專利名稱：一種瓊脂糖免疫磁性微球的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微球的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
單克隆抗體是指由單一克隆雜交瘤細胞產(chǎn)生的只識別某一特定抗原表位的同源抗體。是經(jīng)過人工制備的一類特殊抗體，其本質(zhì)是球蛋白，具有球蛋白的各種理化性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性，具有可變區(qū)和恒定區(qū):可變區(qū)結(jié)合抗原，形成抗原抗體復(fù)合物；恒定區(qū)有補體結(jié)合位點，介導(dǎo)補體發(fā)揮作用，形成攻膜復(fù)合物，殺傷變異的細胞.
單克隆抗體具有一般抗體的性質(zhì)，是由B細胞增殖分化為漿細胞時所產(chǎn)生的一類球蛋白，存在于體液中，具有免疫功能，能夠介導(dǎo)體液免疫，與相應(yīng)抗原(如病原體)發(fā)生特異性結(jié)合，并在其他免疫分子和細胞的參入下發(fā)揮免疫效應(yīng).。單克隆抗體除了具有抗體的一般性質(zhì)外，還具有其特殊的優(yōu)點:理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)合的特異性強、便于人為處理和質(zhì)量控制，并且來源容易、易于體外大量制備和純化等優(yōu)點。這些優(yōu)點使它一問世就受到高度重視，并廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，有廣闊的發(fā)展前景。IgG是人體免疫球蛋白的一種，是唯一可以通過胎盤的免疫球蛋白，是血清主要的抗體成分，約占血清的75%。其中40 50%分布于血清中，其余的分布在各種組織中。IgG的功能作用主要在機體免疫中起保護作用。大多數(shù)抗病毒、抗毒素和抗菌抗體均屬于IgG類。能夠應(yīng)對麻疹、甲型肝炎等疾病，并能有效地預(yù)防相應(yīng)的感染性疾病。因此，在中和毒素、抗細菌、抗病毒、對抗 癌細胞方面，IgG類抗體起著重要作用。曲妥珠是重組DNA衍生的人源化單克隆抗體，屬IgG1型，它可以選擇性地作用于人表皮生長因子受體_2(HER2)的細胞外部位。通過將自己附著在Her2上來阻止人體表皮生長因子在Her2上的附著，從而阻斷癌細胞的生長，同時還可以刺激身體自身的免疫細胞去摧毀癌細胞。事目前配合放化療治療乳腺癌的特效藥物。雖然基因從組的單克隆抗體可以在體外人為控制實現(xiàn)批量生產(chǎn)，但是其分離純化過程十分復(fù)雜，需經(jīng)過細胞破碎、離心分離、鹽析沉淀、溶解沉淀、疏水層析、陰陽離子交換層析和凝膠過濾層析等處理才能獲得較高的純化效率，耗時長、浪費大量人力、物力，由于分離過程步驟多，造成了產(chǎn)品收率較低以及成本高等缺點。因此，開發(fā)能夠簡單、快速分離純化抗體的新技術(shù)已成為當(dāng)今生物領(lǐng)域的主流。目前，一些公司通常采用親和層析以提高純化效率和特異性，但在親和層析之前也要經(jīng)過鹽析、疏水或離子交換層析等處理才一能獲得較高的純化效率。另外，親和層析介質(zhì)同特異性抗體的連接多采用據(jù)毒的澳化氰作為偶聯(lián)劑，增加了工藝的危險性。為克服上述缺點，本發(fā)明在現(xiàn)今最常用的親和層析法的基礎(chǔ)上進行優(yōu)化改良，為蛋白類基因工程產(chǎn)物的分離純化開辟了一條新的途徑。瓊脂糖是十分理想的親和層析介質(zhì)，其表面不帶電荷，非特異性吸附能力極小，在緩沖液離子強度》0.05mol/L時，對蛋白質(zhì)類幾乎沒有特異性吸附作用，并且具有較好的親水性，可以使生物分子易于靠近并與配體作用，且不會使生物分子喪失活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是要解決現(xiàn)有純化的單克隆抗體的過程復(fù)雜，收率低，成本高且偶聯(lián)劑有劇毒的技術(shù)問題，從而提供了一種瓊脂糖免疫磁性微球的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的一種瓊脂糖免疫磁性微球的制備方法及其應(yīng)用是按以下步驟進行:一、取10 15g的FeC13.6H20和30 50g的油酸納溶解在混合溶劑中，加熱至60 80°C，保溫4 6h，反應(yīng)完成后，取上層有機溶劑用蒸餾水洗滌三次，旋蒸去除有機溶齊U，得到油酸鐵前驅(qū)體；其中，混合溶劑由乙醇、蒸餾水和正己烷按體積比60 80: 40 60: 120 140混合而成；二、室溫下，將30 40g的油酸、5 8g的步驟一得到的油酸鐵前驅(qū)體和100 200g的十八烯混合，再以每分鐘3 5°C的升溫速度加熱到320 340°C，并保溫20 50min,然后自然冷卻至室溫,加入400 600mL的無水乙醇,在3000 5000rpm的轉(zhuǎn)速下離心分離10 15min,得到磁流體；三、稱取20 50mL的液體石臘、5 IOmL的石油醚以及I 2g的表面活性劑span-80,預(yù)熱至60 80°C ，作為油相；將0.2 1.0g的瓊脂糖，0.5 1.2g的氯化鈉加入到5 15mL的蒸餾水中，加熱溶解，配制瓊脂糖質(zhì)量濃度為3%的瓊脂糖水溶液作為水相；四、取0.05 0.5g的步驟二得到的磁流體加入到步驟三得到的水相中，超聲分散后，轉(zhuǎn)移到步驟三得到的油相中，在3000 5000rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌10 30min，然后迅速冷卻至室溫，得到瓊脂糖磁性微球；五、取4 6g的步驟四得到的瓊脂糖磁性微球加入到混合溶液中，室溫下反應(yīng)20 40min，得到水解后的瓊脂糖磁性微球溶液，然后向瓊脂糖磁性微球溶液中加入二甲基亞砜和環(huán)氧氯丙烷，至二甲基亞砜的體積分數(shù)為40% 60%，環(huán)氧氯丙烷的體積分數(shù)為20%，在20 40°C恒溫震蕩反應(yīng)8 12h，得到活化交聯(lián)的瓊脂糖磁性微球；其中，混合溶液由9 Ilmg的硼氫化鈉和8 IOmL的氫氧化鈉溶液組成；六、取4 6g的步驟五得到的活化交聯(lián)的瓊脂糖磁性微球，加入8 12mL的氨水，室溫下反應(yīng)4 6h，將氨解后的微球洗凈抽干，然后加入9 12mL的戊二醛，室溫下震蕩反應(yīng)I 3h，用蒸餾水洗凈過量的戊二醛，得到接入間隔臂的瓊脂糖磁性微球；七、取2 4g的步驟六得到的接入間隔臂的瓊脂糖磁性微球加入到5 15mL的含有20 30g蛋白A的NaHCO3-NaCO3緩沖液中，4°C反應(yīng)過夜后，用蒸餾水將微球沖洗干凈，然后加入5 IOmL的lmol/L的乙醇胺溶液，在溫度為28 37°C下反應(yīng)2 6h，然后加入5 IOmL的lmg/mL的牛血清蛋白反應(yīng)，最后用蒸餾水洗凈，得到瓊脂糖免疫磁性微球。本發(fā)明的一種瓊脂糖免疫磁性微球的應(yīng)用為用于純化基因工程重組曲妥珠單克隆抗體。本發(fā)明包括以下有益效果:1、利用本發(fā)明制備的瓊脂糖免疫磁性微球純化基因工程重組曲妥珠單克隆抗體，可省去傳統(tǒng)層析方法必須的預(yù)過濾步驟，大幅度減少預(yù)處理時間，并提高產(chǎn)品收率，降低成本；操作簡便、快速，無須對樣品進行復(fù)雜的前處理，未加入磁場前，微球可以均勻的懸浮于裂解液中，加入磁場后，可以直接將微球從發(fā)酵菌體的裂解液中迅速分離出來，撤去磁場后磁性迅速消失，不影響目標(biāo)蛋白的分離；
2、利用本發(fā)明制備的瓊脂糖免疫磁性微球可以一步純化得到高純度目標(biāo)的蛋白，大大簡化分離純化步驟，提高產(chǎn)品收率，并且分離純化條件溫和，磁球可以回收，重復(fù)多次使用；本發(fā)明可替代免疫親和層析柱，成為一種快速、高效分離純化基因重組抗體的的新技術(shù)；3、本發(fā)明用環(huán)氧氯丙烷代替劇毒的溴化氰活化交聯(lián)瓊脂糖微球，降低了工藝的危險性，在體系中加入了水溶性的有機試劑二甲基亞砜，二甲基亞砜具有高熱穩(wěn)定性、低毒、低腐蝕等特點，不僅與水完全混溶，而且對于多種色譜配基亦有很好的溶解性，二甲基亞砜的加入大大提高了環(huán)氧氯丙烷的溶解度，可使活化密度提高2倍以上，從而大幅度提高了蛋白質(zhì)的純化率；以戊二醛作為交聯(lián)臂，偶聯(lián)特異性吸附極強的金黃色葡萄球菌蛋白A作為配基，可特異性吸附IgG型抗體；4、本發(fā)明制備的瓊脂糖免疫磁性微球表面連接間隔臂使配基與微球表面分開，并使配基較為均勻的分布在微球表面，在充分降低空間位阻的同時也降低了微球?qū)ε浠姆翘禺愋晕阶饔茫煽焖偻瓿晌竭^程，再外加磁場的作用下，可迅速實現(xiàn)分離；應(yīng)用本磁珠如目標(biāo)藥物為胞外分泌，更可省去細胞破碎的目的，直接從活細胞培養(yǎng)液中提取目標(biāo)產(chǎn)物。


圖1為試驗一步驟二得到的磁流體的XRD射線衍射譜；圖2為試驗一步驟四得到的瓊脂糖磁性微球的透射電鏡；圖3為試驗一制備的瓊脂糖免疫磁性微球的分散性；圖4為試驗一制備的瓊脂糖免疫磁性微球的磁性。
具體實施方式
具體實施方式
一:本實施方式的一種瓊脂糖免疫磁性微球的制備方法是按以下步驟進行:一、取10 15g的FeC13.6H20和30 50g的油酸納溶解在混合溶劑中，加熱至60 80°C，保溫4 6h，反應(yīng)完成后，取上層有機溶劑用蒸餾水洗滌三次，旋蒸去除有機溶齊U，得到油酸鐵前驅(qū)體；其中，混合溶劑由乙醇、蒸餾水和正己烷按體積比60 80: 40 60: 120 140混合而成；二、室溫下，將30 40g的油酸、5 8g的步驟一得到的油酸鐵前驅(qū)體和100 200g的十八烯混合，再以每分鐘3 5°C的升溫速度加熱到320 340°C，并保溫20 50min,然后自然冷卻至室溫,加入400 600mL的無水乙醇,在3000 5000rpm的轉(zhuǎn)速下離心分離10 15min,得到磁流體；三、稱取20 50mL的液體石臘、5 IOmL的石油醚以及I 2g的表面活性劑span-80,預(yù)熱至60 80°C，作為油相；將0.2 1.0g的瓊脂糖，0.5 1.2g的氯化鈉加入到5 15mL的蒸餾水中，加熱溶解，配制瓊脂糖質(zhì)量濃度為3%的瓊脂糖水溶液作為水相；四、取0.05 0.5g的步驟二得到的磁流體加入到步驟三得到的水相中，超聲分散后，轉(zhuǎn)移到步驟三得到的油相中，在3000 5000rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌10 30min，然后迅速冷卻至室溫，得到瓊脂糖磁性微球；
五、取4 6g的步驟四得到的瓊脂糖磁性微球加入到混合溶液中，室溫下反應(yīng)20 40min，得到水解后的瓊脂糖磁性微球溶液，然后向瓊脂糖磁性微球溶液中加入二甲基亞砜和環(huán)氧氯丙烷，至二甲基亞砜的體積分數(shù)為40% 60%，環(huán)氧氯丙烷的體積分數(shù)為20%，在20 40°C恒溫震蕩反應(yīng)8 12h，得到活化交聯(lián)的瓊脂糖磁性微球；其中，混合溶液由9 Ilmg的硼氫化鈉和8 IOmL的氫氧化鈉溶液組成；六、取4 6g的步驟五得到的活化交聯(lián)的瓊脂糖磁性微球，加入8 12mL的氨水，室溫下反應(yīng)4 6h，將氨解后的微球洗凈抽干，然后加入9 12mL的戊二醛，室溫下震蕩反應(yīng)I 3h，用蒸餾水洗凈過量的戊二醛，得到接入間隔臂的瓊脂糖磁性微球；七、取2 4g的步驟六得到的接入間隔臂的瓊脂糖磁性微球加入到5 15mL的含有20 30g蛋白A的NaHCO3-NaCO3緩沖液中，4°C反應(yīng)過夜后，用蒸餾水將微球沖洗干凈，然后加入5 IOmL的lmol/L的乙醇胺溶液，在溫度為28 37°C下反應(yīng)2 6h，然后加入5 IOmL的lmg/mL的牛血清蛋白反應(yīng)，最后用蒸餾水洗凈，得到瓊脂糖免疫磁性微球。本實施方式包括以下有益效果:1、利用本實施方式制備的瓊脂糖免疫磁性微球純化基因工程重組曲妥珠單克隆抗體，可省去傳統(tǒng)層析方法必須的預(yù)過濾步驟，大幅度減少預(yù)處理時間，并提高產(chǎn)品收率，降低成本；操作簡便、快 速，無須對樣品進行復(fù)雜的前處理，未加入磁場前，微球可以均勻的懸浮于裂解液中，加入磁場后，可以直接將微球從發(fā)酵菌體的裂解液中迅速分離出來，撤去磁場后磁性迅速消失，不影響目標(biāo)蛋白的分離；2、利用本實施方式制備的瓊脂糖免疫磁性微球可以一步純化得到高純度目標(biāo)的蛋白，大大簡化分離純化步驟，提高產(chǎn)品收率，并且分離純化條件溫和，磁球可以回收，重復(fù)多次使用；本實施方式可替代免疫親和層析柱，成為一種快速、高效分離純化基因重組抗體的的新技術(shù)；3、本實施方式用環(huán)氧氯丙烷代替劇毒的溴化氰活化交聯(lián)瓊脂糖微球，降低了工藝的危險性，在體系中加入了水溶性的有機試劑二甲基亞砜，二甲基亞砜具有高熱穩(wěn)定性、低毒、低腐蝕等特點，不僅與水完全混溶，而且對于多種色譜配基亦有很好的溶解性，二甲基亞砜的加入大大提高了環(huán)氧氯丙烷的溶解度，可使活化密度提高2倍以上，從而大幅度提高了蛋白質(zhì)的純化率；以戊二醛作為交聯(lián)臂，偶聯(lián)特異性吸附極強的金黃色葡萄球菌蛋白A作為配基，可特異性吸附IgG型抗體；4、本實施方式制備的瓊脂糖免疫磁性微球表面連接間隔臂使配基與微球表面分開，并使配基較為均勻的分布在微球表面，在充分降低空間位阻的同時也降低了微球?qū)ε浠姆翘禺愋晕阶饔?，可快速完成吸附過程，再外加磁場的作用下，可迅速實現(xiàn)分離；應(yīng)用本磁珠如目標(biāo)藥物為胞外分泌，更可省去細胞破碎的目的，直接從活細胞培養(yǎng)液中提取目標(biāo)產(chǎn)物。
具體實施方式
二:本實施方式與具體實施方式
一不同的是:步驟一中加熱至70°C,保溫4h。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三:本實施方式與具體實施方式
一或二不同的是:步驟一中混合溶劑由乙醇、蒸餾水和正己烷按體積比80: 60: 140混合而成。其它與具體實施方式
一或二相同。
具體實施方式
四:本實施方式與具體實施方式
一至三之一不同的是:步驟二中每分鐘3°C的升溫速度加熱到320°C，保溫30min。其它與具體實施方式
一至三之一相同。
具體實施方式
五:本實施方式與具體實施方式
一至四之一不同的是:步驟二中在3000rpm轉(zhuǎn)速下離心分離15min。其它與具體實施方式
一至四之一相同。
具體實施方式
六:本實施方式與具體實施方式
一至五之一不同的是:步驟四中在5000rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌30min。其它與具體實施方式
一至五之一相同。
具體實施方式
七:本實施方式與具體實施方式
一至六之一不同的是:步驟五中在20 40°C恒溫震蕩反應(yīng)8 12h。其它與具體實施方式
一至六之一相同。
具體實施方式
八:本實施方式與具體實施方式
一至七之一不同的是:步驟五中混合溶液由9 Ilmg的硼氫化鈉和8 IOmL的氫氧化鈉溶液組成。其它與具體實施方式
一至七之一相同。
具體實施方式
九:本實施方式與具體實施方式
一至八之一不同的是:步驟七中在溫度為37°C下反應(yīng)4h。其它與具體實施方式
一至八之一相同。
具體實施方式
十:本實施方式與具體實施方式
一至九之一不同的是:步驟六中加入5mL的lmg/mL的牛血清蛋白。其它與具體實施方式
一至七之一相同。
具體實施方式
十一:本實施方式的一種瓊脂糖免疫磁性微球的應(yīng)用為用于純化基因工程重組曲妥珠單克隆抗體。
具體實施方式
十二:本實施方式與具體實施方式
i^一不同的是:一種瓊脂糖免疫磁性微球的應(yīng)用，具體是按以下步驟完成的:一、取Im L的免疫磁性微球經(jīng)PBS緩沖液清洗，置于磁力架上，加入IOmL用PBS緩沖液稀釋的含有曲妥珠單克隆抗體的裂解液，緩慢震蕩反應(yīng)0.5 2h，反應(yīng)后將容器置于磁力架上，吸附固定磁性微球，棄去反應(yīng)液，得到固定磁性微球；二、用IOmL的PBS緩沖液清洗步驟一得到固定磁性微球3 5次后，加入4mL0.1M的甘氨酸-鹽酸緩沖液，緩慢震蕩反應(yīng)0.5 lh，然后將容器置于磁力架上，吸附磁性微球，收集解離液，得到純化的曲妥珠單克隆抗體。通過以下試驗驗證本發(fā)明的有益效果:試驗一:本試驗的一種純化曲妥珠單克隆抗體的瓊脂糖免疫磁性微球的制備方法是按以下步驟實現(xiàn)的:一、取10.8g的FeC13.6H20和36.5g的油酸納溶解在混合溶劑中，加熱至70°C，保溫4h，反應(yīng)完成后，取上層有機溶劑用蒸餾水洗滌三次，旋蒸去除有機溶劑，得到油酸鐵前驅(qū)體；其中，混合溶劑由乙醇、蒸餾水和正己烷按體積比80: 60: 140混合而成；二、室溫下，將36g的油酸和5.7g的步驟一得到的油酸鐵前驅(qū)體和200g的十八烯混合，以每分鐘3°C的升溫速度加熱到320°C，保溫30min，然后自然冷卻至室溫，加入500mL的無水乙醇，在3000rpm轉(zhuǎn)速下離心分離15min，得到磁流體；三、稱取30mL的液體石臘、6mL的石油醚以及1.4g的表面活性劑span-80,預(yù)熱至70°C，作為油相；將0.3g的瓊脂糖，0.9g的氯化鈉加入到IOmL的蒸餾水中，加熱溶解，配制瓊脂糖質(zhì)量濃度為3%的瓊脂糖水溶液作為水相；四、取0.05g的步驟二得到的磁流體加入到步驟三得到的水相中，超聲分散后，轉(zhuǎn)移到步驟三得到的油相中，在5000rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌30min，然后迅速冷卻至室溫，得到瓊脂糖磁性微球；
五、取5g的步驟四得到的瓊脂糖磁性微球加入到混合溶液中，室溫下反應(yīng)30min，得到水解后的瓊脂糖磁性微球溶液，然后向瓊脂糖磁性微球溶液中加入二甲基亞砜和環(huán)氧氯丙烷，至二甲基亞砜的體積分數(shù)為60 %，環(huán)氧氯丙烷的體積分數(shù)為20 %，在30°C恒溫震蕩反應(yīng)10h，得到活化交聯(lián)的瓊脂糖磁性微球；其中，混合溶液由IOmg的硼氫化鈉和IOmL的氫氧化鈉溶液組成；六、取5g的步驟五得到的活化交聯(lián)的瓊脂糖磁性微球，加入IOmL的氨水，室溫下反應(yīng)5h，將氨解后的微球洗凈抽干，然后加入IOmL的戊二醛，室溫下震蕩反應(yīng)2h，用蒸餾水洗凈過量的戊二醛，得到接入間隔臂的瓊脂糖磁性微球；七、取3g的步驟六得到的接入間隔臂的瓊脂糖磁性微球加入到IOmL的含有30g蛋白A的NaHCO3-NaCO3緩沖液中，4°C反應(yīng)過夜，用蒸餾水將微球沖洗干凈，然后加入5mL的lmol/L的乙醇胺溶液，在溫度為37°C下反應(yīng)4h，然后加入5mL的lmg/mL的牛血清蛋白反應(yīng)，最后用蒸餾水洗凈，得到瓊脂糖免疫磁性微球。本試驗步驟二得到的磁流體的XRD射線衍射譜如圖1所示，從圖1可以看出，本試驗所制得的是納米級的磁性四氧化三鐵粒子；本試驗步驟四得到的瓊脂糖磁性微球的透射電鏡如圖2所示，從圖2可以看出，本試驗所制得的瓊脂糖磁性微球大小均勻，單分散性好；本試驗制備的瓊脂糖免疫磁性微球的分散性如圖3所示，從圖3可以看出，本試驗所制得的瓊脂糖免疫磁性微球在溶液中的分散性極好；本試驗制備的瓊脂糖免疫磁性微球的磁性如圖4所示，從圖4可以看出，本試驗所制得的瓊脂糖磁性微球磁性極強；試驗二:一種瓊脂糖 免疫磁性微球的應(yīng)用，具體是按以下步驟完成的:一、取ImL的免疫磁性微球經(jīng)PBS緩沖液清洗，置于磁力架上，加入IOmL用PBS緩沖液稀釋的含有曲妥珠單克隆抗體的裂解液，緩慢震蕩反應(yīng)lh，反應(yīng)后將容器置于磁力架上，吸附固定磁性微球，棄去反應(yīng)液，得到固定磁性微球；二、用IOmL的PBS緩沖液清洗步驟一得到固定磁性微球3次后，加入4mL0.1M的甘氨酸-鹽酸緩沖液，緩慢震蕩反應(yīng)lh，然后將容器置于磁力架上，吸附磁性微球，收集解離液，得到純化的曲妥珠單克隆抗體。向上述分離過抗體的磁球中加入PBS緩沖液充分清洗數(shù)次，平衡磁性微球，棄去清洗液，將清洗后的微球放在20%的乙醇水溶液中4°C保存，可重復(fù)使用10次以上。采用ELISA法測定純化后抗體的免疫活性，純化后的抗體的各項指標(biāo)均達到國家標(biāo)準(zhǔn)，直接純化發(fā)酵菌裂解液的抗體動態(tài)吸附載量> 27mg/mL ;平均活性回收率為90.2%,平均比活性為1.5xl08g IU/mg ;經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳純度分析可知，純度近100%，各項指標(biāo)均達到國家標(biāo)準(zhǔn)，并顯示良好的重現(xiàn)性。
權(quán)利要求
1.一種瓊脂糖免疫磁性微球的制備方法，其特征在于瓊脂糖免疫磁性微球的制備方法是按以下步驟進行: 一、取10 15g的FeC13.6H20和30 50g的油酸納溶解在混合溶劑中，加熱至60 80°C，保溫4 6h，反應(yīng)完成后，取上層有機溶劑用蒸餾水洗滌三次，旋蒸去除有機溶齊U，得到油酸鐵前驅(qū)體；其中，混合溶劑由乙醇、蒸餾水和正己烷按體積比60 80: 40 60: 120 140混合而成； 二、室溫下，將30 40g的油酸、5 8g的步驟一得到的油酸鐵前驅(qū)體和100 200g的十八烯混合，再以每分鐘3 5°C的升溫速度加熱到320 340°C，并保溫20 50min，然后自然冷卻至室溫，加入400 600mL的無水乙醇,在3000 5000rpm的轉(zhuǎn)速下離心分離10 15min,得到磁流體； 三、稱取20 50mL的液體石臘、5 IOmL的石油醚以及I 2g的表面活性劑span-80,預(yù)熱至60 80°C，作為油相；將0.2 1.0g的瓊脂糖，0.5 1.2g的氯化鈉加入到5 15mL的蒸餾水中，加熱溶解，配制瓊脂糖質(zhì)量濃度為3%的瓊脂糖水溶液作為水相； 四、取0.05 0.5g的步驟二得到的磁流體加入到步驟三得到的水相中，超聲分散后，轉(zhuǎn)移到步驟三得到的油相中，在3000 5000rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌10 30min，然后迅速冷卻至室溫，得到瓊脂糖磁性微球； 五、取4 6g的步驟四得到的瓊脂糖磁性微球加入到混合溶液中，室溫下反應(yīng)20 40min,得到水解后的瓊脂糖磁性微球溶液，然后向瓊脂糖磁性微球溶液中加入二甲基亞砜和環(huán)氧氯丙烷，至二甲基亞砜的體積分數(shù)為40 % 60 %，環(huán)氧氯丙烷的體積分數(shù)為20 %，在20 40°C恒溫震蕩反應(yīng)8 12h，得到活化交聯(lián)的瓊脂糖磁性微球；其中，混合溶液由9 Ilmg的硼氫化鈉和8 IOmL的氫氧化鈉溶液組成； 六、取4 6g的步驟五得到的活化交聯(lián)的瓊脂糖磁性微球，加入8 12mL的氨水，室溫下反應(yīng)4 6h，將氨解后的微球洗凈抽干，然后加入9 12mL的戊二醛，室溫下震蕩反應(yīng)I 3h，用蒸餾水洗凈過量的戊二醛，得到接入間隔臂的瓊脂糖磁性微球； 七、取2 4g的步驟六得到的接入間隔臂的瓊脂糖磁性微球加入到5 15mL的含有20 30g蛋白A的NaHCO3-NaCO3緩沖液中，4°C反應(yīng)過夜后，用蒸餾水將微球沖洗干凈，然后加入5 IOmL的lmol/L的乙醇胺溶液，在溫度為28 37°C下反應(yīng)2 6h，然后加入5 IOmL的lmg/mL的牛血清蛋白反應(yīng)，最后用蒸餾水洗凈，得到瓊脂糖免疫磁性微球。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種瓊脂糖免疫磁性微球的制備方法，其特征在于步驟一中加熱至70°C，保溫4h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種瓊脂糖免疫磁性微球的制備方法，其特征在于步驟一中混合溶劑由乙醇、蒸餾水和正己烷按體積比80: 60: 140混合而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種瓊脂糖免疫磁性微球的制備方法，其特征在于步驟二中每分鐘3°C的升溫速度加熱到320°C，保溫30min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種瓊脂糖免疫磁性微球的制備方法，其特征在于步驟二中在3000rpm轉(zhuǎn)速下離心分離15min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種瓊脂糖免疫磁性微球的制備方法，其特征在于步驟四中在5000rpm的轉(zhuǎn)速下攪拌30min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種瓊脂糖免疫磁性微球的制備方法，其特征在于步驟五中在30°C恒溫震蕩反應(yīng)10h。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種瓊脂糖免疫磁性微球的制備方法，其特征在于步驟五中混合溶液由IOmg的硼氫化鈉和IOmL的氫氧化鈉溶液組成。
9.如權(quán)利要求1所述的一種瓊脂糖免疫磁性微球的應(yīng)用，其特征在于瓊脂糖免疫磁性微球的應(yīng)用為用于純化基因工程重組曲妥珠單克隆抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種瓊脂糖免疫磁性微球的應(yīng)用，其特征在于瓊脂糖免疫磁性微球的應(yīng)用，具體是按以下步驟完成的: 一、取ImL的免疫磁性微球經(jīng)PBS緩沖液清洗，置于磁力架上，加入IOmL用PBS緩沖液稀釋的含有曲妥珠單克隆抗體的裂解液，緩慢震蕩反應(yīng)0.5 2h，反應(yīng)后將容器置于磁力架上，吸附固定磁性微球，棄去反應(yīng)液，得到固定磁性微球； 二、用IOmL的PBS 緩沖液清洗步驟一得到固定磁性微球3 5次后，加入4mL0.1M的甘氨酸-鹽酸緩沖液，緩慢震蕩反應(yīng)0.5 lh，然后將容器置于磁力架上，吸附磁性微球，收集解離液，得到純化的曲妥珠單克隆抗體。
全文摘要
一種瓊脂糖免疫磁性微球的制備方法及其應(yīng)用，涉及一種微球的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明是要解決現(xiàn)有純化的單克隆抗體的過程復(fù)雜，收率低，成本高且偶聯(lián)劑有劇毒的技術(shù)問題。制備方法一、制備油酸鐵前驅(qū)體；二、制備磁流體；三、制備油相和水相；四、制備瓊脂糖磁性微球；五、制備活化交聯(lián)的瓊脂糖磁性微球；六、制備接入間隔臂的瓊脂糖磁性微球；七、制備瓊脂糖免疫磁性微球。本發(fā)明的一種瓊脂糖免疫磁性微球用于純化基因工程重組曲妥珠單克隆抗體。本發(fā)明制備瓊脂糖免疫磁性微球應(yīng)用于單克隆抗體分離純化領(lǐng)域。
文檔編號B01J20/28GK103212377SQ20131013828
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月19日
發(fā)明者趙九蓬, 侯雪梅, 李垚, 馬麗華, 潘磊, 趙長杰 申請人:哈爾濱益材新材料有限公司