梗絲為單一原料巻煙后進(jìn)行二者的評吸鑒定，同時(shí)對兩種不同處理的梗絲進(jìn)行木質(zhì)素、纖維素等成分的化學(xué)分析。評吸結(jié)果表明，采用木質(zhì)素復(fù)合酶處理對煙葉品質(zhì)有較明顯改善，表現(xiàn)為勁頭、刺激性減弱，香氣質(zhì)、口感得到改善。纖維素、木質(zhì)素化學(xué)成為分析結(jié)果見下表。膨脹梗絲細(xì)胞壁物質(zhì)測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上表顯示，經(jīng)木質(zhì)素復(fù)合酶處理，樣品全纖維素含量有所上升，木質(zhì)素含量有所下降(降低11.4%)。纖維素含量的升高是因?yàn)樵诿柑幚磉^程中，隨著木質(zhì)素和非纖維素含量的減少導(dǎo)致全樣品量的減少，因此造成全纖維素所占比例增加。感觀評吸結(jié)果表明該復(fù)合酶制劑處理梗絲可有效降低其木質(zhì)素含量，促進(jìn)香氣物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，香氣質(zhì)和口感均得以改善。具體實(shí)施方式實(shí)施例l:1.生物酶來源產(chǎn)酶菌株為保藏號CGMCC0571的黑曲霉。2.黑曲霉的活化和培養(yǎng)黑曲霉菌種經(jīng)馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基活化培養(yǎng)后接入滅菌后的種子培養(yǎng)基中，于28°C、250r'min1下?lián)u床培養(yǎng)24h;按10%接種量將種子液接入滅菌后的500ml搖瓶中(含產(chǎn)酶培養(yǎng)液100ml)，于25'C進(jìn)行產(chǎn)酶培養(yǎng)96h后得發(fā)酵液。其中種子培養(yǎng)基主要成分(g丄—i):葡萄糖50，KC10.2,KH2PO40.15，MgS04.7H200.12，(NH4)2HPO40.6，酵母膏3，蛋白胨2。產(chǎn)酶培養(yǎng)基主要成分葡萄糖10g，酒石酸銨O.lg，MgS04.7H200.5g，KH2P04lg，Na2HPO40.2g，MnSO40.035g，CuS045H200.007g，加蒸餾水1000ml，初始pH值自然，滅菌條件121°C，23min。3.木質(zhì)素降解復(fù)合酶的提取發(fā)酵液經(jīng)濾紙過濾后，于1500rpm低速離心分離，上清液經(jīng)(NH4)2804分段鹽析至飽和度為0.7得粗酶液，粗酶液經(jīng)超濾透析(截留分子量20150kD)后得木質(zhì)素降解復(fù)合酶，酶組分活性LiP350U/L;MnPllU/L;Lac5.6U/L。4.酶活性測定-木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)、錳過氧化物酶(MnP)、漆酶(Lac)活性測定釆用畢鑫等的方法進(jìn)行(纖維素科學(xué)與技術(shù)，2002，10(4):41-48)。LiP酶一個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘氧化黎蘆醇產(chǎn)生1umol黎蘆醛所需的酶量；MnP酶一個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘氧化酚紅產(chǎn)生l!xmol產(chǎn)物所需的酶量；Lac酶一個(gè)活單位(U)定義為每小時(shí)600nm吸光度變化0.01所需的酶量。5.改善煙葉膨脹梗絲品質(zhì)取400g巻煙用膨脹梗絲在28'C左右，均勻噴施膨脹梗絲量0.20.4%的木質(zhì)素降解復(fù)合酶液(蒸餾水稀釋25倍后噴施)，置密閉容器內(nèi)在28。C土2酶解9597小時(shí)，自然風(fēng)干至含水率12.5%-15%即可。權(quán)利要求1.一種利用微生物酶改善煙葉膨脹梗絲品質(zhì)的方法，其特征在于以下步驟進(jìn)行1)生物酶的制備①黑曲霉菌種經(jīng)馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基活化培養(yǎng)后接入滅菌后的種子培養(yǎng)基中，于28℃、250r·min-1下?lián)u床培養(yǎng)24h；按10％接種量將種子液接入滅菌后的500ml搖瓶中，含產(chǎn)酶培養(yǎng)液100ml，于25℃進(jìn)行產(chǎn)酶培養(yǎng)96小時(shí)后得發(fā)酵液；②木質(zhì)素降解復(fù)合酶的提取發(fā)酵液經(jīng)濾紙過濾后，于1500rpm低速離心分離，上清液經(jīng)(NH4)2SO4分段鹽析至飽和度為0.7得粗酶液，粗酶液經(jīng)超濾透析后得木質(zhì)素降解復(fù)合酶，酶組分活性LiP350U/L；MnP11U/L；Lac5.6U/L2)改善煙葉膨脹梗絲品質(zhì)稱取卷煙用膨脹梗絲，在28℃±1℃，均勻噴施膨脹梗絲量0.2～0.4％的蒸餾水稀釋后的木質(zhì)素降解復(fù)合酶液，置密閉容器內(nèi)酶解95～97小時(shí)，自然風(fēng)干至含水率12.5％-15％。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用微生物酶改善煙葉膨脹梗絲品質(zhì)的方法，其特征在于種子培養(yǎng)基主要成分葡萄糖50，KC10.2,KH2P040.15，MgS04'7H200.12，(NH4)2HPO40.6，酵母膏3，蛋白胨2，以上單位均為g七一1。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用微生物酶改善煙葉膨脹梗絲品質(zhì)的方法，其特征在于產(chǎn)酶培養(yǎng)基主要成分萄糖10g，酒石酸銨0.1g，MgS04'7H200.5g，KH2P04lg，Na2HP040.2g，MnSO40.035g，CuS045H200.007g，加蒸餾水1000ral，初始pH值自然。全文摘要本發(fā)明是一種利用微生物酶改善煙葉膨脹梗絲品質(zhì)的方法。按以下步驟進(jìn)行1)生物酶的制備①黑曲霉菌種經(jīng)馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基活化培養(yǎng)后接入滅菌后的種子培養(yǎng)基中，于28℃、250r·min^-1下?lián)u床培養(yǎng)24h；按10％接種量將種子液接入滅菌后的500ml搖瓶中(含產(chǎn)酶培養(yǎng)液100ml)，于25℃進(jìn)行產(chǎn)酶培養(yǎng)96小時(shí)后得發(fā)酵液；②木質(zhì)素降解復(fù)合酶的提取發(fā)酵液經(jīng)濾紙過濾后，于1500rpm低速離心分離，上清液經(jīng)(NH4)₂SO₄分段鹽析至飽和度為0.7得粗酶液，粗酶液經(jīng)超濾透析后得木質(zhì)素降解復(fù)合酶，酶組分活性LiP350U/L；MnP11U/L；Lac5.6U/L；2)改善煙葉膨脹梗絲品質(zhì)稱取卷煙用膨脹梗絲，在28℃±1℃，均勻噴施膨脹梗絲量0.2～0.4％的蒸餾水稀釋后的木質(zhì)素降解復(fù)合酶液，置密閉容器內(nèi)酶解95～97小時(shí)，自然風(fēng)干至含水率12.5％-15％。感觀評吸結(jié)果表明該復(fù)合酶制劑可有效降低梗絲中木質(zhì)素含量，促進(jìn)香氣物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，香氣質(zhì)和口感均得以改善。文檔編號C12N9/02GK101288505SQ200810108379公開日2008年10月22日申請日期2008年6月6日優(yōu)先權(quán)日2007年12月6日發(fā)明者何寶玉,陳應(yīng)昆,偉韓申請人:云南萬芳生物技術(shù)有限公司