專利名稱：：具有毒殺松材線蟲活性的化合物及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一類具有毒殺松材線蟲活性的化合物及其應用，屬生物農(nóng)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：松材線蟲(Sw^a//2e/e"c/zz^j^/o;/2z7^)原產(chǎn)北美，是中國重要的外來入侵種(alieninvasivespecies),由它引起的松材線蟲病對中國森林構(gòu)成了嚴重的威脅。松材線蟲病又稱松樹萎蔫病，是由松材線蟲寄生在松樹體內(nèi)導致松樹木質(zhì)部組織細胞受到破壞，水分輸導受阻，呼吸作用加強，樹脂分泌減少直至最后停止，蒸騰作用減弱至松樹迅速死亡。松材線蟲病被稱為松樹的癌癥，是松樹的一種毀滅性病蟲害，通常感病后40天左右即可造成松樹枯死，35年可摧毀成片松林，被列為重要的危害性森林病害。中國大陸于1982年在南京中山陵的黑松上首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲病，當時僅在1省1市1區(qū)發(fā)生，發(fā)生面積200hm2，病死樹僅256株。在短短20多年的時間里，疫區(qū)范圍大大地擴大了。據(jù)國家林業(yè)局在2006年2月的報告，疫區(qū)發(fā)生省市為江蘇、浙江、安徽、江西、山東、湖北、湖南、廣東、重慶、云南、貴州等ll個省、直轄市的95個縣、區(qū)、市，2005年發(fā)生面積達7.7萬hm2，當年致死松樹154萬多株。松材線蟲病的迅速擴散漫延，給我國的森林資源及生態(tài)環(huán)境、自然景觀造成嚴重破壞，并對廣大適生區(qū)的森林構(gòu)成嚴重威脅。目前國內(nèi)外對松材線蟲尚無有效的藥劑及防治方法，一些對植物寄生根結(jié)線蟲和胞囊線蟲有效的生物制劑，對松材線蟲則根本沒有活性。尋找對松材線蟲有效的防治方法和藥劑，已經(jīng)迫在眉睫。在國內(nèi)外專利文獻報道中，均未涉及化合物CerebrosideA和CerebrosideB殺松材線蟲的活性報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種具有毒殺松材線蟲活性的化合物。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的具有毒殺松材線蟲活性的化合物，由擬青霉菌(P^cz7om;;cM)，采用固體發(fā)酵及提取分離的方法獲得；該化合物的結(jié)構(gòu)式為HOH2S式中R的結(jié)構(gòu)式如A或B所示oAR=B所述的化合物，其中，A式和B式的物化常數(shù)如下:分子式ESI-MSIR(Neat)vmax3279(br)，2955,2921,2851，1640，1534，AC41H75N09725，1467,1084cm'1BC4IH77N097273285(br),2955,2920，2851，1650，1542,1467，1079cm"本發(fā)明的化合物可應用于松材線蟲農(nóng)藥制劑。具體實施例方式本發(fā)明在微生物次生代謝產(chǎn)物活性化合物的高通量篩選基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了擬青霉菌(/^e"7om^")的大米發(fā)酵液具有殺松材線蟲活性，通過活性跟蹤，進一步分離純化，得到了具有殺線蟲活性的兩種化合物CerebrosideA和CerebrosideB。與專利文獻報道的其它類殺松材線蟲化合物相比，CerebrosideA具有很好的殺松材線蟲活性，而CerebrosideB具有弱的殺松材線蟲活性。本發(fā)明的生產(chǎn)菌株為擬青霉菌(尸ae"7omyc")，該菌已于2007年12月27日保藏在中國科學院微生物所，保藏號為AS6.34。本發(fā)明的具有毒殺松材線蟲活性的化合物是從生產(chǎn)菌株的固體發(fā)酵培養(yǎng)物中提取分離得到的化合物CerebrosideA和CerebrosideB，其結(jié)構(gòu)式為H，OHN'ROHOH在化合物CerebrosideA中，結(jié)構(gòu)式中的R為o2<化合物CerebrosideB中，結(jié)構(gòu)式中的R為o本發(fā)明的該類活性化合物的物化常數(shù)、氫譜和碳譜數(shù)據(jù)分別見表1和表l.化合物A和B的物化常數(shù)分子式ESI-MSIR(Neat)vmaxAC41H75N09BC41H77N097257273279(br),2955，2921,2851，1640,1534,1467,1084cm-13285(br),2955,2920,2851,1650,1542,1467,1079cm-'表2.化合物A和B的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)_^_positioni5Ha(mult.,>/hh)5cbla4.15,dd(10,5,2)69.7，CH2l卩3.71,dd(10，3.4)23.98,m54.6,CHB4.14,dd(10,5,2)69.7,CH23.72,dd(10，3.4)3.99，m54.6,CH<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發(fā)明的化合物在液體浸泡法的抗線蟲活性測試中，在處理時間為24小時，化合物A和B對松材線蟲的LCso分別為49.4pg/ml和543.8iig/ml?？梢娀衔顰具有很好的殺松材線蟲活性，而化合物B具有弱的殺松材線蟲活性。其中化合物A可單獨或組合用于制備農(nóng)藥制劑，化合物B也可組合用于制備農(nóng)藥制劑。因此，本發(fā)明的化合物可作為制備農(nóng)藥殺線劑應用。下面列舉實施例作詳細說明。實施例1化合物A和B的分離制備a)真菌擬青霉菌(Paec/fomyc^)的活化PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，水1000mL，制成試管斜面，挑取菌絲體接種于試管斜面上，25。C培養(yǎng)7天；b)真菌擬青霉菌(尸m"7o^;cm)的固體發(fā)酵培養(yǎng)大米培養(yǎng)基(制備過程為將100g大米和100mL水加入500mL三角瓶中，浸泡過夜，滅菌冷卻待用)。將制備好的菌懸液(孢子濃度為1x1C)S個/mL)5mL接種于大米培養(yǎng)基上，25。C培養(yǎng)40天；c)待發(fā)酵完畢，將乙酸乙酯加入三角瓶中提取三次，減壓蒸干有機溶劑，得到粗提物。d)將粗提物用石油醚-乙酸乙酯-甲醇體系進行減壓硅膠柱層析。e)在活性跟蹤指導下，將活性組分(乙酸乙酯甲醇=10:1)通過Sephdex-LH20分離，將活性餾份通過HPLC制備得到化合物A和B。實施例2采用液體浸泡法檢測本發(fā)明的化合物的抗線蟲活性的試驗1)試驗用藥劑將2mg供試樣品先溶于1OOpL有機試劑丙酮中，再用純水稀釋成2000pg/mL、200^g/mL和20;/g/mL濃度的供試藥液。2)松材線蟲的培養(yǎng)與制備在PDA平板培養(yǎng)基上接種灰霉即葡萄孢菌于25。C下培養(yǎng)4-5天，灰霉基本長滿平皿；將松材線蟲(Swwfl;/^/enc/n^;qy/o;/H7z^)接種到長滿灰霉的PDA平皿中，在25"C條件下培養(yǎng)1周；待線蟲將菌落吃完，用貝曼淺盤法收集線蟲(即將培養(yǎng)好線蟲的PDA培養(yǎng)基用解剖刀切成塊，放入8層紗布中，將紗布包好，放入帶膠管的直徑為20cm的漏斗中，加入無菌水，靜置后收集)；將收集到的線蟲液離心去上清，在顯微鏡下用無菌純水將線蟲液調(diào)整到合適的濃度，立即使用。3)試驗方法取100//L本發(fā)現(xiàn)的化合物藥液(濃度分別為2000^g/mL、200^g/mL禾口20/^g/mL)加入到24孔板中，再加入100/^L松材線蟲(30-50條)懸液，使供試樣品的最終濃度分別為1000pg/mL、100//g/mL和10^g/mL，待藥液和線蟲液混和均勻，將培養(yǎng)板放置于25。C的培養(yǎng)間中，于黑暗條件下培養(yǎng)24小時后在倒置顯微鏡下計數(shù)活、死線蟲數(shù)目。線蟲死亡率。/^死線蟲數(shù)/總線蟲數(shù)x100。/。將含5%丙酮的水溶液作為對照，實驗三次重復，取三次的死亡率計算出平均死亡率。4)試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>結(jié)果表明本發(fā)明的化合物A具有很好的殺松材線蟲活性，而化合物B具有弱的殺松材線蟲活性。其中化合物A可單獨或組合用于制備農(nóng)藥制劑，化合物B也可組合用于制備農(nóng)藥制劑。權(quán)利要求1、一種具有毒殺松材線蟲活性的化合物，由擬青霉菌(Paecilomyces)，采用固體發(fā)酵及提取分離的方法獲得；該化合物的結(jié)構(gòu)式為式中R的結(jié)構(gòu)式如A或B所示2、如權(quán)利要求1所述的化合物，其中，A式和B式的物化常數(shù)如下:分子式ESI-MSIR(Neat)vmaxAC41H75N09725BC41H77N097273279(br)，2955,2921，2851,1640，1534,1467,1084cm"3285(br)，2955,2920，2851，1650,1542,1467,1079cm-i3、權(quán)利要求l所述的化合物用作松材線蟲農(nóng)藥制劑的應用。全文摘要本發(fā)明涉及一種具有毒殺松材線蟲活性的化合物及其應用，該化合物，由生產(chǎn)菌株，采用固體發(fā)酵及提取分離的方法獲得。其生產(chǎn)菌株為擬青霉菌(Paecilomyces)，該菌已于2007年12月27日保藏在中國科學院微生物所，保藏號為AS6.34。本發(fā)明的該類活性化合物由CerebrosideA和CerebrosideB兩種化合物組成。本發(fā)明的該類化合物，能有效的毒殺松材線蟲，可單獨或組合制備毒殺松材線蟲農(nóng)藥的應用。文檔編號C12P13/02GK101481712SQ20081005578公開日2009年7月15日申請日期2008年1月9日優(yōu)先權(quán)日2008年1月9日發(fā)明者劉杏忠,劉述春,向梅春,張永剛,車永勝申請人:中國科學院微生物研究所