一種鹽酸表柔比星脂質(zhì)體注射液及抗腫瘤活性應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種注射液及其藥物用途，特別涉及一種適合工 業(yè)化生產(chǎn)的鹽酸表柔比星脂質(zhì)體注射液及抗腫瘤活性應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 表柔比星（Epirubicin)，又名表阿霉素，是典型的蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素。1975年 意大利學(xué)者通過(guò)半合成途徑合成表柔比星，與另一典型的蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素藥物多柔比 星（阿霉素）是同分異構(gòu)體，區(qū)別在于其氨基糖苷的4'位上的羥基由順勢(shì)變?yōu)榉绞健１砣?比星用于乳腺癌、卵巢癌等多種實(shí)體瘤。
[0003] 脂質(zhì)體作為藥物載體，具有一定的靶向性，尤以與抗腫瘤藥物的結(jié)合既增強(qiáng)治療 作用又可以降低藥物毒性。普通脂質(zhì)體由磷脂和膽固醇組成，但靶向性差，為提高脂質(zhì)體的 穩(wěn)定性、靶向性和細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入能力，可以采用某些功能基團(tuán)修飾脂質(zhì)體表面，如聚乙二醇 鏈修飾的脂質(zhì)體（長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，STEALTH技術(shù)）。STEALTH技術(shù)采用PEG的磷脂作為載體， 延長(zhǎng)藥物在血液循環(huán)時(shí)間，使脂質(zhì)體可以有效的達(dá)到病變部位。
[0004] 目前，上市的PEG化脂質(zhì)體包括美國(guó)Sequus公司開(kāi)發(fā)的鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射 液，商品名Doxir (楷萊），是第一個(gè)得到美國(guó)認(rèn)可的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體（1995年）。Doxir靜 脈注射后，鹽酸多柔比星脂質(zhì)體會(huì)蓄積到腫瘤組織中，很少進(jìn)入正常組織，體內(nèi)分布呈現(xiàn)腫 瘤靶向性，顯著提高多柔比星的抗癌效能。國(guó)內(nèi)三家公司成功仿制開(kāi)發(fā)了該產(chǎn)品，其中上海 復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司自主創(chuàng)新的阿霉素脂質(zhì)體（里葆多）是國(guó)內(nèi)批準(zhǔn)上市的首 個(gè)PEG化阿霉素脂質(zhì)體，作為乳腺癌、淋巴癌等癌癥的一線化療藥物。已上市的阿霉素脂質(zhì) 體Myocet 8屬于傳統(tǒng)的脂質(zhì)體，即表面沒(méi)有任何修飾。技術(shù)的核心就是利用脂質(zhì)體內(nèi)外pH 的差異而使藥物被動(dòng)裝載于脂質(zhì)體內(nèi)，即pH梯度法。與PEG修飾的多柔比星脂質(zhì)體比較， Myocet 4的膜結(jié)構(gòu)的組成缺少PEG的保護(hù)，容易被巨噬細(xì)胞吞噬清除，因此其體內(nèi)半衰期要 短得多，對(duì)腫瘤組織的靶向性，Myocet 4也較Doxir低，因此帶來(lái)更多的急性毒性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種鹽酸表柔比星脂質(zhì)體注射液及其制備方法，本發(fā)明是由 如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 本發(fā)明所述的鹽酸表柔比星脂質(zhì)體注射液，該注射液由如下原料制成（按脂質(zhì)體 注射液每100體積份計(jì)）：
[0007]
鹽酸表柔比星 160重量份 氫化大豆卵磷脂（HSPC) 2000重量份 膽固醇(CH0) 55重量份 二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000 900重量份 (DSPE-PEG2000) 組氨酸緩沖液 4體積份 蔗糖溶液 200體積份 硫酸銨水溶液 0. 1體積份。
[0015] 本發(fā)明所述的鹽酸表柔比星脂質(zhì)體注射液，原料優(yōu)選為：
[0016] 鹽酸表柔比星 230重量份 氫化大豆卵磷脂（HSPC) 170重量份 膽固醇(CH0) 1000重量份 二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000 60重量份 (DSPE-PEG2000) 組氨酸緩沖液 8體積份 蔗糖溶液 15體積份 硫酸銨水溶液 3體積份。
[0017] 本發(fā)明所述的鹽酸表柔比星脂質(zhì)體注射液，其中：
[0018] 硫酸按溶液的濃度為0? 1~0? 3mol/L ;組氨酸緩沖液濃度為0? 05mol/L~ 0? 4mol/L，pH為6. 2~6. 8 ;蔗糖溶液濃度為7~10 %，pH為6. 50~7. 50。優(yōu)選地，硫酸 銨溶液的濃度為〇? 15mol/L~0? 25mol/L ;組氨酸緩沖液濃度為0? lmol/L~0? 3mol/L ;蔗 糖溶液濃度為8%。優(yōu)選地，硫酸按溶液的濃度為0. 2mol/L ;組氨酸緩沖液濃度為0. 2mol/ L;蔗糖溶液濃度為9%。
[0019] 本發(fā)明所述的鹽酸表柔比星脂質(zhì)體注射液，其中HSPC :CH0 :DSPE-PEG2000的最佳 比例為3:1:1。
[0020] 本發(fā)明所述的鹽酸表柔比星脂質(zhì)體注射液終產(chǎn)品中磷脂的最佳濃度16mg/mL ;終 產(chǎn)品中磷脂與藥物鹽酸表柔比星的最佳比例為8:1，藥物鹽酸表柔比星的濃度為2mg/mL。
[0021] 本發(fā)明鹽酸表柔比星脂質(zhì)體注射液的制備工藝包含以下步驟：
[0022] (1)油相：稱取氫化大豆卵磷脂/膽固醇/二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000,溶于無(wú)水乙醇，加熱溶解后，于55~65°C保溫；
[0023] (2)水相：配制硫酸銨水溶液，于55~65 °C保溫；
[0024] (3)乳化：在55~65°C條件下，將油相注入到水相中，不斷加熱攪拌，并通入氮?dú)猓?直到無(wú)水乙醇完全揮發(fā)，得到空白脂質(zhì)體a ;
[0025] (4)整粒：將空白脂質(zhì)體a高壓均質(zhì)減小粒徑，最大均質(zhì)壓力在1400bar以下；擠 出器擠出，擠出器中采用孔徑為0. 05~0. 5nm的濾膜，得到空白脂質(zhì)體b;
[0026] (5)制造脂質(zhì)體內(nèi)外跨膜梯度：采用超濾法或采用凝膠柱層析法，用蔗糖溶液置 換外水相的硫酸銨溶液，得到空白脂質(zhì)體c;
[0027] (6)載藥、孵化：空白脂質(zhì)體c中加入組氨酸緩沖液，將鹽酸表柔比星溶于上述混 合液中，55~65°C保溫，蔗糖溶液定容，得到鹽酸表柔比星脂質(zhì)體注射液d;
[0028] (7)除菌、分裝：將d用0. 22 ym微孔濾膜除菌、分裝。
[0029] 本發(fā)明方法中所述超濾法可以是：向空白脂質(zhì)體加入同等體積的9%蔗糖溶液， 混合均勻，設(shè)置流量10_25mL/min，泵速15-35rpm/min，用蔗糖溶液置換內(nèi)水相硫酸銨，置 換5-8次，得到空白脂質(zhì)體。處理量不同，流量、泵速也不同，過(guò)大會(huì)破壞脂質(zhì)體。
[0030] 本發(fā)明方法中所述凝膠柱層析法可以是：空白脂質(zhì)體上樣到凝膠柱中，用蔗糖溶 液洗脫，收集洗脫液。
[0031] 將鹽酸表柔比星脂質(zhì)體注射液平均粒徑控制在50~150nm，更優(yōu)選為70~ 100nm，經(jīng)過(guò)擠出后粒徑分布均勻。
【附圖說(shuō)明】
[0032] 圖1為屯粒徑分布圖；
[0033] 圖2為d2粒徑分布圖；
[0034] 圖3為乳腺癌小鼠相對(duì)腫瘤體積隨時(shí)間的變化。
[0035] 本發(fā)明采用無(wú)水乙醇溶解磷脂，解決了以氯仿為溶劑產(chǎn)生毒性的問(wèn)題；通過(guò)加熱 攪拌的方法除去乙醇，容易得到空白脂質(zhì)體，解決了采用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除乙醇緩慢且不易 工業(yè)化生產(chǎn)的問(wèn)題；空白脂質(zhì)體中殘留的乙醇采用超濾法去除，與其他方法相比，極好的控 制了乙醇的殘留量。本發(fā)明中空白脂質(zhì)體用高壓均質(zhì)機(jī)減小粒徑后，采用擠出器擠出，使空 白脂質(zhì)體粒徑分布更均勻。
[0036] 本發(fā)明將鹽酸表柔比星為長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體注射液，符合工業(yè)化大生產(chǎn)要求。與鹽酸 表柔比星注射液以及鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射液（楷萊）進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，治療MCF-7乳腺 癌荷瘤小鼠的抗腫瘤活性結(jié)果表明，本發(fā)明將鹽酸表柔比星長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體注射液具有更好 的抗腫瘤作用。
[0037] 下述實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明但不限于本發(fā)明。
[0038] 實(shí)驗(yàn)例1:本發(fā)明以MCF-7荷瘤小鼠為模型，采用尾靜脈注射給藥，比較鹽酸表柔 比星脂質(zhì)體注射液、鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射液（楷萊）、表柔比星注射液的抗腫瘤活性。
[0039] 1?實(shí)驗(yàn)方法
[0040]取裸鼠（4周齡），將MCF-7細(xì)胞混懸均勻，右前肢腋下進(jìn)行接種，每只注射 0.2mL(l*107)細(xì)胞液，80只全部接種。接種腫瘤細(xì)胞后，每天觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。當(dāng)裸鼠 接種MCF-7細(xì)胞3天后，可在右前腋下隱約觸及腫塊，腫塊逐漸增大，5天后由外觀可見(jiàn)腫塊 形成，待腫瘤直徑至〇. 6~0. 8cm時(shí)，取60只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0041] 將成模裸鼠隨機(jī)分為6組，每組10只（每隔7天給藥1次，給藥3次）。
[0042] 1組：實(shí)施例5鹽酸表柔比星脂質(zhì)體注射液5mg/kg
[0043] 2組：實(shí)施例5鹽酸表柔比星脂質(zhì)體注射液10mg/kg
[0044] 3組：實(shí)施例5鹽酸表柔比星脂質(zhì)體注射液15mg/kg
[0045] 4組：鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射液（楷萊）lOmg/kg
[0046] 5組：鹽酸表柔比星注射液10mg/kg
[0047] 6組：空白對(duì)照（9%蔗糖溶液）
[0048] 尾靜脈注射給藥，每隔7天給藥1次（一個(gè)給藥周期），待生理鹽水對(duì)照組腫瘤體 積達(dá)到2000mm 3時(shí)（長(zhǎng)徑a達(dá)到20mm)，停止試驗(yàn)（試驗(yàn)必須彡注射3個(gè)周期）。
[0049] 給藥后每天觀察裸鼠的精神：自主活動(dòng)量、動(dòng)物休息時(shí)體態(tài)、爬行時(shí)體態(tài)、飲食等 情況，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)直徑（a)、最短徑（b)及體重，估算腫瘤體積。腫瘤 體積=aXb2/2。根據(jù)估算出的腫瘤體積計(jì)算相對(duì)腫瘤體積RTV，RTV = Vt/VQ，其中V。為測(cè) 量開(kāi)始時(shí)同一腫瘤的體積，Vt為每一次測(cè)量時(shí)的腫瘤體積。
[0050] 獲得的數(shù)據(jù)以（5土SD )表示，并做t檢驗(yàn)，取a =〇? 05顯著性水平。
[0051] 注：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中正常飼養(yǎng)小鼠（記錄發(fā)生的異常情況）。
[0052] 2?實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0053] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鹽酸表柔比星脂質(zhì)體注射液有顯著的抗腫瘤活性，且抗腫瘤活性 優(yōu)于鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射液和鹽酸表柔比星注射液。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，15mg/kg給藥劑量 組在21天時(shí)有2只小鼠死亡，鹽酸表柔比星注射液組在21天有3只小鼠死亡。結(jié)果見(jiàn)表 1和表2。
[0054] 表1不同制劑給藥后體重的變化
[0055]
[0056]
[0057] 注：*對(duì)比于空白對(duì)照組有顯著意義（P〈0. 05)。
[0058] 結(jié)果顯示：
[0059] 1)與空白對(duì)照組相比，其他5組藥物對(duì)小鼠體重變化有顯著意義（P〈0. 05);
[0060] 2)第3組高劑量組小鼠在21天有2只死亡，第5組