專利名稱：：一種抗腫瘤類抗生素及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種抗腫瘤類抗生素及其制備方法，具體涉及一種具有抗腫瘤活性的抗生素和其藥學(xué)上可接受的鹽；本發(fā)明也涉及這一化合物的微生物發(fā)酵方法和其在制造抗腫瘤藥物上的用途。腫瘤嚴(yán)重威脅著人類的生命健康，世界各國都投入大量人力物力開發(fā)新的高效抗腫瘤藥?；瘜W(xué)治療在腫瘤治療中起著不可替代的作用。現(xiàn)已經(jīng)知道有許多經(jīng)培養(yǎng)不同種微生物所產(chǎn)生的抗生素類物質(zhì)可表現(xiàn)有抗腫瘤活性。迄今為止，已廣泛使用了某些已知的抗腫瘤在臨床實(shí)踐中為治療腫瘤提供了一種重要的治療手段。然而，臨床上使用的許多已知的抗腫瘤抗生素物質(zhì)都對人體有明顯的毒性，從而在應(yīng)用上受到很大限制。在這個(gè)意義上說，臨床上所使用的所有已知抗腫瘤抗生素均不一定是令人完全滿意的抗腫瘤藥物。因此，目前仍急需找到并提供既對人體毒性低，又有高抗腫瘤活性，而且可有效而安全地用于治療人體腫瘤或癌癥的新的物質(zhì)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種用于治療腫瘤疾病的新的抗腫瘤類抗生素3-取代-2-吲哚酮類化合物，其分子結(jié)構(gòu)式為C15H12N02，分子量238,化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式(I)所示。熔點(diǎn)185.0-186.9°C,外觀呈橙黃色粉末，它在藥學(xué)上可接受的鹽是鹽酸鹽、硫酸鹽或者有機(jī)鹽。本發(fā)明抗生素的結(jié)構(gòu)釆用核磁共振、紅外、紫外等光譜學(xué)的方法確定。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供這種抗腫瘤抗生素的發(fā)酵用菌種和制備方法?！憬?jīng)初步測試，該化合物體外能有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，其IC5。在3-27ng/mL范圍內(nèi)，具有顯著的抗腫瘤活性。式i本發(fā)明的吲哚酮類化合物是從山西省芮城縣古魏鄉(xiāng)土壤中分離得到鏈霉菌Y05A-1065(CGMCCNo.:2363)的發(fā)酵培養(yǎng)物中提取得到，所用的鏈霉菌Y05A-1065已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo.:2363，保藏曰為2008年2月19曰。制備方法的具體步驟如下(1)鏈霉菌Y05A-1065(CGMCCNo.:2363)的斜面菌株培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖0.5-1.5,酵母粉0.05-0.5，蛋白胨0.05-0.2,L跳'3H200.01-0.3,MgS04'7H200.Ol-O.1,蒸餾水100，制成斜面培養(yǎng)基，挑取菌種接入斜面培養(yǎng)基，28-30°C恒溫靜止培養(yǎng)7-9天；(2)鏈霉菌Y05A-1065(CGMCCNo.:2363)種子液的制備種子培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖0.5-1.5，酵母粉0.05-0.5，蛋白胨0.05-0.2,NaCl0.01-0.05,5K2HP043H200.01—0.3,MgS047H200.01-0.1,水100,制成種子培養(yǎng)液，挑取斜面菌種接入，28-30°C恒溫，220r/min震蕩培養(yǎng)24-36小時(shí)；(3)鏈霉菌Y05A-1065(CGMCCNo.:2363)的發(fā)酵液的制備發(fā)酵培養(yǎng)基按重量比為玉米淀粉2.0-10.0，黃豆餅粉0.5-3.5，花生餅粉0.05-1.0，酵母粉0.01-0.5，玉米漿0.01-0.2,CoCl2.H200.01-0.03，pH6.8，水IOO,28°C220r/min搖床振搖培養(yǎng)120-168小時(shí)；(4)將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液過濾，收集菌體，晾干；菌體在室溫下用甲醇浸泡，合并提取液，濃縮得到總提取物；用水重新溶解；(5)將上述去除菌體的培養(yǎng)液過分子量為10000的超濾膜，以進(jìn)一步去除可溶性大分子物質(zhì)；(6)收集超濾膜過濾后的濾液，加熱濃縮(溫度不超過5(TC)至原體積的1/20-1/5，用乙酸乙酯以等體積比加入到濃縮液中，萃取三次，合并萃取相，濃縮乙酸乙酯萃取液，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以CHClfMeOH為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫；(7)發(fā)酵液經(jīng)過硅膠柱層析后，收集20-60。/。的CHCl3-MeOH洗脫液，再以聚酰胺柱層析分離，重結(jié)晶純化，干燥，即得到橙黃色粉末。經(jīng)本發(fā)明所制備的化合物能有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，具有顯著的抗腫瘤活性。本發(fā)明所用的鏈霉菌Y05A-1065已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo.:2363,保藏日為2008年2月19日。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1化合物(I)的制備1.鏈霉菌Y05A-1065(CGMCCNo.:2363)的斜面菌株培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖0.5-1.5，酵母粉0.05-0.5，蛋白胨0.05-0.2，K2HP04.3H200.01-0.3,MgS047H200.01-0.1,蒸餾水100,制成斜面培養(yǎng)基，挑取菌種接入斜面培養(yǎng)基，28-30°C恒溫靜止培養(yǎng)7-9天；2.鏈霉菌Y05A-1065(CGMCCNo.:2363)種子液的制備種子培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖0.5-1.5，酵母粉O.05-0.5，蛋白胨0.05-0.2，NaCl0.01—0.05,5K2HP043H200.01-0.3,MgS047H200.01-0.1，水100,制成種子培養(yǎng)液，挑取斜面菌種接入，28-30°C恒溫，220r/min震蕩培養(yǎng)24-36小時(shí)；3.鏈霉菌Y05A-1065(CGMCCNo.:2363)的發(fā)酵液的制備發(fā)酵培養(yǎng)基按重量比為玉米淀粉2.0-10.0,黃豆餅粉0.5-3.5，花生餅粉0.05—1.0，酵母粉0.01-0.5，玉米漿0.01-0.2,CoCl2.H200.01-0.03,pH6.8,水IOO,28°C220r/min搖床振搖培養(yǎng)120-168小時(shí)；4.將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液過濾，收集菌體，晾干；菌體在室溫下用甲醇浸泡，合并提取液，濃縮得到總提取物；用水重新溶解；5.將上述去除菌體的培養(yǎng)液過分子量為10000的超濾膜，以進(jìn)一步去除可溶性大分子物質(zhì)；6.收集超濾膜過濾后的濾液，加熱濃縮(溫度不超過5(TC)至原體積的1/20-1/5，用乙酸乙酯以等體積比加入到濃縮液中，萃取三次，合并萃取相，濃縮乙酸乙酯萃取液，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以CHC13-MeOH為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫；7.發(fā)酵液經(jīng)過硅膠柱層析后，收集20-60y。的CHCl3-MeOH洗脫液，再以聚酰胺柱層析分離，重結(jié)晶純化，干燥，即得到橙黃色粉末(I)?；衔颱)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)外觀為橙黃色粉末，m.p.185-186.9。微溶于水、苯、氯仿、乙醚等溶劑，溶于乙醇、甲醇。FAB-MS:239(M+1)。最大紫外吸收波長262.8nm(1.171),355.6nm(1.144)。IRu/cm,KBr):3548(u。-H)，3356(uM)，3185(uC_H)，3144(uc-H)，3066(uc—H)，1699(uc,。)，1640(uc-c)。13CNMR(CDC13):170.2(C-2)，156.1(C—1，)，141.7(C-9),133.7(C-3)，131.7(C-10)。實(shí)施例2MTT還原法檢測化合物(I)的抗腫瘤活性1.材料1.1四脞鹽(MTT):用0.OIM的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解MTT(3-(4，5-dimethythiazo1-z-yl)2，5-diphenyltetrazoliumbromide,SIGMA)終濃度5mg/mL,過濾除菌，分裝后4°C避光保存。1.2靶細(xì)胞的制備(以A549細(xì)胞為例)從液氮罐中取出人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞的凍存管，迅速置入37°C水浴中，不停搖動(dòng)使之迅速溶化，無菌搡作移入離心管中；加入全培養(yǎng)液(含10Vj、牛血清的RPMI1640(Gibco1BRL公司))至10mL,1000rpm離心5s,棄上清；重復(fù)以上操作一次；以全培養(yǎng)液吹打使細(xì)胞混勻后移入培養(yǎng)瓶中，5%C02，37°C培養(yǎng)；觀察細(xì)胞生長情況，及時(shí)更換培養(yǎng)液，分瓶。取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至lxl07mL;將細(xì)胞懸液加入到96孔板中，各孔加入A549細(xì)胞100|uL(lxl05/mL)，5%C02，37。C培養(yǎng)8hr。加入不同濃度B6-9(使用全培養(yǎng)液配制)溶液IOOjaL,對照加全培養(yǎng)液100yL，繼續(xù)培養(yǎng)48hr。每孔加入MTT溶液各10|uL,繼續(xù)培養(yǎng)4hr。去除培養(yǎng)液，每孔加入DMS0100卩L,輕輕振蕩5-10min，使顆粒溶解。使用酶聯(lián)免疫儀測定570mn下每孔OD值。計(jì)算腫瘤細(xì)胞殺傷率和抑制率，以抑制率對藥物濃度的對數(shù)作圖，求得ICs。。肺癌細(xì)胞株A549，肝癌細(xì)胞株HepG-2,胃癌細(xì)胞株HGC-27，乳癌細(xì)胞株MCF-7的試驗(yàn)方法同上。腫瘤細(xì)胞殺傷率％=[(對照組測定的平均OD值-加藥組測定的平均0D值)/對照組測定的平均0D值]xlO(W13實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)rf果i示化合物(I)均能有效抑制肺癌細(xì)胞株A549,肝癌細(xì)胞株HepG-2，胃癌細(xì)胞株HGC-27，乳癌細(xì)胞株MCF-7的生長。其對這些癌細(xì)胞的ICs。值(ng/mL)見表l。表1B6-9的體外細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果(IC50jug/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例3鏈霉菌Y05A-1065(CGMCCNo.:2363)的培養(yǎng)特征形態(tài)特征孢子絲1-3圈螺旋形。孢子橢圓形。性狀特征高氏合成1號(hào)瓊脂氣絲青綠色，有次生白色叢?；z無色。無可溶色素。淀粉瓊脂氣絲青綠色?；z無色。無可溶色素。纖維素氣絲綠色?；z好，黃色。無可溶色素。權(quán)利要求1、一種抗腫瘤類抗生素，其特征在于該化合物的結(jié)構(gòu)式如下所示。2、按照權(quán)利要求l所述的一種抗腫瘤類抗生素，其特征在于還包括該抗生素在藥學(xué)上可接受的鹽。3、按照權(quán)利要求2所述的一種抗腫瘤類抗生素，其特征在于所述的藥學(xué)上可接受的鹽為其鹽酸鹽、硫酸鹽或者有機(jī)鹽。4、按照權(quán)利要求2或3所述的一種抗腫瘤類抗生素，其特征在于所述的藥學(xué)上可接受的鹽是鹽酸鹽或者硫酸鹽。5、一種如權(quán)利要求1所述的一種抗腫瘤類抗生素的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)鏈霉菌Y05A-1065(CGMCCNo.:2363)的斜面菌株培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖0.5-1.5，酵母粉0.05-0.5，蛋白胨0.05-0.2，K2HP043H200.01-0.3,MgS047H200.01-0.1,蒸餾水100，制成斜面培養(yǎng)基，挑取菌種接入斜面培養(yǎng)基，28-3(TC恒溫靜止培養(yǎng)7-9天；(2)鏈霉菌Y05A-1065(CGMCCNo.:2363)種子液的制備種子培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖0.5-1.5,酵母粉0.05-0.5，蛋白胨0.05-0.2，NaCl0.Ol-O.05，5K2HP043H200.01—0.3,MgS047H200.01-0.1,水100，制成種子培養(yǎng)液，挑取斜面菌種接入，28-30"恒溫，220r/min震蕩培養(yǎng)24-36小時(shí)；(3)鏈霉菌Y05A-1065(CGMCCNo.:2363)的發(fā)酵液的制備發(fā)酵培養(yǎng)基按重量比為玉米淀粉2.0-10.0，黃豆餅粉0.5-3.5，花生餅粉0.05-1.0，酵母粉0.01-0.5，玉米漿0.01-0.2，CoCl2H200.01-0.03,pH6.8,水IOO，28'C220r/min搖床振搖培養(yǎng)120-168小時(shí)；(4)將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液過濾，收集菌體，晾干；菌體在室溫下用甲醇浸泡，合并提取液，濃縮得到總提取物；用水重新溶解；(5)將上述去除菌體的培養(yǎng)液過分子量為10000的超濾膜，以進(jìn)一步去除可溶性大分子物質(zhì)；(6)收集超濾膜過濾后的濾液，在溫度不超過5(TC條件下加熱濃縮至原體積的1/20-1/5，用乙酸乙酯以等體積比加入到濃縮液中，萃取三次，合并萃取相，濃縮乙酸乙酯萃取液，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以CHCl「MeOH為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫；(7)發(fā)酵液經(jīng)過硅膠柱層析后，收集20-60y。的CHCl3-MeOH洗脫液，再以聚酰胺柱層析分離，重結(jié)晶純化，干燥，得到橙黃色粉末。6、抗腫瘤類抗生素或者其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，提供一種抗腫瘤類抗生素及其制備方法，其結(jié)構(gòu)式如右。該物質(zhì)可通過培養(yǎng)鏈霉菌Y05A-1065(CGMCCNo.2363)的發(fā)酵液中獲得。其主要通過鏈霉菌Y05A-1065的斜面菌株培養(yǎng)、鏈霉菌Y05A-1065種子液的制備、鏈霉菌Y05A-1065發(fā)酵液的制備、菌體濃縮得到總提取物、去除菌體的培養(yǎng)液過超濾膜、乙酸乙酯萃取后硅膠柱中進(jìn)行色譜分離、聚酰胺柱層析分離獲得。該方法簡單可行，重現(xiàn)性好。該物質(zhì)具有顯著的抗腫瘤活性，該物質(zhì)和其藥學(xué)上可接受的鹽可與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合制成抗腫瘤類藥物。文檔編號(hào)C12P17/10GK101538239SQ200810010679公開日2009年9月23日申請日期2008年3月17日優(yōu)先權(quán)日2008年3月17日發(fā)明者吳春福,張怡軒申請人:沈陽藥科大學(xué)