專利名稱：：新的干細胞系、其應用以及培養(yǎng)方法新的干細胞系、其應用以及培養(yǎng)方法本發(fā)明涉及來自正在生長的鹿(鹿科(Cervidae))角的新的干細胞系，和所述細胞在人和動物中重構結(jié)締組織，優(yōu)選地骨、軟骨或脂肪組織中的應用，以及正在生長的鹿角組織用于得到被命名為MIC-I的穩(wěn)定的干細胞系的應用。本發(fā)明的另一個方面是用于培養(yǎng)如此獲得的細胞系的方法。尋找用于重構耳朵(earlobe)和鼻子的軟骨網(wǎng)格(lattice)的理想材料已經(jīng)有一百多年了，并且仍在積極地尋求中。自體肋骨軟骨已經(jīng)在面部外科手術中用作重構材料，并且仍在最經(jīng)常被如此使用。不幸的是，獲得它所需的時間使該程序大大地復雜化，使受試者經(jīng)受較大的術后不適，并且增加了在取樣位點處隨后出現(xiàn)并發(fā)癥的可能性。而且，在兒童中，可用于收獲的肋骨軟骨的量常常太少，以致于不能重構耳朵或鼻子；而在成年人中，它可能是鈣化的和不能用的。在尋找理想的有機重構材料中的重要一步是起始于20世紀90年代期間的Vacanti等人的研究。該開創(chuàng)性研究使用了合成的、生物相容的、生物可降解的且多孔的聚合物網(wǎng)狀物，其用分離的人軟骨細胞進行了浸漬。能夠離體生長的軟骨細胞的數(shù)目是有限的，然而，它對于再生效率有著直接的重要性。該技術是非常昂貴、繁瑣的，并且需要專業(yè)設備。許多植入物還隨著時間過去而失去了其形狀。在大多數(shù)情況下，特別的困難起因于物種相容性的問題，這是因為，針對所引入的外來組織發(fā)生強烈的免疫反應，這導致植入物排斥。21世紀初是關于在所有種類的組織(包括結(jié)締組織)的再生和重構中使用干細胞的非常活躍發(fā)展的時期。干細胞以在體內(nèi)以及在體外均具有大的增殖潛力為特征，并且，能夠植入它們是對于移植學中的顯著進步來說的一個契機。然而，在大多數(shù)組織的情況下，非常難以獲得確定的細胞系。此外，收集人干細胞需承擔倫理學問題，以及轉(zhuǎn)移病毒性疾病和腫瘤的風險?，F(xiàn)有技術揭示了僅僅與從各種人組織獲得專門分化為成骨細胞的干細胞有關的解決方案。申請WO2005/085422和US2005/0048644描述了從脂肪組織中分離的干細胞，其被用于治療運動器疾病。申請WO2005/038012揭示了從人胎兒組織獲得能夠分化為成骨細胞和成軟骨細胞的干細胞的方法。申請2007/0122902揭示了從胎盤血分離和培養(yǎng)多能干細胞的方法。還進行了一些嘗試以基因修飾能夠再生出軟骨和骨的細胞，如專利說明書US6398816所敘述的。最多的倫理學爭論由涉及從胚胎組織分離干細胞的申請(W003068937A2.W002064755A2、WO0038583A1)而引起。在現(xiàn)有技術中被廣泛描述的人干細胞的應用引發(fā)了許多問題，這些問題是需要在這方面繼續(xù)進行研究的證據(jù)。一些主要的問題是由使用胚胎組織所引發(fā)的倫理學顧慮，遺傳缺陷的危險，以及轉(zhuǎn)移病毒性疾病和腫瘤的風險。因此，真實而迫切地需要這樣的干細胞系，其應用將會排除上述問題的風險。每年，成熟的鹿(鹿科)角(其由骨組織構成)被丟棄并迅速重新生長。在出生后，它作為總是存在于頂孔(foramen)上的角柄(pedicel)的延伸進行發(fā)育。生長區(qū)、主干芽基(stemblastema)和鹿角起于頂孔的特定區(qū)域，即所謂的鹿角發(fā)生性骨膜(antlerogenicperiosteum)。芽和正在生長的鹿角由特殊形式的骨-軟骨(其是一種軟骨和骨的混合物)構成。鹿角出現(xiàn)于鹿科39個物種的所有雄性中。鹿的鹿角生長、其形狀和隨后的礦化是復雜并同時迅速的過程。鹿角由于所謂的軟骨內(nèi)成骨過程而生長。在我們的氣候帶中，在從四月至六月的這三個月期間生長是特別迅速的。兩厘米的日生長使得正在生長的鹿角成為哺乳動物中生長最快的器官之一。這需要許多類型細胞的激活和合作，而干細胞在該過程的起始和繼續(xù)中起著特殊的作用。鹿角發(fā)生性細胞具有間充質(zhì)起源，并且它們中的一些可被認為是成年體細胞干細胞。現(xiàn)有技術描述了鹿角組織的特性，所述鹿角組織被認為是哺乳動物組織中生長最快的骨形式。已進行了一些嘗試以利用該組織的生長特性，主要通過分離出生長因子。申請WO93/19085揭示了分離出生長因子以作為能夠再生受損骨組織的物質(zhì)的方法。作者揭示了獲得分離自梅花鹿(Cervusnippon)鹿角的提取物的方法，所述提取物刺激造血干細胞和巨核細胞的生長。申請WO2004/112806揭示了用于治療神經(jīng)元功能障礙的組合物，其基于從鹿角獲得的生長因子標志物。然而，到目前為止，已證明不可能從鹿角獲得穩(wěn)定的干細胞系(其可以成功地用于重構結(jié)締組織損傷)，也沒有培養(yǎng)其的方法。本發(fā)明的目標是獲得穩(wěn)定的干細胞系，其用于在人和動物中重構結(jié)締組織，優(yōu)選地軟骨、骨或脂肪組織。此外，本發(fā)明的目標是差地誘導免疫應答的干細胞系，這將使得它們能夠用于異種植入物中，即是跨物種的。本發(fā)明的一個特別的目標是獲得用于培養(yǎng)這種類型的細胞的方法。本發(fā)明的目標還是獲得此類干細胞系，所述干細胞系的應用將會繞開倫理學顧慮、形成遺傳缺陷的危險以及病毒性疾病和腫瘤轉(zhuǎn)移的風險。出乎意料地，上述目標已在本發(fā)明中達到。本發(fā)明的主題是應用來自正在生長的鹿角的組織，優(yōu)選地來自正在生長的鹿角的側(cè)支(lateraloutgrowth)尖端的組織，以獲得干細胞系。反過來，本發(fā)明的另一個主題是所獲得的干細胞系在制備用作跨物種植入物的制劑中的應用。本發(fā)明的另一個主題是所獲得的干細胞系在制備用于重構結(jié)締組織損傷的制劑中的應用，所述結(jié)締組織優(yōu)選地為骨、軟骨或脂肪組織。本發(fā)明的下一個主題是源于正在生長的鹿(鹿科)角的被命名為MIC-I的新的干細胞系，其以登錄號DSMACC2854保藏在DSMZ庫中。本發(fā)明的下一個主題是MIC-I細胞在重構結(jié)締組織損傷中的應用，所述結(jié)締組織優(yōu)選地為骨、軟骨或脂肪組織。本發(fā)明還涉及這樣的方法，即基于原代培養(yǎng)物，直接從其中或從先前冷凍的細胞，培養(yǎng)源自正在生長的鹿角(特別是歐洲鹿)的干細胞。本發(fā)明這個方面的關鍵點在于這樣的事實從在無菌條件下收集的并均質(zhì)化的鹿角斷片(fragments)建立所述原代培養(yǎng)物，然后分離出細胞并通過使用包含10%胎牛血清、谷氨酰胺和所選抗生素的MEM作為生長培養(yǎng)基來進行培養(yǎng)，其中于37°C在5%CO2的氣氛中進行維持。在第五次傳代后，將細胞進行冷凍或者在相同的培養(yǎng)基上在上述條件下進行維持，其中在確定了正確的細胞數(shù)目(至少2X106)后，將它們在胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)的溶液中進行胰蛋白酶消化，并在完全培養(yǎng)基中進行離心。將沉淀物懸浮在新鮮的MEM中，并使用被切成對于損傷替換而言所需的尺寸的纖維蛋白海綿(fibrinsponges)來制備網(wǎng)格片段(latticefragments)。將其置于無菌小瓶(vial)中，并添加細胞懸浮液(至少2XIO6個細胞/Iml液體)。通過離心使細胞沉降在所述網(wǎng)格上，并移除上清液。出乎意料地，證實了異種細胞可以是人干細胞的替代物。在尋找此類細胞的來源的同時，將注意力轉(zhuǎn)向了鹿角，后者以其獨一無二的、獨特的生長和更新過程為特征。研究結(jié)果顯示，在參與每年鹿角更新的細胞中，存在有一群被賦予了高增殖潛力的細胞。這些細胞形成了有限的一批經(jīng)分化的細胞，它們除了參與其他過程外，尤其還參與受損的軟骨、骨和脂肪組織的再生。由于鹿角發(fā)生性細胞的分化程度低、從而誘導低水平的免疫應答，因此證實，接受由所述細胞構成的、異種的、跨物種的植入物的可能性非常大。所進行的分析以及干細胞研究得出這樣的結(jié)論，即存在有建立穩(wěn)定的干細胞系的迫切需要。出乎意料地，證實了，鹿角發(fā)生性細胞由于其低水平的分化而誘導弱的免疫應答，由于此，它們在動物和人中在異種植入物的植入和接受方面非常有用。顯示了，來源于正在生長的鹿(鹿科)角的側(cè)突(lateralprotrusions)尖端的組織可以是穩(wěn)定的干細胞系的有價值的來源。由本發(fā)明者所進行的研究顯示，許多來自鹿角發(fā)生性骨膜的這些細胞在生長過程中向上逐漸地改變它們的位置。以圖解形式呈現(xiàn)了本發(fā)明的主題，其中圖Ia和圖Ib顯示了在植入到兔耳中的軟骨之內(nèi)后，鹿角發(fā)生性細胞的蘇木精和伊紅(H+E)染色(X200)。這些細胞正在修復軟骨中的損傷。給本說明書增補了所要求保護的本發(fā)明的實施例。它們僅意在更好地闡明本解決方案的性質(zhì)，而不應當是對所要求的保護范圍的限制。實施例1干細胞系從鹿角中的分離和其應用出乎意料地，顯示了，來自正在生長的鹿角，優(yōu)選地來自正在生長的鹿(鹿科)角的側(cè)突尖端的組織切除物可以是穩(wěn)定的干細胞系的有價值的來源，這是因為，如本發(fā)明者的研究所顯示的，隨著鹿角生長，它們的位置從鹿角發(fā)生性骨膜開始緩慢地向上移動。由于上述原因，為了獲得新的干細胞系，在無菌條件和淺的極小量注射的麻醉(常用于動物治療)下，收集正在生長的鹿(鹿科)角的頂端側(cè)突的圓形斷片(1.5CmX0.2mm)。通過使用光學顯微術，確定了，切片的中心部分被血管占據(jù)，其附近是眾多的、小的、稠密充填的細胞。在外圍，這些細胞的數(shù)目大大增加。所述細胞的一部分較大和在形態(tài)學上更為成熟，并且令人想起軟骨細胞(成軟骨細胞、軟骨細胞)。在這些細胞之間存在著具有數(shù)目漸增的膠原纖維的基質(zhì)。正在生長的鹿角的外層是神經(jīng)支配的、血管化的帶毛皮膚，即所謂的鹿茸(velvet)。在移去該層后，以機械方式使切片降解直至獲得細微的斷片，對徑為幾百微米。借助于遷移來分離增殖性細胞。從分離出的細胞來建立原代培養(yǎng)物，其中使用添加有10%胎牛血清以及青霉素和鏈霉素溶液的培養(yǎng)基。液體占生長室容積的至少20%。培養(yǎng)物在標準條件下于37°C在包含5%CO2的氣氛中進行維持，通過至少三次傳代。將所得到的細胞系進行冷凍，并在標準低溫容器中保持在液氮中。當變得需要增殖該細胞系時，將它解凍并且以相同的方式進一步培養(yǎng)經(jīng)過對于產(chǎn)生足夠數(shù)目的干細胞而言所需的時間段。干細胞的存在通過經(jīng)培養(yǎng)的細胞的實際永生性、不存在分化形態(tài)學特征以及陽性免疫細胞化學結(jié)果來確認。在來自鹿角切片的細胞以及經(jīng)培養(yǎng)的細胞上，通過使用電子顯微術來進行超微結(jié)構研究。特別地，檢查了小的、卵形的、未分化的細胞的超微結(jié)構。確定了，在所述兩種情況下，它們都以包含活躍的、松散包裝的染色質(zhì)和核仁的大細胞核為特征。少量的細胞質(zhì)圍繞細胞核并且包含大范圍的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、空泡和糖原顆粒。在表面上觀察到微絨毛。該研究顯示，在經(jīng)培養(yǎng)的細胞之中，總是存在具有廣泛增殖潛力的小的、非粘附的、未分化的、卵形的乳白色細胞。這些細胞以在液氮中進行冷凍并解凍后高的存活率、活性為特征。它們重建了它們的生命功能。在組織學樣品上進行的免疫細胞化學反應顯示出大量的表達抗原Ki-67和PCNA的增殖性細胞。位于正在生長的鹿角中心的血管附近和之中發(fā)現(xiàn)了經(jīng)標記的細胞。相當數(shù)目的具有明確地更加區(qū)帶定向化的定位的這些細胞，位于更外圍并且在緊在皮膚腺體的外分泌部分的下面被發(fā)現(xiàn)。在腺體本身之內(nèi)和在上皮的增殖層中都觀察到經(jīng)標記的細胞。關于血管增殖標志物⑶31和⑶34的存在的反應是陰性的。使用抗-Bcrpl和抗_c_kit抗體(指明干細胞)，在皮膚和其緊鄰的軟骨膜之間的強烈細胞分裂區(qū)帶中獲得了陽性鑒定。在倒置相差顯微鏡下觀察干細胞系培養(yǎng)物幾天之后，對所得到的干細胞系進行的檢查顯示，正在發(fā)生自發(fā)分裂，因為正在進行細胞分化。使用經(jīng)H+E染色的微量培養(yǎng)載玻片獲得了類似的結(jié)果。培養(yǎng)物總是具有小的、非粘附的、卵形的乳白色細胞。這些細胞隨著時間過去而變得較大并且長出外周突起，借助于所述突起，這些細胞常常相互粘附或粘附于基層。細胞生長是無限制的，并且在許多次傳代后它們?nèi)员３址至训哪芰?。對于從鹿角獲得的干細胞的應用進行了研究以回答經(jīng)培養(yǎng)的異種細胞在相異組織中是否將會存活和承擔其生命功能這一問題。為了確定這一點，嘗試著使用來自正在生長的鹿角的干細胞異種植入物在兔耳軟骨中使損傷再生。從在無菌條件下收集的并經(jīng)降解的正在生長的鹿角斷片建立原代培養(yǎng)物，分離出細胞并通過使用具有10%胎牛血清以及谷氨酰胺和所選抗生素的溶液的MEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，其中于37°C在包含5%CO2的氣氛中進行維持。在第五次傳代后，將細胞進行冷凍或者將培養(yǎng)物在相同的培養(yǎng)基中在上述條件下進行維持。在出現(xiàn)合適數(shù)目的細胞(至少2XIO6)后，使用在0.02%EDTA中的胰蛋白酶來使它們脫離，并且在整個培養(yǎng)基中進行離心。將沉淀物懸浮在新鮮的MEM中，并使用被切成對于損傷替換而言所需的尺寸的纖維蛋白海綿來制備網(wǎng)格片段。將其置于無菌小瓶中，并添加細胞懸浮液(至少2XIO6個細胞/Iml液體)。通過離心使細胞沉降在所述網(wǎng)格上，并移除上清液。所述植入物由在網(wǎng)格(其為纖維蛋白海綿)上的根據(jù)本發(fā)明而獲得的經(jīng)培養(yǎng)的細胞構成。在實驗(E組)和對照(C組)植入后，在同時進行的臨床觀察期間觀察愈合。所有參加試驗的動物良好地經(jīng)受了外科手術。術后傷口經(jīng)歷了迅速而正確的愈合。手術后8天去除縫線。在由懸掛在纖維蛋白海綿上的干細胞所構成的軟骨膜內(nèi)植入物的位點處，所述干細胞參與再生過程，而不具有免疫滴度，也沒有植入物排斥。強烈的再生過程導致在該實驗的起初3周中軟骨厚度出現(xiàn)明顯的增加。然后，該過程逐漸慢下來。在該實驗的第7周期間，新形成的耳朵結(jié)構軟骨被未改變的皮膚所覆蓋，稍微不平，并且比周圍的軟骨厚大約15%。在接下來的2周中，未觀察到耳朵厚度的額外增加。移植入對照兔中的于生理鹽水中進行浸泡的纖維蛋白海綿經(jīng)歷了降解，而沒有壞死或免疫滴度，但其中植入了纖維蛋白海綿的區(qū)域仍是凸起的。9周后，這些點仍然顯著更薄，并且兩側(cè)均由未改變的皮膚覆蓋。在此，沒有觀察到再生過程，只有瘢痕形成。在第4周期間，在再生區(qū)域的外圍四周，觀察到大量排列成帶的增殖性的、未分化的細胞。在某些區(qū)域，在它們之間出現(xiàn)小血管。在植入物的中心，細胞布局變得更稀疏，并且在它們之間出現(xiàn)膠原纖維。起初，它們具有規(guī)則的帶狀布局，隨后，它們的布局變得混亂，常常交織在一起。眾多的成纖維細胞和纖維細胞變得定位于膠原纖維之間，并且較不經(jīng)常存在軟骨細胞，以及出現(xiàn)淋巴細胞和嗜酸性粒細胞的局部積累。再生區(qū)帶的中心被基底基質(zhì)所占據(jù)，后者經(jīng)歷通過眾多結(jié)締組織細胞(例如成纖維細胞、成軟骨細胞、成骨細胞)以及眾多濃縮基質(zhì)(condensedmatrix)結(jié)構來進行的組構和重新構造。在形態(tài)學上，這些結(jié)構類似于骨_軟骨棒和骨棒，其包含帶有活性成骨細胞的孔。9周后，觀察到細胞數(shù)目減少，而同時膠原纖維數(shù)目增加。在更為礦化的基底基質(zhì)中觀察到眾多鈣化和單個骨化中心。所進行的免疫細胞化學研究使得能夠在植入物內(nèi)定位表達干細胞所特征性的蛋白質(zhì)Thy-I和CX-CR4的細胞。發(fā)現(xiàn)經(jīng)標記的細胞鄰近血管和在血管內(nèi)，以及在位于植入物和耳朵軟骨之間邊界處以及位于骨-軟骨棒重構區(qū)帶處的強烈增殖性的、未分化的細胞的區(qū)帶中。電子顯微術使我們能夠得出下面的結(jié)論在4周和9周時的再生區(qū)帶的電子顯微術圖像中的大多數(shù)之中，觀察到相對較多的細胞，隨同大量膠原纖維一起。在再生3周后，它們的細胞質(zhì)包含大范圍的具有常常膨脹的潴泡的粗面ER、眾多具有均一的基質(zhì)和輪廓不清晰的嵴的線粒體以及眾多空泡。這些細胞中的細胞核包含大量的松散編織的染色質(zhì)。還觀察到小的、被膜的細胞質(zhì)碎片，它們從細胞中脫離并且變成細胞外基質(zhì)的一部分并參與其礦化。在該實驗的第9周期間，細胞數(shù)目更少，但是膠原的量增長。在許多細胞中，細胞膜和核被膜顯示出內(nèi)陷，并且染色質(zhì)變得濃縮。眾多細胞經(jīng)歷凋亡，并且顯示出凋亡細胞所典型的細胞核，其中染色質(zhì)濃縮，并且它們的細胞質(zhì)變得片段化。在3周后，軟骨生長明顯減慢，而在9周后，在耳朵中的軟骨結(jié)構之中的損傷被完全修復。在此，電子顯微術顯示出眾多的凋亡細胞。凋亡負責正在生長的鹿角的形態(tài)發(fā)生并且也是對再生發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的一種機制，其尤其限制了過度的細胞生長。在骨生長和重新構造期間，在骨骼發(fā)育的過程中，也出現(xiàn)類似的調(diào)節(jié)過程。通過使用電泳，將實驗和對照動物的血清分級分離成諸如白蛋白、α工球蛋白、α2球蛋白、^球蛋白、02球蛋白和Y球蛋白的蛋白質(zhì)。將各個級分以絕對單位和相對單位進行定量，并計算出白蛋白對球蛋白的比率。血清蛋白質(zhì)的電泳分離表明了廣泛范圍的級分的行為，其中包括急性期蛋白和免疫球蛋白。白蛋白是陰性反應性級分，而包含在α”α2、βρβ2球蛋白級分中的蛋白質(zhì)在不同程度上和以多樣化的速率陽性地發(fā)生反應?？梢院侠淼睾雎孕g后創(chuàng)傷和組織完整性的破壞作為急性期反應的誘導劑的作用，這是因為，來自兩個組的所有動物經(jīng)歷了相同的操作程序。當比較用鹿角發(fā)生性細胞進行了植入的實驗組和對照組動物的蛋白質(zhì)模式時，我們只觀察到旦2球蛋白級分的小的增加，在統(tǒng)計學顯著性的邊界線上。這與同時觀察到的低的針對異種細胞的炎癥水平相關。有限的血管發(fā)生和大規(guī)模的膠原合成(伴隨著缺乏將可能激活蛋白水解的嗜中性粒細胞浸潤)是鹿角發(fā)生性細胞的再生活性的證據(jù)。出于同樣原因，術后動物的免疫應答是非常弱的并且不伴有植入物排斥。下表顯示了來自實驗組和對照組的兔血清蛋白質(zhì)的電泳分離。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>“根據(jù)本發(fā)明而獲得的鹿角發(fā)生性細胞不被不同物種(兔)的代表性組的動物所排斥。相反地，它們隨同容忍了它們的存在的宿主組織一起參與了軟骨的再生。這促進了這樣的推測，即也存在在人中使用以此方式獲得的干細胞的現(xiàn)實可能性。根據(jù)本發(fā)明的細胞植入物使得能夠避免在使用標準方法時所遇到的在人中進行結(jié)締組織再生中的一系列困難，所述標準方法具有轉(zhuǎn)移病毒性或遺傳性疾病或腫瘤的風險。還避免了與為此目的而獲得人干細胞相關的倫理學顧慮。在鹿角發(fā)生性細胞植入方面的成功嘗試表明，由于組織相容性抗原的有限的表達，因而存在有很大的在再生醫(yī)學中使用異種干細胞的可能性。因此，在將來，鹿角發(fā)生性細胞可以用于結(jié)締組織的重構。實施例2MIC-I干細胞系的建立以及其特征在經(jīng)由極小量注射的麻醉下，在無菌條件下，在最強烈生長的時期(五月)，從正在生長的赤鹿(Cervuselaphus)鹿角的尖端側(cè)部斷片(tiplateralfragments)收集1.5cmX0.2mm的圓形切除物。以機械方式使所收集的切除物降解，直至獲得100至900微米的細微的斷片。保留一半的經(jīng)降解的組織以用于光學和電子顯微鏡分析。借助于細胞遷移，從經(jīng)降解的鹿角的部分中分離出增殖性細胞。將分離出的細胞置于培養(yǎng)瓶中。所用的培養(yǎng)基為來自CAMBREX的SmGM-2SingleQuots，其具有ImM/mlL-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和0.lmg/ml鏈霉素(SIGMA，Germany)。將細胞置于培養(yǎng)箱中，在那里它們在標準條件下于+37°C在包含5%CO2的氣氛中生長。以每周大約5百萬個細胞的效率，將該細胞系維持四個月。將所得到的MIC-I細胞系進行冷凍，并置于在低溫容器中的-176°C液氮之中。隨后，進行比較的和ID檢查。將用于顯微鏡分析的樣品在4%經(jīng)緩沖的福爾馬林中進行固定，脫水，并包埋在石蠟塊中。將顯微鏡載玻片進行H+E染色。用下列抗體進行免疫細胞化學分析抗-Ki-67和抗-PcNA(增殖標志物)，抗-⑶-31和抗-⑶-34(血管標志物)，以及抗-CX-CR4、抗-c-kit、抗-Thy-I和抗-Bcrp-I(干細胞標志物)。在卡可酸鹽緩沖液(0.ΙΜ,ρΗ7.4)中的2.5%戊二醛之中固定用于電子顯微術的材料，然后脫水并包埋在Epon812樹脂中。用常規(guī)方法使切片形成反差(contrast)，并在JEM-100B電子顯微鏡上進行觀察。在微量培養(yǎng)制備物上進行免疫細胞化學反應，以嘗試用特異性標志物來鑒定干細胞抗-CXCR4、抗-c-kit、抗-Thy-I和抗-Bcrp-I。使用抗_c_kit和抗-Thy-I抗體，只在小的、卵形的、頻繁分裂的細胞的情況下獲得了特異的、陽性的膜反應。我們未觀察到抗原Bcrp-I和CXCR4的表達。在具有細胞質(zhì)突起的更加分化的細胞中未觀察到上面提及的抗原的表達。用針對抗-Bcrp-I和抗-c-kit的抗體，使用針對干細胞的特異性抗體，在石蠟切片上也獲得了陽性免疫細胞化學結(jié)果。使用電子顯微術來研究經(jīng)培養(yǎng)的細胞和來自鹿角切片的細胞的超微結(jié)構。我們主要檢查了小的、卵形的、未分化的細胞的超微結(jié)構。在這兩種情況下，它們都以具有松散的染色質(zhì)和核仁的大細胞核為特征。少量的細胞質(zhì)圍繞細胞核并且包含大范圍的粗面ER、線粒體、空泡和糖原顆粒。在細胞膜上觀察到微絨毛。MIC-I干細胞系的基因分型在11種多態(tài)的二和四核苷酸微衛(wèi)星的基礎上，測定了來自赤鹿的MIC-I干細胞系的基因型。為了進行比較，使用了梅花鹿(東北梅花鹿(Cervusnipponhortulorum)DNA。使用QIAGENMultiplexPCRKit(Qiagen)以及合適的正向和反向引物對，制備了PCR反應混合物。正向引物的5’末端用熒光染料FAM、HEX或TET進行標記，并且在合成之后用HPLC進行純化。在下面的條件下，在GeneAmpPCRSystem9700(AppliedBiosystem)循環(huán)變溫器中進行PCR-初始變性95°C，15分鐘<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>-最終延伸72°C，10分鐘在ABIPrism310(AppliedBiosystem)系統(tǒng)上，使用毛細管電泳來進行基因分型。MIC-I干細胞系的基因型<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>bp-堿基對引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>MIC-I干細胞系于2007年7月26日保藏在DSMZ(德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH),Braunschweig),其是具有用于專利保護的國際保藏單位(IDA)資格的機構。該專利保藏物被指定有編號DSMACC2854。實施例3MIC-I細胞系在異種植入物中的應用在無菌條件下從處于麻醉下的動物中收集正在生長的鹿角的1.5cmX0.2mm的圓形斷片。將所收集的組織斷片分為四個部分。將用于細胞培養(yǎng)的那部分置于試管中，浸沒在IOml培養(yǎng)基(添加有100U.I./ml青霉素和0.lmg/ml鏈霉素的來自Cambrex的MEM)中。在實驗室條件下，將切片在含有所述抗生素的培養(yǎng)基中洗滌幾次，接著，以機械方式使其降解成對徑為幾百微米的小斷片。借助于其自發(fā)遷移，從該材料中分離出增殖性細胞。在分離后，將細胞懸浮在具有10%胎牛血清、100U.I./ml青霉素、0.lmg/ml鏈霉素、ImM/mlL-谷氨酰胺的完全培養(yǎng)基(以占培養(yǎng)室至少20%的體積)中，然后，將它們轉(zhuǎn)移至25cm2的培養(yǎng)瓶中。在Kendro培養(yǎng)箱中，在標準條件下，意即于+37°C和在5%CO2中對該培養(yǎng)物進行維持。在獲得完整的單層后，用具有0.02%EDTA的0.05%胰蛋白酶使細胞從培養(yǎng)瓶上脫離，并將其轉(zhuǎn)移至連續(xù)培養(yǎng)瓶中。從這樣的原代細胞系得到連續(xù)細胞系，并且在第五次傳代后在添加10%二甲亞砜(DMSO)的情況下使細胞冷凍并保存于_176°C的液氮中。為了制備用于植入的細胞，使第五代解凍，并將細胞在相同的完全培養(yǎng)基中進一步進行培養(yǎng)。在產(chǎn)生了合適數(shù)目的細胞(5X106)后，使用胰蛋白酶和EDTA將它們從基層上脫離，然后在培養(yǎng)基中進行離心。培養(yǎng)基中的血清使胰蛋白酶失活，并且將所產(chǎn)生的沉淀物懸浮在沒有血清、L-谷氨酰胺而且也沒有抗生素的新鮮MEM中。在BUrker室中對細胞進行計數(shù)，并以2XIO6個細胞/植入物取樣出懸浮液以用于沉降在網(wǎng)格上。將纖維蛋白海綿用于此目的，它們也在外科手術中使用以用于止血，在此用作用于粘附細胞的載體。將海綿置于無菌的塑料小瓶中，并添加包含2XIO6個細胞/Iml干凈MEM的懸浮液。然后，將此進行離心，從而細胞沉降到海綿上。離心在Hereus離心機上以大約700rpm進行10分鐘。傾析掉上清液，以準備將在纖維蛋白海綿上的細胞進行植入。關于植入，我們使用了來自如上所進行的培養(yǎng)的細胞，其在用于植入的網(wǎng)格(其為纖維蛋白海綿)上。該實驗采用了12只兔，其中6只在實驗組(E)中，而6只作為對照組(C)。這些是重3.5-4.Okg的8月齡的白色加利福尼亞兔。在耳朵的中間，在其外側(cè)我們進行了標準的外科手術準備。對皮膚表面進行刮毛、清潔和消毒。從耳朵邊緣大約Icm處，我們切除了IXIcm的一瓣皮膚和軟骨膜。然后，我們切除和移去了0.8X0.8cm的一片裸露的軟骨。使用電凝法來阻塞小的、流血的血管。在6只E組兔中，采用一塊用細胞懸浮液浸透的切成一定尺寸的纖維蛋白海綿來填充軟骨損傷，總是在右側(cè)。對6只C組兔，施行相同的操作程序，這些兔植入了用生理鹽水浸透的纖維蛋白海綿。然后，用皮膚-軟骨膜瓣覆蓋植入物。用單層縫線來閉合傷口。然后，用過氧化氫洗滌傷口，并讓其保持無遮蓋的狀態(tài)，而不進行包扎。使用肌內(nèi)施用的50000U.I./kg青霉素，在抗生素保護下進行外科手術。手術后4和9周，借助于臨床觀察，從所述兩組動物中的植入物位點之中離體收集實驗材料。以穿過耳朵的整個厚度的切除物形式來收集材料，其包含植入物和動物自身的軟骨。固定所獲得的材料，以用于免疫細胞化學檢查和電子顯微術。關于免疫細胞化學，所述材料在4%經(jīng)緩沖的福爾馬林中進行固定，脫水，并包埋在石蠟中。光學顯微術切片用H+E和甲苯胺(T)進行染色。將石蠟切片用于免疫細胞化學，其中使用抗-CX-CR4、抗-c-kit和抗-Thy-I抗體，它們識別對于干細胞來說特異的蛋白質(zhì)。在卡可酸鹽緩沖液(0.ΙΜ,ρΗ7.4)中的2.5%戊二醛之中固定用于電子顯微術的材料，然后脫水并包埋在Epon812樹脂中。在手術后4周，在2ml從側(cè)耳靜脈收集的血液樣品上進行血清蛋白質(zhì)的電泳。以標準方式，將血液于37°C溫育0.5小時，然后離心5分鐘以分離血清。使用高電壓水平電泳，在經(jīng)緩沖的瓊脂糖凝膠上施行分離。使用光密度計裝置在600nm處進行定量，從而獲得各個蛋白質(zhì)級分。還測定了白蛋白對球蛋白的比率。從電泳獲得的結(jié)果經(jīng)過統(tǒng)計學分析，其中使用Student'st-檢驗，以0.05的α水平。該檢驗使用Statistica7.0(StatSoft)來進行。對照和實驗動物的血清的電泳分離產(chǎn)生諸如白蛋白、、球蛋白、^2球蛋白、球蛋白、日2球蛋白和Y球蛋白的蛋白質(zhì)級分。將各個級分以絕對值和相對值進行量化，并計算出白蛋白對球蛋白的比率。電泳顯示了廣泛范圍的級分的行為，其中包括急性期蛋白和免疫球蛋白。在該情況下，白蛋白是陰性應答性級分，而在h、α2>運工和β2球蛋白級分中的蛋白質(zhì)在不同程度上和以多樣化的速率陽性地發(fā)生反應?？梢院侠淼睾雎孕g后創(chuàng)傷和組織完整性的破壞作為急性期反應的誘導劑的作用，這是因為，來自兩個組的所有動物經(jīng)歷了相同的操作程序。當比較用鹿角發(fā)生性細胞進行了植入的實驗組和對照組動物的蛋白質(zhì)模式時，我們只觀察到β2球蛋白級分的小的增加，在統(tǒng)計學顯著性的邊界線上。這與同時觀察到的低的針對異種細胞的炎癥水平相關。有限的血管發(fā)生和大規(guī)模的膠原合成(伴隨著缺乏將可能激活蛋白水解的嗜中性粒細胞浸潤)是鹿角發(fā)生性細胞的再生活性的證據(jù)。出于同樣原因，術后動物的免疫應答是非常弱的并且不伴有植入物排斥。下表顯示了來自實驗組和對照組的兔血清蛋白質(zhì)的電泳分離。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>權利要求正在生長的鹿角的組織在建立新的干細胞系中的應用。2.根據(jù)權利要求1的應用，其特征在于，所述干細胞系從正在生長的鹿角的尖端側(cè)部斷片獲得。3.根據(jù)權利要求1的應用，其特征在于，將所獲得的干細胞系用于制備用于植入的制劑，優(yōu)選地異種植入物。4.根據(jù)權利要求1的應用，其特征在于，將所獲得的干細胞系用于制備用于重構結(jié)締組織損傷的制劑，所述結(jié)締組織優(yōu)選地選自軟骨、骨或脂肪組織。5.源自正在生長的鹿(鹿科)角的被命名為MIC-I的新的干細胞系，其以登錄號DSMACC2854保藏在DSMZ。6.根據(jù)權利要求5的新的干細胞系，其用于在重構結(jié)締組織損傷中應用，所述結(jié)締組織優(yōu)選地選自軟骨、骨或脂肪組織。7.用于以在5%CO2的氣氛中和在37°C下的原代培養(yǎng)物開始，直接從該培養(yǎng)物或者從先前冷凍的細胞，培養(yǎng)源自正在生長的鹿角，特別是赤鹿鹿角的干細胞的方法，其特征在于，從在無菌條件下收集的并磨成粉狀的正在生長的鹿角斷片建立所述原代培養(yǎng)物，分離出細胞并在包含10%胎牛血清以及谷氨酰胺和所選抗生素的溶液的MEM培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；在第五次傳代后，將細胞進行冷凍或者在相同的培養(yǎng)基上在上面所描述的條件下進一步進行培養(yǎng)。當產(chǎn)生至少2X106個細胞時，使用胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)來使它們脫離，在培養(yǎng)基中進行離心，并將所獲得的沉淀物重懸浮在干凈的MEM中；從具有對于替換所失去的組織的體積而言所需的尺寸的纖維蛋白海綿塊來制備網(wǎng)格片段，由此將它們放置在無菌小瓶中，并補充包含至少2XIO6個細胞/Iml液體的細胞懸浮液，然后通過離心使細胞沉降在海綿上，隨后傾析掉上清液。全文摘要來自正在生長的鹿(鹿科(Cervidae))角的新的干細胞系，和所述細胞在人和動物中重構結(jié)締組織，優(yōu)選地骨、軟骨或脂肪組織中的應用；以及培養(yǎng)它們的方法，和來自正在生長的鹿角的組織在制備穩(wěn)定的干細胞系MIC-1中的應用。文檔編號C12N5/077GK101808672SQ200780053496公開日2010年8月18日申請日期2007年12月10日優(yōu)先權日2007年4月25日發(fā)明者I·卡爾科辛斯基,M·博赫尼亞,M·采蓋爾斯基,W·杰維斯?jié)煽松暾埲?干細胞旋轉(zhuǎn)私人控股有限責任公司