專利名稱：2-酮基-d-葡萄糖酸半連續(xù)發(fā)酵工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以葡萄糖或淀粉水解糖為原料發(fā)酵生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖 酸的半連續(xù)發(fā)酵工藝。
背景技術(shù)：
2-酮基-D-葡萄糖酸是生產(chǎn)D-異抗壞血酸及其鹽類的前體。根據(jù)公知 的間接發(fā)酵技術(shù)(如US 3， 381, 027 )可以將該化合物轉(zhuǎn)化為D-異抗壞血酸 及其鹽類(如D-異抗壞血酸鈉)。
2_酮基-D-葡萄糖酸的生產(chǎn)方法主要有酶法(如US 4, 351，902 )、化 學(xué)合成法(如US 6, 018, 034 )和發(fā)酵法(如US 3,255,093 )等3種。由于 生產(chǎn)成本方面的原因，目前在工業(yè)生產(chǎn)中均釆用細(xì)菌發(fā)酵的方法。
公知的2-酮基-D-葡萄糖酸發(fā)酵技術(shù)采用的是分批發(fā)酵或補(bǔ)料分批發(fā)
酵模式，其基本特征是分批次的。每完成一批次發(fā)酵后，需要對發(fā)酵罐進(jìn) 行清理和重新接種才能進(jìn)行下一批次發(fā)酵。在發(fā)酵轉(zhuǎn)化率上，現(xiàn)有的2-酮 基-D-葡萄糖酸發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)達(dá)到一定的水平；在發(fā)酵產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量上， 現(xiàn)有的2-酮基-D-葡萄糖酸發(fā)酵技術(shù)仍存在著一定欠缺，表現(xiàn)在發(fā)酵產(chǎn)率 較低， 一般只能達(dá)到4. Og/L/h左右，且產(chǎn)品質(zhì)量不夠穩(wěn)定。因此，開發(fā)產(chǎn) 物質(zhì)量穩(wěn)定、高產(chǎn)率的2-酮基-D-葡萄糖酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝是本發(fā)明的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明披露的是一種通過半連續(xù)發(fā)酵從葡萄糖或淀粉水解糖高產(chǎn)率發(fā) 酵生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸及其鹽類的方法。半連續(xù)發(fā)酵也稱重復(fù)補(bǔ)料分
批發(fā)酵，其典型特征是使用發(fā)酵液的一部分作為下一批次發(fā)酵的種子。本
發(fā)明可以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，能夠提高發(fā)酵產(chǎn)率，保證發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量的 穩(wěn)定，具有工藝操作簡便、設(shè)備利用率高、能源消耗低、易于實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)的 自動化等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明采取如下方法
(1) 在發(fā)酵容器中培養(yǎng)具有轉(zhuǎn)化葡萄糖為2-酮基-D-葡萄糖酸能力的
微生物。適用于本發(fā)明的微生物較多，它們分屬于假單胞菌屬
(Aww/咖o/7M)、歐文氏菌屬(Ar『i/7/a)、沙雷氏菌屬(5ferrs〃s)、葡萄 糖酸桿菌屬(^7〃c朋o&cz^r)、節(jié)桿菌屬(^YAroA2^e/")、產(chǎn)堿菌屬
U/c3/Z^/7")和醋酸桿菌屬(Jce"&"er)等。本發(fā)明主要釆用了熒 光假單胞菌(戶5"e〃^ yz ar7as /Vz/c^resce/^)和球狀節(jié)桿菌(J/^力ro&"er
(2) 向發(fā)酵容器中補(bǔ)給含有葡萄糖的培養(yǎng)基至發(fā)酵容器體積的60%至 85%(補(bǔ)料過程中發(fā)酵的最大瞬時稀釋率控制在大約0. Olh-'至大約0. 3h-\ 培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度在大約100g/L至大約250g/L)。
(3) 補(bǔ)料結(jié)束，從發(fā)酵容器中放出大約50%至大約的發(fā)酵液以回 收2-酮基-D-葡萄糖酸或其鹽(此時發(fā)酵液中的葡萄糖濃度應(yīng)低于2g/L)。
(4) 以發(fā)酵容器中剩余的發(fā)酵液為種子，進(jìn)行重復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵。 培養(yǎng)基中的碳源主要為葡萄糖，氮源主要為玉米漿。培養(yǎng)基中的葡萄
糖濃度可以在大約100g/L至大約250g/L之間，優(yōu)選的葡萄糖濃度為18% 左右；培養(yǎng)基的含氮量在大約0. 3g/L至大約2.0g/L之間，優(yōu)選的含氮量 在1.0g/L左右。補(bǔ)料過程中，發(fā)酵的最大瞬時稀釋率控制在大約0. Olh—
至大約0. 3 h—'。
本發(fā)酵方法可以在pH為大約4. 0至大約9. 0之間進(jìn)行，適宜的發(fā)酵
pH為5.0左右。發(fā)酵pH的控制過程中，可以采用輕質(zhì)碳酸鈣、碳酸鈉或 氫氧化鈉等作為中和劑。
本發(fā)酵方法可以在大約28。c至大約4rc的溫度下進(jìn)行，適宜的發(fā)酵溫
度為33。C左右。
本發(fā)酵方法需要在有氧條件下進(jìn)行，發(fā)酵過程中的通氣量大約為 0. 2v/v/ni (每分鐘每體積單位發(fā)酵液中的空氣體積)至2. Ov/v/m，適宜的 通氣量為0. 7v/v/m左右。
雖然本發(fā)明的發(fā)酵幾乎可以在常壓下進(jìn)行，但最好選擇在 0. 02MPa-0. 05MPa的壓力下進(jìn)行發(fā)酵。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
種子培養(yǎng)采用5L的自控發(fā)酵罐。將熒光假單胞菌K1005的菌懸液接入 2. OL含有2. 0%的葡萄糖、1. 0%的玉米漿、0. 2%的尿素、0. 2%的KH2PO" 0. 05% 的MgS04 . 7H20、 0. 25%的輕質(zhì)CaC03 (滅菌前pH 7. 0 )的種子培養(yǎng)基中，控 制攪拌轉(zhuǎn)速400rpm、罐溫33°C 、罐壓0. 030MPa、通氣量0. 5v/v/m培養(yǎng)20h。 半連續(xù)發(fā)酵釆用50L的自控發(fā)酵罐。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為16. 2%的淀 粉水解糖、1. 5%的玉米漿和4. 5。/。的輕質(zhì)CaC03 (滅菌前pH6. 7)。將前述培 養(yǎng)好的種液接入20L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制攪拌轉(zhuǎn)速400rpra、罐溫3rC、 罐壓0. 03謹(jǐn)Pa、通氣量0. 7v/v/m培養(yǎng)24h,然后以2. OL/h的補(bǔ)料速率流 加另外的20L發(fā)酵培養(yǎng)基。流加結(jié)束后，.快速放掉20L左右的發(fā)酵液，重 復(fù)以上的流加操作。如此重復(fù)5次，共耗時76h左右，生產(chǎn)2-酮基-D-葡 萄糖酸18805. 4g,發(fā)酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的濃度為161. 7g/L,發(fā)酵 液中殘留的葡萄糖平均為0.007%。根據(jù)上述結(jié)果計算，平均發(fā)酵轉(zhuǎn)化率 (mol/mo1)為89. 75%,平均發(fā)酵產(chǎn)率約為4. 95g/L/h。 實(shí)施例2
種子培養(yǎng)同實(shí)施例1。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為18. W的淀粉水解糖、1.5%的玉米漿和5. 0%的 輕質(zhì)CaC03 (滅菌前pH 6.7)。將種液接入20L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制攪拌 轉(zhuǎn)速4Q0rpm、罐溫33。C、罐壓0. 030MPa、通氣量1. Ov/v/m培養(yǎng)30h,然 后以2. OL/h的補(bǔ)料速率流加另外的20L發(fā)酵培養(yǎng)基。流加結(jié)東后，快速放 掉2dL左右的發(fā)酵液，重復(fù)以上的流加操作。如此重復(fù)5次，共耗時82h 左右，生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸21052. 6g，發(fā)酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸 的濃沒為178.4g/L，發(fā)酵液中殘留的葡萄糖平均為0.041%。根據(jù)上述結(jié)果 計算，平均發(fā)酵轉(zhuǎn)化率(mol/mol)為90.43%,平均發(fā)酵產(chǎn)率約為5. 13g/L/h。
實(shí)施例3
種子培養(yǎng)同實(shí)施例1。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成同實(shí)施例2。將種液接入20L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，控 制攪拌轉(zhuǎn)速400rpm、罐溫34°C 、罐壓0. 020MPa、通氣量1. Ov/v/m培養(yǎng)30h, 然后以2. 2L/h的補(bǔ)料速率流加另外的20L發(fā)酵培養(yǎng)基。流加結(jié)東后，快速 放掉20L左右的發(fā)酵液，重復(fù)以上的流加操作。如此重復(fù)5次，共耗時78h 左右，生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸20944. 9g,發(fā)酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸 的濃度為175.8g/L,發(fā)酵液中殘留的葡萄糖平均為0.103%。根據(jù)上述結(jié)果 計算，平均發(fā)酵轉(zhuǎn)化率(raol/mol)為89. 97%，平均發(fā)酵產(chǎn)率約為5. 37g/L/h。
實(shí)施例4
種子培養(yǎng)同實(shí)施例l,菌種為球狀節(jié)桿菌K1022。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為18.0%的淀粉水解糖和1.7%的玉米漿(滅菌前 pH4. 5,滅菌后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)至6. 4)。將種液接入20L的發(fā)酵培養(yǎng)基中， 控制攪拌轉(zhuǎn)速400rpm、罐溫35。C、罐壓0. G20MPa、通氣量1, Ov/v/m培養(yǎng) 30h(培養(yǎng)過程中用氫氧化鈉控制發(fā)酵液pH值為5. 3左右)，然后以2. 2L/h 的補(bǔ)料速率流加另外的20L發(fā)酵培養(yǎng)基。流加結(jié)束后，快速放掉20L左右 的發(fā)酵液，重復(fù)以上的流加操作。如此重復(fù)5次，共耗時78h左右，生產(chǎn) 2-酮基-D-葡萄糖酸20775. 2g,發(fā)酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的濃度為
173. 7g/L,發(fā)酵液中殘留的葡萄糖平均為0. 085%。根據(jù)上述結(jié)果計算，平 均發(fā)酵轉(zhuǎn)化率(mol/mol )為89. 24%,平均發(fā)酵產(chǎn)率約為5. 32g/L/h。 ^施例5
種子培養(yǎng)同實(shí)施例4。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成同實(shí)施例2。將種液接入12L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，控 制攪拌轉(zhuǎn)速400rpm、罐溫35。C、罐壓0. 020MPa、通氣量1. Ov/v/m培養(yǎng)30h， 然后以2. OL/h的補(bǔ)料速率流加另外的28L發(fā)酵培養(yǎng)基。流加結(jié)東后，快速 放掉28L左右的發(fā)酵液，重復(fù)以上的流加操作。如此重復(fù)5次，共耗時102h 左右，生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸25984. 5g,發(fā)酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸 的濃度為171.5g/L,發(fā)酵液中殘留的葡萄糖平均為0.111%。根據(jù)上述結(jié)果 計算，平均發(fā)酵轉(zhuǎn)化率(mol/mol )為88. 12%,平均發(fā)酵產(chǎn)率約為5. 10g/L/h。
實(shí)施例6
種子培養(yǎng)同實(shí)施例1。
起始發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為9. 0%的淀粉水解糖、1. 0%的玉米漿和2. 5% 的輕質(zhì)CaC03 (滅菌前pH 6.7)。補(bǔ)料培養(yǎng)基的組成為18. 0%的淀粉水解 糖、1.0%的玉米漿和5. 0y。的輕質(zhì)CaC()3 (滅菌前pH 6. 7)。將種液接入12L 的起始發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制攪拌轉(zhuǎn)速400rpm、罐溫35'C、罐壓0. 020MPa、 通氣量1. Ov/v/m培養(yǎng)24h,然后以2. OL/h的速率流加28L的補(bǔ)料培養(yǎng)基。 流加結(jié)束后，快速放掉28L左右的發(fā)酵液，重復(fù)以上的流加搡作。如此重 復(fù)5次，共耗時96h左右，生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸25491.8g,發(fā)酵液中 2-酮基-D-葡萄糖酸的濃度為168.8g/L,發(fā)酵液中殘留的葡萄糖平均為 0.009%。根據(jù)上述結(jié)果計算，平均發(fā)酵轉(zhuǎn)化率(mol/mol)為90.00%,平 均發(fā)酵產(chǎn)率約為5. 31g/L/h。
對照例1
種子培養(yǎng)同實(shí)施例1。
起始發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為9. 0%的淀粉水解糖、1. 0%的玉米漿和2. 5% 的輕質(zhì)CaC03 (滅菌前pH 6.7)。補(bǔ)料培養(yǎng)基的組成為18. 0%的淀粉水解
糖、1.0%的玉米漿和5. (T/。的輕質(zhì)CaC03 (滅菌前pH 6.7)。將種液接入12L 的起始發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制攪拌轉(zhuǎn)速400rpm、罐溫35。C、罐壓0. MOMPa、 通氣量1. Ov/v/m培養(yǎng)12h，然后以2. OL/h的速率流加28L的補(bǔ)料培養(yǎng)基。 流加結(jié)束后，繼續(xù)發(fā)酵至發(fā)酵液中的殘?zhí)菫?.1%以下。該發(fā)酵周期為29h, 生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸5905. 8g，發(fā)酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的濃度為 154二g/L,發(fā)酵液中殘留的葡萄糖平均為0.013%。根據(jù)上述結(jié)果計算，平 均發(fā)酵轉(zhuǎn)化率(mol/mo1)為89.54%,平均發(fā)酵產(chǎn)率約為4. 07g/L/h。 對照例2
種子培養(yǎng)同實(shí)施例4。
起始發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為11.65%的淀粉水解糖、2.45%的玉米漿和 8. 0%的輕質(zhì)CaC03 (滅菌前pH 6. 7 )。補(bǔ)料培養(yǎng)基的組成為30. 0%的淀粉水 解糖。將種液接入25L的起始發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制攪拌轉(zhuǎn)速400rpm、罐溫 35°C、罐壓O. 020MPa、通氣量1. Ov/v/m培養(yǎng)16h,然后以2. OL/h的速率 流加:l5L的補(bǔ)料培養(yǎng)基。流加結(jié)東后，繼續(xù)發(fā)酵至發(fā)酵液中的殘?zhí)菫?.1% 以下。該發(fā)酵周期為36h,生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸7160. 6g，發(fā)酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的濃度為179.1g/L,發(fā)酵液中殘留的葡萄糖平均為 0.003%。根據(jù)上述結(jié)果計算，平均發(fā)酵轉(zhuǎn)化率(mol/mol)為89. B%，平 均發(fā)酵產(chǎn)率約為3. 98g/L/h。
權(quán)利要求
1.一種由葡萄糖或淀粉水解糖高產(chǎn)率發(fā)酵生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸及其鹽類的方法，其特征是所述的方法是通過半連續(xù)發(fā)酵即重復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝實(shí)現(xiàn)的，所述方法包括如下步驟在所述發(fā)酵工藝的發(fā)酵容器中培養(yǎng)具有轉(zhuǎn)化葡萄糖為2-酮基-D-葡萄糖酸能力的微生物，向所述發(fā)酵工藝的發(fā)酵容器中補(bǔ)給含有葡萄糖的培養(yǎng)基至所述發(fā)酵工藝的發(fā)酵容器體積的60％至85％，在所述發(fā)酵工藝補(bǔ)料結(jié)束后，從所述發(fā)酵工藝的發(fā)酵容器中放出50％至95％的發(fā)酵液以回收2-酮基-D-葡萄糖酸或其鹽(此時發(fā)酵液中的葡萄糖濃度應(yīng)低于2g/L)，以所述發(fā)酵工藝的發(fā)酵容器中剩余的發(fā)酵液為種子，進(jìn)行重復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵。
2. 如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵工藝，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)液的一部分被用 作下一次發(fā)酵的種子培養(yǎng)液。
3. 如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵工藝，其特征是所述的發(fā)酵PH值控制在 4. 0至9. 0之間。
4. 如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵工藝，其特征是所述的發(fā)酵溫度控制在28。c至4rc之間。
5. 如權(quán)利要求l所述的發(fā)酵工藝，其特征是補(bǔ)料過程中發(fā)酵的最大瞬 時稀釋率控制在0. Olh-'至0. 3h、培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度應(yīng)控制在100g/L 至250g/L。
6. 如權(quán)利要求l所述的發(fā)酵工藝，其特征是從發(fā)酵容器排出用以回收 2-酮基-D-葡萄糖酸或其鹽的發(fā)酵液中的葡萄糖濃度應(yīng)低于2g/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種由葡萄糖或淀粉水解糖高產(chǎn)率發(fā)酵生產(chǎn)2-酮基-D-葡萄糖酸及其鹽類的方法，該方法是通過半連續(xù)發(fā)酵即重復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝實(shí)現(xiàn)的。該方法包括以下步驟在發(fā)酵容器中培養(yǎng)具有轉(zhuǎn)化葡萄糖為2-酮基-D-葡萄糖酸能力的微生物；向發(fā)酵容器中補(bǔ)給含有葡萄糖的培養(yǎng)基至所述發(fā)酵容器體積的60％至85％；補(bǔ)料結(jié)束后，從發(fā)酵容器中放出50％至95％的發(fā)酵液以回收2-酮基-D-葡萄糖酸或其鹽(此時發(fā)酵液中的葡萄糖濃度應(yīng)低于2g/L)；以發(fā)酵容器中剩余的發(fā)酵液為種子，進(jìn)行重復(fù)補(bǔ)料分批發(fā)酵。
文檔編號C12P7/40GK101348806SQ20081010705
公開日2009年1月21日 申請日期2008年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月4日
發(fā)明者彬 余, 余泗蓮, 劉敬澤, 強(qiáng) 周, 孫文敬, 李中兵, 楊曉軍, 轉(zhuǎn) 魏, 黃達(dá)明 申請人:江西省德興市百勤異Vc鈉有限公司;江蘇大學(xué);河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院