專利名稱：一類具有毒殺線蟲活性的化合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類具有毒殺線蟲活性的化合物及其應(yīng)用，屬微生物生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
線蟲危害嚴(yán)重，它不僅給人類和動(dòng)物帶來嚴(yán)重的疾病，而且每年給農(nóng)作物造成相當(dāng)于1044億美元的損失。目前對(duì)線蟲的防治仍然以化學(xué)防治為主，但由于化學(xué)殺線蟲劑多數(shù)是高毒、高殘留農(nóng)藥，對(duì)人蓄和環(huán)境造成嚴(yán)重的威脅。有的化學(xué)殺線蟲劑，如用作土壤熏蒸劑的溴甲烷類等，已經(jīng)在全球多數(shù)國(guó)家禁止使用或已經(jīng)規(guī)定使用的最后期限。隨著人們環(huán)境意識(shí)的增強(qiáng)，化學(xué)殺線劑的應(yīng)用受到限制，因此對(duì)線蟲的生防研究自然成為重點(diǎn)和焦點(diǎn)問題。在線蟲的生防研究中，目前已有直接利用菌體的第一代商品生防劑問世，并已有相當(dāng)范圍的大田應(yīng)用。由于這一代產(chǎn)品是活菌體，土壤存在著不同程度的抑菌作用，導(dǎo)致在不同國(guó)家不同土壤中試用的不穩(wěn)定性和不一致。這是活體生防制劑的共同通病，為克服這一難題，人們更加關(guān)注線蟲生防第二代產(chǎn)品的開發(fā)，即菌株次生代謝產(chǎn)物的研究與開發(fā)。
近30年的研究中，已從50多株菌中分離到90多種對(duì)線蟲有活性的化合物，其結(jié)構(gòu)類型多樣，主要有醌類、生物堿類、萜類、肽類、吡喃類、脂肪酸類和萘類等。但由于各種原因，在這些化合物中目前具有潛力開發(fā)成線蟲生防制劑的很少，因此加緊篩選獲得對(duì)線蟲有活性的物質(zhì)或組分，將其開發(fā)成生防制劑是一項(xiàng)具有重要意義。
5-甲基-3-呋喃羧酸是一種呋喃的羧酸衍生物，CAS No.21984-93-0，CA名稱3-Furancarboxylic acid，5-Methyl，分子式C6H6O3，分子量126.10，結(jié)構(gòu)式如下 5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮是一種呋喃類的衍生物，CASNo.14300-72-2，CA名稱2(5H)-Furanone，-5-hydroxy-3，5-dimethyl，分子式C6H8O3，分子量128.21，結(jié)構(gòu)式如下
國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)檢索表明，5-甲基-3-呋喃羧酸常被用作有機(jī)合成的前體，但未見有關(guān)活性和天然來源的報(bào)道，也未見5-甲基-3-呋喃羧酸和5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮用于制備殺線蟲制劑應(yīng)用的公開文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供5-甲基-3-呋喃羧酸和5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮及其在制備殺線蟲制劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明使用的真菌是毛頭鬼傘(Coprinus comatus LHA-7)，LHA-7菌株已于2003年5月26日保存于中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCCNo.0932。
毛頭鬼傘屬擔(dān)子菌，主要形態(tài)特征是子實(shí)體較大。菌蓋呈圓柱形，當(dāng)開傘后限快邊緣菌褶溶化成墨汁狀液體。菌蓋直徑3-5cm，高達(dá)9-11cm，表面褐色至淺褐色，并隨著菌蓋長(zhǎng)大而斷裂成較大型鱗片。菌肉白色。菌柄白色較細(xì)長(zhǎng)，圓柱形且向下漸粗，長(zhǎng)7-25cm，粗1-2cm，光滑，橢圓形12.5-16×7.5-9μm。具囊體，無色，棒狀頂部鈍圓24-60×10-12.3μm。菌絲無色，具明顯鎖狀聯(lián)合。
本發(fā)明將毛頭鬼傘(Coprinus comatus LHA-7)通過常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)，將發(fā)酵液低壓濃縮后，用甲醇提取。將甲醇提取物經(jīng)反復(fù)硅膠柱，氯仿/甲醇洗脫，得到本發(fā)明的化合物，化合物經(jīng)核磁共振波譜，質(zhì)譜，紅外光譜和紫外光譜確定為5-甲基-3-呋喃羧酸和5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮，結(jié)構(gòu)式依次為 5-甲基-3-呋喃羧酸5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮實(shí)驗(yàn)表明5-甲基-3-呋喃羧酸具有顯著的毒殺腐生線蟲和花生根結(jié)線蟲的活性，對(duì)腐生線蟲的ED50(半致死率)為125ppm(24hr)，ED90(90％致死率24hr)為500ppm。對(duì)花生根結(jié)線蟲的ED50(半致死率)為125ppm(24hr)，ED90(90％致死率24hr)為250ppm。5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮對(duì)腐生線蟲的ED50(半致死率)為250ppm(24hr)，ED90(90％致死率24hr)為500ppm。對(duì)花生根結(jié)線蟲的ED50(半致死率)為250ppm(24hr)，ED90(90％致死率24hr)為500ppm。
本發(fā)明將從Coprinus comatus LHA-7中用現(xiàn)有方法分離得到的5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮作為制備殺線蟲制劑的應(yīng)用。
本發(fā)明亦可將0.5mg5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮溶于二甲亞砜，再用Tween-20水溶液稀釋，得具殺線蟲活性物質(zhì)的乳濁液；乳濁液中，二甲亞砜的終濃度不超過3％，Tween-20的終濃度不超過0.3％；該乳濁液作為制備殺線蟲制劑的應(yīng)用。
本發(fā)明與現(xiàn)有的殺植物寄生線蟲藥相比，具有高效、低毒及低殘留等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明化合物的發(fā)酵生產(chǎn)方法1、將LHA-7的菌絲體接種到試管固體培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，20-30℃下培養(yǎng)4-8天，獲得試管種；2、將試管種接種到250ml三角瓶中(每瓶裝50ml)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1000ml，自然pH。培養(yǎng)溫度20-30℃；搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100-300rpm；培養(yǎng)時(shí)間4-12天。
3、將含菌絲的發(fā)酵液將發(fā)酵液低壓濃縮后，用甲醇反復(fù)溶解，把溶解物合并低壓濃縮后得甲醇提取物。用甲醇溶解提取物上樣，經(jīng)正相硅膠柱層析，氯仿反復(fù)洗脫?；钚愿櫃z測(cè)所分離到的組分，將具有活性的部分合并低壓濃縮，經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析，氯仿/甲醇洗脫，洗脫液經(jīng)活性檢測(cè)，活性部分經(jīng)TLC檢測(cè)(展開劑氯仿∶甲醇5∶1；硫酸顯色)，將只具有同一個(gè)單點(diǎn)的部位合并得到化合物5-甲基-3-呋喃羧酸和5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮。
本發(fā)明化合物對(duì)植物寄生線蟲的藥效試驗(yàn)1、試驗(yàn)用藥劑將化合物溶于少量二甲亞砜，用無菌蒸餾水稀釋為適用濃度，二甲亞砜的終濃度不超過3％。
將未接種的發(fā)酵培養(yǎng)基低壓濃縮后，用甲醇提取。將甲醇提取物濃縮后用二甲亞砜溶解，再用無菌蒸餾水稀釋為適用濃度作為對(duì)照。
2、制備試驗(yàn)用線蟲(1)制備Panagrellus redivivus線蟲將P.redivivus線蟲接種于燕麥片培養(yǎng)基上，于28℃下培養(yǎng)6天，凍于4℃冰箱備用。將所需線蟲用貝曼漏斗法洗出，置于5ml離心管內(nèi)，加5ml無菌水洗滌，瞬時(shí)離心，棄上清，重復(fù)5次得到潔凈供試線蟲。用無菌水將線蟲稀釋為含量為15條/μl的線蟲懸浮液。
(2)花生根結(jié)線蟲(Meloidogyne arenaria)的培養(yǎng)將溫室培養(yǎng)的帶有花生根結(jié)線蟲的蕃茄根用無菌水洗凈，用解剖針挑取根結(jié)線蟲的卵囊置于0.4M的KCl溶液中，在5ml離心管中依次用4ml無菌水(三次)、1ml無菌青-鏈霉素雙抗溶液、3ml 0.1％的NaClO溶液洗滌和消毒，每一步驟均通過短暫離心(8000轉(zhuǎn)30秒)除去上清液。洗滌好的蟲卵置于0.4M的ZnCl2溶液中孵化48小時(shí)，二齡幼蟲用移液器收集于1.5ml離心管，通過短暫離心(5000轉(zhuǎn)30秒)富集備用。
3、試驗(yàn)方法將本發(fā)明化合物稀釋為不同濃度供試藥液，將藥液200μl于20孔板中，加入活線蟲100-150條，置于25℃下，分別于4小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)在光學(xué)顯微鏡下檢查計(jì)算線蟲的死亡率。
鑒定死亡的方法為在處理板孔中加入1-5滴5％Nacl溶液，2分鐘后觀察，死蟲僵直，活蟲則卷曲或扭動(dòng)。
死亡率％＝(死亡線蟲數(shù)/(死亡線蟲數(shù)+存活線蟲數(shù)))×100％校正死亡率％＝樣品死亡率-對(duì)照死亡率實(shí)施例1化合物對(duì)線蟲的毒殺作用將0.5mg5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮溶于少量二甲亞砜，用無菌蒸餾水稀釋為500ppm溶液，二甲亞砜的終濃度不超過3％。
按上述試驗(yàn)方法進(jìn)行藥效試驗(yàn)。列表所示為校正死亡率。
表15-甲基-3-呋喃羧酸對(duì)P.redivivus線蟲的毒殺作用重復(fù)次數(shù) 4小時(shí) 12小時(shí)24小時(shí)135.3％ 81.1％100％243.7％ 82.8％100％352.1％ 98.3％100％結(jié)果表明，5-甲基-3-呋喃羧酸500ppm水溶液對(duì)P.redivivus線蟲的致死率在12小時(shí)達(dá)到80％以上，24小時(shí)達(dá)到100％。具有明顯的殺線蟲活性。
表2 5-甲基-3-呋喃羧酸對(duì)M.arenaria線蟲的毒殺作用重復(fù)次數(shù) 4小時(shí) 12小時(shí)24小時(shí)l40.7％ 90.7％100％248.8％ 93.5％100％353.6％ 88.9％100％結(jié)果表明，5-甲基-3-呋喃羧酸500ppm水溶液對(duì)M.arenaria線蟲的致死率在12小時(shí)達(dá)到90％以上，24小時(shí)達(dá)到100％。具有明顯的殺線蟲活性。
表3 5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮對(duì)P.redivivus線蟲的毒殺作用重復(fù)次數(shù) 4小時(shí) 12小時(shí) 24小時(shí)145.2％ 87.1％ 100％233.1％ 72.4％ 100％342.1％ 78.3％ 100％結(jié)果表明，5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮500ppm水溶液對(duì)P.redivivus線蟲的致死率在12小時(shí)達(dá)到70％以上，24小時(shí)達(dá)到100％。具有明顯的殺線蟲活性。
表4 5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮對(duì)M.arenaria線蟲的毒殺作用重復(fù)次數(shù) 4小時(shí) 12小時(shí)24小時(shí)152.1％ 91.1％100％255.4％ 92.5％100％352.2％ 91.0％100％結(jié)果表明，5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮500ppm水溶液對(duì)M.arenaria線蟲的致死率在12小時(shí)達(dá)到90％以上，24小時(shí)達(dá)到100％。具有明顯的殺線蟲活性。
實(shí)施例2化合物對(duì)線蟲的半致死率ED50實(shí)施例2方法同實(shí)施例1，不同之處為將2.5mg5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮溶于少量二甲亞砜，配制為1000ppm的水溶液，隨后倍半稀釋，測(cè)定ED50(半致死率)和ED90(90％致死率)，待測(cè)溶液中二甲亞砜的終濃度不超過3％。
表5 5-甲基-3-呋喃羧酸對(duì)P.redivivus線蟲的ED50和ED90濃度ppm4小時(shí) 12小時(shí)24小時(shí)1000 86.5％ 97.3％100％50078.8％ 92.1％100％25067.9％ 75.4％89.6％12545.8％ 60.7％83.4％60 9.34％ 11.3％18.2％30 7.90％ 15.6％17.6％15 6.86％ 10.8％17.3％表6 5-甲基-3-呋喃羧酸對(duì)M.arenaria線蟲的ED50和ED90濃度ppm4小時(shí) 12小時(shí)24小時(shí)1000 81.7％ 97.7％100％50068.6％ 87.8％100％25051.5％ 86.5％98.8％
125 23.5％ 45.7％ 64.2％6021.6％ 31.3％ 45.5％3011.7％ 12.8％ 20.9％1510.7％ 13.5％ 15.6％結(jié)果表明，5-甲基-3-呋喃羧酸對(duì)M.arenaria線蟲的ED50(半致死率，24hr)為125ppm，ED90(90％致死率，24hr)為250ppm。
表7 5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮對(duì)P.redivivus線蟲的ED50和ED90濃度ppm 4小時(shí) 12小時(shí)24小時(shí)1000 71.2％ 89.4％100％500 60.8％ 76.6％100％250 47.2％ 55.4％72.1％125 33.3％ 40.7％46.9％6011.2％ 12.1％27.6％309.08％ 15.6％19.5％1510.1％ 12.55 18.7％結(jié)果表明，5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮對(duì)P.redivivus線蟲的ED50(半致死率，24hr)為250ppm，ED90(90％致死率，24hr)為500pm。
表8 5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮對(duì)M.arenaria線蟲的ED50和ED90濃度ppm4小時(shí) 12小時(shí)24小時(shí)1000 76.5％ 97.3％100％50072.1％ 82.1％100％25065.8％ 65.4％70.8％12534.8％ 47.7％49.4％60 19.2％ 28.3％33.9％30 11.9％ 16.6％28.9％15 11.2％ 10.8％17.3％結(jié)果表明，5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮對(duì)M.arenaria線蟲的ED50(半致死率，24hr)為250ppm，ED90(90％致死率，24hr)為500ppm。
實(shí)施例3化合物與乳化劑混合對(duì)線蟲的毒殺作用實(shí)施例3方法同實(shí)施例1，不同之處為將0.5mg5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮溶于二甲亞砜，再用0.3％濃度的Tween-20水溶液稀釋，稀釋濃度為500ppm，得具殺線蟲活性物質(zhì)的乳濁液。在該乳濁液中，二甲亞砜的終濃度不超過3％，Tween-20的終濃度不超過0.3％。
表9 5-甲基-3-呋喃羧酸乳化制劑對(duì)P.redivivus線蟲的毒殺作用重復(fù)次數(shù)4小時(shí) 12小時(shí) 24小時(shí)1 52.5％ 99.8％ 100％2 62.4％ 98.4％ 100％3 58.6％ 97.8％ 100％結(jié)果表明，5-甲基-3-呋喃羧酸與乳化劑混合后可以提高毒殺P.redivivus線蟲活性，提高率為12-20％。
表10 5-甲基-3-呋喃羧酸乳化制劑對(duì)M.arenaria線蟲的毒殺作用重復(fù)次數(shù)4小時(shí) 12小時(shí) 24小時(shí)1 61.3％ 99.0％ 100％2 62.4％ 98.7％ 100％3 65.8％ 96.7％ 100％結(jié)果表明，5-甲基-3-呋喃羧酸與乳化劑混合后可以提高毒殺M.arenaria線蟲活性，提高率為7-10％。
表11 5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮乳化制劑對(duì)P.redivivus的毒殺作用重復(fù)次數(shù)4小時(shí) 12小時(shí) 24小時(shí)1 51.382.41002 52.291.21003 57.680.7100結(jié)果表明，5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮與乳化劑混合后可以提高毒殺P.redivivus線蟲活性，提高率為7-10％。
表12 5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮乳化制劑對(duì)M.arenaria的毒殺作用重復(fù)次數(shù)4小時(shí) 12小時(shí) 24小時(shí)1 72.398.51002 65.291.21003 68.495.8100結(jié)果表明，5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮與乳化劑混合后可以提高毒殺M.arenaria線蟲活性，提高率為4-6％。
權(quán)利要求
1.一類具有毒殺線蟲活性的化合物，由生產(chǎn)菌株和輔料經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)、甲醇提取、反復(fù)硅膠柱及氯仿/甲醇洗脫工序后分離得到，其特征在于(1)生產(chǎn)菌株為毛頭鬼傘(Coprinus comatus LHA-7)，LHA-7菌株已于2003年5月26日保存于中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCCNo.0932；(2)分離得到的化合物經(jīng)核磁共振波譜，質(zhì)譜，紅外光譜和紫外光譜確定為5-甲基-3-呋喃羧酸和5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮，結(jié)構(gòu)式依次為
2.權(quán)利要求1所說的化合物，其特征在于(1)5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮作為制備殺線蟲制劑的應(yīng)用；(2)將0.5mg5-甲基-3-呋喃羧酸或5-羥基-3，5-二甲基-2(5H)呋喃酮溶于二甲亞砜，再用Tween-20水溶液稀釋，得具殺線蟲活性物質(zhì)的乳濁液；乳濁液中，二甲亞砜的終濃度不超過3％，Tween-20的終濃度不超過0.3％；該乳濁液作為制備殺線蟲制劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類具有毒殺線蟲活性的化合物及其應(yīng)用，屬微生物生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明由毛頭鬼傘(Coprinus comatus)LHA－7菌株和輔料經(jīng)常規(guī)工序后分離得到5－甲基－3－呋喃羧酸和5－羥基－3，5－二甲基－2(5H)呋喃酮。5－甲基－3－呋喃羧酸具有顯著的毒殺線蟲活性，對(duì)腐生線蟲的ED
文檔編號(hào)C12P17/02GK1631885SQ20041004079
公開日2005年6月29日 申請(qǐng)日期2004年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月30日
發(fā)明者劉亞君, 張克勤 申請(qǐng)人:云南大學(xué)