專利名稱：一種添加脯氨酸促進(jìn)丙酮酸過量積累的方法
一種添加脯氨酸促進(jìn)丙酮酸過量積累的方法技術(shù)領(lǐng)域一種添加脯氨酸促進(jìn)丙酮酸過量積累的方法，屬于定向改變和優(yōu)化微生物 代謝功能、優(yōu)化發(fā)酵過程技術(shù)領(lǐng)域。 技術(shù)背景丙酮酸是多種氨基酸、維生素及其它有用物質(zhì)的重要前體，在化工、制藥 及農(nóng)用化學(xué)品工業(yè)中有著廣泛的用途，因價格昂貴，故推廣應(yīng)用受到限制。丙酮酸是一種十分重要的有機(jī)化工中間體，主要應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥和曰化 工業(yè)，近年來丙酮酸的開發(fā)應(yīng)用已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。丙酮酸在醫(yī)藥工業(yè)中被用于合成治療高血壓新藥血管緊張肽n抗藥、系列蛋白酶抑制劑、鎮(zhèn)靜劑、消炎陣痛藥辛可芬、抗結(jié)核藥異煙肼丙酮酸鈣、解熱藥2-苯基喹啉-4-羧酸、驅(qū) 蟲藥恩波吡維胺、藥物磷酸烯醇丙酮酸、4-甲唑甲酸、抗病毒劑氮雜喹喔啉以及 噻咪唑藥物等。值得一提的是，丙酮酸在人體檸檬酸循環(huán)和合成氨基酸及其糖 類中是重要的中間體，可以使脂肪代謝率達(dá)到48%，對人體安全性高，因此近 年來國外發(fā)達(dá)國家利用丙酮酸這一特性，以其鈣鹽作為減肥保健藥品。國外有 關(guān)媒體已經(jīng)報道，含有丙酮酸鈣的減肥藥已經(jīng)風(fēng)靡全球，成為減肥藥市場上的 新寵。在丙酮酸的發(fā)酵過程中，為了維持發(fā)酵體系pH處于最適范圍而流加一定量 的NaOH等堿性物質(zhì)，且隨著NaOH等的添加，發(fā)酵液的滲透壓不斷升高，導(dǎo) 致細(xì)胞凋亡和積累丙酮酸能力的下降，最終影響有機(jī)酸生產(chǎn)效率。本發(fā)明通過研究脯氨酸對高滲條件下酵母細(xì)胞的保護(hù)作用，提出針對性更 強(qiáng)的發(fā)酵過程優(yōu)化策略。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種添加脯氨酸促進(jìn)丙酮酸過量積累的方法，添加脯 氨酸作為滲透相容性物質(zhì)實(shí)現(xiàn)丙酮酸過量積累，利用本發(fā)明能提高丙酮酸發(fā)酵 的產(chǎn)量、生產(chǎn)強(qiáng)度和得率。本發(fā)明的技術(shù)方案 一種添加脯氨酸促進(jìn)丙酮酸過量積累的方法，其特征是利用多重維生素營養(yǎng)缺陷型的光滑球擬酵母(T. g/"6rato)CCTCC M202019為 生產(chǎn)菌株，當(dāng)發(fā)酵過程中丙酮酸鈉濃虔達(dá)到0.4mol/L時，向培養(yǎng)基中添加脯氨 酸，使培養(yǎng)基中脯氨酸濃度達(dá)到lg/L，脯氨酸作為滲透相容性物質(zhì)保護(hù)光滑球 擬酵母細(xì)胞，促進(jìn)CCTCCM202019合成丙酮酸。 1、菌株光滑球擬酵母( :g/a6rato)CCTCCM202019為煙酸(NA)、生物素(Bio)、硫 胺素(BO和吡哆醇(Pdx)四種維生素營養(yǎng)缺陷型，且丙酮酸脫羧酶活性組成型降 低，為本研究室選育的菌株，該菌種已申請中國專利，專利號為02113142.2。2、 培養(yǎng)基種子和斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖30，蛋白胨10，磷酸二氫鉀1，七水硫 酸鎂0.5;瓊脂20 (斜面培養(yǎng)基)，pH5.5?；景l(fā)酵培養(yǎng)基(L):葡萄糖100g， NH4S04 7 g,乙酸鈉6g， KC1 5 g， KH2P045 g， Mg2S047H20 0,8 g， pH5.5。3、 培養(yǎng)斜面培養(yǎng)30°C 、 200rpm下培養(yǎng)24h;搖瓶培養(yǎng)將種子以10%的接種量轉(zhuǎn)入基本發(fā)酵培養(yǎng)基于30°C、 200 rpm 條件下培養(yǎng)24h，按實(shí)驗(yàn)要求添加不同濃度的煙酸、生物素、硫胺素和吡哆醇。發(fā)酵培養(yǎng)最后在71^發(fā)酵罐中進(jìn)^1發(fā)酵，發(fā)酵條件為pH5.5，攪拌轉(zhuǎn)速 400rpm，通氣速率l.Ovvm。細(xì)胞干重的測定取一定量的菌懸液置于10 mL容量瓶中，加2 mL鹽酸 溶解菌懸液中的碳酸鈣，加入去離子水定容至10 mL，搖勻，用UV 7500型可 見分光光度計(jì)，于660nm處比色測OD值，用細(xì)胞干重標(biāo)準(zhǔn)曲線算得細(xì)胞干重。丙酮酸濃度的測定高效液相色譜(HPLC)儀器Agilent 1100高效液相色譜儀(配紫外可見檢測器、視差折光檢測器 和工作站)， 色譜條件色譜柱C18柱，5 [xm， 4.6 mm x250 mm流動相0.1%H3PO4流速1 mIVmin柱溫28 °C 進(jìn)樣量10 pL紫外檢測器波長210 nm樣品制備5mL發(fā)酵液在10000 rpm下離心10min，取上清液移入試管中 以備測丙酮酸時用。測丙酮酸時，取l mL上清液移入50mL容量瓶中，去離 子水定容至刻線，經(jīng)0.45 pm濾膜過濾后，濾液供液相色譜分析用。本發(fā)明的有益效果脯氨酸并不是作為營養(yǎng)成分促進(jìn)了光滑球擬酵母的生 長，而是脯氨酸可以作為滲透相容性物質(zhì)保護(hù)光滑球擬酵母細(xì)胞。本發(fā)明采用 向培養(yǎng)基中添加1,0g/L脯氨酸后使(1)發(fā)酵時間由72h縮短到64h; (2)丙酮 酸產(chǎn)量從68.0 g提高到71.7 g，生產(chǎn)強(qiáng)度從0.944 g/L/h提高到1.12 g/L/h。促使 丙酮酸發(fā)酵周期縮短8h,丙酮酸產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高5.4%和18.6%。這一研究結(jié)果可應(yīng)用于有機(jī)酸發(fā)酵等其他典型工業(yè)生物的過程，為工業(yè)生物技術(shù)特別是發(fā)酵過程優(yōu)化提供新的技術(shù)思路。
具體實(shí)施方式
對照實(shí)施例本發(fā)明^f用菌種為光滑球擬酵母(7bnJo戸^ g/"6rato)CCTCC M202019，先轉(zhuǎn)斜面在30。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)24 h，溫度30 °C，轉(zhuǎn)速200rpm，最后在7L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵72 h，發(fā)酵條件為pH5.5，攪拌 轉(zhuǎn)速400rpm，通氣速率l.Ovvm。發(fā)酵培養(yǎng)基為(L):葡萄糖100g， NH4S04 7 g,乙酸鈉6g， KC15g， KH2P045g， Mg2S04'7H20 0.8 g，維生素溶液10mL， 微量元素溶液10mL， pH5.5。丙酮酸的得率為0.60g/g，產(chǎn)量為68.0g/L。所用維生素液組成為煙酸80mg，硫胺素0.15mg，吡哆醇40 mg，生物 素4mg，核黃素10mg，自來水定容至1L。所用微量元素液組成為:CaCl2*2H20 2 g， FeS04'7恥2 g， ZnCl2 0.5 g， MnCl2'41120 12 g， CuS04*5H20 0.05 g， 2 mol/L HC1溶解后定容至1 L。實(shí)施例當(dāng)丙酮酸鈉濃度達(dá)到0.4mol/L時，向培養(yǎng)基中添加脯氨酸，使培 養(yǎng)基中脯氨酸濃度達(dá)到lg/L。其余發(fā)酵條件同對照實(shí)施例，發(fā)酵時間64 h，丙 酮酸得率為0.61 g/g，產(chǎn)量為71.2 g/L
權(quán)利要求
1、一種添加脯氨酸促進(jìn)丙酮酸過量積累的方法，其特征是利用多重維生素營養(yǎng)缺陷型的光滑球擬酵母(T.glabrata)CCTCC M202019為生產(chǎn)菌株，當(dāng)發(fā)酵過程中丙酮酸鈉濃度達(dá)到0.4mol/L時，向培養(yǎng)基中添加脯氨酸，使培養(yǎng)基中脯氨酸濃度達(dá)到1g/L，脯氨酸作為滲透相容性物質(zhì)保護(hù)光滑球擬酵母細(xì)胞，促進(jìn)CCTCC M202019合成丙酮酸。
全文摘要
一種添加脯氨酸促進(jìn)丙酮酸過量積累的方法，屬于定向改變和優(yōu)化微生物代謝功能、優(yōu)化發(fā)酵過程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用多重維生素營養(yǎng)缺陷型的光滑球擬酵母(T.glabrata)CCTCC M202019為生產(chǎn)菌株，當(dāng)發(fā)酵過程中丙酮酸鈉濃度達(dá)到0.4mol/L時，向培養(yǎng)基中添加脯氨酸，使培養(yǎng)基中脯氨酸濃度達(dá)到1g/L，脯氨酸作為滲透相容性物質(zhì)保護(hù)光滑球擬酵母細(xì)胞，促進(jìn)CCTCC M202019合成丙酮酸。本發(fā)明采用向培養(yǎng)基中添加1g/L脯氨酸促使丙酮酸發(fā)酵周期縮短8h，丙酮酸產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高5.4％和18.6％。這一研究結(jié)果可應(yīng)用于有機(jī)酸發(fā)酵等其他典型工業(yè)生物的過程，為工業(yè)生物技術(shù)特別是發(fā)酵過程優(yōu)化提供新的技術(shù)思路。
文檔編號C12P7/40GK101225410SQ20081002057
公開日2008年7月23日 申請日期2008年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月29日
發(fā)明者劉立明, 堵國成, 沙 徐, 堅(jiān) 陳 申請人:江南大學(xué)