專利名稱：：能夠產(chǎn)生白蛋白和凝血因子的已分化的無限增殖細(xì)胞系、從白血病細(xì)胞系制備該細(xì)胞系...的制作方法能夠產(chǎn)生白蛋白和凝血因子的已分化的無限增殖細(xì)胞系、從白血病細(xì)胞系制備該細(xì)胞系的方法及其用途本發(fā)明涉及源自白血病細(xì)胞系(優(yōu)選市售THP1細(xì)胞系)的能夠產(chǎn)生白蛋白和凝血因子的已分化細(xì)胞系。本發(fā)明利用了通過亞克隆從THP1白血病細(xì)胞系衍生的多能干細(xì)胞(下文中稱作"PSC-THP1",即多能干細(xì)胞-THPl)。具體而言，PSC-THP1細(xì)胞來自THP1細(xì)胞系，THP1細(xì)胞系由對(duì)THP1-CD34+/CD14+/CD90+細(xì)胞獨(dú)一的分選才支術(shù)選出。PSC-THP1，即丁111《034+/€014+/0090+多能干細(xì)胞，不借助外部誘導(dǎo)例如培養(yǎng)基或生長因子來挑選，而是僅僅借助于分離顯示至少三種干細(xì)胞表面簇合物(即CD34、CD14和CD90標(biāo)記)的標(biāo)記呈陽性的組分而選出。然后誘導(dǎo)PSC-THP1-CD34+/CD14+/CD90+細(xì)胞分化為人組織的各種表型特征，特別是人肝細(xì)胞表型。因此，本發(fā)明還涉及用于從白血病細(xì)胞系(優(yōu)選THP1)開始獲得多能干細(xì)胞系的方法，使所述多能干細(xì)胞系分化成特征在于有特定表型(尤其是人肝細(xì)胞表型)的相關(guān)已分化細(xì)胞系的方法，以及具有源自多能干細(xì)胞系？3011>1^034+/€014+/0090+的具有人肝細(xì)胞表型的細(xì)胞系用于生產(chǎn)白蛋白和凝血因子的用途及相關(guān)治療應(yīng)用。發(fā)明
背景技術(shù)：
：干細(xì)胞對(duì)于所有生物體都極其重要，其特征在于有兩種區(qū)別于其它細(xì)胞類型的特性。首先，它們構(gòu)成能夠復(fù)制的非特化細(xì)胞的連續(xù)無窮的來源。其次，干細(xì)胞具有特化的能力，可響應(yīng)局部信號(hào)分化為不同細(xì)胞類型。所述事件在受損身體組織需要的時(shí)候發(fā)生。在某些生理?xiàng)l件或?qū)嶒?yàn)條件下，干細(xì)胞被誘導(dǎo)以經(jīng)歷變化并執(zhí)行特化功能(例如肌肉中的肌細(xì)胞或肝中的肝細(xì)胞等等)。因此，干細(xì)胞具有繁殖的能力，也有經(jīng)歷變化以產(chǎn)生許多不同細(xì)胞類型的能力，最終，具有代替受損組織的潛能[1-15]。"干細(xì)胞，，的一個(gè)普遍公認(rèn)的定義是具有以下兩種特性的細(xì)胞[2]:1)無限的或長期的自我更新的能力，即長期繁殖而不分化的能力；2)產(chǎn)生具有有限增殖能力的暫時(shí)性祖細(xì)胞的能力，高度分化的細(xì)胞群(肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、血液細(xì)胞、腸細(xì)胞等等)是所述祖細(xì)胞的后代。干細(xì)胞分化為特定組織的能力隨該細(xì)胞來源及其所取自的生物體的發(fā)育階段而變化。因此，有幾種干細(xì)胞類型[2]:多能細(xì)胞，在某種意義上它們擁有分化為任何成熟動(dòng)物細(xì)胞類型的潛能，但它們不是能夠產(chǎn)生胚胎的全能細(xì)胞。在受精后的第4天或第5天(桑椹胚期)，胚胎仍由相同的胚胎細(xì)胞組成，但所述細(xì)胞不再能形成胚胎。從受精后的第5及第6天(胚泡期，存在100個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞)開始，在桑椹胚里面形成球形腔，其外部細(xì)胞團(tuán)開始分化成將形成胎盤和環(huán)繞胚胎的膜的細(xì)胞，同時(shí)內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)開始分化成將形成真正胚胎的細(xì)胞。從內(nèi)腔細(xì)胞團(tuán)分離的后者這些細(xì)胞，正好就是多能干細(xì)胞。實(shí)際上，如果將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移到子宮，它們沒有植入和發(fā)育的能力，因?yàn)槌鞘古咛ヅc其從中攝取營養(yǎng)的胎盤發(fā)育同步化，否則胚胎發(fā)育不能進(jìn)行下去。在成年人的各種組織(骨髓、肝、滑液、牙髓、心臟、腸、外周血等等)中也已經(jīng)鑒定出多能干細(xì)胞。然而，胚胎干細(xì)胞具有增殖并分化為眾多不同的細(xì)胞類型的巨大能力，這些細(xì)胞類型包括雙潛能肝卵圓細(xì)胞和肝細(xì)胞。它們是最有希望大規(guī)模生產(chǎn)的肝細(xì)胞。但是，正象胎兒細(xì)胞一樣，它們的有用性受到倫理考慮、分離困難、排斥的可能性和誘導(dǎo)腫瘤發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)的限制。5從研究成體干細(xì)胞開始的過去30年間，業(yè)已清楚地顯示干細(xì)胞存在于很多成體組織中，但它們僅能產(chǎn)生特定組織細(xì)胞。也就是說不能考慮其重新程序化的可能性。然而，最近在各種人組織中，在骨髓、大腦中、在各種器官間充質(zhì)細(xì)胞中、在臍帶血中和在外周血中，還發(fā)現(xiàn)了能夠產(chǎn)生若干細(xì)胞類型(主要有血液、肌肉和神經(jīng))的多能干細(xì)胞。研究人員一直在觀察怎樣識(shí)別它們、選擇它們，怎樣維持它們發(fā)育，和怎樣借助生長因子和其它調(diào)控蛋白誘導(dǎo)它們形成各種成熟的細(xì)胞類型。足可提及的是，在人骨髓干細(xì)胞(其它血液細(xì)胞系由其形成)中有CD14+和/或CD29+和/或CD34+和/或CD44+和/或CD45+和/或其被純化時(shí)，它們能夠重建接受輻射和化療切除劑量(ablativedoses)的患者的整體血細(xì)胞群，它們能以與所用細(xì)胞數(shù)量成比例的速率做到這點(diǎn)[l]。已知對(duì)源自臍帶或其它來源的干細(xì)胞(CD14+和/或CD29+和/或CD34+和/或CD44+和/或CD45+和/或CD71+和/或CD90+和/或,CD105+和/或CD117+造血祖細(xì)胞)移植而言，供體-受體的相容性是必不可少的。為此，已經(jīng)建立了很多骨髓和胎盤血庫。在同種異體移植情況下，尋找相容性供體可能花費(fèi)相當(dāng)長的時(shí)間；另一方面，在自體移植情況下，即干細(xì)胞來自相同移植患者(來自骨髓或外周血)，干細(xì)胞必須首先經(jīng)取出，分離、培養(yǎng)、增殖并完好地儲(chǔ)存甚至是相當(dāng)長的時(shí)間。實(shí)際上，祖干細(xì)胞(CD14+和/或CD29+和/或CD34+和/或CD44+發(fā)育能力對(duì)移植得以實(shí)現(xiàn)的能力具有重要作用[l-2]。在成年人中，各種組織(包括骨髓、外周血、肝、腸、牙髓、滑液等等)含有能夠分化為成體肝細(xì)胞的干細(xì)胞。假設(shè)可以容易地培養(yǎng)它們(離體培養(yǎng))的話，這樣的細(xì)胞的治療用途將非常令人感興趣。因?yàn)樗鼈冊(cè)醋曰颊?，所以總是可相容，沒有與倫理有關(guān)的問題[l]。成體骨髓含有造血祖細(xì)胞(來自血液)和基質(zhì)祖細(xì)胞(其形成器官支架)。造血細(xì)胞系之一的所謂"HSC"細(xì)胞長期產(chǎn)生各種細(xì)胞系，包括內(nèi)皮細(xì)胞系。骨髓間質(zhì)細(xì)胞具有同樣的能力[2]。成體血液含有造血祖干細(xì)胞。根據(jù)Huberman(2003年)的工作，在多能造血細(xì)胞中尤其可鑒別"HSC"(CD14+和/或CD34+)細(xì)胞，當(dāng)用生長因子刺激時(shí)，可分化并特化為身體許多部分(包括肝臟)的細(xì)胞類型[1-2]。在2003年，Huberman等[l]鑒定了存在于人外周血單核細(xì)胞分離物的具干細(xì)胞樣和多能特性的一組細(xì)胞(CD14+和/或CD34+)(PSC，多能干細(xì)胞)，也就是說顯示了細(xì)胞可怎樣被誘導(dǎo)獲得巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和肝細(xì)胞表型而不必與預(yù)先存在的成熟的組織融合。很不幸，這些生長在補(bǔ)充生長因子的培養(yǎng)基中的細(xì)胞在體外不是無限增殖的，在分離后30-40天內(nèi)，它們衰老死亡。當(dāng)這些細(xì)胞在不含生長因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，這種現(xiàn)象加快，即在體外分離后7-8天內(nèi)，它們衰老死亡。因此，可將由Huberman等[l]發(fā)現(xiàn)并在專利WO2006044842中闡述的多能循環(huán)CD14+/CD34+單核干細(xì)胞定義為"必死的(MORTAL)，，[l]。此外，由我們自己按照Huberman等的方法對(duì)從10位志愿者的外周血分離的PSC群進(jìn)行的關(guān)于細(xì)胞死亡的研究，在用生長因子處理的細(xì)胞中第30天時(shí)和在用無生長因子培養(yǎng)基處理的細(xì)胞中第7天時(shí)，業(yè)已顯示出p27蛋白(控制細(xì)胞凋亡的核蛋白)的重要性增加；這一資料看來確證了依賴進(jìn)行性細(xì)胞衰老的"細(xì)胞程序性死亡"的存在。這些涉及細(xì)胞死亡、衰老和凋亡的觀察報(bào)告也在BlasticonBiotechnologischeFurschungGmbH(US2005/0233447)的歐洲專利申請(qǐng)EP1436381B1或EP1506999[KremerBerndKarlFriedrich(DE);FaendrichFred(DE);RuhnkeMaren)(DE)]中提出，題目為7"Dedifferentiated,programmablestemcellsofmonocyticorigin,andtheirproductionanduse(單核細(xì)胞來源的去分化的程序性干細(xì)胞及其生產(chǎn)和應(yīng)用)"；根據(jù)Kremer等，人單核細(xì)胞來源的去分化干細(xì)胞特征為存在膜相關(guān)單核細(xì)胞特異性表面抗原CD14和存在選自CD117、CD123和CD135的至少一種多能標(biāo)記。前述專利提及通過分離人血液獲得單核細(xì)胞，并在第59段中提及，如果不能從人血液分離就直接從內(nèi)臟器官分離，例如在貧血或白血病患者的情況中。因此，以該專利內(nèi)容為基礎(chǔ)，能夠假定討i侖中的細(xì)胞有依賴進(jìn)行性細(xì)胞衰老的"細(xì)胞程序性死亡"傾向，因?yàn)樗鼈兪欠悄[瘤細(xì)胞。發(fā)明說明本發(fā)明目的是提供多能干細(xì)胞系，所述細(xì)胞系容易獲得，無限增殖(因?yàn)槠鋪碓从诎籽∷詿o限增殖)，隨時(shí)間過去穩(wěn)定，并容易分化以獲得適用于生產(chǎn)生物學(xué)分子的特化細(xì)胞系。根據(jù)本發(fā)明，達(dá)到所述目的是由于在以上權(quán)利要求中明確要求保護(hù)的解決方法。權(quán)利要求構(gòu)成了本文提供的涉及本發(fā)明的技術(shù)教導(dǎo)的組成部分。本發(fā)明一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案涉及源自無限增殖人單核白血病細(xì)胞系(優(yōu)選人細(xì)胞系THP1)的無限增殖白血病多能干細(xì)胞系。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)和刺激人單核細(xì)胞樣白血病細(xì)胞系成為無限增殖白血病多能干細(xì)胞系的方法。更具體地說，在特定實(shí)施方案中，該無限增殖單核細(xì)胞樣白血病細(xì)胞系為THP1細(xì)胞系，其通過單-雙-三克隆增殖和天然未成熟的無限繁殖THP1白血病干細(xì)胞的增殖來選出，THP1白血病干細(xì)胞顯示表示潛在多能干細(xì)胞特性的至少三種細(xì)胞表面標(biāo)記，即CD34+、CD14+和CD90+,藉此獲得PSC-THPl-CD34+eCD14+eCD90+細(xì)胞系。無限增殖PSC-THPl-CD34+eCD14+eCD90+細(xì)胞系涉及源自多能無限增殖干細(xì)胞系的無限增殖細(xì)胞系，該無限增殖細(xì)胞系具有作為人組織特征的細(xì)胞林表型，尤其是人肝細(xì)胞表型。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)無限增殖多能干細(xì)胞系分化為具有感興趣的人組織細(xì)胞林表型的衍生的(已分化)無限增殖細(xì)胞系的方法。具體而言，本發(fā)明涉及使無限增殖細(xì)胞系生的無限增殖細(xì)胞系的方法成熟的肝細(xì)胞單克隆表型和無限增殖。被誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的PSC-THPl-CD34+eCD14+eCD90+細(xì)胞成為成熟的肝細(xì)胞(PSC-THP1-EP)，因而它們可用于診斷、研究和預(yù)防及治療慢性和急性肝病。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明無限增殖成熟人肝細(xì)胞細(xì)胞系是指定為PSC-THP1-EP的細(xì)胞系，于2006年11月10日將其保藏于意大利熱那亞的高級(jí)生物技術(shù)中心-國際實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞系保藏中心(AdvancedBiotechnologyCentre-InterlabCellLineCollection(ICLC),Genoa,Italy),保藏號(hào)為ICLCPDNo.06005。無限增殖PSC-THP1-EP細(xì)胞系具有成熟的肝細(xì)胞表型。該細(xì)胞系的某些細(xì)胞標(biāo)記特征列舉如下人HLA-DRIMHCII類、CD34+、CD44+、CD68+、CD71+、CD81+、CD90+、CD105+、CD117+、TLR5、CDw328、CDwl56c、CD172g、LDLRec(LDL5/6+)+、GATA-4+、HNF-la+、麗F爭、IL-1RTl+、CK8+、CK18+、CK7-/+、CK19—/+、C-Met、a曱胎蛋白—/+、白蛋白+。所述具有成熟的肝細(xì)胞PSC-THP1-EP表型的無限增殖細(xì)胞系，顯示以下的代謝特征每2-3天的倍增細(xì)胞周期，從培養(yǎng)的第3天到第5天分泌白蛋白和凝血因子。優(yōu)選在更換培養(yǎng)基后，所述PSC-THP1-EP細(xì)胞系在培養(yǎng)的第72小時(shí)到第120小時(shí)顯示分泌白蛋白和凝血因子的特性(白蛋白在更換培養(yǎng)基后每培養(yǎng)72-120小時(shí)30-60g/l;在更換培養(yǎng)基后每培養(yǎng)72-120小時(shí)凝血因子為存在于人循環(huán)血液中的含量的5%-90%)。此外，借助PSC-THP1-EP細(xì)胞系(ICLCPDNo.06005,2006年11月10日)的多次連續(xù)分裂，業(yè)已選出新的細(xì)胞群，即指定為PSC-THP1-EP-FAST的無限增殖細(xì)胞系，其具有成熟的肝細(xì)胞表型，分離自具有如下特定代謝特征的集落每6-8小時(shí)的快速倍增細(xì)胞周期，從更換培養(yǎng)基后第3個(gè)小時(shí)開始分泌白蛋白和凝血因子，且產(chǎn)生高峰在8-12小時(shí)之間(白蛋白在更換培養(yǎng)基后每培養(yǎng)8-12小時(shí)8-10g/l;在更換培養(yǎng)基后每培養(yǎng)8-12小時(shí)凝血因子為存在于人循環(huán)血液中的含量的5%-90%)。指定為PSC-THP1-EP-FAST的本發(fā)明無限增殖人成熟肝細(xì)胞細(xì)胞系，于2006年12月15日保藏于意大利熱那亞的高級(jí)生物技術(shù)中心-國際實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞系保藏中心(ICLC),保藏號(hào)為ICLCPDNo.06008。指定為PSC-THP1-EP-FAST的無限增殖細(xì)胞系具有已分化為成熟肝細(xì)胞的多能干細(xì)胞的典型性質(zhì)。此外，它保留了來源于白血病細(xì)胞系所賦予的原有的無限增殖性，并且其基于如下若干特定代謝特征被選出快速細(xì)胞周期；每6-8小時(shí)細(xì)胞倍增，每12小時(shí)更換培養(yǎng)基(每12小時(shí)更換50-70%的培養(yǎng)基)；快速新陳代謝和分解代謝(8-12小時(shí))。該細(xì)胞系的某些細(xì)胞標(biāo)記特征列舉如下人HLA-DR1MHCII類、CD34+、CD44+、CD68+、CD71+、CD81+、CD90+、CD105+、CD117+、TLR5、CDw328、CDwl56c、CD172g、LDLRec(LDL5/6+)+、GATA-4+、麗F-la+、麗F-3卩+、IL-1RTl+、CK8+、CK18+、CK7-/+、CK19—/+、C-Met、a曱胎蛋白—/+、白蛋白+。如上所述，具有上述成熟的肝細(xì)胞表型的無限增殖細(xì)胞系源自用于產(chǎn)生白蛋白和凝血因子的PSC-THPl-CD34+eCD14+eCD90+無限增殖多能干細(xì)胞系。此外，通過聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)人HepG2細(xì)胞系(可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)獲得)與10PSC-THP1-EP細(xì)胞系的細(xì)胞融合，業(yè)已獲得新型細(xì)胞系(PSC-THP1-HEP)，其具有已分化為肝細(xì)胞和成肝細(xì)胞的多能干細(xì)胞的典型特性，并且保留了其來源于白血病細(xì)胞系所賦予的原有的無限增殖性。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明無限增殖人肝細(xì)胞細(xì)胞系是指定為PSC-THP1-HEP的細(xì)胞系，于2006年12月15日保藏于意大利熱那亞的高級(jí)生物技術(shù)中心-國際實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞系保藏中心(ICLC),保藏號(hào)為ICLCPDNo.06006。具體而言，本發(fā)明涉及所述PSC-THP1-HEP無限增殖細(xì)胞系的用途，該細(xì)胞系具有已分化為成熟的和未成熟的肝細(xì)胞的多能干細(xì)胞的典型性質(zhì)，并且保留了其來源于白血病細(xì)胞系所賦予的原有的無限增殖性。具有成熟的和未成熟的肝細(xì)胞表型的本發(fā)明PSC-THP1-HEP無限增殖細(xì)胞系的核型經(jīng)由以下實(shí)例闡明"50-52;SY/XXY,-Y,dei(l)t(l;12)(p32;ql3),+der(l)del(l)(p22p34)add(lXq21),+del(6)(p21l),+de順(p2m)，12，14,+der(14)t(3;14)(pll;pl2),+del(17)(pll),18，+marl，+mar2rHmar3,+mar4"。所述具有成熟的肝細(xì)胞PSC-THP1-HEP表型的無限增殖細(xì)胞系具有以下代謝特征每2-3天的倍增細(xì)胞周期，從培養(yǎng)的第3天一直到第7天分泌白蛋白和凝血因子。優(yōu)選在更換培養(yǎng)基后，所述PSC-THP1-HEP細(xì)胞系在培養(yǎng)的第72-144小時(shí)顯示分泌白蛋白和凝血因子的特性(白蛋白在更換培養(yǎng)基后每培養(yǎng)72-144小時(shí)30-60g/l;在更換培養(yǎng)基后每培養(yǎng)72-144小時(shí)凝血因子為存在于人循環(huán)血液中的含量的50/。-90%)。此外，通過優(yōu)選的PEG介導(dǎo)的人HepG2細(xì)胞系與PSC-THP1-EP細(xì)胞系與原代成熟的人肝細(xì)胞的細(xì)胞融合，業(yè)已獲得新型細(xì)胞系，該細(xì)胞系具有已分化為成熟的肝細(xì)胞的多能干細(xì)胞的典型特性，并且保留其來源于白血病細(xì)胞系所賦予的原有的無限增殖性。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明無限增殖成熟人肝細(xì)胞細(xì)胞系是指定為PSC-THP1-EPEP的細(xì)胞系，于2006年12月15日保藏于意大利熱那亞的高級(jí)生物技術(shù)中心-國際實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞系保藏中心(ICLC),保藏號(hào)為ICLCPDNo.06007。所述PSC-THP1-EPEP無限增殖細(xì)胞系具有已分化為成熟的肝細(xì)胞的多能干細(xì)胞的典型性質(zhì)，并且保留了其來源于白血病細(xì)胞系所賦予的原有的無限增殖性。PSC-THP1-EPEP無限增殖細(xì)胞系具有成熟的肝細(xì)胞表型，其核型經(jīng)由實(shí)例列出"50-52,XY/XXY,Y，dera)t(l;12)(p32;ql3),+der(l)del(lXp22p34)add(l)(q21),+del(6)(p2m),+dd(6)(p2m),12，14,+der(14)t(3;14Xpll;pl2),+del(17)(pll，+raaTl'+mar2,+mar3"。所述具有成熟的肝細(xì)胞PSC-THP1-EPEP表型的無限增殖細(xì)胞系具有以下代謝特征每2-3天的倍增細(xì)胞周期，從培養(yǎng)的第3天一直到第5天分泌白蛋白和凝血因子。優(yōu)選在更換培養(yǎng)基后，本發(fā)明PSC-THP1-EPEP細(xì)胞系在培養(yǎng)的第72-120小時(shí)顯示分泌白蛋白和凝血因子的特性(白蛋白在更換培養(yǎng)基后每培養(yǎng)72-120小時(shí)30-60g/l;在更換培養(yǎng)基后每培養(yǎng)72-120d、時(shí)凝血因子為存在于人循環(huán)血液中的含量的5%-90%)。此外，本發(fā)明涉及白蛋白作為治療劑和作為用于藥物或疫苗的載體的用途；所述白蛋白由具有成熟的肝細(xì)胞表型的無限增殖細(xì)胞系產(chǎn)生，該細(xì)胞系來源于通過分選尤其是通過分離和增殖所述PSC-THPl-CD34+eCD14+eCD90+細(xì)胞系，乂人無限增殖多能干細(xì)胞克隆的選擇。無限增殖THP-1細(xì)胞系為人單核細(xì)胞樣細(xì)胞系(因此為白血病性并無限增殖)，其來源于1名罹患單核細(xì)胞白血病的一周歲日本兒童的外周血的細(xì)胞培養(yǎng)物(白血病單核細(xì)胞)(Tsuchiya等)[16]。置于培養(yǎng)基中的來自該兒童供體的循環(huán)單核細(xì)胞沒有死亡，卻以高頻率(每2天)進(jìn)行體外復(fù)制；由于其白血病來源使得所述單核細(xì)胞無限增殖。單核白血病細(xì)胞定義為"單核細(xì)胞樣細(xì)胞(monocytoids)"，即其具有與其來源細(xì)胞相似但不一樣的表型特征；實(shí)際上，單核細(xì)胞是具有確定細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞，其經(jīng)歷不依賴外部因素的細(xì)胞衰老(生物學(xué)衰老)和死亡，而單核細(xì)胞樣白血病細(xì)胞被腫瘤基因永生化，因此它們永不衰老，具有與環(huán)境條件密切相關(guān)的極為可變的形態(tài)。能夠不斷無限復(fù)制的無限增殖細(xì)胞群，即THP-1細(xì)胞系，分離自所述日本兒童的單核細(xì)胞樣細(xì)胞[16]。因此，對(duì)無限增殖THP-1細(xì)胞的合適的限定并不是限定為單核細(xì)胞，而是因其具有白血病特性，限定為具有高度未成熟和無限增殖的典型特征的單核細(xì)胞樣細(xì)胞[1-27]。措辭無限增殖細(xì)胞系意即一旦將其置于培養(yǎng)基中就能夠永遠(yuǎn)繁殖而不會(huì)衰老(生物學(xué)衰老)的一類細(xì)胞。業(yè)已通過體內(nèi)分選從所述THP1無限增殖細(xì)胞系中選擇而獲得源自THP1無限增殖細(xì)胞系的PSC-THPl-CD34+eCD14+eCD90+無限增殖多能干細(xì)胞系，這些細(xì)胞顯示至少三種指定為CD34+eCD14+eCD90+的干細(xì)胞表面標(biāo)記呈陽性，藉此獲得并增殖具有多能干細(xì)胞的典型特性同時(shí)還保留了極為重要的無限增殖特征的細(xì)胞。隨后對(duì)該無限增殖細(xì)胞系PSC-THPl-CD34+eCD14+eCD90+的調(diào)節(jié)使得可獲得同樣為無限增殖并具有成熟肝細(xì)胞的典型功能的細(xì)胞系(PSC-THP1-EP)。特定情況為，這些無限增殖PSC-THP1-EP細(xì)胞被誘導(dǎo)分化，由此獲得無未成熟組成的均一細(xì)胞群中的成熟肝細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和功能特征。此外，經(jīng)PSC-THP1-EP細(xì)胞系多次連續(xù)分裂，選出了新的細(xì)胞群，即從顯示特定代謝特征的集落中分離的具有成熟肝細(xì)胞表型的PSC-THP1-EP-FAST無限增殖細(xì)胞系。此外，通過優(yōu)選的PEG-介導(dǎo)的人HepG2細(xì)胞系與PSC-THP1-EP13細(xì)胞系的細(xì)胞融合，獲得新型細(xì)胞系(PSC-THP1-HEP)，其具有已分化為成熟的肝細(xì)胞和成肝細(xì)胞的多能干細(xì)胞的典型特性，并且保留了其來源于白血病細(xì)胞系所賦予的原有的無限增殖性。此外，通過優(yōu)選的PEG-介導(dǎo)的人HepG2細(xì)胞系與PSC-THP1-EP細(xì)胞系與原代成熟的人肝細(xì)胞的細(xì)胞融合，獲得新型細(xì)胞系(PSC-THP1-EPEP),其具有已分化為成熟的肝細(xì)胞的多能干細(xì)胞的典型特性，并保留了其來源于白血病細(xì)胞系所賦予的原有的無限增殖性。肝細(xì)胞是產(chǎn)生負(fù)責(zé)維持穩(wěn)態(tài)和凝血的血漿蛋白質(zhì)的功能肝細(xì)胞。因以下可能性-誘導(dǎo)無限增殖PSC-THPl-CD34+eCD14+eCD90+細(xì)胞分化為無限增殖成熟肝細(xì)胞(PSC-THP1-EP);-選出具有確定和特定代謝特性的細(xì)胞亞克隆(PSC-THP1-EP畫FAST);-通過細(xì)胞融合制備新型穩(wěn)定的成熟肝細(xì)胞細(xì)胞系(PSC-THP1-HEP和PSC-THP1-EPEP);所以提供用于生產(chǎn)具有人白蛋白和人凝血因子的物理化學(xué)、生物學(xué)和生理學(xué)特性的白蛋白和凝血因子的連續(xù)穩(wěn)定的無限增殖細(xì)胞系統(tǒng)，該細(xì)胞系統(tǒng)由此成為用于制備治療多種疾病所需的這樣的蛋白質(zhì)的選擇來源。舉例來說，就白蛋白而言，其可能在以下病理中使用肝功能衰竭、低白蛋白血癥、血容量過低、腎病綜合征、Menetrier病、小腸小腸瘺、燒傷、肝炎、肝纖維化、肝硬化、在肝硬化中或放液穿刺術(shù)后及在吸收障礙綜合征中的嚴(yán)重高鹽潴留(hydrosalineretention)。舉例來說，就凝血因子而言，其可能在以下病理中使用出血；血管壁的先天性或獲得性缺陷；血小板減少癥或血小板病(即在即使血小板數(shù)量可能正常時(shí)與其有關(guān)的疾病)；涉及一種或多種凝血因子的先天性或獲得性缺乏，即因子vm或ix缺乏癥(血友病)、因子V和VIII聯(lián)合缺乏癥、因子xm缺乏癥、抗纖溶酶、增加纖溶酶原活性和PAi(纖溶酶原激活劑的抑制劑)缺乏癥、單獨(dú)的血小板因子3缺乏癥、異常血纖維蛋白原血、血管性血友病(VonWillebrand，sdisease)、可能的因子XII缺乏癥、激肽釋;^文酶原和高分子量激肽原缺乏癥；肝病、循環(huán)抗凝劑、口服抗凝血?jiǎng)┲委煛⒏嗡?、彌散性血管?nèi)凝血；過分的纖維蛋白溶解機(jī)制活性；血栓癥；血管壁缺陷(通常是獲得性)；先天性或獲得性天然凝血抑制劑缺乏癥(例如ATIII、蛋白C或蛋白S缺乏癥)；顯著并持久地升高血小板；纖維蛋白溶解機(jī)制缺陷。.發(fā)明詳述現(xiàn)在將引用幾個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案純粹作為非限制性實(shí)例來詳述本發(fā)明。PSC-THPl-CD34+eCD14+eCD90+細(xì)胞業(yè)已定向特化(在成熟和分化意義上)，它們?nèi)烤坏爻蔀榫哂谐墒旄渭?xì)胞典型功能的細(xì)胞(PSC-THP1-EP)。舉例而言，具有肝細(xì)胞表型的無限增殖PSC-THP1-EP細(xì)胞系顯示具有與以下某些細(xì)胞標(biāo)記有關(guān)的特征人HLA-DR1MHCII類、CD34+、CD44+、CD68+、CD71+、CD81+、CD90+、CD105+、CD117+、TLR5、CDw328、CDwl56c、CD172g、LDLRec(LDL5/6+)+、GATA畫4+、HNF-la+、HNF，、IL-1RTl+、CK8+、CK18+、CK7畫/十、CK19—/+、C-Met、a曱胎蛋白—/+、白蛋白+。所述具有成熟的肝細(xì)胞PSC-THP1-EP表型的無限增殖細(xì)胞系具有以下代謝特征每2-3天的倍增細(xì)胞周期，從培養(yǎng)的第3天一直到第5天分泌白蛋白和凝血因子。優(yōu)選在更換培養(yǎng)基后，所述PSC-THP1-EP細(xì)胞系在培養(yǎng)的第72-120小時(shí)顯示分泌白蛋白和凝血因子的特性(白蛋白在更換培養(yǎng)基后每培養(yǎng)72-120小時(shí)30-60g/l;在更換培養(yǎng)基后每培養(yǎng)72-120小時(shí)凝血因子為存在于人循環(huán)血液中的含量的5%-90%)。此外，通過PSC-THP1-EP細(xì)胞系(2006年11月10日的PD06005)的多次連續(xù)分裂，業(yè)已選出新的細(xì)胞群PSC-THP1-EP-FAST細(xì)胞系，其分離自具有如下特定代謝特征的集落每6-8小時(shí)的快速倍增細(xì)胞周期，從更換培養(yǎng)基后第3個(gè)小時(shí)開始分泌白蛋白和凝血因子，且生產(chǎn)高峰在第8-12小時(shí)之間(白蛋白在更換培養(yǎng)基后每培養(yǎng)8-12小時(shí)8-10g/l;在更換培養(yǎng)基后每培養(yǎng)8-12小時(shí)凝血因子為存在于人循環(huán)血液中的含量的5%-90%)。具體而言，所述具有已分化為成熟肝細(xì)胞的多能干細(xì)胞的典型性質(zhì)并保留了其來源于白血病細(xì)胞系所賦予的原有無限增殖性的PSC-THP1-EP-FAST無限增殖細(xì)胞系，為了以下特定代謝特性業(yè)已經(jīng)過分離、選擇和克隆增殖快速細(xì)胞周期；每6-8小時(shí)倍增，需要每12小時(shí)更換培養(yǎng)基(每12小時(shí)更換50-70%的培養(yǎng)基)。舉例而言，所述具有成熟的肝細(xì)胞表型和快速代謝周期的無限增殖PSC-THP1-EP-FAST細(xì)胞系具有與以下某些細(xì)胞標(biāo)記有關(guān)的特征人HLA-DR1MHCII類、CD34+、CD44+、CD68+、CD71+、CD81+、CD90+、CD105+、CD117+、TLR5、CDw328、CDwl56c、CD172g、LDLRec(LDL5/6+)+、GATA-4+、HNF-la+、麗F-3卩+、IL-1RTl+、CK8+、CK18+、CK7-/+、CK19—/+、C-Met、a曱胎蛋白—/+、白蛋白+。這些細(xì)胞業(yè)已被i秀導(dǎo)分化，獲得成熟肝細(xì)胞的形態(tài)和功能特征，通過使其在培養(yǎng)中經(jīng)受由以下生長因子產(chǎn)生的連續(xù)刺激物來實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)HGF(肝細(xì)胞生長因子)、M-CSF(巨噬細(xì)胞集落刺激生長因子)、慶大霉素(gentamycin)、EGF(表皮生長因子)、葡萄糖、白介素2和白介素6組合和氨基酸。除了白蛋白外，本發(fā)明細(xì)胞系PSC-THP1-EP、PSC-THP1-EP-FAST、PSC-THP1-HEP和PSC-THP1-EPEP還分泌詳細(xì)列舉于表1中的凝血因子到培養(yǎng)上清液中，檢測到其5%-80%的活性。表l.凝血因子抗凝血酶IIIVonWillebrand因子前蛋白原Ser/Cys蛋白酶抑制劑C尿激酶型纖溶酶激活物受體(人UPAR)凝血酶的緩慢抗凝血形式(人THRB)凝血因子V凝血因子VII凝血因子VIII凝血因子XIIIBct-2-巨J求蛋白蛋白C(凝血因子Va和Viiia的滅活劑)蛋白S(a)APC(活化的蛋白質(zhì)C受體)a-1-抗胰蛋白酶前體(a-1蛋白酶抑制劑/a-1-抗蛋白酶Cl酯酶抑制劑劍系通過在室溫下于磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.2)中將THP-1單核細(xì)胞樣細(xì)胞[16]以160g離心IO分鐘來洗滌三次，并以再次在磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2)中以10X106個(gè)細(xì)胞/1111的終濃度重新懸浮于50ml管(Nunc,丹買卡姆魯普)中。經(jīng)過在37。C下以160g離心10分鐘來洗滌三次后，構(gòu)成本研究主題的所有細(xì)胞樣品用綴合以下物質(zhì)的抗人小鼠單克隆抗體(Mab)來進(jìn)行體內(nèi)標(biāo)記R-藻紅蛋白、抗人CD34(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗人CD14(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗人CD90(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)，并通過分選來進(jìn)行體內(nèi)分析和選擇(Coulter,Hialeath,美國弗羅里達(dá)州)。通過體內(nèi)無菌細(xì)胞熒光測定法(細(xì)胞分選儀)分離的細(xì)胞表達(dá)我們自己認(rèn)為是基本的至少三種干細(xì)胞標(biāo)記，也就是CD34、CD14和CD90。將未分化多能干細(xì)胞(PSC-THPl-CD34+eCD14+eCD90+)以每ml1X106個(gè)細(xì)胞的終濃度重新懸浮在6孔板(Lab-Tek⑧chamberslide,Nunc,Kamstrup,Denmark)中，每孔含0.5ml包含補(bǔ)充如下物質(zhì)的AIM-V培養(yǎng)基(GIBCO)的最終溶液10%FCS(Celbio,意大利米蘭)；100單位/mL青霉素(penicillin);100|ng/mL鏈霉素(streptomycin);160mg/L慶大霉素(Schering-Plough,意大利米蘭)；2mML-谷氨酰胺(LifeTechnologies;生長培養(yǎng)基)；25ng/mLM-CSF(巨噬細(xì)胞集落刺激因子，PeprotechInc.，美國新澤西州)。所述細(xì)胞用每3天更換的0.25ml培養(yǎng)基在Heraeus控溫培養(yǎng)箱中于37。C溫度下在含有5%恒流C02(空氣中v/v)的氣氛中孵育10天。孵育期過后，細(xì)胞都顯示成纖維樣(fibroblastoid)形態(tài)。將用2%利多卡因(lidocaine)(SigmaAldrich，意大利米蘭)/PBS[17，21]收獲的細(xì)胞在37。C下于RPMI1640(LifeTechnologies,紐約州的大島)中以16018g離心10分鐘洗滌3次，按照以下說明孵育第二次。將預(yù)定用于刺激成為特化肝細(xì)胞(PSC-THP1-EP)的樣品以每ml1X106個(gè)細(xì)胞的終濃度重新懸浮于6孔板(Lab-Tek⑧chamberslides,Nunc,Kamstrup，Denmark)中，每孔含0.5ml包含如下所述培養(yǎng)基的最終溶液表l<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>此外，加入列入表2中的物質(zhì)作為蛋白質(zhì)來源表2<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>培養(yǎng)23天后，收集研究的培養(yǎng)上清液并儲(chǔ)存于-80。C用于實(shí)驗(yàn)室分析以下物質(zhì)的濃度4敬白蛋白、鈣、a曱胎蛋白、葡萄糖、糖原和尿素。再培養(yǎng)23天后，用2Q/o利多卡因(SigmaAldrich,意大利米蘭)/PBS孵育5-8分鐘后，用移液沖倉反復(fù)吹打孔中的細(xì)胞懸液，然后收獲所得溶液，從而獲得所有研究樣品的細(xì)胞懸液，如參考文獻(xiàn)[17,21]所述。通過用未補(bǔ)充的RPMI1640(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)于37。C下以160g離心10分鐘來將細(xì)胞洗滌三次。從獲得的細(xì)胞沉淀中，取小部分細(xì)胞以5X105個(gè)細(xì)胞/ml的終濃度重新懸浮于15ml管(Lab-Tek⑧chamberslides,Nunc,Kamstrup，Denmark)中用于隨后的表型分析(蛋白質(zhì)印跡、直接免疫熒光法和FACS)，取一部分細(xì)胞于4。C下在PBS中以160g離心10分鐘，完全干燥所得的細(xì)胞沉淀，并立即于-8(TC下冷凍用于隨后的RNA分析(PCR)。將PSC-THP1-EP細(xì)胞樣品以每孔1/3細(xì)胞的終濃度重新懸浮于96孔板(Lab-Tek⑧chamberslides,Nunc,Kamstrup,Denmark)中,每孑L含0.05ml(5Q昭)包含如下所述培養(yǎng)基的最終溶液<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>此外，加入列入表2中的物質(zhì)作為蛋白質(zhì)來源:表2<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>培養(yǎng)23天后，收集研究的培養(yǎng)上清液并儲(chǔ)存于-80。C用于實(shí)驗(yàn)室分析以下物質(zhì)的濃度微白蛋白、鈣、a曱胎蛋白、葡萄糖、糖元和尿素。在進(jìn)行代謝分型之后，從PSC-THP1-EP細(xì)胞系選出具有特定的快速代謝周期的細(xì)胞亞克隆(稱為PSC-THP1-EP-FAST)并進(jìn)行增殖。勿/《嚴(yán)合可借助細(xì)胞融合將各種來源的細(xì)胞中所含遺傳信息組合在單個(gè)核中。細(xì)胞融合需要細(xì)胞得以接觸，包括用化學(xué)試劑短暫破壞細(xì)胞膜。當(dāng)發(fā)生膜重建時(shí)，鄰近細(xì)胞可使它們的膜一起重新形成，由此產(chǎn)生單個(gè)雜交細(xì)胞。最初，由融合產(chǎn)生的細(xì)胞含有2-4個(gè)核(多核的異核體)，但在細(xì)胞分裂后，兩個(gè)細(xì)胞中的染色體組包裹在單個(gè)核(融核體)中。細(xì)胞融合技術(shù)使用PEG(聚乙二醇)。勿應(yīng)凝合才法對(duì)于考慮用于細(xì)胞融合的兩種或多種人細(xì)胞類型(白血病或原代)中的每種懸浮或貼壁細(xì)胞類型(即，用于PSC-THP1-HEP為HEPG2細(xì)胞和PSC-THP1-EP細(xì)胞；用于PSC-THP1-EPEP為HEPG2纟田月包、PSC-THP1-EP細(xì)胞和原代人肝細(xì)胞)，收獲兩百萬個(gè)細(xì)胞的樣品。根據(jù)細(xì)胞類型如上所述以特定方式使貼壁細(xì)胞脫附。將考慮用于融合的所有細(xì)胞收集在單個(gè)50ml管(Lab-Tek(g)chamberslides,Nunc,Kamstrup,Denmark)中，通過于37。C下在無血清DMEM-LG培養(yǎng)基(Gibco;GrandIsland,NY)中以160g離心7分鐘來洗滌2次。通過用移液槍反復(fù)吹打60秒來使由沉淀獲得的細(xì)胞重新懸浮在每4百萬個(gè)細(xì)胞所對(duì)應(yīng)的2mlPEG中。在吹打60秒后，加入10ml的FCS或FBS，通過于37。C以160g離心7分鐘來洗滌細(xì)胞。由此獲得的細(xì)胞通過于37。C下在含20。/。血清(FCS或FBS)的DMEM-LG培養(yǎng)基(Gibco;GrandIsland,NY)中以160g離心7分鐘來洗滌2次，以1Xl(^個(gè)細(xì)胞/ml濃度重新懸浮于補(bǔ)充20%FCS的AIM-V培養(yǎng)基中，并在Heraeus溫控培養(yǎng)箱中于37。C溫度在含有5%恒流C02(空氣中v/v)的氣氛中孵育3天。完成孵育后，通過于37。C下在RPMI1640(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)中以160g離心10分鐘來將由此獲得的細(xì)胞(PSC-THP1-HEP或PSC-THP1-EPEP)洗滌3次，然后將其置于25cm2培養(yǎng)瓶(Nunc,Kamstrup,Denmark)中以1Xl(^個(gè)細(xì)胞/ml的終濃度在包含如下所述培養(yǎng)基的終溶液中培養(yǎng)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>通過于室溫下在PBS(pH7.4)中以160g離心10分鐘洗滌三次后，將細(xì)胞沉淀接到載玻片上，使液體在空氣中蒸發(fā)。在室溫下用95%乙醇將樣品固定15分鐘。用PBS輕輕漂洗3次(每次30秒)后，用蘇木精(SigmaAldrich)溶液處理細(xì)胞5分鐘；為了避免切片上有任何沉降，使載玻片在稱為"表面皿"的合適容器中保持染色面朝上。接著用PBS輕輕漂洗大約10分鐘；在此階段，如此操作是為了使染色穩(wěn)定，染上的顏色從暗紅變成(develope)藍(lán)色，使結(jié)合穩(wěn)定。用曙紅溶液(SigmaAldrichInc.)處理細(xì)胞l分鐘；在該情況下，為了避免切片上有任何沉降，再次使載玻片在稱為"表面皿"的合適容器中保持染色面朝上。接著用PBS輕輕漂洗大約10秒，然后在99%乙醇中快速脫水。最后，將一滴熱(56。C)moviol(Vectashield)滴在所述載玻片的中心，封上蓋玻片(coverslide)。通過光學(xué)顯微鏡(100X)觀察該制備物，評(píng)估細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的形態(tài)[10-11]。勿應(yīng)廣合處充^凝裙發(fā)查使細(xì)胞沉淀于室溫下重新懸浮于含4%多聚曱醛的RPMI1640(pH7.4)固定溶液中l(wèi)小時(shí)。用PBS洗滌三次后，使細(xì)胞于4。C下重新懸浮于PBS和0.1。/。Triton溶液中l(wèi)小時(shí)。用PBS洗滌三次后，將細(xì)胞接到蓋玻片(slidecover)上，讓液體在空氣中蒸發(fā)；然后加入Hoechst溶液(DAPI,1:1000稀釋)并保持1分鐘，Hoechst溶液是一種通過與DNA雙螺旋結(jié)合來將核染成藍(lán)色的染料。最后再洗滌3次，將含細(xì)胞的蓋玻片用Moviol(Vectashield)封在載玻片上，Moviol是一種讓熒光保留大約一個(gè)月的粘合劑。在4。C下經(jīng)一夜后，細(xì)胞可隨時(shí)用于通過熒光顯微鏡觀察。屬于經(jīng)過細(xì)胞融合的樣品的細(xì)胞具有顯著高的細(xì)胞融合百分比(與未處理對(duì)照的0%相比為樣品的90%)。與未處理對(duì)照的0%相比，融合后3個(gè)月的樣品細(xì)胞核型分析顯示95%四倍性。理所當(dāng)然的是，在不偏離所附權(quán)利要求中限定的本發(fā)明保護(hù)范圍下，就所描述和記載的細(xì)節(jié)而言，可在大程度上改變實(shí)施方案的細(xì)節(jié)和形式。樣品用以下物質(zhì)通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行有關(guān)各標(biāo)記的表型分析抗CD14(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗CD29(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗CD34(SantaCruzBiotechnology,美國力口利福尼亞州)、抗CD44(SantaCruzBiotechnology,美國力口利福尼亞州)、抗CD45(SantaCruzBiotechnology,美國力口利福尼亞州)、抗CD71(SantaCruzBiotechnology,美國力p利福尼亞州)、抗CD90(SantaCruzBiotechnology,美國力口禾'J福尼亞州)、抗CD105(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗CD117/c-KIT(SantaCruzBiotechnology,美國力。利福尼亞州)、抗c-MET(SantaCruz25Biotechnology,美國加利福尼亞州)、抗細(xì)胞角蛋白7(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗細(xì)胞角蛋白8(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗細(xì)胞角蛋白18(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗細(xì)胞角蛋白19(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗細(xì)胞角蛋白7/17(SantaCruzBiotechnology,美國力口利福尼亞州)、抗白蛋白(RocklandImmunochemicals,美國賓夕法尼亞州)、抗a曱胎蛋白(MonosanEuropa，荷蘭)。在洗滌5次后，讓膜與綴合辣根過氧化物酶(HRP，SantaCruzBiotechnologiesInc.,SantaCruz,美國加利福尼亞州)的對(duì)應(yīng)的第二抗體(l:IOOO)在室溫孵育1小時(shí)，其如下表所報(bào)告。^瘦炎乂實(shí)發(fā)才黃讓懸浮細(xì)胞在37。C下與0.2mMMitoTrackerRed孵育10分鐘。通過于室溫下在PBS(pH7.4)中以160g離心10分鐘洗滌三次后，在室溫將細(xì)胞沉淀重新懸浮于含4%多聚曱醛的RPMI1640(pH7.4)固定溶液中1小時(shí)。用PBS洗滌3次后，讓細(xì)胞于4'C下重新懸浮于PBS和0.1%Triton溶液中1小時(shí)。用PBS洗滌三次后，將細(xì)胞接到蓋玻片上，讓液體在空氣中蒸發(fā)。用20%正常山羊血清封閉細(xì)胞1小時(shí)，然后與綴合藻紅蛋白(PE)或異疏氰酸熒光素(FITC)的以下抗人單克隆抗體孵育30分鐘抗CD14(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗CD29(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗CD34(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗CD44(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗CD45(SantaCruzBiotechnology,美國力口利福尼亞州)、抗CD71(SantaCruzBiotechnology,美國力口利福尼亞州)、抗CD90(SantaCruzBiotechnology,美國力口利福尼亞州)、抗CD105(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗CD117/c-KIT(SantaCruzBiotechnology,美國力口利福尼亞州)、抗c匿MET(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗細(xì)胞角蛋白7(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗細(xì)胞角蛋白8(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗細(xì)胞角蛋白18(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗細(xì)胞角蛋白19(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗細(xì)胞角蛋白7/17(SantaCruzBiotechnology,美國力口利福尼亞外l)、抗白蛋白(RocklandImmunochemicals,美國賓夕法尼亞州)、抗a曱月臺(tái)蛋白(MonosanEuropa,荷蘭)。對(duì)于每種單克隆抗體設(shè)計(jì)了具有對(duì)應(yīng)的同種型的特定對(duì)照(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)。用Hoechst溶液(稀釋1:1000)染色核。通過光學(xué)顯微鏡檢查用moviol使蓋玻片封在載片上[16-17]。炎^^勿應(yīng)為Wi^CS)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50ml管(Lab-Tek⑧chamberslides,Nunc,Kamstrup,Denmark)中，通過于室溫下在PBS(pH7.4)中以160g離心10分鐘洗滌三次。使沉淀以5Xl()S個(gè)細(xì)胞/ml的終濃度重新懸浮于PBS中。讓洗滌三次后，讓細(xì)胞于室溫下在含4。/。多聚曱醛的PBS(pH7.4)中固定1小時(shí)。用PBS洗滌3次后，讓細(xì)胞于4'C下重新懸浮于PBS和0.1。/。Triton溶液中1小時(shí)。在用PBS洗滌5次后，讓細(xì)胞在20%正常山羊血清封閉液中懸浮1小時(shí)。在用PBS洗滌三次后，讓樣品與以下抗人單克隆抗體孵育30分鐘抗CD14(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗CD29(SantaCruzBiotechnology,美國力口利福尼亞州)、抗CD34(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗CD44(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗CD45(SantaCruzBiotechnology,美國力口利福尼亞州)、抗CD71(SantaCruzBiotechnology,美國力口利福尼亞州)、抗CD90(SantaCruzBiotechnology,美國力口利福尼亞州)、抗CD105(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗CD117/c-KIT(SantaCruzBiotechnology,美國力口利福尼亞州)、抗c-MET(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗細(xì)胞角蛋白7(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗細(xì)胞角蛋白8(SantaCruzBiotechnology,美國力口利福尼亞州)、抗細(xì)胞角蛋白18(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗細(xì)胞角蛋白19(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)、抗細(xì)胞角蛋白7/17(SantaCruzBiotechnology,美國力。利福尼亞外l)、抗白蛋白(RocklandImmunochemicals,美國賓夕法尼亞州)、抗a曱月臺(tái)蛋白(MonosanEuropa:荷蘭)。所用的所有抗體都為綴合R-藻紅蛋白(PE)或異硫氰酸熒光素(FITC)的單克隆抗體。對(duì)于每種單克隆抗體設(shè)計(jì)了具有對(duì)應(yīng)的同種型的特定對(duì)照(SantaCruzBiotechnology,美國加利福尼亞州)。用激光細(xì)胞熒光計(jì)(EpicsProfileII,Coulter,Hialeath，F(xiàn)L)在488nm處對(duì)樣品進(jìn)行定量分析，將熒光細(xì)胞百分比(PFC)記作幾何平均數(shù)。用標(biāo)記了相應(yīng)同種型的樣品確定閾值(門值(gates))。用15,000個(gè)細(xì)胞的最小閾值分析了所有的值。m4-尸a歸^-,合凝淑啟炎承用Tri試劑溶液(MolecularResearchCenter,Inc.)按照廠商說明進(jìn)行RNA提取。將每一樣品的細(xì)胞沉淀重新懸浮于1ml的Tri試劑溶液中，在室溫孵育5分鐘。孵育后加入100|il溴氯丙烷，讓樣品在室溫下再孵育15分鐘。在4。C下以12000g離心15分鐘后，回收水相，連同500pl異丙醇轉(zhuǎn)移到Eppendorf型管(大約500nl)中。讓樣品在室溫孵育10分鐘，然后在4。C下以12000g離心8分鐘，用1ml的75%乙醇洗滌，然后以7500g離心5分鐘，最后用注射器移走上清液，在通風(fēng)櫥中小心干燥沉淀。最后，將RNA樣品重新懸浮于50|iil無DNA酶的水中。為、M顛量讓樣品懸浮于50|al剛打開的高壓滅菌的MilliQH20中，用分光光度計(jì)讀5nl(稀釋1:100)。用AppliedBiosystems"cDNAArchiveKit"^式齊'J盒(AppliedBiosystems)逆轉(zhuǎn)錄信使RNA。在0.25IU的RNA酶(Promega)存在下于50ial總體積中準(zhǔn)備反應(yīng)物，其中10|^1樣品溶液+1120。樣品在25'C下孵育10分鐘，然后在37'C下孵育2小時(shí)。表3.<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>將樣品插入PCR儀中，在25。C下10分鐘和37。C下2小時(shí)。cDNA儲(chǔ)存于-2(TC下。用"TURBO無DNA"體系(Ambion)通過在37。C下孵育30分鐘除去基因組DNA。通過讓每一樣品與5|LilDNA酶除去劑在室溫孵育2分鐘除去DNA酶。然后以10,000xg讓樣品離心1分鐘，最后將1pi各個(gè)逆轉(zhuǎn)錄樣品用于實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。表4.<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>用"SYBRGreen"方法(SYBRGreenMasterMix試劑盒，AppliedBiosystems)將以下引物用于實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增ALB一細(xì)5'-GAGATGCACACAAGAGTGAG-3'ALB一rv5'-CTGAGCAAAGGCAATCAACA-3'AFP一fw5'-GGGAGCGGCTGACATTATTA-3'AFP一rv5'-TCTTGCTTCATCGTTTGCAG-3'MET一fW5'-CTCCTCTGGGAGCTGATGAC-3'MET一rv5'-GGTGCCAGCATTTTAGCATT_3'GAPDHJW5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'GAPDH一rv5'—GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'為擴(kuò)增反應(yīng)(兩個(gè)方向)測定以下引物濃度(nM):ALB50/150;AFP50/300;MET300/300;GAPDH50/300。通過用H20將溶液調(diào)整到100pi來稀釋反應(yīng)物，1]ul用于各個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)。用"SYBRGreenMasterMix"(AppliedBiosystems)試劑盒在25pi總體積中準(zhǔn)備反應(yīng)物。反應(yīng)進(jìn)行三個(gè)平行。用"ABIPrism7700序列枱r測儀，，(PerkinElmer)實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)。用SequenceDetection1.9.1軟件(PerkinElmer)分析數(shù)據(jù)。摩^勿應(yīng)培券2,遂^^afy^蛋冷、^素、^蛋冷和凝^f冷W^土用ModularAnalyticsP自動(dòng)系統(tǒng)(Roche-Hitachi)實(shí)施所有的測量。摩*勿應(yīng)潛券丄#遂^的凝A^子的謇;t用MALDI-TOF-MS(MicroMX,Waters,英國曼徹斯特)自動(dòng)系統(tǒng)實(shí)施所有的測量。為了重建序列用ProFound-PeptideMapping在線搜索引擎處理所鑒別的肽，用PMF((PeptideMassFingerprintingtechnique)肽質(zhì)量指紋譜技術(shù))(EMBL-EBI,歐洲生物信息學(xué)研究所(EuropeanBioinformaticInstitute);NCBI,美國國家生物信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation))處J里只于應(yīng)的蛋白質(zhì)。實(shí)施例1.光學(xué)顯微鏡檢查在分選和增殖所選出的細(xì)胞克隆后，孵育IO天時(shí)樣品顯示THPI細(xì)胞形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變，從圓細(xì)胞變?yōu)橘N附培養(yǎng)板的拉長的成纖維樣形態(tài)。對(duì)照表現(xiàn)出純粹的圓形并且完全懸浮。實(shí)施例2.光學(xué)顯微鏡檢查孵育23天在如上所述補(bǔ)充的AIM-V培養(yǎng)基中將育23天后，樣品顯示THP1細(xì)胞從圓形到貼附培養(yǎng)板的四面體形的形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變，以下物質(zhì)的產(chǎn)生呈陽性白蛋白、a甲胎蛋白、肝糖、細(xì)胞角蛋白7、8、17、18和19、OV-6、c-Met受體(FACS,免疫組織化學(xué)，WB,PCR)和幾種凝血因子(蛋白質(zhì)印跡，MALDI-TOF-MS,2D電泳)，其如表1所示。對(duì)照僅顯示圓形形態(tài)，所有細(xì)胞都為懸浮狀態(tài)，且白蛋白、a-曱胎蛋白、肝糖、細(xì)胞角蛋白7、8、17、18和19、OV-6結(jié)果呈陰性。實(shí)施例3.THP-1與？5(2-丁1^《034+/0014+/€090+和PSC-THP1畫EP和PSC-THP1-EP-FAST相比較的特征與CD14+、CD29+、CD34+、CD44+、CD45-AKCD71+、CD90+、CD105+、CD117+、C-Met、細(xì)胞角蛋白7、細(xì)胞角蛋白8、細(xì)胞角蛋白18、細(xì)胞角蛋白19、細(xì)胞角蛋白7/17的表達(dá)情況有關(guān)的結(jié)果以數(shù)量等級(jí)(quantitativescale)表示，其如下表5所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>=沒有任何焚光+=每視野1-5個(gè)熒光細(xì)胞++=每視野6-10個(gè)熒光細(xì)胞+++=每視野10-20個(gè)焚光細(xì)胞++++=每視野20-50個(gè)熒光細(xì)胞+++++〉每視野50個(gè)熒光細(xì)胞實(shí)施例4.蛋白質(zhì)印跡通過蛋白質(zhì)印跡對(duì)細(xì)胞的標(biāo)記白蛋白和a曱胎蛋白進(jìn)行了表型分析，其如下所示。在下表中報(bào)告的定量表征必須按照以下解釋來理解—=沒有任何條帶-/+=存在微弱的條帶+=存在淡淡的條帶++=存在中等條帶+++=存在寬條帶++++=存在高含量的條帶+++++=存在豐富含量的條帶1.白蛋白(RocklandImmunochemicals,美國賓夕法尼亞州)結(jié)果顯示，在對(duì)照THP-1細(xì)胞中人白蛋白的產(chǎn)生呈微弱的陽性，在PSC-THPlCD34+eCD14+eCD90+細(xì)胞中呈淡淡的陽性；相比之下，在HEPG2細(xì)胞中人白蛋白的產(chǎn)生呈顯著的陽性，而在PSC-THP1-EP、PSC-THP1-EP-FAST、PSC-THP1-HEP、PSC-THP1-EPEP細(xì)胞中的人白蛋白呈程度大的陽性，如表6中所報(bào)告。表6.<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>實(shí)施例5.THP-1與？30丁!^^034+/0014+/0090+和PSC-THP1畫EP和PSC-THPl-EP-FAST細(xì)胞相比較的細(xì)胞熒光光度術(shù)(FACS)特征成體血液含有造血祖細(xì)胞。在造血細(xì)胞中，所謂的"HSC"細(xì)胞(CD14+和CD34+)為多能細(xì)胞(Zhao,2003)，當(dāng)其受到生長因子適當(dāng)刺激時(shí)，可分化并特化為不同身體部分(包括肝臟)的典型細(xì)胞[1-2]。通過分選選出高熒光陽性的CD14+、CD34+和CD90+的所培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞；在培養(yǎng)中分離所述選出的細(xì)胞克隆并進(jìn)行增殖，10天后，可能觀察到所述熒光在培養(yǎng)中保持穩(wěn)定的情況。未處理的對(duì)照顯示CD29+、CD34+、CD44+、CD90+、CD105+的熒光微弱。在培養(yǎng)中與25ng/mLHGF孵育50天的THP-1細(xì)胞顯示沒有CD14+、CD29+、CD34+、CD44+、CD45-AKCD90+、CD105+(PSC畫THP1)熒光，但對(duì)于c-Met和CD117呈微弱陽性，對(duì)于白蛋白、a曱胎蛋白和細(xì)胞角蛋白(7、17、8、18和19)和CD71顯示高亮度熒光。未處理的對(duì)照顯示CD14和CD45焚光。結(jié)果作為幾何平均數(shù)+/-標(biāo)準(zhǔn)差(30)報(bào)告于表8和9中。表8.<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>白蛋白用HGF以不同孵育時(shí)間(最具代表性時(shí)間為一7、15、23天)處理培養(yǎng)中的細(xì)胞樣品，并對(duì)其進(jìn)行分析。與先前分析一致，數(shù)據(jù)顯示來源于通過多能干細(xì)胞分選所選出的THP-1細(xì)胞系(？30丁1^1^034+/。014+/0090+)的成熟的肝細(xì)胞樣細(xì)胞(PSC-THP1-EP)產(chǎn)生白蛋白。涉及測試樣品中微白蛋白的數(shù)據(jù)在數(shù)值和時(shí)間兩個(gè)方面上都支持了先前關(guān)于白蛋白的數(shù)據(jù)。實(shí)際上，在用HGF處理、于實(shí)驗(yàn)的第7、15和30天取樣的僅3個(gè)樣品(PSC-THP1-EP)觀察到在最小檢測限之上的微白蛋白濃度。4義、理W7HP-7對(duì)厲勿應(yīng)在所有的孵育時(shí)間中，通過細(xì)胞熒光光度術(shù)顯示THP-1對(duì)照細(xì)胞無顯著的白蛋白存在。作為舉例，出示了對(duì)照在第23天時(shí)的相關(guān)數(shù)據(jù)。^MGSF處理的77/尸-7勿/^PSC-77/尸"在所有的孵育時(shí)間中，通過細(xì)胞熒光光度術(shù)顯示用25ng/mLMCSF處理的THP-1細(xì)胞(PSC-THP1)沒有可檢測的白蛋白。作為舉例，出示了對(duì)照在第23天時(shí)的有關(guān)數(shù)據(jù)。與25"g/m丄W//G尸/^f^尸SC-JH尸7細(xì)應(yīng)(7、"、"大〕在低濃度的包括HGF(2.5ng/mL和25ng/mL)在內(nèi)的生長因子下，PSC-THP1細(xì)胞到肝細(xì)胞的分化緩慢，并且觀察到產(chǎn)生高濃度白蛋白的成熟肝細(xì)胞外觀，。a曱胎蛋白在不同孵育時(shí)間(第7、15和23天)分析了培養(yǎng)中的未處理的THP-1細(xì)胞(對(duì)照)、用50ng/mLMCSF處理的THP-l細(xì)胞(PSC-THPl)和用不同濃度(25ng/mL和2.5ng/mL)的生長因子處理的THP-l細(xì)胞(PSC-THP1-EP、PSC-THP1-EP-FAST、PSC-THP1-HEP和PSC-THP1-EPEP)的樣品。觀察到與HEPG2細(xì)胞和PSC-THP1-HEP細(xì)胞(肝細(xì)胞和成肝細(xì)胞混合細(xì)胞群)相似的關(guān)于生產(chǎn)a曱胎蛋白的概況。在所有的孵育時(shí)間中，通過細(xì)胞熒光光度術(shù)顯示THP-l對(duì)照細(xì)胞無顯著的a曱胎蛋白產(chǎn)生。作為舉例，出示了對(duì)照在第23天時(shí)的有關(guān)數(shù)據(jù)。實(shí)施例6.實(shí)時(shí)PCRGAPDH數(shù)據(jù)顯示GAPDHmRNA在測試的所有的樣品中表達(dá)一致，確保了所提取的mRNA儲(chǔ)存恰當(dāng)和所檢查樣品的初始濃度的一致性。白蛋白數(shù)據(jù)顯示僅在HepG2陽性對(duì)照和用HGF(最佳處理范圍25ng/mLHGF)刺激至少30天后的THP1-PSC肝樣細(xì)胞中清楚存在白蛋白mRNA;在所有的其它對(duì)照中似乎沒有白蛋白mRNA。a甲胎蛋白數(shù)據(jù)顯示僅在HepG2陽性對(duì)照中清楚存在a曱胎蛋白mRNA。c-Met數(shù)據(jù)顯示在所有測試細(xì)胞中相當(dāng)高地表達(dá)c-MetmRNA的存在。c-MetmRNA似乎并沒有被任何處理改變。MALDI-TOF畫MS用蛋白質(zhì)印跡法處理PSC-THP1-EP細(xì)胞培養(yǎng)上清液，切下獲得的帶并消化。從消化物中鑒定出許多肽。為了重建序列，用ProFound-PeptideMapping在線搜索引擎處理獲得的肽，用PMF(肽質(zhì)量指紋譜技術(shù))鑒定相應(yīng)的蛋白質(zhì)。在PSC-THP1-EP、PSC-THP1畫EP-FAST、PSC-THP1-HEP和PSC-THP1-EPEP細(xì)胞培養(yǎng)上清液中鑒定的幾種蛋白質(zhì)的相關(guān)序列附在下面，其與具有成熟的肝細(xì)胞表型的所述培養(yǎng)物產(chǎn)物的特征有關(guān)。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>細(xì)胞色素P450(CYP450)細(xì)胞色素P-450是在體外和體內(nèi)代ilt大量藥物、異生素和內(nèi)源物質(zhì)的超家族酶。細(xì)胞色素P450超家族酶催化多種物質(zhì)的氧化代謝，這些物質(zhì)包括諸如類固醇、脂肪酸、前列腺素、白三烯和維生素等天然化合物以及藥物、致癌物質(zhì)、誘變劑和異生素。細(xì)胞色素P450也稱為P450血紅素-硫鐵蛋白(heme-thiolateprotein),通常在多組分電子傳遞鏈中起末端氧化酶的作用，稱為含P450的單加氧酶系統(tǒng)。催化的特定反應(yīng)包括羥基化作用、環(huán)氧化作用、N-氧化作用、磺化氧化作用、N-、S-和O-脫烷基化作用、脫硫酸鹽作用、脫氨基作用和偶氮基、硝基和N-氧化物基團(tuán)的還原作用。這些反應(yīng)涉及動(dòng)物中的糖皮質(zhì)激素、皮質(zhì)醇、雌激素和雄激素的類固醇生成作用；昆蟲中的殺蟲劑耐受；植物中的除草劑耐受和花著色；和微生物的環(huán)境生物除污。細(xì)胞色素P450對(duì)藥物、致癌物質(zhì)、誘變劑和異生素的作用可導(dǎo)致解毒或?qū)⑽镔|(zhì)轉(zhuǎn)化為更具毒性的產(chǎn)物。細(xì)胞色素P450在肝臟中很豐富，但也出現(xiàn)在其它組織中。細(xì)胞色素P450家族成員以不同水平存在，其表達(dá)和活性受諸如化學(xué)環(huán)境、性別、發(fā)育階段、營養(yǎng)和年齡等變量的控制。已經(jīng)鑒定出超過200種細(xì)胞色素P450的基因。這些P450有多種形式，每種單獨(dú)的形式對(duì)上面化合物類別中的單種化學(xué)物質(zhì)表現(xiàn)出特異性程度。在某些情況下，底物(不管是藥物還是致癌物質(zhì))由不止一種細(xì)胞色素P450代謝。所有的細(xì)胞色素P450都使用血紅素輔因子，享有共同的結(jié)構(gòu)特征。大部分細(xì)胞色素P450長度為400-530個(gè)氨基酸。酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)為約70%a-螺旋和約22°/。卩折疊。細(xì)胞色素P450的遺傳性多態(tài)現(xiàn)象導(dǎo)致表型截然不同的亞群，這些亞群生物轉(zhuǎn)化特定藥物和其它化學(xué)化合物的能力不同。這些表型差別對(duì)于選擇藥物而言具有重要的含義。例如，給予大部分人時(shí)都安全的藥物，可能在罹患缺乏解毒該藥物所需的酶的個(gè)體中可引起毒性副作用。或者，在大部分人中有效的藥物，可能在特定的亞群中無效，因?yàn)樗鼈冎腥狈⒃撍幬镛D(zhuǎn)化為代謝活性形式所需的酶。另外，缺乏生物轉(zhuǎn)化酶的個(gè)體，由于不能使環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)解毒，通常容易罹患由該化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致的癌癥。人肝臟中的主要P450形式為P4501A2(CYP1A2)和P-4503A(CYP3A)。人細(xì)胞色素P4501A2構(gòu)成人肝臟中的總P450的13%，是繼人細(xì)胞色素P4503A4后第二豐富的P450。P4501A2催化大量不同藥物和致癌物質(zhì)的代謝。由人P4501A2代謝的藥物包括非那西丁(phenacetin)、R-華法4木(R-warfarin)、氯米帕明(clomipramine)、丙n末"秦(imipramine)、茶石成(theophyline)、可可石威(theobromine)、副黃噪呤(paraxanthine)、咖啡因(caffeine)、氯哇沙宗(chlorzoxazone)、7-甲氧基試鹵靈(7-methoxyresorufin)和7-乙氧基香豆素(7-ethoxycoumarin)。P4501A2還在激活誘變劑和致癌物質(zhì)中起主要作用。例如，1A2代謝性激活食物高溫分解產(chǎn)物IQ和MeIQx以活化誘變劑?；颊咚幬镞x擇的復(fù)雜性在于尚未鑒定大部分藥物是由P4501A2還是其它細(xì)胞色素P450代謝。不知道哪一種(哪些)細(xì)胞色素p450負(fù)責(zé)個(gè)別藥物的代謝，就不能評(píng)價(jià)患者P450概況的適當(dāng)性。對(duì)于這樣的藥物，若將藥物給予代謝缺陷者則會(huì)有有害作用的風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)胞色素P-4503A(CYP3A)同工酶是細(xì)胞色素P-450超家族的成員。它構(gòu)成總?cè)烁闻K微粒體細(xì)胞色素P-450的60%,負(fù)責(zé)大量藥物的代謝，這些藥物包括硝苯地平(nifedipine)、大環(huán)內(nèi)酯抗生素(包括紅霉素(erythromycin)和三-竹杉匕霉素(tri-oleandomycin))、環(huán)孑包霉素A(cyclosporinA))、FK506、teffenadine、他莫昔芬(tamoxifen)、利多卡因、口米達(dá)哇侖(midazolam)、三峻侖(triazolam)、氨苯石風(fēng)(dapsone)、i也爾硫卓(diltiazem)、洛伐他汀(lovastatin)、查尼丁(quinidine)、乙基雌二醇、睪酮和阿芬太尼(alfentanil)。另外，CYP3A業(yè)已顯示在體外涉及幾種致癌物質(zhì)的生物活化和解毒途徑。除肝臟外，還在其它器官中發(fā)現(xiàn)CYP3A的活性形式，這些器官包括腎臟上皮細(xì)胞、空腸粘膜和肺。細(xì)胞色素P450蛋白的量在這些器官中比在肝臟中低4艮多。細(xì)胞色素P-4503A在肺微粒體中的存在表明，由CYP3A(P450-3A)介導(dǎo)的代謝的藥物和其它物質(zhì)可能在肺中部分被代謝。對(duì)于局部類固醇(丙酸倍氯米松(beclomethasomedipropionate))這已經(jīng)得到證明。還有研究顯示只有約10%的由吸入器釋放的藥物可被肺利用。其余的量留在儲(chǔ)霧裝置和口腔中。從肺和胃腸道吸收的類固醇隨后由肝臟細(xì)胞色素P450代謝。很多藥物由CYP3A家族成員CYP3A4代謝，這些藥物例如潑尼松(prednisone)、環(huán)孢霉素、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、洋地黃毒苷(digitoxin)、地西泮(diazepam)、乙炔基雌二醇、咪達(dá)哇侖、三唑苯二氮草、二氪吡咬類釣通道阻滯劑、某些HMG-CoA還原酶抑制劑等等。細(xì)胞色素P450和人肝細(xì)胞有人研究了冷凍保存的人肝細(xì)胞中的細(xì)胞色素P450(CYP450)同工型1A2、2A6、2C9、2C19、2D6、2E1和3A4[28，29]。該方法在測定藥物間的相互作用中尤其有用[28,29]。人CYP2A6是CYP超家族的重要成員，在肝臟中存在高達(dá)總CYP含量的1%。人CYP2A6代謝性活化致癌物質(zhì)黃曲霉毒素B1、煙草特有亞硝胺4-(曱基亞硝氨基)-l-(3-吡咬)-l-丁酮和N-亞硝基二乙基胺。CYP2A6還在人中通過芳香羥化進(jìn)行香豆素代謝。已經(jīng)將香豆素7-羥基化用作體外CYP2A6活性的標(biāo)記和測量體內(nèi)表達(dá)CYP2A6的根據(jù)。業(yè)已發(fā)現(xiàn)CYP2A6的遺傳性多態(tài)現(xiàn)象，這要?dú)w因于三個(gè)等位基因的變體形式，即分別為CYP2A6*1、2A6*2、2A6*3。細(xì)胞色素P4502D6也稱為異喹胍(debrisoquine)羥化酶，是人群中表征最充分的多態(tài)P450。業(yè)已報(bào)道代謝不良者的表型，其表現(xiàn)為常染色體隱性品質(zhì)，在北美和歐洲白人中發(fā)生率為5-10%。代謝不良者顯示可以幾乎可忽略量的細(xì)胞色素P4502D6。細(xì)胞色素P4502D6的遺傳差異可與發(fā)展中的基于環(huán)境和職業(yè)的疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。有些證據(jù)證明S-美芬妥英(S-mephenytoin)4'羥化酶的活性在于細(xì)胞色素P4502C酶家族。許多2C人變體(指定為2C8、2C9和2C10)業(yè)已部分被純化和/或克隆。各種P4502CcDNA和其預(yù)測的氨基Sl/f列的比較表明在人P4502C亞家族中約70%的氨基酸絕對(duì)保守。人P4502C蛋白序列的某些區(qū)域具有尤為高度的保守性，這些區(qū)域可能參與各種共有的P450功能。其它區(qū)域顯示更大的序列差異區(qū)域，很可能是造成2C成員間不同的底物特異性的原因。已知幾種用于治療心血管病和精神病的藥物為細(xì)胞色素P4502D6的底物。細(xì)胞色素P450與PSC-THP1-EP、PSC-THP1-HEP、PSC-THP1-EP-FAST、PSC-THP1-EPEP細(xì)胞系可預(yù)測的是，本發(fā)明肝細(xì)胞樣細(xì)胞系PSC-THP1-EP、PSC-THP1-HEP、PSC-THP1-EP-FAST、PSC-THP1-EPEP將象人肝細(xì)胞一樣可用于測定化學(xué)物質(zhì)和藥物的相互作用，因而，很可能用于測量由細(xì)胞色素P450家族進(jìn)行的化學(xué)物質(zhì)/藥物代謝。本發(fā)明肝細(xì)胞樣細(xì)胞系表達(dá)細(xì)胞色素P450，其由DNA微陣列所測量。具體而言，在本發(fā)明PSC-THP1-EP、PSC-THP1-HEP、PSC-THP1-EP-FAST、PSC-THP1-EPEP細(xì)胞系中業(yè)已鑒定出多種形式的細(xì)胞色素P450基因，其如下所示人細(xì)胞色素P450家族1亞家族A多肽2(CYP1A2)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族1亞家族A多肽1(CYP1A1)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族1亞家族B多肽1(CYP1B1)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族2亞家族A多肽6(CYP2A6)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族2亞家族A多肽7(CYP2A7)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族2亞家族A多肽13(CYP2A13)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族2亞家族B多肽6(CYP2B6)的mRNA42人細(xì)胞色素P450家族2亞家族C多肽8(CYP2C8)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族2亞家族C多肽9(CYP2C9)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族2亞家族C多肽18(CYP2C18)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族2亞家族C多肽19(CYP2C19)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族2亞家D多肽6(CYP2D6)轉(zhuǎn)錄變體1的mRNA人細(xì)胞色素P450家族2亞家族E多肽2同系物(FLJ39501)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族2亞家族E多肽1(CYP2E1)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族2亞家族F多肽1(CYP2F1)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族2亞家族J多肽2(CYP2J2)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族2亞家族R多肽1(CYP2R1)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族2亞家族S多肽1(CYP2S1)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族2亞家族U多肽1(CYP2U1)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族2亞家族W多肽1(CYP2W1)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族3亞家族A多肽4(CYP3A4)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族3亞家族A多肽5(CYP3A5)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族3亞家族A多肽7(CYP3A7)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族3亞家族A多肽43(CYP3A43)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族4亞家族A多肽11(CYP4A1l)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族4亞家族A多肽22(CYP4A22)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族4亞家族B多肽1(CYP4B1)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族4亞家族F多肽2(CYP4F2)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族4亞家族F多肽3(CYP4F3)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族4亞家族F多肽8(CYP4F8)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族4亞家族F多肽11(CYP4F11)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族4亞家族F多肽12(CYP4F12)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族4亞家族X多肽1(CYP4X1)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族4亞家族V多肽2(CYP4V2)的mRNA人細(xì)胞色素P450家族4亞家族Z多肽1(CYP4Z1)的mRNA由于本發(fā)明細(xì)胞系表達(dá)上述細(xì)胞色素P450形式，因而它們可潛在地用于進(jìn)行以下體外試驗(yàn)測定藥物和化學(xué)物質(zhì)的代謝情況和測定藥物間的相互作用。參考文獻(xiàn)1.ZhaoY，GlesneD，HubermanE.(2003).Ahumanperipheralbloodmonocyte-derivedsubsetactsaspluripotentstemcells(來源、于人夕卜周血單核細(xì)胞的亞型起多能干細(xì)胞的作用).Proc.Natl.Acad.Sci.USA.100(5):2426-31。2.StemCells:ScientificProgressandFutureResearchDirections(干細(xì)胞科學(xué)進(jìn)展和未來研究方向).衛(wèi)生與公眾服務(wù)部(DepartmentofHealthandHumanServices).2001年7月。3.UzanG.(2004).Therapeuticuseofstemcells(干細(xì)月包的治療用途).Rev.Prat,54(13):1399-403。4.Griffith,L.G.&Naughton，G.(2002).Tissueengineering-currentchallengesandexpandingopportunities(組織工禾呈學(xué)——目前的才兆戰(zhàn)和發(fā)展機(jī)會(huì)).Science.295,1009-1014。5.Wagers，A.J.，Christensen，J.L.，&Weissman,I.L.(2002).Cellfatedeterminationfromstemcells(干細(xì)月包的細(xì)月包命運(yùn)測定).GeneTher.9,606-612。6丄agasse,E.,Connors,H.,AlDhalimy,M.,Reitsma，M.，Dohse,M.，Osborne,L,Wang,X.，F(xiàn)inegold,M.，Weissman,I.L.和Grompe,M.(2000).Purifiedhaematopoieticstemcellscandifferentiateintohepatocytesv!'vo(純化的造血干細(xì)胞可在體內(nèi)分化為肝細(xì)胞)。7.Theise，N.D.，Nimmakayalu，M.,Gardner,R.,Illei,P.B.,Morgan,G.，Teperman,L.,Henegariu,O.和Krause,D.S.(2000).Liverfrombonemarrowinhumans.Hepatology(來自人骨ft的肝).Hepatology.3二11-16。8.0sawa,M.,Hanada,K.,Hamada,H.和Nakauchi,H.(1996).Long-termlymphohematopoieticreconstitutionbyasin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í)驗(yàn)室細(xì)胞系保藏中心(ICLC),保藏號(hào)為ICLCPDNo.06008。7.無限增殖的已分化細(xì)胞系，其特征在于可通過人HepG2細(xì)胞系與權(quán)利要求4的細(xì)胞系的融合而獲得。8.權(quán)利要求7的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系是被指定為PSC-THP1-HEP的細(xì)胞系，其于2006年12月15日保藏于意大利熱那亞的高級(jí)生物技術(shù)中心—國際實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞系保藏中心(ICLC)，保藏號(hào)為ICLCPDNo.06006。9.無限增殖的已分化細(xì)胞系，其特征在于可通過人HepG2細(xì)胞系、權(quán)利要求4的細(xì)胞系與成熟的人原代肝細(xì)胞的融合而獲得。10.權(quán)利要求9的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系是被指定為PSC-THP1-EPEP的細(xì)胞系，其于2006年12月15日保藏于意大利熱那亞的高級(jí)生物技術(shù)中心-國際實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞系保藏中心，保藏號(hào)為ICLCPDNo.06007。11.制備權(quán)利要求5或6的細(xì)胞系的方法，所述方法包括在以下生長因子存在下培養(yǎng)權(quán)利要求4的細(xì)胞系HGF(肝細(xì)胞生長因子)、M-CSF(巨噬細(xì)胞集落刺激生長因子)和EGF(表皮生長因子)以及白介素2和白介素6。12.制備權(quán)利要求7或8的細(xì)胞系的方法，所述方法包括使人HepG2細(xì)胞系與權(quán)利要求4的細(xì)胞系融合。13.制備權(quán)利要求9或10的細(xì)胞系的方法，所述方法包括使人HepG2細(xì)胞系、權(quán)利要求4的細(xì)胞系和成熟的人原代肝細(xì)胞融合。14.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的細(xì)胞系用于制備白蛋白的用途。15.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的細(xì)胞系用于制備一種或多種凝血因子的用途。16.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的細(xì)胞系用于在體外進(jìn)行以下試驗(yàn)的用途測定藥物和其它化學(xué)物質(zhì)的代謝情況或測定藥物間相互作用。全文摘要本發(fā)明涉及來自具肝細(xì)胞表型能夠產(chǎn)生白蛋白和凝血因子的已分化細(xì)胞的細(xì)胞系，所述細(xì)胞源自人白血病細(xì)胞系，優(yōu)選人THP1細(xì)胞系，所述細(xì)胞保留無限增殖特性。在本發(fā)明細(xì)胞系中，優(yōu)選稱為PSC-THP1-EP、PSC-THP1-EP-FAST、PSC-THP1-HEP和PSC-THP1-EPEP的細(xì)胞系。本發(fā)明還涉及用于獲得本發(fā)明細(xì)胞系的方法及所述細(xì)胞系的用途，尤其是用于制備白蛋白和/或凝血因子的用途。文檔編號(hào)C12N5/071GK101679945SQ200780051926公開日2010年3月24日申請(qǐng)日期2007年12月21日優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日發(fā)明者A·龐澤托,A·薩瓦里諾,G·佩斯卡莫納,G·梅里茲,L·格尼羅申請(qǐng)人:梅迪斯蒂生物科技有限公司