專利名稱：P基因的干擾靶位點序列和小干擾核酸及組合物和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于P基因的干擾靶位點序列和小干擾核酸及組合物和應(yīng)用，更確切地 說，本發(fā)明涉及P基因的干擾靶位點序列，用于抑制P基因表達(dá)的小核酸，以及含有該小干 擾核酸的化妝品組合物和該小干擾核酸在制備用于抑制黑色素生成和沉積或祛除黑色素 的化妝品組合物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
黑色素(melanin)是由黑素細(xì)胞合成的一種生物多聚體，由皮膚、毛囊、虹膜和視 網(wǎng)膜的黑色素細(xì)胞產(chǎn)生，分為黑棕色的真黑素和紅黃色的褐黑素。動物與人的皮膚和毛發(fā) 顏色與黑素體的數(shù)目、大小和分布等都有直接的關(guān)系。過量的黑色素會使皮膚變黑，而非均 勻分布的黑色素會導(dǎo)致黃褐斑和祛斑的產(chǎn)生。隨著生活水平和生活質(zhì)量的提高，人們對美的關(guān)注也日益增強(qiáng)，美白、去斑就是其 中很重要的一項內(nèi)容。因此，開發(fā)一種能夠抑制黑色素生成和沉積或祛除黑色素的產(chǎn)品稱 為迫切需要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供P基因的干擾靶位點序列。本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于抑制P基因表達(dá)的小干擾核酸。本發(fā)明的第三個目的是提供一種含有所述小干擾核酸的化妝品組合物。本發(fā)明的第四個目的是提供所述小干擾核酸在制備用于抑制黑色素生成和沉積 或祛除黑色素的化妝品組合物中的應(yīng)用。RNA干擾技術(shù)的出現(xiàn)為抑制黑色素生成和沉積或祛除黑色素提供了一種新的途 徑。RNA 干擾(RNA interference, RNAi)是由雙鏈 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)分子 在mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)基因的表達(dá)或使該基因沉默的過程。RNA干擾技術(shù)又被形象地稱為基 因敲低(knock-down)或基因沉默(gene silencing)，是一種典型的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控方法， 又稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。最早有關(guān)RNA干擾 的報道出現(xiàn)在1990年，由兩個不同的研究小組同時報道了轉(zhuǎn)基因植物中的RNA干擾現(xiàn)象， 以后又在線蟲、果蠅、斑馬魚和小鼠等幾乎所有真核生物中觀察到了 RNA干擾現(xiàn)象。1999 年，Hamilton和Baulcombe在發(fā)生RNA干擾的植物中檢測到了長度為21-25個核苷酸的 RNA片段，這些RNA片斷被證明是RNA干擾所必需的，稱為小分子干擾RNA (小干擾核酸)。 雙鏈小干擾核酸與細(xì)胞源性的相關(guān)酶和蛋白質(zhì)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC)。在RNA干擾過程中，雙鏈小干擾核酸中的正義鏈被排除出復(fù)合 體，反義鏈指導(dǎo)RISC結(jié)合到靶mRNA的相應(yīng)位點，然后由復(fù)合物中的核糖核酸酶III降解靶 mRNA,從而關(guān)閉靶基因的表達(dá)。本發(fā)明人對黑色素的合成以及沉積進(jìn)行了細(xì)致的研究，發(fā)現(xiàn)黑色素是由多個基因 相互協(xié)調(diào)并經(jīng)過一系列復(fù)雜的生理生化過程合成，這些與色素沉著相關(guān)的基因參與黑色素
4的合成、運輸和分布。在與黑色素生成有關(guān)的一系列基因中，P基因是其中很重要的一個基 因。P基因也叫0CA2基因，負(fù)責(zé)合成P蛋白。P蛋白是IlOkDa的跨膜蛋白，由838個 氨基酸殘基構(gòu)成，含有12個跨膜區(qū)，6個糖基化位點，位于黑色素小體膜上，與黑色素小體 膜的完整性有關(guān)，是產(chǎn)生黑素小體所必需的蛋白。另有研究結(jié)果表明，P基因編碼的蛋白與 一些參與陰離子轉(zhuǎn)運的膜轉(zhuǎn)運蛋白具有顯著同源性，它作為一種膜通道蛋白可減少黑素小 體內(nèi)質(zhì)子的濃度，參與黑色素小體內(nèi)PH值的調(diào)節(jié)，使局部環(huán)境呈中性，這有利于維護(hù)高分 子酪氨酸-TYRP1-TYRP2復(fù)合體的穩(wěn)定性，增強(qiáng)酪氨酸酶活性，增加黑色素的生成及沉積。此外，P基因的變異會導(dǎo)致黑素細(xì)胞數(shù)量的減少以及黑素細(xì)胞中黑色素合成的降 低，P基因的編碼產(chǎn)物為真黑素合成所必需，因此，通過RNA干擾而專一性地抑制P基因的 表達(dá)，從而沉默P基因的活性，是抑制黑色素合成、改善膚色的有效途徑。本發(fā)明提供了 P基因的干擾靶位點序列，其中，該靶序列具有如SEQ IDNos :2_16 中之一所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種小干擾核酸，其中，該小干擾核酸包括能夠在嚴(yán)格條件下與 所述干擾靶位點序列進(jìn)行雜交的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種用于抑制黑色素生成和沉積或祛除黑色素的化妝品組合物， 其中，該化妝品組合物含有所述小干擾核酸作為活性成分。本發(fā)明還提供了所述小干擾核酸在制備用于抑制黑色素生成和沉積或祛除黑色 素的化妝品組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的小干擾核酸對P基因表達(dá)的抑制活性高，能夠有效地抑制黑色素生 成和沉積。例如，本發(fā)明提供的小干擾核酸PGENE-I至PGENE-30能夠高效的抑制P基因的 表達(dá)，這說明本發(fā)明提供的小干擾核酸用于抑制P基因的表達(dá)時，對P基因表達(dá)的抑制活性較高。
具體實施例方式本發(fā)明提供了 P基因的干擾靶位點序列，其中，該靶序列具有如SEQ IDNos :2_16 中之一所示的核苷酸序列。優(yōu)選情況下，所述靶序列具有如SEQID No :3、SEQ ID No :4、SEQ ID No :7、SEQ ID No 10 或 SEQ ID No 12 所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種小干擾核酸，其中，該小干擾核酸能夠通過作用于權(quán)利要求1 所述的靶位點序列而抑制P基因的表達(dá)，該小干擾核酸的GC含量為35-60%。所述P基因包括24個外顯子和23個內(nèi)含子。第1外顯子編碼P基因mRNA的5’ 端非翻譯序列，翻譯的起始位點位于第2外顯子。P基因編碼一種IlOkDa的跨膜蛋白，該蛋 白為真黑素合成所必需，由838個氨基酸殘基構(gòu)成，含有12個跨膜區(qū)，6個糖基化位點，位于 黑色素小體膜上，與黑色素小體膜的完整性有關(guān)。本發(fā)明所述小干擾核酸為包括正義鏈和反義鏈的雙鏈分子，所述正義鏈和反義鏈 的長度分別為15-27個核苷酸；優(yōu)選情況下，所述正義鏈和反義鏈的長度分別為19-21個核苷酸。在本發(fā)明此方面的優(yōu)選實施方式中，所述小干擾核酸具有PGENE-1、PGENE_2、 PGENE-3、PGENE-4、PGENE-5、PGENE-6、PGENE-7、PGENE-8、PGENE-9、PGENE-10, PGENE-IUPGENE-12、PGENE-13、PGENE-14 或 PGENE-15 所示的核苷酸序列，或者具有對 PGENE-1、 PGENE-2、PGENE-3、PGENE-4、PGENE-5、PGENE-6、PGENE-7、PGENE-8、PGENE-9、PGENE-10、 PGENE-11、PGENE-12、PGENE-13, PGENE-14或PGENE-15所示的核苷酸序列進(jìn)行化學(xué)修飾所 得到的核苷酸序列，其中，
PGENE-I 正義鏈5
反義鏈 PGENE-2 正義鏈 反義鏈 PGENE-3 正義鏈 反義鏈 PGENE-4 正義鏈 反義鏈 PGENE-5 正義鏈 反義鏈 PGENE-6 正義鏈 反義鏈 PGENE-7 正義鏈 反義鏈 PGENE-8 正義鏈 反義鏈 PGENE-9 正義鏈 反義鏈 PGENE-10正義鏈 反義鏈 PGENE-Il正義鏈 反義鏈 PGENE-12正義鏈 反義鏈 PGENE-13正義鏈 反義鏈 PGENE-14正義鏈 反義鏈 PGENE-15正義鏈
，-GCCAGGA⑶UUGCUUCAUUdTdT-3’ ’ -AAUGAAGCAAACUCCUGGCdTdT-3’ ； ’ -GGAG⑶CUCACUCUUCUUUdTdT-3’ ’ -AAAGAAGA⑶GAGACCUCCdTdT-3’ ； ’ -CCUUAUCACCGCUGGAGAAdTdT-3’ ’ -UUCUCCAGCG⑶GAUAAGGdTdT-3’ ； ’ -GCCU⑶GACCAUAAG⑶UGdTdT-3’ ’ -CAACCUUAUG⑶CACAGGCdTdT-3’ ； ’ -GCAGAA⑶GAUCUUCACAAdTdT-3’ ’ -UU⑶GAAGAUCACUUCUGCdTdT-3’ ； ’ -CCGGAUUCACUGCACACAUdTdT-3’ ’ -AUGUGUGCA⑶GAAUCCGGdTdT-3’ ； ’ -GGAGACCAAUAUCCAAGAAdTdT-3’ ’ -UUCUUGGAUAUUG⑶CUCCdTdT-3’ ； ’ -CCCUGGCAUUCAUCUUGAUdTdT-3’ ’ -AUCAAGAUGAAUGCCAGGGdTdT-3’ ； ’ -G⑶GCCAUCUGGUUGCUAAdTdT-3’ ’ -UUAGCAACCAGAUGGCACCdTdT-3’ ； ’ -GGGCUUCCCAAUGAUGGUUdTdT-3’ ’ -AACCAUCAUUGGGAAGCCCdTdT-3’ ； ’ -GGUU⑶⑶CCUGCACUGUUdTdT-3’ ’ -AACAGUGCAGGACACAACCdTdT-3’ ； ’ -GCACUGUUGGGAU⑶⑶UAdTdT-3’ ’ -UAACACAUCCCAACA⑶GCdTdT-3’ ； ’ -GCUUACCCUGGAGAUGCUAdTdT-3’ ’ -UAGCAUCUCCAGGGUAAGCdTdT-3’ ； ’ -GGAAUAGACCUUGACACUAdTdT-3’ ’ -UA⑶⑶CAAGGUCUAUUCCdTdT-3’ ； ’ -UCAAUUCUCCUGAGGCUAAdTdT-3’ ’ -UUAGCCUCAGGAGAAUUGAdTdT-3’。
小干擾核酸具有 PGENE-2、PGENE-3、PGENE-6、PGENE-9 或
PGENE-Il所示的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明，所述化學(xué)修飾為如下修飾中的至少一種(1)對所述小干擾核酸的核苷酸序列中連接核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾；(2)對所述小干擾核酸的核苷酸序列中核糖的2’ -OH的修飾；
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(3)對所述小干擾核酸的核苷酸序列中堿基的修飾。所述化學(xué)修飾為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，所述磷酸二酯鍵的修飾是指對磷酸二酯 鍵中的氧進(jìn)行修飾，包括硫代磷酸修飾，如式1所示；和硼烷化磷酸鹽修飾，如式2所示。兩 種修飾都能穩(wěn)定小干擾核酸結(jié)構(gòu)，保持堿基配對的高特異性和高親和力。 所述核糖修飾是指對核苷酸戊糖中2’ -OH的修飾，即，在核糖的羥基位置引入某 些取代基，例如，2’ -氟代修飾，如式3所示；2’ -氧甲基修飾，如式4所示；2’ -氧亞乙基 甲氧基修飾，如式5所示；2，4’_ 二硝基苯酚修飾，如式6所示；鎖核酸(LNA)，如式7所示； 2’ _氨基修飾，如式8所示；2’ -脫氧修飾，如式9所示。
(7)(8)(9)所述堿基修飾是指對核苷酸的堿基進(jìn)行修飾，例如，5' _溴尿嘧啶修飾，如式10 所示；5'-碘尿嘧啶修飾，如式11所示；N-甲基脲嘧啶修飾，如式12所示；2，6_ 二氨基嘌 呤修飾，如式13所示。 優(yōu)選情況下，所述修飾使修飾后的小干擾核酸在細(xì)胞內(nèi)抵抗核酸酶水解的能力增強(qiáng)。此外，為了促進(jìn)小干擾核酸進(jìn)入細(xì)胞，可以在以上修飾的基礎(chǔ)上，在小干擾核酸正 義鏈的末端引入膽固醇等親脂性的基團(tuán)以利于通過由脂質(zhì)雙分子層構(gòu)成的細(xì)胞膜與細(xì)胞 內(nèi)的mRNA發(fā)生作用。本發(fā)明提供的小干擾核酸的制備方法包括小干擾核酸序列的設(shè)計和小干擾核酸 的制備。所述小干擾核酸序列的設(shè)計是指在P基因cDNA序列(Genbank登記號為 NM-000275)的l-3136bp的范圍內(nèi)選取19bp長度的核苷酸序列。19bp核苷酸序列的選取主 要參考以下幾項原則=(I)GC含量在35-55%之間，(2)避免處于重復(fù)序列或低復(fù)雜性序列 區(qū)域內(nèi)，(3)避免出現(xiàn)4個以上的連續(xù)堿基序列，(4)避免含有單核苷酸多態(tài)性位點，(5)避 免處于讀碼框起始密碼和終止密碼的50-100bp區(qū)域之內(nèi)，除此之外，還要分析核苷酸序列 的組成和熱力學(xué)性質(zhì)。通過BLAST分析，將候選小干擾核酸靶位點同人類基因序列進(jìn)行同 源性比對，排除同其它基因有很大的序列同源性(16個以上堿基)的序列，以確保候選小干 擾核酸靶位點不會對其他非相關(guān)基因發(fā)生抑制作用，而僅對P基因具有特異的抑制作用。最后將這樣獲得的19bp核苷酸序列的3’末端加上兩個脫氧胸腺嘧啶核苷酸作為 小干擾核酸序列的正義鏈，在此19bp核苷酸序列的互補序列3’末端加上兩個脫氧胸腺嘧
9啶核苷酸作為小干擾核酸序列的反義鏈。根據(jù)本發(fā)明，所述小干擾核酸的制備方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，所述小 干擾核酸可以通過化學(xué)合成得到，或者通過質(zhì)粒和/或病毒載體的表達(dá)而得到。所述小干擾核酸序列的合成可以采用化學(xué)合成的方法，或者委托專門從事核酸合 成的生物技術(shù)公司合成，如委托上海GenePharma公司進(jìn)行合成。一般來說，所述化學(xué)合成的方法包括以下四個過程(1)寡聚核糖核苷酸的合成；(2)脫保護(hù)；(3)純化分離；(4)脫鹽。例如，具有PGENE-I所示核苷酸序列的小干擾核酸化學(xué)合成的具體步驟如下(1)寡聚核糖核苷酸的合成寡聚核糖核苷酸的合成是在自動DNA/RNA合成儀 (例如，Applied Biosystems EXPEDITE8909)上進(jìn)行，根據(jù)PGENE-I所示的核苷酸序列(正 義鏈5，-GCCAGGA⑶UUGCUUCAUUdTdT-3，，反義鏈5，-AAUGAAGCAAACUCCUGGCdTdT-3，)的順 序?qū)?yīng)的核苷酸逐個連接起來。由于小干擾核酸是由一段19個寡聚核糖核苷酸和2個 脫氧胸苷酸組成。因此，起始物為固相連接的5’-0_對二甲氧基-胸苷，具體的每一個循環(huán) 合成可分為四步來完成，第一步是將與固定連接的胸苷上5’位的保護(hù)基在三氯乙酸的作用 下洗脫；第二步在活性催化劑S-乙基四唑的作用下，將5’ -0-對二甲氧基三苯甲基_胸苷 亞磷酰胺偶聯(lián)至已脫去保護(hù)的上一個胸苷上，形成二胸苷亞磷酸三酯，偶合時間偶合次數(shù) 均按儀器廠家提供的程序來完成；第三步是將偶合的二胸苷亞磷酸三酯在0. 05M碘水作用 下，氧化成二胸苷磷酸三酯；第四步是乙?；?，將固相上的少量未反應(yīng)的活性基團(tuán)(例如， 羥基和胺基)在乙酸酐的作用下形成酯或酰胺，從而達(dá)到封閉的作用，以減少整體副產(chǎn)物 的產(chǎn)生，重復(fù)此循環(huán)直至完成全部核酸序列的合成。(2)脫保護(hù)將合成好的固相小干擾核酸放入至一個可以密封的小瓶中，并加入1毫升的乙醇 /胺(體積比為1 3)，然后密封，置于55-70°C溫箱中，孵育2-30小時，取出溶液，并將固 相再次用雙蒸水淋洗，收集洗脫液，并干燥去除溶劑。然后，加入1毫升四丁基氟化銨的四 氫呋喃溶液(IM)，室溫放置4-12小時，再經(jīng)過乙醇沉淀，得到小干擾核酸的粗產(chǎn)物。(3)純化分離將小干擾核酸的粗產(chǎn)物溶解于2毫升的乙酸銨水溶液中，然后經(jīng)過反應(yīng)C18高壓 液相色譜的分離，運用梯度淋洗的方法，收集小干擾核酸主產(chǎn)物(淋洗液A :0. IM乙酸銨； 淋洗液B :20%的0. IM乙酸銨和80%的乙腈)，除去主產(chǎn)物中的溶劑，并加入5毫升80% 的乙酸水溶液，在室溫靜置15分鐘，然后將此溶液進(jìn)行陰離子交換的分離(DEAE-5PW，陰 離子交換柱)，即可得到純度在90 %以上的小干擾核酸(梯度淋洗，淋洗液A 0. 025M的 Tris-HCl, 0. 025M 的 NaCl，pH = 8，5% 的乙腈；淋洗液B 0. 025M 的 Tris-HCl，2. OM 的 NaCl， PH = 8，5%的乙腈)。(4)脫鹽純化的小干擾核酸經(jīng)過透析，除去鹽份，隨后將小干擾核酸溶液進(jìn)行過濾消毒和 干燥結(jié)晶。然后將正義鏈和反義鏈的寡聚核糖核酸經(jīng)過退火處理形成穩(wěn)定的雙鏈小干擾核 酸，其方法是將正義鏈和反義鏈的寡聚核糖核苷酸混合溶解在1-2毫升的緩沖液中(IOmM Tris,pH = 7. 5-8. 0,50mM NaCl)，將此溶液加熱至95°C，然后緩緩將此溶液冷卻至室溫，最 后將此溶液存放在4°C冰箱中保存，以備隨時使用。
除化學(xué)合成外，小干擾核酸還可通過質(zhì)粒和/或病毒載體的表達(dá)而得到，得到具 有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的shRNA，其長度為50-90個核苷酸。shRNA的結(jié)構(gòu)為5，-GATCCG-正義鏈 GAAGCTTG-反義鏈 TTTTTTGGAATT-3，兩端為酶切位點(例如BamHI和EcoRI)，中間為一段loop序列(例如GAAGCTTG)， 通過克隆技術(shù)將其插入到用相應(yīng)內(nèi)切酶酶切過的載體中，再整合到染色體中，即可穩(wěn)定表 達(dá)小干擾核酸。根據(jù)本發(fā)明提供的用于抑制黑色素生成和沉積或祛除黑色素的化妝品組合物，該 化妝品組合物含有本發(fā)明提供的小干擾核酸作為活性成分。根據(jù)本發(fā)明，所述化妝品組合物還含有載體。本發(fā)明中，所述小干擾核酸與載體的含量可以在很大范圍內(nèi)變動，優(yōu)選情況下，相 對于100重量份的小干擾核酸，所述載體的含量為1000-10000000重量份；進(jìn)一步優(yōu)選為， 相對于100重量份的小干擾核酸，所述載體的含量為2000-100000重量份。本發(fā)明中，對所述載體沒有特別的限制，可以是任何用于化妝品組合物的載體，例 如可以為動植物油、烴油、酯、高級脂肪酸和高級脂肪醇中的一種或幾種；例如，所述動植物 油可以為貂油、鱉油、大豆油、芝麻油、玉米油、油菜籽油、棉籽油、橄欖油和蓖麻油中的一種 或幾種；所述烴油可以為石蠟油、異三十六烷和凡士林中的一種或幾種；所述酯可以為棕 櫚酸異丙酯、硬脂酸丁酯、月桂酸己酯、異壬酸異壬酯、2-乙基己基棕櫚酸酯、2-己基癸基 月桂酸酯和2-辛基十二烷基肉豆蔻酸酯中的一種或幾種；所述高級脂肪酸可以為棕櫚酸、 硬脂酸、亞油酸和亞麻酸中的一種或幾種；高級脂肪醇可以為鯨蠟醇和/或十八烷醇。根據(jù)本發(fā)明，所述化妝品組合物還含有其它用于化妝品組合物的成分。本發(fā)明中，所述小干擾核酸與其它用于化妝品組合物的成分的含量可以在很大范 圍內(nèi)變動，優(yōu)選情況下，相對于100重量份的小干擾核酸，所述其它用于化妝品組合物的成 分的含量為1000-10000000重量份；進(jìn)一步優(yōu)選為，相對于100重量份的小干擾核酸，所述 其它用于化妝品組合物的成分的含量為2000-100000重量份。本發(fā)明中，對所述其它用于化妝品組合物的成分沒有特別的限制，例如，可以為保 濕劑、著色劑、防腐劑、增稠劑、抗氧化劑、表面活性劑和佐劑中的一種或幾種。本發(fā)明中，對所述保濕劑沒有特別的限制，可以為各種用于化妝品組合物的保濕 劑，例如，所述保濕劑可以為丙二醇、二丙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇、山梨醇、己二醇、1， 3- 丁二醇和甘油中的一種或幾種。本發(fā)明中，對所述著色劑沒有特別的限制，可以為各種用于化妝品組合物的著色 劑，例如，所述著色劑可以為胭脂紅、滑石、云母、碳酸鎂、碳酸鈣、硅酸鎂、二氧化硅、氧化鋅 和群青中的一種或幾種。本發(fā)明中，對所述增稠劑沒有特別的限制，可以為各種用于化妝品組合物的增稠 劑，例如，所述增稠劑可以為蜂蠟、小燭樹蠟、鯨蠟、微晶蠟、淀粉、黃原膠、阿拉伯膠、瓜爾 膠、果膠和膨潤土中的一種或幾種。本發(fā)明中，對所述防腐劑沒有特別的限制，可以為各種用于化妝品組合物的防腐 劑，例如，所述防腐劑可以為苯甲酸、水楊酸、羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯和間苯二酚中 的一種或幾種。本發(fā)明中，對所述抗氧化劑沒有特別的限制，可以為各種用于化妝品組合物的抗氧化劑，例如，所述抗氧化劑可以為抗壞血酸、維生素Α、β-胡蘿卜素、維生素B、半胱氨酸、 谷胱甘肽、過氧化氫酶、檸檬酸和二茶酚中的一種或幾種。本發(fā)明中，對所述表面活性劑沒有特別的限制，可以為各種用于化妝品組合物的 表面活性劑，例如，所述表面活性劑可以為脂肪酸甘油酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油、烷基苯磺 酸鈉、磺基琥珀酸二烷基酯、N-?；劝彼岷途垩跻蚁┩榛蛩徕c中的一種或幾種。所述佐劑的種類沒有特別的限制，可以為各種能夠用于化妝品組合物的佐劑，例 如，所述佐劑可以為維生素Β3、海藻提取物、氮酮、海藻糖、雙咪唑烷基脲和透明質(zhì)酸中的一 種或幾種。所述化妝品組合物可以為各種常規(guī)的化妝品組合物的形式，例如，可以為乳劑、膏 劑、液劑、氣霧劑或粉劑。所述化妝品組合物為外用劑，可以用于身體各個部位的皮膚，例如 臉部、頸部、手臂、軀干(胸部、腹部和背部)、腿部、手部和腳部。本發(fā)明還提供了所述小干擾核酸在制備用于抑制黑色素生成和沉積或祛除黑色 素的化妝品組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的P基因的干擾靶位點、小干擾核酸、化妝品組合物和應(yīng)用可以用于 防止、改善、和祛除皮膚的色素沉淀，以達(dá)到防止、改善、和祛除不理想或不健康的皮膚以及 美白皮膚的目的。并且，本發(fā)明的小干擾核酸能夠特異、高效、穩(wěn)定地特異抑制P蛋白的表 達(dá)，本發(fā)明提供的小干擾核酸能夠廣泛地用于制備各種用于防止、改善、和祛除皮膚的色素 沉淀相關(guān)的藥品或化妝品。并且本發(fā)明提供的小干擾核酸、化妝品組合物等可以直接涂抹 或轉(zhuǎn)載到作用部位。下面結(jié)合實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，除非特別說明，本發(fā)明所用到的試劑、培養(yǎng)基 均為市售商品。實施例1小干擾核酸的合成在P基因的cDNA序列(Genbank登記號為NM-000275)的l_3136bp的范圍內(nèi)選 取19bp長度的核苷酸序列。19bp核苷酸序列的選取主要參考以下幾項原則(I)GC含量在 35-55%之間，(2)避免處于重復(fù)序列或低復(fù)雜性序列區(qū)域內(nèi)，(3)避免出現(xiàn)4個以上的連續(xù) 堿基序列，(4)避免含有單核苷酸多態(tài)性位點，(5)避免處于讀碼框起始密碼和終止密碼的 50-100bp區(qū)域之內(nèi)，除此之外，還要分析核苷酸序列的組成和熱力學(xué)性質(zhì)。通過BLAST分 析，將候選小干擾核酸靶位點同人類基因序列進(jìn)行同源性比對，排除同其它基因有很大的 序列同源性(16個以上堿基)的序列，以確保候選小干擾核酸靶位點不會對其他非相關(guān)基 因發(fā)生抑制作用，而僅對P基因具有特異的抑制作用。最后將這樣獲得的19bp核苷酸序列的3’末端加上兩個脫氧胸腺嘧啶核苷酸作為 小干擾核酸序列的正義鏈，在此19bp核苷酸序列的互補序列3’末端加上兩個脫氧胸腺嘧 啶核苷酸作為小干擾核酸序列的反義鏈。設(shè)計好的小干擾核酸經(jīng)上海吉瑪(GenePharma)公司進(jìn)行化學(xué)合成，得到小于擾 核酸PGENE-I至PGENE-15，所述小干擾核酸PGENE-I至PGENE-15的核苷酸序列如表1所不。表1 所述攻擊范圍是指該小干擾核酸在序列表第1號序列中的相對應(yīng)位置。實施例2P基因表達(dá)的抑制活性檢測(1)黑素細(xì)胞的培養(yǎng)用含有10%胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、100U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素的MEM 完全培養(yǎng)基，在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板上以5 X IO6個細(xì)胞/孔的密度接種SK-MEL-3黑色素腫瘤 細(xì)胞(北京百星高科技術(shù)開發(fā)有限公司)，在溫度為37°C及CO2含量為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行 培養(yǎng)，每48小時傳代、更換新鮮培養(yǎng)基。2)小干擾核酸的轉(zhuǎn)染使用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000脂質(zhì)體對實施例1得到 的小干擾核酸PGENE-I至PGENE-15分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以無關(guān)小干擾核酸(正義鏈 5-UUCUCCGAAC⑶⑶CAC⑶TT-3 ；反義鏈5_AC⑶GACACGUUCGGAGAATT-3)作為陰性對照。具體 操作步驟如下將小干擾核酸溶解于無RNA酶的無菌水中，配制成濃度為20ymol/L的溶 液。將SK-MEL-3黑色素瘤細(xì)胞接種至24孔板中，用OptiMEM I低血清培養(yǎng)基(Invitrogen 公司，31985-062)稀釋成濃度為8 X IO5個細(xì)胞/ml，每孔500 μ 1。分別將1. 5 μ 1小干擾核酸 (20ymol/L)稀釋于50μ 1 Opti-MEM I 低血清培養(yǎng)基(Invitrogen公司，31985-062)中，將
131 μ 1 Lipofectamine 2000 脂質(zhì)體稀釋于 50 μ 1 Opti-MEM I 低血清培養(yǎng)基(Invitrogen 公司，31985-062)中，然后將上述兩種溶液在室溫下孵育5分鐘后混合，混合溶液于室溫靜 置20分鐘后，把100 μ 1該混合溶液加到接種有細(xì)胞的所述24孔板中。小干擾核酸的最終 濃度是50ηΜ。細(xì)胞37°C培養(yǎng)4小時，再加入Iml含10%胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、100U/ ml青霉素、100μ g/ml鏈霉素的MEM完全培養(yǎng)基，然后在37°C下再培養(yǎng)24小時。(3)抑制活性檢測通過RT-PCR分別檢測轉(zhuǎn)染了小干擾核酸PGENE-I至PGENE-15的SK-MEL-3黑色 素瘤細(xì)胞中P基因mRNA的表達(dá)量，具體步驟為用1ml TRIzol (GIBC0L公司)裂解轉(zhuǎn)染小干擾核酸的SK-MEL-3黑色素瘤細(xì)胞，并 提取總RNA，提取總RNA的具體步驟為將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在37°C溫度下，及CO2含量為5% 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，離心收集細(xì)胞，去除上清，并用預(yù)冷的PBS洗一遍；所述PBS的組 成為NaCl 137mmol/L, KC12. 7mmol/L, Na2HP044. 3mmol/L, KH2P041. 4mmol/L ；每孔加入 Iml Trizol裂解細(xì)胞3分鐘；吹打細(xì)胞，將裂解物轉(zhuǎn)移到1. 5ml EP管中，室溫放置10分鐘；加入 200 μ 1氯仿，在振蕩器上劇烈震蕩15秒，室溫放置10分鐘；12000rpm 4°C離心20分鐘；取 上清約300-500 μ 1放于一新的EP管中，加入等體積的異丙醇，_30°C沉淀過夜；12，OOOrpm, 4°C離心10分鐘。去上清，Iml 75%乙醇洗一次；12，OOOrpm，4°C離心10分鐘；吸去上清，干 燥RNA沉淀10分鐘；加入20 μ 1 DEPC水溶解RNA。將2單位的DNase I (RNase-free) (TakaRa公司)加入至總RNA中，并在37°C條件 下靜置30分鐘，以除去總RNA中殘留的DNA。經(jīng)過DNase I處理后，對總RNA進(jìn)行提純，提純 的具體步驟為(采用 Invitrogen 公司 PureLinkMicro-to-Midi Total RNA Purification Kit)，在總RNA中加入等體積的70%乙醇，振蕩混合均勻，將混合物轉(zhuǎn)移至純化柱上，室溫 12000g離心15秒，棄過濾液，加入700 μ 1清洗緩沖液I，室溫12000g離心15秒，棄過濾液， 加入500 μ 1清洗緩沖液II，室溫12000g離心15秒，棄過濾液，再加入500 μ 1清洗緩沖液 II，室溫12000g離心15秒，棄過濾液，室溫12000g離心1分鐘，將純化柱轉(zhuǎn)移至RNA收集 管上，加入30 μ IDEPC水，室溫放置1分鐘，室溫13000g離心2分鐘，丟棄純化柱，將RNA樣 品至于_80°C保存。對提純后得到的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，所用的逆轉(zhuǎn)錄酶為 Promega公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的具體步驟為將Iug提純后的總RNA與0. 5ug 的Oligo dT在試管中進(jìn)行混合，用DEPC水將總體積補足至16. 25μ 1，將試管進(jìn)行加熱，加 熱的條件包括加熱溫度為70°C，加熱時間為5分鐘；然后將試管迅速冷卻至0°C，并加入緩 沖液(5XMLVbuffer 5 μ 1, IOmM Dntp 1. 25 μ 1，RNasin 0. 5 μ 1,M-MLV 1口1)，在42°0條件 下孵育1小時，得到cDNA。將得到的cDNA作為PCR反應(yīng)的模板，進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。Real-time PCR 反應(yīng)體系為ddH20 17. 5 μ 1, IOmM Dntp 0. 5μ 1, IOXTaq buffer2. 5 μ 1, Taq 0. 5μ 1, F primer 0· 5 μ 1，R primer 0· 5 μ 1，Syber Green I 1 μ 1, cDNA 2 μ 1 ；PCR 反應(yīng)的條件為 94度2分鐘，94度15秒，60度30秒，共40個循環(huán)。根據(jù)以下公式計算小干擾核酸的抑制 活性，結(jié)果如表2所示。小干擾核酸抑制活性=[1_(小干擾核酸轉(zhuǎn)染后的P基因的拷貝數(shù)/小干擾核酸 轉(zhuǎn)染后的GAPDH拷貝數(shù))/ (對照孔P基因的拷貝數(shù)/對照孔GAPDH拷貝數(shù))]X 100%。
GAPDH :3_磷酸甘油醛脫氫酶基因。3_磷酸甘油醛脫氫酶基因是細(xì)胞中的看家基 因，在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，不受其他外加因素的影響，因此作為熒光定量PCR反應(yīng)的內(nèi)參照。表2 從表2可以看出，本發(fā)明提供的小干擾核酸PGENE-I至PGENE-30能夠高效的P基 因的表達(dá),特別是小干擾核酸PGENE-2、PGENE-3、PGENE-6、PGENE-9和PGENE-Il對P基因 的抑制活性分別達(dá)到85%、82%、82%、81%和82%，說明本發(fā)明提供的小干擾核酸用于抑 制P基因的表達(dá)時，對P基因表達(dá)的抑制活性高。實施例3黑素細(xì)胞內(nèi)黑色素含量的抑制(1)黑素細(xì)胞的培養(yǎng)用含有15%胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、100U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素的MEM 完全培養(yǎng)基，在溫度為37°C及CO2含量為5%的培養(yǎng)箱中對SK-MEL-3黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行培 養(yǎng)，每48小時傳代、更換新鮮培養(yǎng)基。(2)黑色素含量檢測分別檢測小干擾核酸PGENE-I至PGENE-15對黑色素含量的抑制效果，具體步驟如 下以每孔2 X IO5細(xì)胞/ImL接種于6孔培養(yǎng)板，每孔分別加入小干擾核酸 和LipOfectamineTM2000脂質(zhì)體(Invitrogen)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，小干擾核酸的最終濃度 為50nM。以無關(guān)小干擾核酸(正義鏈5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ；反義鏈 5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3)作為陰性對照。轉(zhuǎn)染后72小時棄培養(yǎng)基，用pH7. 4的 PBS 洗滌 2 次，所述 PBS 的組成為NaCl 137mmol/L, KCl 2. 7mmol/L, Na2HP044. 3mmol/ L，KH2P041. 4mmol/L ；然后每孔加500 μ L濃度為1重量％的TritonX-IOO溶液，所述 TritonX-100溶液的組成為99ml水、Iml TritonX-IOO ；迅速放置于_80°C中，凍存30分鐘； 隨后室溫融化使細(xì)胞完全破裂，離心，沉淀用濃度為10重量％的三氯乙酸和無水乙醇各洗 滌1次，12000g離心5分鐘，棄上清液，最后加入IM NaOH(含10%體積DMS0)在80°C水浴 保溫2小時后于405nm測吸光度值并計算黑色素含量的抑制率，結(jié)果如表3所示。黑色素含量的抑制率=[1-[(小干擾核酸轉(zhuǎn)染后的孔吸光度值_空白孔吸光度 值)/ (對照孔吸光度值-空白孔吸光度值)]]X100 %。
表3 從表3可以看出，本發(fā)明提供的小干擾核酸PGENE-I至PGENE-30能夠顯著的提 高黑色素含量的抑制率，特別是通過小干擾核酸PGENE-2、PGENE-3、PGENE-6、PGENE-9和 PGENE-Il的抑制，黑素細(xì)胞內(nèi)黑色素含量的抑制率達(dá)到45%以上，說明本發(fā)明提供的小干 擾核酸能夠顯著的提高黑色素含量的抑制率。實施例4人體皮膚的美白效果檢驗為了增強(qiáng)小干擾核酸的穩(wěn)定性，委托上海吉瑪公司合成化學(xué)修飾的小干擾核酸 PGENE-I至PGENE-15，其中，化學(xué)修飾是指對小干擾核酸PGENE-I至PGENE-15正義鏈的U、 C和G核苷酸戊糖的2’ -OH進(jìn)行了 2’ -氟代修飾，反義鏈U和C核苷酸戊糖的2’ -OH進(jìn)行 了 2’-氧甲基修飾。然后按表4所示的組成將各組分混合，然后攪拌均勻得到組合物1-30， 以評價含有本發(fā)明提供的小干擾核酸作為活性成分的組合物的臨床美白效果。選擇20名健康的年齡在18-55歲之間的女性志愿者，在志愿者的臀部利用GS2006 型日光模擬器(中國北京奧華設(shè)備有限公司)誘導(dǎo)皮膚的黑化，誘導(dǎo)黑化的時間為1小時， 形成直徑1. Ocm的黑化斑點，明顯黑于未黑化皮膚的膚色；之后，分別使用組合物1-15施用 于黑化的皮膚，早、晚各一次，每次用量為0. 5ml，并在施用后每一個月的最后一天觀察黑化 皮膚顏色的變化，結(jié)果如表5所示。表4 表 5 美白效果評價標(biāo)準(zhǔn)無效果無任何變化；輕微效果黑化皮膚的膚色略微變白，但仍比未黑化皮膚的膚色略黑；顯著效果黑化皮膚的膚色明顯變白與未黑化皮膚的膚色基本一致。從表5可以看出，含有本發(fā)明提供的小干擾核酸PGENE-1至PGENE-15的組合物 在使用5個月后，對黑化皮膚具有顯著的美白效果，特別是通過含有PGENE-2、PGENE-3、 PGENE-6.PGENE-9和PGENE-11的組合物，在使用1個月后，對黑化皮膚具有輕微美白效果， 使用3個月后，對黑化皮膚具有顯著的美白效果。SEQUENCE LISTING<110>蘇州瑞博生物技術(shù)有限公司<120>P基因的干擾靶位點序列和小干擾核酸及組合物和應(yīng)用<130>I 10627SRB<160>31<170>PatentIn version 3.4<210>1<211>3136<212>DNA<213> 人類(Homo sapiens)<400>1tctgagttct tacttcgaag gctgtgctcc gctcaccatc cagagcggag gtgcggacct 60taaactcact cctggagaaa gatctgcaag tgcgcagaga gaagactggc agtggagcat 120gcatctggag ggcagagacg gcaggcggta ccccggcgcg ccggcggtgg agctcctgca 180
gacgtccgtg cccagcggac tcgctgaact tgtggccggc aagcgcaggc ttcctcgggg240agccggtgga gctgacccct cgcactcctg ccccaggggg gctgccgggc agagctcttg300ggctcctgca ggccaggagt ttgcttcatt cctcacaaaa gggaggtctc actcttcttt360gccccagatg tccagctcca ggtctaaaga ttcctgcttt acagaaaaca ctcctttgct420gaggaattcc ttacaggaga aagggtcacg gtgcatacct gtttaccatc cagagttcat480cactgctgaa gagtcttggg aagacagctc tgctgactgg gagcgaagat acctgctaag540cagggaggtg tctggtctgt ctgcatctgc ctcctccgag aagggagacc ttctggacag600cccgcacatc cgactccgtc tttccaagct gaggcgctgt gtgcagtggc tgaaagtcat660gggcctgttt gcctttgtgg tgctgtgttc tattttgttc agcctatatc cggatcaagg720aaagctctgg cagctgttgg ccttatcacc gctggagaac tactccgtga accttagcag780ccacgtggac tccacgctgc tgcaggtgga cctggcaggg gccctagtgg ccagtgggcc840gagtcgtcct gggagggaag agcacatcgt ggtggagctg acccaggatg acgctttggg900ctccaggtgg cggcggccac agcaggtcac tcacaactgg acggtgtatt taaatccgag960gagaagcgag cactcagtga tgagcaggac ctttgaggta ctgaccagag agacggtgtc1020catcagcatc cgggcctccc tgcagcagac ccaggctgtc cctcttttga tggctcatca1080gtacctccgc ggaagtgtag aaacccaggt gaccatcgcg acggccatcc tcgcgggcgt1140ctacgcgctg atcatatttg agatcgtgca cagaactctg gcggccatgc tgggttccct1200tgcagcactg gcagcactgg ctgtgattgg cgatagaccc agcctgaccc atgtggtgga1260gtggattgat tttgagacgc tggccctgct gtttggcatg atgatcttag tagccatatt1320ttcagaaacg ggatttttcg attattgtgc tgtaaaggca taccggctct cccggggacg1380ggtgtgggcc atgatcatca tgctctgtct catcgcggcc gtcctctctg ccttcttgga1440caacgtcacc accatgctcc tcttcacgcc tgtgaccata aggttgtgtg aggtgctcaa1500ccttgatcca agacaagtcc tgattgcaga agtgatcttc acaaacattg gaggagctgc1560cactgccatc ggggaccctc caaatgtcat tattgtttcc aaccaagagc tgaggaagat1620gggcctggac tttgccggat tcactgcaca catgttcatt gggatttgcc ttgttctcct1680ggtctgcttt ccgctcctca gactccttta ctggaacaga aagctttata acaaggaacc1740cagtgagatt gttgaactga agcacgagat tcacgtctgg cgcctgactg ctcagcgcat1800cagcccggcc agccgcgagg agacagctgt gcgccgcctg ctgctgggga aggtgctggc1860actggagcac ctgctcgccc ggaggctgca caccttccac agacagatct cacaggagga1920caaaaattgg gagaccaata tccaagaact ccaaaaaaag cataggatat ctgacgggat1980tctgctcgcc aaatgcctga cagtgttggg atttgttatc ttcatgtttt tcctcaattc2040gtttgtccct ggcattcatc ttgatcttgg atggattgct attctgggtg ccatctggtt2100gctaatttta gctgatattc atgattttga gataattcta cacagagtgg aatgggcaac2160ccttctgttt tttgcagcgc tctttgttct gatggaggca ttggcacatc tccacttaat2220agaatatgtt ggagaacaaa ctgctttgct aataaagatg gtcccagagg agcagcgcct2280catagccgcc attgtcctgg tggtgtgggt ctcagccctg gcgtcgtccc tgattgacaa2340catcccgttc actgctacca tgattcccgt gctcctgaac ctgagccacg accctgaggt2400tggcctgccc gcaccgccgc tcatgtatgc cctggccttc ggtgcttgcc tgggaggcaa2460cgggacactg attggcgcgt cggcaaacgt cgtgtgtgca gggattgcag aacagcatgg2520CN 10
921744 A
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atatgggttctccttcatgg aatttttcagcactgttgggatgtgttatc tccttgtggcatccatctattgctcgaaga ctaaaggaaaactaccctgaccccactgtt tgaagaagaacacagtggaatagaccttga cactaacactcctcctctgtgtgtcctttc tccccaaggatcaagattcccctccagaaa aatacgtatgaagacacacatccacctaaa attgactgtaacacagtttgtttttcttgt aatcactttttgctttctgaatatagactt tctgggaaaat a11 aaaat aaactgt<210>2<211>19<212>DNA〈213〉人類(Homo sapiens)<400>2gccaggagtttgcttcatt<210>3<211>19<212>DNA〈213〉人類(Homo sapiens)<400>3ggaggtctcactcttcttt<210>4
<211>19<212>DNA〈213> 人類(Homo sapiens)<400>4ccttatcaccgctggagaa<210>5<211>19<212>DNA〈213> 人類(Homo sapiens)<400>5gcctgtgaccataaggttg<210>6<211>19<212>DNA〈213> 人類(Homo sapiens)
gctgggcttcccaatgatggttgtgtcctg2580tcatgtggtggtgggatggaattaatagac2640cttcatccatcacaacccattagtcataaa2700aaggtgcttaccctggagatgctacagaga2760ctaattcaagcgaatgttggaacaccatga2820caaaatgtagaaagatgtgagataacttac2880tttaaaaacccttcctgctatacataggaa2940ctgtttaactgtcaattctcctgaggctaa3000catgttaaaataatcagcattcaaattgta3060ggtttactgctcgtaaggaaacattttatg3120 3136
19
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uucuccagcg gugauaaggt
<210>20
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<400>20
caaccuuaug gucacaggct
<210>21
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
<400>21
uugugaagau cacuucugct
<210>22
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
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<211>21
<212>RNA
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<400>23
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<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
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<212>RNA
<213>人工序列
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<210>26
21 21 21 21 21 21<211>21 <212>RNA <213>人工序列 <400>26
aaccaucauu gggaagccct t21
<210>27
<211>21
<212>RNA
<213>人工序列
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<210>28 <211>21 <212>RNA <213>人工序列 <400>28
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<400>29
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<210>30
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<212>RNA
<213>人工序列
<400>30
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<210>31 <211>21 <212>RNA <213>人工序列 <400>31
uuagccucag gagaauugat t21
CN
[0361 [0362 [0363 [0364 [0365 [0366 [0367 [0368 [0369 [0370 [0371 [0372 [0373 [0374 [0375 [0376 [0377 [0378 [0379 [03 [0； [0； [0； [0； [0； [0 [0 [0 [0 [0 [0 [0 [0 [0 [0
380
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丨392 丨393 丨394 丨395
2權(quán)利要求
P基因的干擾靶位點序列，其特征在于，該靶位點序列具有如SEQ IDNos2 16中之一所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干擾靶位點序列，其中，所述靶序列具有如SEQID No:3、SEQ ID No :4、SEQ ID No :7、SEQ ID No 10 或 SEQ IDNo 12 所示的核苷酸序列。
3.一種小干擾核酸，其特征在于，該小干擾核酸能夠通過作用于權(quán)利要求1所述的靶 位點序列而抑制P基因的表達(dá)，該小干擾核酸的GC含量為35-60%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的小干擾核酸，其中，該小干擾核酸通過化學(xué)合成得到，或者通 過質(zhì)粒和/或病毒載體的表達(dá)而得到。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的小干擾核酸，其中，該小干擾核酸為包括正義鏈和反義鏈的 雙鏈分子，所述正義鏈和反義鏈的長度分別為15-27個核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的小干擾核酸，其中，所述正義鏈和反義鏈的長度分別為19-21 個核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的小干擾核酸，其中，該小干擾核酸具有PGENE-1、PGENE-2、 PGENE-3、PGENE-4、PGENE-5、PGENE-6、PGENE-7、PGENE-8、PGENE-9、PGENE-IO, PGENE-IU PGENE-12、PGENE-13、PGENE-14 或 PGENE-15 所示的核苷酸序列，或者具有對 PGENE-1、 PGENE-2、PGENE-3、PGENE-4、PGENE-5、PGENE-6、PGENE-7、PGENE-8、PGENE-9、PGENE-IO, PGENE-11、PGENE-12、PGENE-13, PGENE-14或PGENE-15所示的核苷酸序列進(jìn)行化學(xué)修飾所 得到的核苷酸序列，其中，PGENE--1正義鏈5，-GCCAGGA⑶UUGCUUCAUUdTdT--3反義鏈5，-AAUGAAGCAAACUCCUGGCdTdT--3PGENE--2正義鏈5，-GGAG⑶CUCACUCUUCUUUdTdT--3反義鏈5，-AAAGAAGAiiUGAGACCUCCdTdT--3PGENE--3正義鏈5，-CCUUAUCACCGCUGGAGAAdTdT--3反義鏈5，-UUCUCCAGCG⑶GAUAAGGdTdT--3PGENE--4正義鏈5，-GCCU ⑶ GACCAUAAGiiUUGdTdT--3反義鏈5，-CAACCUUAUG⑶CACAGGCdTdT--3PGENE--5正義鏈5，-GCAGAA⑶GAUCUUCACAAdTdT--3反義鏈5，-UU⑶GAAGAUCACUUCUGCdTdT--3PGENE--6正義鏈5，-CCGGAUUCACUGCACACAUdTdT--3反義鏈5，-AUGUGUGCA⑶GAAUCCGGdTdT--3PGENE--7正義鏈5，-GGAGACCAAUAUCCAAGAAdTdT--3反義鏈5，-UUCUUGGAUAUUG⑶CUCCdTdT--3PGENE--8正義鏈5，-CCCUGGCAUUCAUCUUGAUdTdT--3反義鏈5，-AUCAAGAUGAAUGCCAGGGdTdT--3PGENE--9正義鏈5，-G⑶GCCAUCUGGUUGCUAAdTdT--3反義鏈5，-UUAGCAACCAGAUGGCACCdTdT--3PGENE--10正義鏈5，-GGGCUUCCCAAUGAUGGUUdTdT--3反義鏈5，-AACCAUCAUUGGGAAGCCCdTdT--3PGENE--11正義鏈5，-GGUU ⑶⑶ CCUGCACUGUUdTdT--3反義鏈5，-AACAGUGCAGGACACAACCdTdT-3，；PGENE-12 正義鏈5’ -GCACUGUUGGGAU⑶⑶UAdTdT-3’ 反義鏈5，-UAACACAUCCCAACA⑶GCdTdT-3，；PGENE-13 正義鏈5’ -GCUUACCCUGGAGAUGCUAdTdT-3’ 反義鏈5，-UAGCAUCUCCAGGGUAAGCdTdT-3，；PGENE-14 正義鏈5’ -GGAAUAGACCUUGACACUAdTdT-3’ 反義鏈5，-UA⑶⑶CAAGGUCUAUUCCdTdT-3，；PGENE-15 正義鏈5’ -UCAAUUCUCCUGAGGCUAAdTdT-3’ 反義鏈5’ -UUAGCCUCAGGAGAAUUGAdTdT-3，。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的小干擾核酸，其中，該小干擾核酸具有PGENE-2、PGENE-3、 PGENE-6、PGENE-9或PGENE-Il所示的核苷酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的小干擾核酸，其中，所述化學(xué)修飾為如下修飾中的至少一種(1)對小干擾核酸的核苷酸序列中連接核苷酸的磷酸二酯鍵的修飾；(2)對小干擾核酸的核苷酸序列中核糖的修飾；(3)對小干擾核酸的核苷酸序列中堿基的修飾。
10.一種用于抑制黑色素生成和沉積或祛除黑色素的化妝品組合物，其特征在于，該化 妝品組合物含有權(quán)利要求3-9中的任意一項所述的小干擾核酸作為活性成分。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的化妝品組合物，其中，所述化妝品組合物還含有載體，所述 載體選自動植物油、烴油、酯、高級脂肪酸和高級脂肪醇中的一種或幾種。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的化妝品組合物，其中，相對于100重量份的小干擾核酸，所 述載體的含量為1000-10000000重量份。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的化妝品組合物，其中，所述化妝品組合物還含其它用 于化妝品組合物的成分，所述其它用于化妝品組合物的成分選自保濕劑、著色劑、防腐劑、 增稠劑、抗氧化劑、表面活性劑和佐劑中的一種或幾種。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的化妝品組合物，其中，相對于100重量份的小干擾核酸，所 述其它用于化妝品組合物的成分的含量為1000-10000000重量份。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的化妝品組合物，其中，該化妝品組合物為乳劑、膏劑、液劑、 氣霧劑或粉劑。
16.權(quán)利要求3-9中的任意一項所述的小干擾核酸在制備用于抑制黑色素生成和沉積 或祛除黑色素的化妝品組合物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了P基因的干擾靶位點序列，用于抑制P基因表達(dá)的小核酸，以及含有該小干擾核酸的化妝品組合物和該小干擾核酸在制備用于抑制黑色素生成和沉積或祛除黑色素的化妝品組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的小干擾核酸對P基因表達(dá)的抑制活性高，能夠有效地抑制黑色素生成和沉積。
文檔編號C12N15/11GK101921744SQ20091014732
公開日2010年12月22日 申請日期2009年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月11日
發(fā)明者張鴻雁, 梁子才 申請人:蘇州瑞博生物技術(shù)有限公司