專利名稱：：在芽孢桿菌屬細(xì)胞中獲得遺傳感受態(tài)的方法在芽孢桿菌屬細(xì)胞中獲得遺傳感受態(tài)的方法對序列表的引用本申請包含計算機(jī)可讀格式的序列表。所述計算機(jī)可讀格式通過提述并入本文。
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：發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及在非感受態(tài)芽孢桿菌屬(5"C/〃W力細(xì)胞中獲得遺傳感受態(tài)的方法。相關(guān)領(lǐng)域描述遺傳感受態(tài)是這樣的生理狀態(tài)外源DNA能夠被內(nèi)在化，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化事件(Berka等，2002，Mol.Microbiol.43:1331-45),但是與涉及電穿孔、原生質(zhì)體和熱休克或CaCl2處理的人工轉(zhuǎn)化不同。在革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌菌種中都已經(jīng)觀察到了天然感受態(tài)(Dubnau,1999,AnnualRev.Microbiol.53:217—44)，并且過程需要十幾種蛋白質(zhì)，其表達(dá)經(jīng)過精確地設(shè)計編排以滿足每種生物的需要。關(guān)于天然感受態(tài)的目的，已經(jīng)提出了幾種假設(shè)，這些假設(shè)可以總結(jié)為為食物的DNA、為修復(fù)的DNA和為遺傳多樣性的DNA(Dubnau,1999,見上文)。為食物的DNA假設(shè)得到如下觀察結(jié)果的支持感受態(tài)是穩(wěn)定期現(xiàn)象，當(dāng)細(xì)胞營養(yǎng)有限時出現(xiàn)，并且強(qiáng)大的非特異性核酸酶經(jīng)常與轉(zhuǎn)化特異性蛋白質(zhì)共表達(dá)。第二種假設(shè)的證據(jù)來自下述事實編碼DNA修復(fù)酶的基因與編碼DNA轉(zhuǎn)運蛋白的那些基因協(xié)同表達(dá)。最后，用于遺傳多樣性的DNA假設(shè)提出，感受態(tài)是通過水平基因轉(zhuǎn)移用于探索適應(yīng)性景觀(forexploringthefitnesslandscape)的機(jī)制。感受態(tài)受到細(xì)胞密度感受機(jī)制(quorum-sensingmechanism)的調(diào)節(jié)，并且其是一種雙穩(wěn)態(tài)狀態(tài)(Avery,2005，TrendsMicrobiol.13:459-462),這樣的觀察結(jié)果支持著這一假設(shè)。公共數(shù)據(jù)庫現(xiàn)在包含眾多完整的細(xì)菌基因組，包括來自同一菌種不同菌13抹的幾個基因組。近來的分析表明，使用配對全基因組比對，同一菌種的不同菌抹在基因內(nèi)容上可能有很大差異。例如，大腸桿菌菌株CFT073、EDL933和MG1655的基因組比較表明，它們的聯(lián)合蛋白質(zhì)(基因產(chǎn)物)集合中只有39.2%對于所有三抹菌都是常見的，突出表明了同一菌種的菌抹之間令人驚訝的多樣性(Blattner等，1997，5We"ce277:1453-74;Hayashi等，2006,M/.SyW.所o/.doi:10.1038:msb4100049;Perna等，2001，A^we409:529-33;Welch等，2002,尸rac.7VW/.^c^^c/.USA99:17020-17024)。此外，大腸桿菌菌株CFT073的基因組序列表明有1,623個菌抹特異基因(21.2%)。根據(jù)這類比較，清楚地表明細(xì)菌基因組分成常見的保守骨架和菌林特異性序列。通常，菌種中指定菌林的基因組按照在所有菌抹之間都保守的保守"骨架"基因和可能通過水平轉(zhuǎn)移獲得的非保守基因的分布而呈現(xiàn)鑲嵌結(jié)構(gòu)(Brzuszkiewicz等，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:12879-12884;Welch等，2002,見上文)。按照實際應(yīng)用，藉由天然感受態(tài)的轉(zhuǎn)化是構(gòu)建細(xì)菌菌抹如芽孢桿菌的極為有用的工具，所述菌抹中可以包含染色體基因的已改變的等位基因，或者通過重組DNA方法裝配的質(zhì)粒。盡管可以通過上述人工方法(例如，電穿孔、原生質(zhì)體，和熱休克或CaCl2處理)實現(xiàn)用質(zhì)粒和染色體DNA轉(zhuǎn)化某些菌種，但是通過天然感受態(tài)導(dǎo)入DNA可以在筒單、方便、速度和效率方面提供明顯的優(yōu)勢。在枯草芽孢桿菌(Sac,7/船w6"fe)中，藉由涉及細(xì)胞密度感受、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)級聯(lián)的過程，群體中只有5-10%的細(xì)胞分化成感受態(tài)狀態(tài)(稱為炎,態(tài))(Avery,2005,見上文)。已知至少50個基因與感受態(tài)直4妻有關(guān)，并且多達(dá)165個基因受到中央轉(zhuǎn)錄因子ComK(直接或間接)的調(diào)節(jié)(Berka等，2002，見上文)。枯草芽孢桿菌中的感受態(tài)級聯(lián)由兩個調(diào)節(jié)模塊組成，所述模塊由分子開關(guān)(圖l)間隔，所述分子開關(guān)涉及ComS與銜接分子MecA的結(jié)合，從而通過ClpC/ClpP蛋白酶干擾轉(zhuǎn)錄因子ComK的降解(Turgay等，1998,EAffi(9/.17:6730-6738)。在密切相關(guān)的菌種地衣芽孢桿菌CSa"'〃M"c/zew/ow^)中，感受態(tài)相比而言知之甚少。Thorne和同事(Gwinn和Thome,1964,見上文；Leonard等，1964，6acfen'o/.88:220-225;Thome禾口Stull,1966,JSacte"'o/.91:1012-1020)在20世紀(jì)60年代發(fā)表了一系列文章，描述通過天然感受態(tài)對源自地衣芽孢桿菌ATCC9945A的三抹營養(yǎng)缺陷型突變體的轉(zhuǎn)化。僅在三抹特定的營養(yǎng)缺陷14型突變體，9945A-M28(g/>T)、-M30(未表征的營養(yǎng)缺陷型)，和-M33(pw-)中觀察到了天然感受態(tài)。源自相同親本菌林(ATCC9945A)的很多其他營養(yǎng)缺陷型不產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體，包括需要硫胺素、賴氨酸、精氨酸、曱硫氨酸、色氨酸、組氨酸、尿嘧啶、腺噪呤或次黃嘌呤，和13種其他未表征的營養(yǎng)缺陷型需要(Gwinn和Thorne,1964，見上文)的那些。此外，這些研究者不能i正明地衣芽孑包桿菌ATCC10716中通過天然感受態(tài)進(jìn)行的轉(zhuǎn)化(Gwinn和Thome,1964,見上文)。如Throne和同事的早期工作所建議的，大多數(shù)地衣芽孢桿菌分離株不出現(xiàn)天然感受態(tài)，并且近年來，僅通過電穿孑L(Tangney等，1994，Aofec/wo/.rec/7m々w&s8:463-466)、接合(Herzog-Velikonja等，1994，尸/oy脂W31:201-206)或原生質(zhì)體(protoplasing)(Pragai等，1994,M/craWo/(7^^"gj140:305-310)，已經(jīng)實現(xiàn)了很多地衣芽孢桿菌分離林的轉(zhuǎn)化。地衣芽孢桿菌中明顯缺少感受態(tài)狀態(tài)的原因尚不可知。Ashikaga等，2000，Jm""a/o/Bflc&Wo/ogy182:2411-2415,描述了枯草芽孢桿菌納豆亞種(5ac/〃ww&tosubsp."a"o)發(fā)展遺傳感受態(tài)和表達(dá)并入夕卜源DNA所需的后期感受態(tài)基因(latecompetencegene)的能力。Liu等，1996，Jo^7w/o/Sac&n'o/ogv178:5144-5152，描述了通過多拷貝表達(dá)co附S而提高野生型枯草芽孢桿菌中感受基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)化效率。Tortosa等，2000,Mo/ecw/w腸'cra^o/ogy35:1110-1119,證明了破壞y/6F基因會引起comK表達(dá)的減少，并且的過量表達(dá)足以避開突變的感受態(tài)表型。因為地衣芽孢桿菌是具有工業(yè)重要性的菌種，所以極為期望表現(xiàn)天然感受態(tài)的工程菌抹用于構(gòu)建新的改進(jìn)型生產(chǎn)菌抹。提供用于在轉(zhuǎn)化性差的地衣芽孢桿菌菌抹中誘導(dǎo)感受態(tài)的交鑰匙方法(turn-keymethod)可以提高導(dǎo)入染色體標(biāo)記/等位基因和表達(dá)質(zhì)粒的速度與效率。如本文所述，術(shù)語轉(zhuǎn)化性差和非感受態(tài)可互換使用，這些術(shù)語指，當(dāng)如前所述用于在枯草芽孢桿菌或土芽孢桿菌中感受態(tài)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化時，每微克DNA中的轉(zhuǎn)化體數(shù)目小于自發(fā)突變效率的兩^f咅(Anagnostopoulos和Spizizen，1961,^ac/en'o/.81:741-746;Thorne和Stull,1966,J.5a"eWo/.91:1012-1020;Gwinn和Thome,1964，見上文)。本發(fā)明涉及在非感受態(tài)芽孢桿菌屬細(xì)胞中獲得遺傳感受態(tài)的方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及獲得感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞的方法，包含(a)將至少一個拷貝的第一核酸構(gòu)建體導(dǎo)入非感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建體包含與編碼ComS多肽的多核苦酸可操作連接的啟動子區(qū)，其中編碼ComS多肽的多核苷酸對于芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是外源的；和(b)分離包含編碼ComS多肽的多核苷酸的感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及獲得芽孢桿菌屬轉(zhuǎn)化體的方法，包含(a)將外源DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞通過至少一個拷貝的導(dǎo)入的第一核酸構(gòu)建體而成為感受態(tài)，所述核酸構(gòu)建體包含與編碼ComS多肽的多核芬酸可操作連接的啟動子區(qū)，其中編碼ComS多肽的多核苷酸對于芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是外源的；和(b)分離包含所述外源DNA的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生生物物質(zhì)的方法，包含(a)在有利于產(chǎn)生所述物質(zhì)的條件下培養(yǎng)用外源DNA轉(zhuǎn)化的芽孢桿菌屬一個拷貝的導(dǎo)入的核酸構(gòu)建體而使芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞成為感受態(tài)，所述核酸構(gòu)建體包含與編碼ComS多肽的多核苷酸可操作連接的啟動子區(qū)，其中編碼ComS多肽的多核苷酸對于芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是外源的，并且所述細(xì)胞在導(dǎo)入該核酸構(gòu)建體之前是非感受態(tài)的；和(b)回收所述具有生物活性的物質(zhì)。本發(fā)明還涉及包含至少一個拷貝的導(dǎo)入的第一核酸構(gòu)建體的感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建體包含與編碼ComS多肽的多核苷酸可操作連接的啟動子區(qū)，其中編碼ComS多肽的多核苷酸對于芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是外源的，并且所述細(xì)胞在導(dǎo)入該核酸構(gòu)建體之前是非感受態(tài)的。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生親本芽孢桿菌屬細(xì)胞的突變體的方法，其包括(a)用包含核酸構(gòu)建體的外源DNA轉(zhuǎn)化親本芽孢桿菌屬細(xì)胞，以修飾親本芽孢桿菌屬細(xì)胞中編碼多肽的基因，這產(chǎn)生在相同條件下培養(yǎng)時與親本細(xì)胞相比產(chǎn)生的多肽較少或產(chǎn)生的多肽生物活性較低的突變細(xì)胞，其中通過至少一個拷貝的導(dǎo)入的第一核酸構(gòu)建體而使芽孢桿菌屬細(xì)胞成為感受態(tài)，所述核酸構(gòu)建體包含與編碼ComS多肽的多核苷酸可操作連接的啟動子區(qū)，其中編碼ComS多肽的多核苷酸對于親本芽孢桿菌屬細(xì)胞是外源的，并且所述細(xì)胞在導(dǎo)入該核酸構(gòu)建體之前是非感受態(tài)的；和(b)分離所述突變細(xì)胞在優(yōu)選的方面，上述成為感受態(tài)的芽孢桿菌屬細(xì)胞進(jìn)一步包含至少一個拷貝的導(dǎo)入的第二核酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含與編碼ComK多肽的多核苷酸可操作連接的啟動子區(qū)，賦予芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞更進(jìn)一步的感受態(tài)。附圖簡述圖1表明枯草芽孢桿菌的感受態(tài)調(diào)控級聯(lián)。模塊1包括感受態(tài)信息素CSF的檢測和通過磷酸中繼機(jī)制(phosphorelaymechanism)進(jìn)行的信號傳導(dǎo)，其引起ComS肽的合成。ComS通過與MecA結(jié)合而干擾轉(zhuǎn)錄因子ComK的蛋白質(zhì)分解降解，MecA活化編碼后期感受態(tài)功能的模塊2,后期感受態(tài)功能編碼DNA轉(zhuǎn)運才幾制。圖2A和2B表示地衣芽孢桿菌DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的基因組DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列(分別為SEQIDNO:51和52)。圖3A、3B和3C表示地衣芽孢桿菌Blil90411限制-修飾系統(tǒng)的基因組DNA序列，其包含編碼Blil卯411限制性內(nèi)切核酸酶和M.Blil90411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的基因(SEQIDNO:53)。Blil90411限制性內(nèi)切核酸酶編碼區(qū)的反向補(bǔ)體(reversecomplement)用雙下劃線表示，而M.Blil90411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶編碼區(qū)用單下劃線表示。圖4顯示pMDT138的限制圖語。圖5顯示pKK223-3的限制圖語。圖6顯示pNBT51的限制圖傳。圖7顯示pNBT52的限制圖語。圖8顯示pNBT53的限制圖譜。圖9顯示pNBT54的限制圖傳。圖10顯示pNBT35的限制圖譜。圖11顯示pNBT30的限制圖譜。圖12顯示pNBT31的限制圖語。圖13顯示pNBT36的限制圖譜。圖14顯示pMDT100的限制圖譜。圖15顯示枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌基因組編碼的ComS蛋白質(zhì)的氨基酸序列比對。圖16顯示pMRT098的限制圖鐠。圖17顯示pMRT098/cowK的限制圖i普。圖18顯示pMRT098/cowX/a附少ZJ，的限制圖譜。圖19顯示pMRT098/com^/am;;丄弁24的限制圖語。圖20顯示pMMar2的限制圖譜。圖21顯示枯草芽孢桿菌cow6"和地衣芽孢桿菌cow《共表達(dá)的示意圖。定義感受態(tài)術(shù)語"感受態(tài)"在本文中定義為天然生理狀態(tài)，在這種狀態(tài)中外源(胞夕卜)DNA能夠內(nèi)在化至芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化事件(Berka等,2002,Mo/.M/cra&'o/.43:1331-45)。感受態(tài)不同于涉及電穿孔、原生質(zhì)體、熱休克或CaCl2處理的人工轉(zhuǎn)化。感受態(tài)機(jī)制(級聯(lián))術(shù)語"感受態(tài)機(jī)制，，和"感受態(tài)級聯(lián)"在本文可以互換使用，指細(xì)胞分化過程，所述過程將芽孢桿菌屬細(xì)胞轉(zhuǎn)化成天然可轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，所述可轉(zhuǎn)化細(xì)胞能使用后期感受態(tài)基因編碼的特定轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)攝取和合并外源(胞外)DNA，所述基因包含cowC、cow五、cowF和comG操縱子。非感受態(tài)如本文所述，術(shù)語"非感受態(tài)"和"可轉(zhuǎn)化性差"可互換使用，并且這些術(shù)語指使用如前所述在枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌中由感受態(tài)介導(dǎo)的專爭4匕方法日寸(Anagnostopoulos和Spizizen,1961,/.5a"en'o/.81:741-746;Thome和Stull，1966,J91:1012-1020;Gwinn和Thorne,1964，見上文)，每微克DNA中轉(zhuǎn)化體的數(shù)目少于自發(fā)突變頻率的兩倍。ComS多肽術(shù)語"ComS多肽"在本文中定義為co附S基因的產(chǎn)物，其參與遺傳感受態(tài)的調(diào)控。ComS是感受態(tài)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中其他調(diào)控組分之間的裝配接頭(Ogura等，1999,Mo/.Mfcra&o/.32:799-812;LiuandZuber，1998，乂5acten》/.180:4243-4251)。ComK多肽術(shù)語"ComK多肽"在本文中定義為com《基因的產(chǎn)物；在感受態(tài)發(fā)展之前作為最后的自身調(diào)控控制開關(guān)起作用的轉(zhuǎn)錄因子；參與后期感受態(tài)基因表達(dá)的活化，所述基因參與DNA-結(jié)合和攝取以及重組(Liu和Zuber，1998,見上文；Hamoen等，1998,Ge"wDev.12:1539-1550)。外源多核苷酸術(shù)語"外源多核苷酸"及其變體(variation)用于本文中指對于芽孢桿菌屬細(xì)胞非天然的多核苷酸，或者對于芽孢桿菌屬細(xì)胞是天然的，但是已經(jīng)通過使用對于芽孢桿菌屬細(xì)胞非天然的遺傳元件修飾的多核苷酸，或者已經(jīng)通過使用天然元件修飾的多核苦酸，該天然元件已經(jīng)經(jīng)過操作，以芽孢桿菌屬細(xì)胞中通常不存在的方式起作用。外源DNA:術(shù)語"外源DNA"在本文表示在芽孢桿菌屬細(xì)胞外部的DNA。同一性參數(shù)"同一性"描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的同一性程度使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,/Mo/.48:443-453)來測定，如在EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000，7>^"<*16:276-277)的Needle程序中所執(zhí)行的，優(yōu)選3.0.0版或以后的版本。使用的可選參數(shù)為缺口開放罰分(gapopenpenalty)10，在失口延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5,和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為"最長同一性"的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，并如下計算(相同殘基xiooy(比對長度-比對中缺口的總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的序列同一性程度使用Needleman-Wunsch算法(Needleman,口Wunsch，1970,見上文)測定，^口EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,見上文)的Needle程序所執(zhí)行的，優(yōu)選3.0.0版或以后的版本。使用的可選參數(shù)為缺口開放罰分10,缺口延伸罰分0.5,和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為"最長同一性"的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項獲得)作為百分比同一性，并如下計算(相同脫氧核糖核苷酸xiooy(比對長度-比對中缺口的總數(shù))肽片段術(shù)語"肽片段，，在本文中定義為從ComS多肽或ComK多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個氨基酸的ComS多肽或ComK多肽，其中所述片段分別具有ComS或ComK活性。在優(yōu)選的方面，SEQIDNO:2、4、6、8或10的ComS片段，或其同源物，含有至少30個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少35個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少40個氨基酸殘基。在另一個優(yōu)選的方面，SEQIDNO:12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50的ComK片段，或其同源物，含有至少400個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少420個氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少440個氨基酸殘基。19亞序列術(shù)語"亞序列(subsequence)，，在本文中定義為編碼ComS多肽或ComK多肽的多核香酸，其從所述多核苦酸的5，和/或3，端缺失一個或多個核苷酸，其中所述亞序列編碼具有ComS或ComK活性的肽片段。在優(yōu)選的方面，SEQIDNO:l、3、5、7,或9的cowS亞序列，或其同源物，含有至少90個核苷酸，更優(yōu)選至少105個核苷酸，并且最優(yōu)選至少120個核香酸。在另一個優(yōu)選的方面，SEQIDNO:11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47或49的comK亞序列，或其同源物，含有至少1200個核苷酸，更優(yōu)選至少1260個核香酸，并且最優(yōu)選至少1320個核苷酸。等位變體(allelicvariant):術(shù)語"等位變體"在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸術(shù)語"分離的多核苷酸，，用于本文中指從來源分離的多核脊酸。在優(yōu)選的方面，所述多核苷酸如通過瓊脂糖電泳測定為至少1%純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80°/。純，并且最優(yōu)選至少90%純?；旧霞兊亩嗪塑账嵝g(shù)語"基本上純的(substantiallypure)多核苷酸"用于本文指不含其它外來的或不期望的核苷酸的多核苷酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核香酸按重量計含有至多10%，優(yōu)選至多8%,更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5。/。，更優(yōu)選至多4%,更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5'和3，非翻譯區(qū)，例如啟動子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%，并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純。本發(fā)明所述多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式，即，所述多核苷酸制備物基本上不含與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。分離的多肽術(shù)語"分離的多肽"用于本文中指由其來源分離的多肽。在優(yōu)選的方面，所述多肽如通過SDS-PAGE測定是至少1%純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，和最優(yōu)選至少90%純的多肽。基本上純的多肽術(shù)語"基本上純的多肽"在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物按重量計含有至多10%,優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%,更優(yōu)選至多4%,更優(yōu)選至多3%,甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5。/。的與其天然或重組結(jié)合的(associated)的其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽是按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%純，最優(yōu)選至少99.5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式，即，所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多肽材料。這能夠通過以下方法實現(xiàn)，例如，通過公知的重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽。核酸構(gòu)建體術(shù)語"核酸構(gòu)建體"用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在的基因，或?qū)⑵鋇(奮飾以本來不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式含有核酸的區(qū)段。當(dāng)所述核酸構(gòu)建體含有表達(dá)編碼序列所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語"表達(dá)盒"同義。調(diào)控序列(controls叫uence):術(shù)語"調(diào)控序列"在本文定義為包括對于表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸是必需的或有利的所有組分。各種調(diào)控序列對于編碼所述多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各種調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可與用于導(dǎo)入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接。啟動子術(shù)語"啟動子"在本文定義為與RNA聚合酶結(jié)合并指導(dǎo)聚合酶到達(dá)多核苷酸正確的下游轉(zhuǎn)錄起始位點以啟動轉(zhuǎn)錄的DNA序列，所述多核苷酸編碼具有生物活性的多肽。RNA聚合酶有效地催化與編碼區(qū)合適DNA鏈互補(bǔ)的信使RNA的裝配。術(shù)語"啟動子，，還應(yīng)理解為包括5'非編碼區(qū)(在啟動子和翻譯起點之間)，用于轉(zhuǎn)錄成mRNA后的翻譯，順式作用轉(zhuǎn)錄控制元件如增強(qiáng)子，和/或其他能與轉(zhuǎn)錄因子相互作用的核苷酸序列。啟動子可以是野生型、變體、雜合或共有(consensus)啟動子。啟動子區(qū)術(shù)語"啟動子區(qū)"在本文定義為包含一個或多個(幾個)啟動子序列的核苷酸序列，例如，三聯(lián)啟動子(tandemtriplepromoter)。啟動子變體術(shù)語"啟動子變體"在本文定義為這樣的啟動子，其具有的核苷酸序列包含對親本啟動子的一個或多個(幾個)核苷酸的取代、缺失和/或插入，其中突變啟動子具有比相應(yīng)的親本啟動子更多或更少的啟動子活性。術(shù)語"啟動子變體"還包含天然變體和使用本領(lǐng)域已知方法獲得的體外產(chǎn)生的變體，所述方法如經(jīng)典誘變、定點誘變，和DNA改組。串聯(lián)啟動子術(shù)語"串聯(lián)啟動子"在本文定義為兩個或更多的啟動子序列，每個都與編碼序列可操作地連接，并介導(dǎo)編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA。雜合啟動子術(shù)語"雜合啟動子"在本文定義為兩個或更多啟動子的部分，其融合在一起產(chǎn)生為所述兩個或多個啟動子的融合體的序列，與編碼具有生物活性的多肽的多核苷酸編碼序列可操作連接時介導(dǎo)該編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA?？刹僮鞯剡B接術(shù)語"可操作地連接"在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的合適位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)多肽的編碼序列的表達(dá)。編碼序列當(dāng)用于本文時術(shù)語"編碼序列"的意思是直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開放閱讀框確定，所述開放閱讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的核苷酸序列。表達(dá)術(shù)語"表達(dá)"包括涉及感興趣的多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達(dá)載體術(shù)語"表達(dá)載體"在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼感興趣的多肽的多核苷酸，并且與提供用于其表達(dá)的額外核苷酸可操作地連接。宿主細(xì)胞如本文中所使用的術(shù)語"宿主細(xì)胞"包括任何細(xì)胞類型，所述細(xì)胞類型對于使用核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合等是易感的(susceptible)。轉(zhuǎn)化術(shù)語"轉(zhuǎn)化"在本文定義為將外源DNA導(dǎo)入芽孢桿菌屬細(xì)胞，使所述DNA作為染色體整合體或作為自復(fù)制的染色體外載體保留。轉(zhuǎn)染術(shù)語"轉(zhuǎn)染"在本文定義為用病毒核酸轉(zhuǎn)化芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)術(shù)語"轉(zhuǎn)導(dǎo)"在本文定義為將來自第一芽孢桿菌屬細(xì)胞的DNA包裝入病毒顆粒，并通過用病毒顆粒感染第二芽孢桿菌屬細(xì)胞，將細(xì)菌DNA轉(zhuǎn)入第二細(xì)胞。接合術(shù)語"接合"在本文定義為通過細(xì)胞與細(xì)胞的接觸，將DNA直接從一個芽孢桿菌屬細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一個芽孢桿菌屬細(xì)胞。轉(zhuǎn)化體術(shù)語"轉(zhuǎn)化體，，在本文定義為通常包含任何芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，其中已經(jīng)通過轉(zhuǎn)化將外源DNA導(dǎo)入了所述細(xì)胞。術(shù)語"轉(zhuǎn)化體"不包括由人工方法如電穿孔、原生質(zhì)體、熱休克或CaCl2處理產(chǎn)生的轉(zhuǎn)染體、接合體和轉(zhuǎn)化體。修飾術(shù)語"修飾"在本文的意思是，對ComS多肽或ComK多肽的任何化學(xué)修飾，以及對編碼如ComS多肽或ComK多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個或多個氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個氨基酸側(cè)鏈的置換。人工變體當(dāng)用在本文時，術(shù)語"ComS人工變體"是指由表達(dá)修飾的ComS編碼序列的生物產(chǎn)生的ComS多肽。術(shù)語"ComK人工變體，，是指由表達(dá)修飾的ComK編碼序列的生物產(chǎn)生的ComK多肽。所述修飾的核苷酸序列通過人為干預(yù)(humanintervention),通過修飾親本ComS或親本ComK編碼序列來獲得。親本序列可以是野生型序列、合成序列、突變序列等。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及獲得感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞的方法，其包括(a)將至少一個拷貝的第一核酸構(gòu)建體導(dǎo)入非感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建體包含與編碼ComS多肽的多核苷酸可操作連接的啟動子區(qū)，其中編碼ComS多肽的多核苷酸對于所述芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是外源的；和(b)分離包含編碼ComS多肽的多核香酸的感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生獲得芽孢桿菌屬轉(zhuǎn)化體的方法，其包括(a)將外源DNA23轉(zhuǎn)化進(jìn)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞通過至少一個拷貝的導(dǎo)入的第一核酸構(gòu)建體而成為感受態(tài)，所述核酸構(gòu)建體包含與編碼ComS多肽的多核苷酸可操作連接的啟動子區(qū)，其中編碼ComS多肽的多核苷酸對于芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是外源的，所述細(xì)胞在導(dǎo)入第一核酸構(gòu)建體之前是非感受態(tài)的；和(b)分離包含所述DNA的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體。與非感受態(tài)芽孢桿菌屬細(xì)胞相比，本發(fā)明的方法將獲得的轉(zhuǎn)化體的數(shù)目增加至少IO倍，優(yōu)選至少100倍，更優(yōu)選至少1000倍，甚至更優(yōu)選至少10,000倍，并且最優(yōu)選至少IOO，OOO倍。芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞在本發(fā)明的方法中，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞可以是任何非感受態(tài)或可轉(zhuǎn)化性差的芽孢桿菌屬細(xì)胞。如本文所述，術(shù)語非感受態(tài)或可轉(zhuǎn)化性差指在枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌中在使用感受態(tài)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法時，每微克DNA中的轉(zhuǎn)化體的數(shù)目小于自發(fā)突變頻率的兩倍。在本文，術(shù)語非感受態(tài)和可轉(zhuǎn)化性差可以互換使用。應(yīng)理解的是，本文中的術(shù)語"芽孢桿菌屬，，還涵蓋芽孢桿菌屬的同義詞和曾被分類為芽孢桿菌的屬如土芽孢桿菌屬(C7eo^c/〃M力和類芽孢桿菌屬(尸ae"/6ac///^)。在本發(fā)明的實踐中有用的非感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞包括，但不限于，嗜堿芽孢桿菌(6a"7/附aM:a/，/n7船)、解淀粉芽孢桿菌(iac/7/wsawy/o/Z^MeT^c/em1)、萎縮芽孑包桿菌(Ba"'〃^afro//zflew)、短芽孑包斥干菌(Sac/〃z^6rev&)、環(huán)狀芽孑包桿菌0B(2"'〃ws">ct//ara)、克勞氏芽孑包桿菌C6ac/〃MSc/oms,7)、)疑結(jié)芽孑包斥干菌(v5ac/〃m1coag"/"m1)、堅固芽孑包4干菌(Sa"'〃ws、杣爛芽孢桿菌(Bfl"7/船、遲緩芽孢桿菌CSacf〃i"/eWw力、地衣芽孢桿菌(Sac/〃MS//c/zem/c^m/力、巨大芽孑包才干菌(Sac/〃MSmegae〃'wm)、莫〉每威芽孑包斗干菌(Sa"'〃z^wq/awm7'力、短小芽孑包桿菌(5ac/〃wspwm7M力、嗜熱月旨肪芽孑包桿菌(5<3"'〃z."■sto3ra^zenwo//7z^)、枯草芽孑包才干菌(^6a"'〃wssw6"to)、蘇云金芽孑包^干菌(5ac/〃ws/^Mn'"g/em7》，和花i或芽孑包才干菌(Ba"'〃MSva〃^moW力纟田月包。在優(yōu)選的方面，非感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在更優(yōu)選的方面，非感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞。在另外的更優(yōu)選方面，非感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是克勞氏芽孢桿菌細(xì)胞。在另外的更優(yōu)選方面，非感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是地衣芽孢桿菌細(xì)胞。在另外的更優(yōu)選方面，非感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在最優(yōu)選的方面，非感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是地衣芽孢桿菌細(xì)胞。在本發(fā)明的另外的方面，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞可以另外包含一個或多個(幾個)修飾，例如，對其他基因的缺失或破壞，所述其它基因可能不利于感興趣的多肽或生物化學(xué)物質(zhì)(biochemical)的產(chǎn)生、回收或應(yīng)用。在優(yōu)選的方面，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是蛋白酶缺陷型細(xì)胞。在更優(yōu)選的方面，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞包含對和"/r五的破壞或缺失。在另外的優(yōu)選方面，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞不產(chǎn)生孢子。在另外的更優(yōu)選的方面，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞包含對Wo/"C的^C壞或缺失。在另外的優(yōu)選方面，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞包含破壞或缺失與表面活性肽的生物合成有關(guān)的基因之一，所述基因例如w/丄w/B、w/C和wyD。參見，例如，美國專利5,958,728。也可以石皮壞或缺失不利于感興趣的多肽或生物物質(zhì)產(chǎn)生、回收或應(yīng)用的其他基因，例如，am少五基因。本發(fā)明還涉及感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，其包含至少一個拷貝的導(dǎo)入的第一核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含與編碼ComS多肽的多核苷酸可操作連接的啟動子區(qū)，其中編碼ComS多肽的多核苷酸對于芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是外源的，所述細(xì)胞在導(dǎo)入第一核酸構(gòu)建體之前是非感受態(tài)的。在優(yōu)選的方面，上述成為感受態(tài)的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含至少一個拷貝的導(dǎo)入的第二核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含與編碼ComK多肽的多核苷酸可操作連接的啟動子區(qū)，賦予芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞高于通過表達(dá)ComS多肽獲得的感受態(tài)的更進(jìn)一步的感受態(tài)。通過進(jìn)一步將獲得的轉(zhuǎn)化體數(shù)目與通過表達(dá)ComS多肽獲得感受態(tài)的芽孢桿菌屬細(xì)胞相比，增加至少2倍，優(yōu)選至少5倍，更優(yōu)選至少10倍，更優(yōu)選至少100倍，甚至更優(yōu)選至少1000倍，最優(yōu)選至少IO，OOO倍，和甚至最優(yōu)選至少100,000倍，由此賦予芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞更進(jìn)一步的感受態(tài)。本發(fā)明還涉及這樣的感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包含核酸構(gòu)建體或重組表達(dá)載體，其包含編碼或參與生物物質(zhì)表達(dá)的感興趣的DNA。ComS多肽和ComK多肽和它們的多核苦酸在本發(fā)明的方法中，可以使用適于賦予非感受態(tài)芽孢桿菌屬細(xì)胞遺傳感受態(tài)的編碼ComS多肽的任何分離的多核苷酸。此外，可以使用適于賦予感受態(tài)芽孢桿菌屬細(xì)胞在遺傳上更強(qiáng)的感受態(tài)的編碼ComK多肽的任何分離的多核苷酸。分離的多核苷酸可以是基因組、cDNA、半合成、合成來源，或它們的任何組合。編碼ComS多肽的多核苷酸可以獲得自，例如，解淀粉芽孢桿菌(登錄號Q70KJ5)、枯草芽孢桿菌(登錄號P80355和Q83WC2),或地衣芽孢桿菌。編碼ComK多肽的多核香酸可以獲得自，例如，枯草芽孢桿菌168(登錄號P40396)、地衣芽孢桿菌(DSM13/ATCC14580)(登錄號Q65LN7)、地衣芽孢桿菌(登錄號Q8VQ66)、芽孢桿菌菌種Bt24(登錄號Q2HQ4"、韋氏芽孢桿菌(5ad〃wwe//2e"Wep/w"e";^)KBAB4(登錄號Q2AUN4)、蘇云金芽孢桿菌fe"A:z^a"亞種(登錄號Q6HM51)、蠟狀芽孢桿菌(Ba"7/wcerew力ATCC10987(登錄號Q73C31)、蠟狀芽孢桿菌菌抹ZK/E33L(登錄號Q63EM6)、蠟狀芽孢桿菌G9241(登錄號Q4MPH9)、炭疽芽孢桿菌(fiac/〃w(登錄號Q81TW5)、蠟狀芽孢桿菌(ATCC14579/DSM31;登錄號Q81GQ3)、蠟狀芽孢桿菌qytoto;ds亞種NVH391-98(登錄號Q2E900)、芽孢桿菌菌種NRRLB-14911(登錄號Q2B9A0)、芽孢桿菌菌種Ob20(登錄號Q2HQ30)、芽孢桿菌菌種Bt26(登錄號Q2HQ36)、芽孢桿菌菌種Ob07(登錄號Q2HQ38)、芽孢桿菌菌種Bt30(登錄號Q2HQ39)、芽孢桿菌菌種Bt35(登錄號Q2HQ35)、芽孢桿菌菌種Ob12b(登錄號Q2HQ37)，和蘇云金芽孢桿菌以色列亞種(Sac/〃wZ/n/n'"g/em7'5subsp./srae/era7.力(ATCC35646;登錄號Q3EYL1)。在第一方面，編碼ComS多肽的分離的多核苷酸包含與SEQIDN0:2，SEQIDNO:4,SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，或SEQIDNO:10具有如下同一性程度的氨基酸序列，優(yōu)選至少60%,更優(yōu)選具有至少65%,更優(yōu)選至少70%,更優(yōu)選至少75%,更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%(下文中的"同源ComS多肽，，或"ComS同源物")。在優(yōu)選的方面，同源的ComS多肽包含這樣的氨基酉1^列，其與SEQIDNO:2，SEQIDNO:4，SEQIDNO:6,SEQIDNO:8，或SEQIDNO:10有十個氨基酸不同，優(yōu)選五個氨基酸不同，更優(yōu)選四個氨基酸不同，甚至更優(yōu)選三個氨基酸不同，最優(yōu)選兩個氨基酸不同，并且甚至最優(yōu)選一個氨基酸不同。分離的多核苷酸優(yōu)選編碼包含SEQIDNO:2，SEQIDNO:4,SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，或SEQIDNO:10的氨基酸序列的ComS多肽，或其等位變體；或其保持ComS多肽活性的片段。在優(yōu)選的方面，ComS多肽包含SEQIDNO:2，SEQIDNO:4，SEQIDNO:6，SEQIDNO:8,或SEQIDNO:10的氨基酸序列。在另外的優(yōu)選方面，ComS多肽由SEQIDNO:2，SEQIDNO:4，SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，或SEQIDNO:10的氨基酸序列，或其等位變體；或其具有ComS活性的片段組成。在另外優(yōu)選的方面，ComS多肽由SEQIDNO:2，SEQIDNO:4,SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，或SEQIDNO:10的氨基酸序列組成。在另外的第一方面，編碼ComK多肽的分離的多核苷酸包含與SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16,SEQIDNO:18,SEQIDNO:20,SEQIDNO:22，SEQIDNO:24，SEQIDNO:26,SEQIDNO:28，SEQIDNO:30，SEQIDNO:32，SEQIDNO:34，SEQIDNO:36，SEQIDNO:38,SEQIDNO:40,SEQIDNO:42,SEQIDNO:44,SEQIDNO:46,SEQIDNO:48,或SEQIDNO:50具有如下同一性程度的氨基酸序列，優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少85%,甚至更優(yōu)選至少90%,最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少96%，至少97%，至少98%，或至少99%(下文中的"同源ComK多肽"或"ComK同源物，，)。在優(yōu)選的方面，同源的ComK多肽包含氨基Sl/f列，所述氨基S臾序列與SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18,SEQIDNO:20，SEQIDNO:22,SEQIDNO:24,SEQIDNO:26,SEQIDNO:28，SEQIDNO:30,SEQIDNO:32,SEQIDNO:34,SEQIDNO:36,SEQIDNO:38，SEQIDNO:40，SEQIDNO:42，SEQIDNO:44，SEQIDNO:46，SEQIDNO:48，或SEQIDNO:50的氨基酸有十個氨基酸不同，優(yōu)選五個氨基酸不同，更優(yōu)選四個氨基酸不同，甚至更優(yōu)選三個氨基酸不同，最優(yōu)選兩個氨基酸不同，并且甚至最優(yōu)選一個氨基酸不同。分離的多核苷酸優(yōu)選編碼包含SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16,SEQIDNO:18,SEQIDNO:20，SEQIDNO:22，SEQIDNO:24,SEQIDNO:26，SEQIDNO:28，SEQIDNO:30,SEQIDNO:32,SEQIDNO:34,SEQIDNO:36，SEQIDNO:38,SEQIDNO:40，SEQIDNO:42,SEQIDNO:44,SEQIDNO:46，SEQIDNO:48,或SEQIDNO:50的ComK多肽，或其等位變體；或其保持ComK多肽活性的片段。在優(yōu)選的方面，ComK多肽包含SEQIDNO:12，SEQIDNO:14,SEQIDNO:16,SEQIDNO:18,27SEQIDNO:20，SEQIDNO:22，SEQIDNO:24，SEQIDNO:26，SEQIDNO:28,SEQIDNO:30,SEQIDNO:32,SEQIDNO:34，SEQIDNO:36,SEQIDNO:38，SEQIDNO:40，SEQIDNO:42，SEQIDNO:44,SEQIDNO:46，SEQIDNO:48,或SEQIDNO:50的氨基酸序列。在另外的優(yōu)選方面，ComK多肽由SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18,SEQIDNO:20，SEQIDNO:22,SEQIDNO:24,SEQIDNO:26，SEQIDNO:28,SEQIDNO:30,SEQIDNO:32,SEQIDNO:34,SEQIDNO:36，SEQIDNO:38,SEQIDNO:40，SEQIDNO:42,SEQIDNO:44，SEQIDNO:46,SEQIDNO:48,或SEQIDNO:50的氨基酸序列，或其等位變體；或其具有ComK活性的片段組成。在另外優(yōu)選的方面，ComK多肽由SEQIDNO:12,SEQIDNO:14,SEQIDNO:16,SEQIDNO:18,SEQIDNO:20，SEQIDNO:22,SEQIDNO:24，SEQIDNO:26，SEQIDNO:28,SEQIDNO:30，SEQIDNO:32，SEQIDNO:34,SEQIDNO:36，SEQIDNO:38，SEQIDNO:40,SEQIDNO:42,SEQIDNO:44，SEQIDNO:46，SEQIDNO:48,或SEQIDNO:50的氨基酸序列組成。在第二方面，編碼ComS多肽的分離的多核香酸優(yōu)選在至少非常低嚴(yán)緊性條件下，更優(yōu)選至少低嚴(yán)緊性條件下，更優(yōu)選至少中嚴(yán)緊性條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊性條件下，甚至更優(yōu)選至少高嚴(yán)緊性條件下，并且最優(yōu)選至少非常高嚴(yán)緊性條件下，與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7或SEQIDNO:9雜交(ii)(i)的亞序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互才卜!連(J.Sambrook,E.F.Fritsch禾口T.Maniatis,1989,Mo/ecw/arC7ow'"g,爿丄Woratoo;Afa"認(rèn)/,第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7或SEQIDNO:9的亞序列含有至少90個連續(xù)的核香酸或優(yōu)選至少120個連續(xù)的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有ComS活性的多肽片段。在另一個第二方面，編碼ComK多肽的分離的多核苷酸在優(yōu)選至少非常低嚴(yán)緊性條件下，更優(yōu)選至少低嚴(yán)緊性條件下，更優(yōu)選至少中嚴(yán)緊性條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊性條件下，甚至更優(yōu)選至少高嚴(yán)緊性條件下，并且最優(yōu)選至少非常高嚴(yán)緊性條件下，與SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47或SEQIDNO:49雜交，(ii)(i)的亞序列，或(iii)(i)或(ii)的全長互補(bǔ)鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989,M/ecw/arC7<9w/wg，爿La6oratoMam^ar/,第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47或SEQIDNO:49的亞序列含有至少100個連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個連續(xù)的核苷酸。此外，所述亞序列可編碼具有ComK活性的多肽片段。上述核苷酸序列或其亞序列，以及上述氨基酸序列或其片段，可用于設(shè)計核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬和種的菌抹鑒定和克隆編碼ComS多肽和ComK多肽的DNA。具體而言，才艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法，可將這些探針用于與感興趣的屬或種的基因組DNA雜交，以鑒定和分離其中相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長度應(yīng)為至少14,優(yōu)選至少17，更優(yōu)選至少20，并且最優(yōu)選至少50個核苷酸。然而，優(yōu)選所述核酸探針長度為至少60個核苷酸。例如，所述核酸探針的長度可以是至少100個核苷酸。DNA和RNA兩種探針均可使用。通常將探針標(biāo)記以探測相應(yīng)的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標(biāo)記)。這些探針包含于本發(fā)明中。因而，可從制備自這些其它生物體的基因組DNA文庫中篩選與上述探針雜交并且編碼ComS多肽或ComK多肽的DNA?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或其它分離技術(shù)分離來自這些其它生物體的基因組DNA?？梢詫碜晕膸斓腄NA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7或SEQIDNO:9或其亞序列，或SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47或SEQID29NO:49,其全長互補(bǔ)鏈，或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料用在Sounthern印跡中。就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高嚴(yán)緊性條件下與標(biāo)記的核酸探針雜交，所述核酸探針對應(yīng)于SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7或SEQIDNO:9中所示的核普酸序列，它的全長互補(bǔ)《連，或它們的亞序列，或SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47或SEQIDNO:49，它的全長互補(bǔ)鏈，或他們的亞序列?？墒褂美鏧射線片(X-rayfilm)檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在優(yōu)選的方面，核酸探針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:2的ComS多肽，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:1或其全長互補(bǔ)鏈。在另一個優(yōu)選的方面ComS多肽，或其亞序列。其全長互補(bǔ)鏈。在另一個優(yōu)選的方面ComS多肽，或其亞序列。其全長互補(bǔ)鏈。在另一個優(yōu)選的方面ComS多肽，或其亞序列。其全長互補(bǔ)鏈。在另一個優(yōu)選的方面ComS多狀，或其亞序列。其全長互補(bǔ)鏈。在另一個優(yōu)選的方面ComK多肽，或其亞序列或其全長互補(bǔ)鏈。在另一個優(yōu)選的方面30,核酸探針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:4的在另一個優(yōu)選方面，核酸^f笨針是SEQIDNO:3或,核酸探針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:6的在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:5或,核酸探針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:8的在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:7或,核酸探針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:10的在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:9或,核酸探針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:12的。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:11,核酸探針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:14的ComK多肽，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:13或其全長互補(bǔ)鏈。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:16的ComK多肽，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:15或其全長互補(bǔ)鏈。在另一個優(yōu)選的方面，核酸#1針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:18的ComK多肽，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:17或其全長互補(bǔ)鏈。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:20的ComK多肽，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:19或其全長互補(bǔ)鏈。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:22的ComK多肽，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:21或其全長互補(bǔ)鏈。在另一個優(yōu)選的方面，核酸^^笨針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:24的ComK多肽，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:23或其全長互補(bǔ)鏈。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:26的ComK多肽，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:25或其全長互補(bǔ)鏈。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:28的ComK多肽，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:27或其全長互補(bǔ)鏈。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:30的ComK多肽，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:29或其全長互補(bǔ)鏈。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:32的ComK多肽，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:31或其全長互補(bǔ)鏈。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:34的ComK多肽，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸4笨針是SEQIDNO:33在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:36的ComK多肽，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸^:針是SEQIDNO:35或其全長互補(bǔ)鏈。在另一個優(yōu)選的方面，核酸"^笨針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:38的ComK多肽，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸4果針是SEQIDNO:37或其全長互補(bǔ)鏈。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:40的ComK多肽，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:39或其全長互補(bǔ)鏈。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:42的ComK多肽，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:41或其全長互補(bǔ)鏈。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:44的ComK多肽，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:43或其全長互補(bǔ)鏈。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:46的ComK多肽，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:45或其全長互補(bǔ)^1。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:48的ComK多肽，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:47或其全長互補(bǔ)鏈。在另一個優(yōu)選的方面，核酸探針是多核苷酸，其編碼SEQIDNO:50的ComK多肽，或其亞序列。在另一個優(yōu)選方面，核酸探針是SEQIDNO:49或其全長互補(bǔ)l連。對于長度至少IOO個核苷酸的長探針，將非常低至非常高嚴(yán)緊性條件定義為在42。C，在5XSSPE、0.3%SDS、200昭/ml已剪切并且變性的鮭精DNA，并且對于非常低和低嚴(yán)緊性為25%的曱酰胺、對于中和中-高嚴(yán)緊性為35%的曱酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍?yán)緊性為50。/。的曱酰胺中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡法進(jìn)行預(yù)雜交和雜交最佳12至24小時。對于長度為至少100個核苷酸的長探針，使用2XSSC、0.2%SDS優(yōu)選至少在45。C(非常低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在50。C(低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在55。C(中嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選至少在60。C(中-高嚴(yán)緊性)，甚至更優(yōu)選至少在65。C(高嚴(yán)緊性)，并且最優(yōu)選至少在70。C(非常高嚴(yán)緊性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將嚴(yán)緊性條件定義為在比使用Bolton和McCarthy的計算法(1962,/VoceeW"gsAeAto/0加"caAw70/^c/e"c^OS^48:1390)得出的Tm低大約5°C至大約10°C，在0.9MNaCl,0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA,0.5%NP-40,IxDenhardt;容'液，1mM焦石壽酸4內(nèi)(sodiumpyrophosphate),1mM石粦酉吏二氫#)(sodiummonobasicphosphate),0.1mMATP和0.2mg/ml的酵母RNA中，才艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌最佳12至24小時。對于長度大約15個核苷酸至大約70個核苷酸的短探針，將載體材料在6xSSC加0.10/。SDS中洗滌一次15分鐘，并用6xSSC在比計算的Tm低5。C至10。C的溫度下洗滌兩次，每次15分鐘。在第三個方面，分離的多核苷酸編碼ComS多肽的人工變體，所述人工變體包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8或SEQIDNO:10，或其同源序列；或其成熟多肽。在另外的第三方面，分離的多核苷酸編碼ComK多肽的人工變體，所述人工變體包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48或SEQIDNO:50,或其同源序列；或其成熟多肽。優(yōu)選地，氨基酸改變對性質(zhì)是較不重要的(ofaminornature),即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；小缺失，通常缺失1至大約30個氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端曱硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進(jìn)純化的'J、延伸，例如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域(bindingdomain)。33保守取代的實例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和曱硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例^口H.Neurath禾口R丄.Hill，1979,77ze尸rae/m1,AcademicPress,NewYork4苗述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。除了20個基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羥脯氨酸、6-7V-曱基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和a-曱基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基。"非天然氨基酸，，在蛋白質(zhì)合成后已經(jīng)過修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學(xué)方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上可獲得的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑烷羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3,3-二曱基脯氨酸?？蛇x地，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)以使ComS多肽或ComK多肽的物理化學(xué)性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改進(jìn)ComS或ComK對于MecA的結(jié)合親和力和/或結(jié)合動力學(xué)，或ComK與基因組中它的DNA序列靶標(biāo)的結(jié)合親和力等。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定點誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(alanine-scanningmutagenesis)(Cunningham和Wells,1989,;SWe"ce244:1081-1085)來鑒定親本ComS或ComK多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變導(dǎo)入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的生物活性(即，限制性內(nèi)切核酸酶活性)以鑒定對于所述分子的活性關(guān)4建的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，/編.CVw.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過物理分析結(jié)構(gòu)來測定，如通過以下這些技術(shù)如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記，連同推定的接觸位點氨基酸的突變來測定。參見例如deVos等，1992,S"'e"ce255:306-312;Smith等，1992,J.M/.編.224:899-904;Wlodaver等,1992，309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能夠通過分析與多肽的同一性來推斷，所述多肽與根據(jù)本發(fā)明的多肽相關(guān)。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組方法，繼之以有關(guān)的篩選方法，例^口刃卩些由Reidhaar-01son和Sauer，1988,Sc/ewce241:53-57;Bowie禾口Sauer，1989,尸rac.胸/.JcadCASJ86:2152-2156;WO95/17413;或WO95/22625公開的那些方法，來進(jìn)行并測試單個或多個氨基酸取代。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991,5z'octem.30:10832-10837;美國專利5,223,409;WO92/06204)和區(qū)域定向的誘變(regiondirected-mutagenesis)(Derbyshire等，1986,46:145;Ner等，1988,DiVJ7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999,AtowwB/o/ec/wo/ogy17:893-896)。能夠從宿主細(xì)胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法快速測序。這些方法允許快速確定感興趣的多肽中單個氨基酸殘基的重要性，并且能夠應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)優(yōu)選是10，更優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7,更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選1。ComS和ComK多核苷酸的表達(dá)可以用許多方式操作編碼ComS多肽或ComK多肽的多核苷酸，以用于多核苷酸在芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中的表達(dá)。依賴于核酸構(gòu)建體或載體或芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，在將多核苷酸的序列插入核酸構(gòu)建體或載體之前對其進(jìn)行操作可能是理想的或必需的。使用克隆方法修飾核苷S吏序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。包含編碼ComS多肽或ComK多肽的多核苷酸的核酸構(gòu)建體可以與一個或多個調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下能夠指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。每個調(diào)控序列對于編碼ComS多肽或ComK多肽的核苷酸序列可以是天然或外源的。這樣的調(diào)控序列包括，但不限于，前導(dǎo)序列、啟動子、信號序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻i爭的終止信號。調(diào)控序列可以與用于導(dǎo)入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進(jìn)調(diào)控序列與編碼ComS多肽或ComK多肽的核苷酸序列編碼區(qū)35的連接。調(diào)控序列可以是合適的啟動子序列，其是由用于表達(dá)編碼ComS多肽或ComK多肽的多核苷酸的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞識別的核苷酸序列。啟動子序列含有介導(dǎo)ComS多肽或ComK多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子區(qū)可以是在所選芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，并可獲得自指導(dǎo)與芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞同源或異源的具有生物活性的胞外或胞內(nèi)多肽合成的基因。啟動子區(qū)可以包含單一啟動子或啟動子的組合。當(dāng)啟動子區(qū)包含啟動子的組合時，啟動子優(yōu)選串聯(lián)(intandem)。啟動子區(qū)的啟動子可以是能啟動編碼具有生物活性的多肽的多核苷酸在感興趣的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的任何啟動子。啟動子對于編碼具有生物活性的多肽的核苷酸序列可以是天然的、外源的或其組合。這樣的啟動子能獲得自指導(dǎo)與芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞同源或異源的具有生物活性的胞外或胞內(nèi)多肽合成的基因。在優(yōu)選的方面，啟動子區(qū)包含獲得自細(xì)菌來源的啟動子。在更優(yōu)選的方面，啟動子區(qū)包含獲得自革蘭氏陽性細(xì)菌的啟動子。在另一個更優(yōu)選的方面，啟動子區(qū)包含獲得自革蘭氏陰性細(xì)菌的啟動子。革蘭氏陽性細(xì)菌包括，但不限于，芽孢桿菌屬、鏈球菌屬OS^e/tococcw力、鏈霉菌屬OS^印to^yce"、葡萄球菌屬(5Vfl;/^/ococcw力、腸球菌屬、乳桿菌屬(丄"cto/a"'〃船)、乳球菌屬(丄"ctococc附)、梭菌屬(C7o欲Www)、土芽孢桿菌屬和海洋芽孢桿菌屬(Oce朋o&cz7/附)。革蘭氏陰性細(xì)菌包括，但不限于，大腸桿菌、假單胞菌屬(尸wM(iowcway)、沙門氏菌屬0Sa/wowe〃a)、彎曲桿菌屬(C"w;^/c^acer)、螺4干菌屬(T/e/z'cc^acZar)、黃4干菌屬(F/av06acten'ww)、4臾4干菌屬(Fwso6a"en'MW)、泥桿菌屬(〃yoZ)acfer)、奈瑟氏球菌屬(Afe/Men》)和尿枝原體屬(L/rea;/a^a)。在最優(yōu)選的方面，啟動子區(qū)包含獲得自芽孢桿菌屬菌株的啟動子，例如，Bac/〃MSagara^erem、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅固芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌；或獲得自鏈霉菌屬菌抹，例如，淺青紫鏈霉菌(&，to，ces//W(i"m)或鼠灰鏈霉菌(6Vreptomyce51wwr/做力。用于指導(dǎo)編碼本發(fā)明方法中具有生物活性的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下述獲得的啟動子大腸桿菌/ac操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌6/^0/00瓊脂糖酶基因(&^)、遲緩芽孢桿菌或克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶基因("Pr//),地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(枯草蛋白酶Carlsberg基因(subtilisinCarlsberggene))，枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因Cy"cS)、枯草芽孢桿菌a-淀粉酶基因("wj^)、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(mwyi:)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因("m;;M)、解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amy0、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(peW)、枯草芽孢桿菌矽M和砂/萬基因，蘇云金芽孢桿菌擬步行甲亞種(^ac/〃M//mn'"g/em/jsubsp.^"An'om'"CryIIIA基因或其部分，原核|3-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978，JVocee(iz'"gso/AeiV加'o加/Jca<ie，o/S"'e"cas175:3727-3731),和巨大芽孢桿菌矽M基因(RygusandHillen，1992，J！^cfen'o/.174:3049-3055;Kim等，1996,(7e"e181:71-76),以及,ac啟動子(DeBoer等，1983,尸raceW"g^o/Z/zevVa"o加/爿c"fifewyo/6We"c&s80:21-25)，質(zhì)粒pUB110的0^8啟動子(Tortosa等，2000,7W0/.Mcra&o/.35:1110-1119),和spac啟動子(Henner,1990,MeAoAEwz;;mo/.185:223-228)。其他實例是5po/細(xì)菌噬菌體啟動子和tac啟動子的啟動子(DeBoer等，1983,尸r(9cmi/"g61。/決e7V"Z/cw"/血"de考^SWe"cest/S/i80:21-25)。在"Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"于5We"^/c爿wen'ca",1980,242:74-94中；詳口Sambrook，F(xiàn)ritsch，牙口Maniatis,1989，Afo/ecw/arC7ow'wg,j丄a6oratoryAfom/"/,第2版，ColdSpringHarbor,NewYork中描述了其他啟動子。在另一個優(yōu)選的方面，啟動子區(qū)包含啟動子，其為"共有"啟動子，在"-35"區(qū)具有序列TTGACA,并且在"-10，，區(qū)具有TATAAT。共有啟動子可以獲得自能在芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中起作用的任何啟動子?？梢酝ㄟ^下述方法完成"共有"啟動子的構(gòu)建使用本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行定點誘變產(chǎn)生啟動子，其更完美地符合枯草芽孢桿菌營養(yǎng)型"oA-型，，啟動子的"-10"和"-35，，區(qū)已確定的共有序歹')(Voskuil等，1995,Mo/ec"/"廠Mcro^Wogy17:271-279)。在另一個優(yōu)選的方面，啟動子區(qū)包含"共有"啟動子，該"共有"啟動子獲得自從下述獲得的啟動子大腸桿菌/"c操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂糖酶基因(""g^)、克勞氏芽孢桿菌或遲緩芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(，r//),地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(枯草蛋白酶Carlsberg基因)，枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因0flc司、枯草芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amy五)、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(a^y丄)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因(am少M)、解淀粉芽孢桿37菌a-淀粉酶基因(aw;;g)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(pew尸)、枯草芽孢桿菌和矽/J5基因，蘇云金芽孢桿菌擬步行甲亞種OyIIIA基因07/7Z4)或其部分，或原核(3-內(nèi)酰胺酶基因細(xì)菌噬菌體啟動子。在更優(yōu)選的方面，啟動子區(qū)包含獲得自解淀粉芽孢桿菌(X-淀粉酶基因(^y;0的"共有"啟動子。在另一個優(yōu)選的方面，啟動子區(qū)包含啟動子，其為雜合啟動子。在另一個優(yōu)選的方面，啟動子區(qū)包含啟動子，其為變體啟動子。參見，例如，WO05/098-16，美國專利5，698，415和美國專利6,100,063。在優(yōu)選的方面，變體啟動子是P咖yL4199，其中P^啟動子。在另一個優(yōu)選的方面，啟動子區(qū)包含啟動子，其為串聯(lián)啟動子。參見，例如，WO99/043835和WO05/098016。在優(yōu)選的方面，串聯(lián)啟動子是P共有,ye-Pc/7〃"-c廠少7/Z4mRNA力口工/穩(wěn)、定序歹'J(mRNAprocessing/stablizings叫uence)。在另一個優(yōu)選的方面，串聯(lián)啟動子是P畫^彬9-P共有。/^-^〃,"3///"1111^八加工/:急定序列。、"、',一、的多肽的多核苷酸是異源的，即使其野生型啟動子對于所述多核苷酸序列是天然的。例如，在一個由至少兩個啟動子組成的串聯(lián)啟動子中，一個啟動子可以是編碼生物物質(zhì)的多核苷酸的野生型啟動子。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，其是由芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列與編碼ComS多肽或ComK多肽的核苷酸序列的3'末端可操作地連接。在所選芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子都可用于本發(fā)明中。調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，其是對于芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于指導(dǎo)具有生物活性的多肽合成的核苦酸序列的5，-末端。在所選芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列都可用于本發(fā)明中。調(diào)控序列還可以是mRNA穩(wěn)定序列。術(shù)語"mRNA穩(wěn)定序列"在本文中定義為位于啟動子區(qū)下游和編碼ComS多肽或ComK多肽的多核苷酸編碼序列上游的序列，啟動子區(qū)與其可操作地連接，從而使所有從啟動子區(qū)合成的mRNA可以被加工以產(chǎn)生在轉(zhuǎn)錄物的5，末端包含穩(wěn)定物序列(stabilizers叫uence)的mRNA轉(zhuǎn)錄物。在mRNA轉(zhuǎn)錄物的5，末端存在這樣的穩(wěn)定物序列可以增加其半衰期(Agaisse和Lereclus,1994，見上文，Hue等，1995,Jow"a/0/Ba"e〃'o/ogv177:3465-3471)。mRNA加工/穩(wěn)定序列與細(xì)菌16S核糖體RNA的3，末端互補(bǔ)。在優(yōu)選的方面，mRNA加工/穩(wěn)定序列基本產(chǎn)生單一大小的轉(zhuǎn)錄物，其在5'末端包含穩(wěn)定序列。mRNA加工/穩(wěn)定序列優(yōu)選為一個與細(xì)菌16S核糖體RNA的3'末端互補(bǔ)的序列。參見，美國專利6,255,076和5,955,310。對于芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞有效的mRNA加工/穩(wěn)定序列是WO94/25612中公開的蘇云金芽孢桿菌co;//"mRNA加工/穩(wěn)定序列，或其保持mRNA加工/穩(wěn)定功能的部分，或Hue等，1995，Jowwa/o/^ac^v'o/ogy177:3465-3471中公開的枯草芽孢桿菌SP82mRNA加工/穩(wěn)定序列，或其保持mRNA加工/穩(wěn)定功能的部分。然后使用本領(lǐng)域已知的方法或本文所述用于表達(dá)ComS多肽或ComK多肽的方法，將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞。還可以與如上所述相似地構(gòu)建包含感興趣的DNA的核酸構(gòu)建體，所述DNA編碼或參與具有生物活性的物質(zhì)的表達(dá)。為了獲得導(dǎo)入DNA的產(chǎn)物的分泌，調(diào)控序列還可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的氨基末端相連的氨基酸序列，其可指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入細(xì)胞的苷酸序列的編碼序列的5，端可固有地包含信號肽編碼區(qū)，其與編碼分泌多肽的編碼區(qū)片段一起天然地連接在翻譯閱讀框中?？蛇x地，編碼序列5'端可含有信號肽編碼區(qū)，其對于編碼分泌多肽的編碼序列的部分是外源的。外源信號肽編碼區(qū)在編碼序列不正常含有信號肽編碼區(qū)時可能是必需的?；蛘撸饨Y(jié)合的天然信號肽編碼區(qū)獲得增強(qiáng)的多肽分泌。信號肽編碼區(qū)可以獲得自芽孢桿菌屬菌種的淀粉酶或蛋白酶基因。然而，能夠指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)可用于本發(fā)明中。對于芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞有效的信號肽編碼區(qū)是從如下獲得的信號肽編碼區(qū)芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因、嗜熱脂肪芽孢軒菌a-淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶基因、地衣芽孢桿菌P-內(nèi)酰胺酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶基因("/rr,^nW)和枯草芽孢桿菌基因。另夕卜的"f言號月太由Simonen牙口Palva，1993,M/'craWo/og/ca/Wev/ew557:109-137描述。39重組表達(dá)載體在本發(fā)明的方法中，可以使用重組表達(dá)載體重組產(chǎn)生ComS多肽或ComK多肽，所述重組表達(dá)載體包含編碼ComS多肽或ComK多肽的多核苷酸，啟動子，和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。上述各種核酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，所述載體可以包括一個或多個方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代指導(dǎo)ComS多肽或ComK多肽合成的多核苷酸。可選地，可通過將多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體插入合適的用于表達(dá)的載體中來表達(dá)多核苦酸。在制備表達(dá)載體的過程中，將編碼序列置于載體中，使得該編碼序列與用于表達(dá)和可能的分泌的合適的調(diào)控序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是任何載體，其能夠方便地進(jìn)行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生核苷酸序列的表達(dá)。載體的選擇將通常依賴于載體與將導(dǎo)入該載體的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其復(fù)制獨立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)?；蛘撸d體可以是一種當(dāng)被導(dǎo)入芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。載體系統(tǒng)可以是單獨的載體或質(zhì)?；騼蓚€或更多的載體或質(zhì)粒，其共同含有待導(dǎo)入芽孢桿菌屬細(xì)胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或者是轉(zhuǎn)座子(transposon)。當(dāng)導(dǎo)入芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞時，載體可以整合入基因組。為了整合，載體可依賴于指導(dǎo)ComS多肽或ComK多肽合成的核苷酸序列，或通過同源重組將載體穩(wěn)定整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘撸d體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導(dǎo)通過同源重組整合入芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞的基因組。所述額外的核苷酸序列使載體能夠整合入芽孢桿菌屬細(xì)胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)該優(yōu)選含有足夠數(shù)目的核酸，如100至1,500堿基對，優(yōu)選400至1,500堿基對，并且最優(yōu)選800至1，500堿基對，其與相應(yīng)的靶序列高度同源以增強(qiáng)同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞基因組中的靶序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。為了自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含復(fù)制起點，其使載體能夠在所述的40芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。細(xì)菌復(fù)制起點的實例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點，和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMfil的復(fù)制起點。復(fù)制起點可以是具有突變以使其在芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中的功能對溫度敏感的復(fù)制起點(參見，例如，Ehrlich，1978,尸racee^"^o/^e7V加'o朋/yic(2<im_y。/5Wewcay75:1433-1436)。可以將多于一個拷貝的指導(dǎo)具有生物活性的多肽，或ComS多肽或ComK多肽合成的核芬酸序列導(dǎo)入芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞以擴(kuò)增核苷酸序列的表達(dá)。核苷酸序列的穩(wěn)定擴(kuò)增可通過如下方式獲得使用本領(lǐng)域公知的方法將至少一個額外拷貝的序列整合入芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞基因組并選擇轉(zhuǎn)化體。WO94/14968中描述了用于實現(xiàn)基因組DNA序列擴(kuò)增的方便的方法。載體優(yōu)選地含有一個或多個選擇性標(biāo)記，其允許簡單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的da/基因，或賦予抗生素抗性的標(biāo)記，所述抗生素抗性例如氨,青霉素、卡那霉素、紅霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。此外，可以通過共轉(zhuǎn)化完成選擇，例如，如WO91/09129中所述，其中選擇性標(biāo)記在單獨的載體上。用于連接上述元件以構(gòu)建重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。也可以與如上所述相似地構(gòu)建包含感興趣的DNA的重組表達(dá)載體，所述DNA編碼或參與具有生物活性的物質(zhì)的表達(dá)。將載體導(dǎo)入芽孢桿菌屬細(xì)胞可，例如，通過如下實現(xiàn)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang和Cohen，1979，她/簡/arGe麼"/(7簡/to168:111-115)，使用感受態(tài)纟田月包(參見，例戈口'Young和Spizizen，1961，Jb"m"/o/5ac&n》/ogy81:823-829或Dubnau禾口Davidoff-Abelson,1971,Joz^"a/o/jWo/eci//<ar56:209—221),電穿孑L(參見，侈'B口，Shigekawa牙口Dower,1988,S〖o(jì)tec/zm々wes6:742-751)或4妄合(參見，例如，Koehler和Thome，1987,Jowma/o/Sa"en'o/ogy169:5771-5278)。DNA在本發(fā)明的方法中，根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的，導(dǎo)入感受態(tài)芽孢桿菌屬細(xì)胞的外源DNA可以是任何感興趣的DNA。DNA可以是基因組、cDNA、半合成、合成來源，或其任意組合。DNA可以編碼具有感興趣的生物活性的任何物質(zhì)(下文中的"生物物質(zhì)")或者可以是參與所述生物物質(zhì)表達(dá)的DNA,例如，啟動子。具有生物活性的物質(zhì)可以是任何感興趣的多肽。多肽對于感興趣的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞可以是天然的或異源(夕卜源)的。術(shù)語"異源多肽"在本文中定義為對宿主細(xì)胞不是天然的多肽；天然多肽，其中進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾以使天然多肽改變，例如，使天然多肽的蛋白質(zhì)序列改變；或作為通過重組DNA技術(shù)對編碼多肽的DNA操作的結(jié)果，例如更強(qiáng)的啟動子，而使其表達(dá)量改變的天然多肽。多肽可以是下述多肽和雜合多肽的天然存在的等位變體和工程改造的變體。術(shù)語"多肽"在本文并不指特定長度的編碼產(chǎn)物，因此，包括肽、寡肽和蛋白質(zhì)。術(shù)語"多肽，，還包括雜合多肽，其包含獲得自至少兩個不同多肽的部分或全部多肽序列的組合，其中一個或多個多肽對芽孢桿菌屬細(xì)胞可以是異源的。多肽進(jìn)一步包括多肽的天然存在的等位變體和工程改造的變體。在優(yōu)選的方面，多肽是抗體、抗原、抗微生物肽、酶、生長因子、激素、免疫調(diào)節(jié)劑(immunodilator)、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、報告蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子。在更優(yōu)選的方面，多肽是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶或連接酶。在最優(yōu)選的方面，多肽是a-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)式糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、(3-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖腦苷脂酶、(x-葡糖苷酶、(3-葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變構(gòu)酶(mutanase)、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、尿激酶或木聚糖酶。在另一個優(yōu)選方面，多肽是清蛋白、膠原、原彈性蛋白、彈性蛋白或明膠。在另一個優(yōu)選方面，多肽是雜合多肽，其包含獲得自至少兩個不同多肽的部分或完整多肽序列的組合，其中一個或多個多肽對于芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞可以是異源的。在另一個優(yōu)選的方面，多肽是融合的多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼一種多肽的核苷酸序列(或其部分)與編碼另一種多肽的核苷酸序列(或其部分)融合而產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，且包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在閱讀框中，并且使融合的多肽的表達(dá)在相同啟動子和終止子的調(diào)控下。編碼感興趣的多肽的DNA可以獲得自任何原核、真核或其他來源。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源有關(guān)的術(shù)語"獲得自"，意思應(yīng)為多肽由所述來源產(chǎn)生，或由其中插入了來自所述來源的基因的細(xì)胞產(chǎn)生。用于分離或克隆編碼感興趣的多肽的DNA的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，且包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或它們的組合?？赏ㄟ^例如使用熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)實現(xiàn)從這種基因組DNA克隆感興趣的多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990,尸C7^toM"WsW々;//cfl"o"，AcademicPress,NewYork?？寺〔襟E可以涉及包含編碼多肽的核酸序列的期望核酸片段的切除與分離，向載體分子中插入該片段，和將重組載體并入突變芽孢桿菌屬細(xì)胞，其中將復(fù)制多個拷貝或克隆的所述核酸序列。DNA可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任意組合?？梢杂迷S多方式操作編碼感興趣的多肽的DNA以提供DNA在合適的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中的表達(dá)。用于編碼感興趣的多肽的DNA的核酸構(gòu)建體和重組表達(dá)載體的構(gòu)建可以如本文ComS多肽或ComK多肽的表達(dá)中所述進(jìn)行。DNA還可以是調(diào)控序列，例如，啟動子，用于操作感興趣的基因的表達(dá)。調(diào)控序列的非限定性實例在本文中描述。DNA還可以是用于將芽孢桿菌屬細(xì)胞中感興趣的基因失活的核酸構(gòu)建體。DNA的范圍不限定于上述公開的具體實例，因為這些實例意欲作為對本發(fā)明幾個方面的說明。產(chǎn)生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還涉及產(chǎn)生生物物質(zhì)的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生物質(zhì)的條件下培養(yǎng)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞用編碼或參與具有生物活性的物質(zhì)的表達(dá)的外源DNA轉(zhuǎn)化，其中通過至少一個拷貝導(dǎo)入的核酸構(gòu)建體使芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞成為感受態(tài)，所述核酸構(gòu)建體包含與編碼ComS多肽的多核苷酸可操作連接的啟動子區(qū)，其中編碼ComS多肽的多核苷酸對于芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是異源的，所述細(xì)胞在導(dǎo)入該核酸構(gòu)建體之前是非感受態(tài)的；和(b)回收具有生物活性的物質(zhì)。在優(yōu)選的方面，上述成為感受態(tài)的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含至少一個拷貝的導(dǎo)入的第二核酸構(gòu)建體，所述第二核酸構(gòu)建體包含與編碼ComK多肽的多核苦酸可操作連接的啟動子區(qū)，賦予芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞更進(jìn)一步的感受態(tài)。使用本領(lǐng)域已知的方法在適合于產(chǎn)生感興趣的多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞。例如，可以通過在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離感興趣的多肽的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，和在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公布的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。分泌的感興趣的物質(zhì)能夠從培養(yǎng)基中直接回收。感興趣的生物物質(zhì)，例如多肽，可以使用本領(lǐng)域已知的特定用于該物質(zhì)的方法來檢測。這些檢測方法可包括特異性抗體的使用、高效液相層析、毛細(xì)管層析、酶產(chǎn)物的形成、酶底物的消失或SDS-PAGE。例如，酶試-驗(enzymeassay)可用于測定具有酶活性的多肽的活性。對于很多酶，用于測定酶活性的方法在本領(lǐng)域中已知(參見，例如，D.Schomburg和M.Salzmann(編)，^wzjweT/cm必ooA:,Springer-Verlag，NewYork,1990)。所得感興趣的生物物質(zhì)，例如，多肽，可以用本領(lǐng)域已知的方法分離。例如，感興趣的多肽可以通過常規(guī)方法從培養(yǎng)基中分離，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。然后分離的感興趣的生物物質(zhì)可以通過多種本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)一步純化，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦(IEF))、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)或提耳又(參見，例如，尸rato'"尸w折ca"o"，J.-C.Janson和LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)。44基因的修飾本發(fā)明還涉及產(chǎn)生親本芽孢桿菌屬細(xì)胞突變體的方法，其包括(a)將包含核酸的外源DNA轉(zhuǎn)化入親本芽孢桿菌屬細(xì)胞，以修飾親本芽孢桿菌屬細(xì)胞中編碼多肽的基因，這產(chǎn)生在相同條件下培養(yǎng)時與親本細(xì)胞相比產(chǎn)生較少的所述多肽或產(chǎn)生的多肽生物活性較低的突變細(xì)胞；其中親本芽孢桿菌屬細(xì)胞通過至少一個拷貝導(dǎo)入的第一核酸構(gòu)建體成為感受態(tài)，所述第一核酸構(gòu)建體包含與編碼ComS多肽的多核苷酸可操作連接的啟動子區(qū)，其中編碼ComS多肽的多核苷酸對于親本芽孢桿菌屬細(xì)胞是外源的，所述細(xì)胞在導(dǎo)入第一核酸構(gòu)建體之前是非感受態(tài)的；和(b)分離突變細(xì)胞。在優(yōu)選的方面，修飾是將使其產(chǎn)物的產(chǎn)生消失的基因失活。在另一個優(yōu)選的方面，上述成為感受態(tài)的芽孢桿菌屬細(xì)胞進(jìn)一步包含至少一個拷貝導(dǎo)入的第二核酸構(gòu)建體，其包含與編碼ComK多肽的多核苷酸可操作連接的啟動子區(qū)，賦予芽孢桿菌屬細(xì)胞更進(jìn)一步的感受態(tài)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的方法構(gòu)建包含修飾基因的突變細(xì)胞，例如，通過插入、破壞、替代或缺失。待修飾的基因可以是，例如，編碼區(qū)或其對于活性而言關(guān)鍵的部分，或編碼區(qū)表達(dá)所需的調(diào)節(jié)元件。這樣的調(diào)節(jié)或調(diào)控序列的實例可以是啟動子序列或其功能部分，即，足以影響基因表達(dá)的部分。其他用于可能的修飾的調(diào)控序列包括，但不限于，前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列、轉(zhuǎn)錄終止子和轉(zhuǎn)錄激活因子?？梢酝ㄟ^在基因或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)節(jié)元件中導(dǎo)入、取代或去除一個或多個核苷酸而完成基因的修飾。例如，可以插入或去除核苷酸，導(dǎo)致終止密碼子的導(dǎo)入，起始密碼子的去除，或開放閱讀框的改變。修飾基因的方便方法的實例是基于基因置換、基因缺失或基因破壞的技術(shù)。例如，在基因破壞方法中，將對應(yīng)于內(nèi)源核苷酸序列的核酸序列在體外突變，產(chǎn)生缺陷型核酸序列，然后將所述缺陷型核酸序列導(dǎo)入親本細(xì)胞，產(chǎn)生缺陷型基因。通過同源重組，缺陷核酸序列替代內(nèi)源核苷酸序列?？赡芨硐氲氖?，缺陷型核苷酸序列還編碼標(biāo)記，其可用于選擇核苷酸序列已被修飾或破壞的轉(zhuǎn)化體。在特別優(yōu)選的方面，用選擇性標(biāo)記如本文所述的那些破壞核苷酸序列。外源的多肽特別有用。因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生天然或外源多肽的方法，其包括(a)在有益于多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)突變細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。術(shù)語"外源多肽"在本文定義為對于宿主細(xì)胞不是天然的多肽，其中經(jīng)過修飾而使天然序列改變的天然蛋白質(zhì)，或作為通過重組DNA技術(shù)操作宿主細(xì)胞的結(jié)果而表達(dá)量發(fā)生改變的天然蛋白質(zhì)。能在這樣的突變體中表達(dá)的多肽的實例在本文描述。用于培養(yǎng)和純化感興趣的產(chǎn)物的方法可以通過本領(lǐng)域已知和本文所述的方法進(jìn)行。通過下述實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但不應(yīng)將下述實施例理解為對本發(fā)明范圍的限制。實施例DNA測序使用AppliedBiosystemsModel3130XGeneticAnalyzer(3130X型遺傳分析儀)(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA),利用染料終止子化學(xué)(dyeterminatorchemistry)(Giesecke等，1992，Jowma/o/Wra/.她/zocfe38:47-60)進(jìn)行DNA測序。4吏用phred/phrap/consed(UniversityofWashington,Seattle,WA,USA)用測序特定引物組裝序列。大腸桿菌菌才朱使用ONESHOTTOP10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA，USA)，SURE⑧感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(Stratagene，LaJolla,CA,USA),XL1-Blue感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(Stratagene,LaJolla,CA,USA)，和SOLOPACKGold超感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(Stratagene,LaJolla,CA，USA)用于常規(guī)的質(zhì)粒構(gòu)建與增殖。芽孢桿菌屬菌林枯草芽孢桿菌168A4源自枯草芽孢桿菌典型菌林168(BGSC1A1,BacillusGeneticStockCenter,Columbus,OH,USA)，并在s;o/Z4C、a;rE、和aw7i基因中有缺失?；救鐚莶菅挎邨U菌A164A5所述進(jìn)行這四個基因的缺失，過程如美國專利5,891,701中詳細(xì)所述。向枯草芽孢桿菌168A4的培養(yǎng)物中補(bǔ)充50叱/ml色氨酸。在枯草芽孢桿菌168A4(枯草芽孢桿菌168Aw'gFAaprEA"prEAam;^)中構(gòu)建了所有溫度敏感型質(zhì)粒。使用枯草芽孢桿菌A164A5(枯草芽孢桿菌A164Aypott4C,Aa;rE,A"jwf,Aaw》必，Aw/4C)作為宿主評價地衣芽孢桿菌cow尺過表達(dá)對枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化效率的影響。枯草芽孢桿菌菌抹MDT101，如本文所述，表達(dá)地衣芽孢桿菌SJ1904限制-修飾系統(tǒng)(restriction-modificationsystem)的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶成分，將該菌抹用于在轉(zhuǎn)化實驗前修飾質(zhì)粒DNA。地衣芽孢桿菌SJ1904(美國專利5，733，753)用作宿主用于表ii^古草芽孢桿菌com51基因，用于增加地衣芽孢桿菌com尺基因的表達(dá)，并且用于后續(xù)在地衣芽孢桿菌中誘導(dǎo)感受態(tài)。才艮才居Anagnostopolous和Spizizen，1961,/S""en'o/.81:741-746的方法專爭化枯草芽孢桿菌。根據(jù)Susanna等，2004,J5a"m'o/.186:1120-1128的方法，通過電穿孔轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌菌抹SJ1904。用已經(jīng)曱基化的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化限制-健全型(restriction-proficient)地衣芽孢桿菌菌抹，賦予其對地衣芽孢桿菌中限制(restriction)的抗性。為了提供正確的甲基化，從枯草芽孢桿菌MDT101的先前轉(zhuǎn)化體分離了DNA。培養(yǎng)基2XYT平板由每升16g胰蛋白胨、10g酵母提取物，5gNaCl，和15g細(xì)菌用瓊脂(bactoagar)組成。2XYT氨芐青霉素平板由每升16g胰蛋白胨、10g酵母提取物，5gNaCl，和15g細(xì)菌用瓊脂，補(bǔ)充有100(ig/ml氨芐青霉素組成。TBAB由TryptoseBloodAgarBase(胰蛋白際血瓊脂基底)(BDDiagnostics,FranklinLakes,NJ，USA)組成。LB培養(yǎng)基由每升10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5gNaCl組成。LB平板由LB培養(yǎng)基與每升15g細(xì)菌用瓊脂組成。LB紅霉素培養(yǎng)基由包含5嗎/ml紅霉素的LB培養(yǎng)基組成。LB紅霉素/林可霉素平板由LB培養(yǎng)基與每毫升1嗎紅霉素和25昭林可霉素組成。LB氯霉素平板由LB培養(yǎng)基與每毫升5嗎氯霉素組成。LB紅霉素/氯霉素平板由LB培養(yǎng)基與每毫升1嗎紅霉素和5(ig氯霉素組成。47VY培養(yǎng)基由每升25g小牛肉浸出物(vealinflision)(BDDiagnostics,FranklinLakes,NJ,USA)和5g酵母提取物組成。SpizizenI培養(yǎng)基由IXSpizizen鹽、0.5%葡萄糖、0.1%酵母提取物和0.02%酪蛋白水解物組成。這個培養(yǎng)基在本文也稱作基本培養(yǎng)基。IXSpizizen鹽由每升6gKH2P04,14gK2HP04,2g(NH4)2S04,1g檸檬酸鈉和0.2gofMgS04組成，pH7.0。SpizizenII培養(yǎng)基由SpizizenI培養(yǎng)基補(bǔ)充0.5mMCaCl2和2.5mMMgCl2組成。TBAB紅霉素/林可霉素平板由TBAB培養(yǎng)基和每毫升1昭紅霉素和25嗎林可霉素組成。實施例k測定地衣芽孢桿菌菌株SJ1904的基因組序列從使用454DNA測序技術(shù)(Margulies等，2005，Atowe437:376-380)產(chǎn)生的重疊群(contig)，使用Sanger測序技術(shù)的隨機(jī)配對讀數(shù)(randompairedreads),和為了關(guān)閉缺口和解析重復(fù)序列的來自基因組DNA的PCR片段的讀數(shù)，確定地衣芽孢桿菌菌抹SJ1904完整染色體的基因組序列。使用Phrap組裝測序數(shù)據(jù)，并在Consed中編輯和查看。使用Glimmer(Delcher等，1999,7Vwc/e/cJc^i^'ewc/727:4636-4641)由基因組DNA序列預(yù)測基因模型。使用E-值閾值為lXlO-5的BLASTP,通過與無冗余數(shù)據(jù)庫PIR-NREF(Wu等，2002,A^c/a'cJc/AWe"arc/z30:35-37)的比較，對基因模型進(jìn)行機(jī)器注解。實施例2:地衣芽孢桿菌M.Blil90411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶基因的鑒定使用BLASTP(Altschul等，1997,7Vwc/e/cWe^arc/z25:3389-3402)將地衣芽孢桿菌菌林SJ1904基因模型的推定的氨基酸序列與來自REBASE(Roberts,R丄，Macelis,M.，Rebase.2005)的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較。因為DNA曱基轉(zhuǎn)移酶具有中等水平的序列保守性，所以這項分析鑒定了這個基因組中所有推定的DNA曱基轉(zhuǎn)移酶。使用通過InterProScanv3.3版執(zhí)行的Prints-S16版，鑒定了M.Blil卯411中的胞嘧啶特異性DNA曱基轉(zhuǎn)移酶特征(signature)。此外，發(fā)現(xiàn)存在于胞嘧啶特異性DNA曱基轉(zhuǎn)移酶中的六個高度保守的基序(motif)在地衣芽孢桿菌M.Blil904IIDNA甲基轉(zhuǎn)移酶中也是保守的。實施例3:地衣芽孢桿菌M.Blil90411DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表征地衣芽孢桿菌M.Blil90411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶基因的核苦酸序列(SEQIDNO:51)和推定的氨基酸序列(SEQIDNO:52)如圖2A和2B中所示。編碼序列為1014bp，其包括終止密碼子。編碼區(qū)為36.1%G+C。編碼的預(yù)測蛋白質(zhì)為337個氨基酸，分子量為38.5kDa。使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970，見上文)，如EMBOSS的Needle程序中所執(zhí)行的，缺口開放罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，使用EBLOSUM62矩陣，確定了氨基酸序列的比較性配對全局比對(comparativepairwiseglobalalignment)。比對顯示，地衣芽孑包桿菌M.Blil90411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的推定氨基酸序列與韋氏芽孢桿菌C-5胞嘧啶特異性DNA曱基轉(zhuǎn)移酶前體(UniRef100—Q2AVE0)共享64%的同一性，并且與(9cea"o6ac/〃wAe少em^的胞嘧咬特異性DNA曱基轉(zhuǎn)移酶(UniRefl00—Q8EL98)共享47%的同一性。當(dāng)使用Needle標(biāo)記為"最長同一性"的輸出結(jié)果作為百分比同一性并如下計算時(相同的殘基xl00)/(比對長度-比對中缺口數(shù)目)地衣芽孢桿菌M.Blil90411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶的推定氨基酸序列與韋氏芽孢桿菌C-5胞嘧啶特異性DNA曱基轉(zhuǎn)移酶前體(UniRefl0(^Q2AVE0)共享68.5%的同一性，并且與Ocea"oki!c/〃^的胞嘧咬特異性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(UniRef100—Q8EL98)共享55.9%的同一性。實施例4:地衣芽孢桿菌M.Blil904IIDNA曱基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆為在枯草芽孢桿菌中表達(dá)而通過PCR克隆了地衣芽孢桿菌M.Blil90411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶基因。根據(jù)Pitcher等，1989,J/;/.M/cra&o/.8:151-156的方法從地衣芽孢桿菌SJ1904分離了基因組DNA。圖3顯示了包含編碼BU1904II限制性內(nèi)切核酸酶和M.Blil904IIDNA曱基轉(zhuǎn)移酶的基因的地衣芽孢桿菌染色體區(qū)域。使用如下所示的引物999611和999612,通過PCR從地衣芽孢桿菌SJ1904基因組DNA擴(kuò)增了地衣芽孢桿菌SJ1卯4染色體中約1043bp的片^:,其包括M.Blil卯411DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因的核糖體結(jié)合位點和編碼區(qū)，包含SEQIDNO:53的核苷酸2019-3049(圖3A、3B和3C)。引物999611并入了Sacl限制性位點，而引物999612并入了M/mI限制性位點。引物999611:5'-GAGCTCTGCAAGGAGGTATAATTTTG-3'(SEQIDNO:54)引物999612:5'-ACGCGTTTATTCAGCTATTGCATATTC陽3'(SEQIDNO:55)使用尸々PLATINUMDNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)進(jìn)行PCR。擴(kuò)增反應(yīng)(50iil)由下述組成IX尸々擴(kuò)增緩沖液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA),1mMMgS04，300每種dNTP,0.3每條引物，1.25單位PLATINUM尸/xDNA聚合酶，和約200ng模板DNA。使用ROBOCYCLER40溫度循環(huán)儀(StratageneCorporation,LaJolla,CA，USA)進(jìn)行反應(yīng)，程序為95°C2分鐘的1個循環(huán)；95°C1分鐘、55°C1分鐘和68°C1分鐘的30個循環(huán)；和68。C3分鐘的1個循環(huán)。使用用于測序的ZEROBLUNTTOPOPCR克隆試劑盒(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)將獲得的約1043bpPCR產(chǎn)物克隆入載體pCR4Blunt,并用PlasmidMidi試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA，USA)從一個轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA，并通過用EcoRI、Wcol和S""BI消化然后在TBE(50mMTris堿-50mM硼酸-lmMEDTA二鈉)緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進(jìn)行驗證，用五coRI消化獲得了3939bp和1061bp的期望片段;7VwI為3217bp和1783bp;而S腦BI為4165bp和835bp。通過DNA測序確認(rèn)了克隆的PCR片段的DNA序列。將這個質(zhì)粒命名為pMDT138(圖4)。根據(jù)制造商說明，將質(zhì)粒pMDT138轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL1-Blue細(xì)胞(StratageneCorporation,LaJolla,CA,USA)，在37。C在2XYT氨芐青霉素平板上選擇氨千青霉素抗性。將一個轉(zhuǎn)化體命名為MDT45，并按照布達(dá)佩斯條約的條款于2006年9月7日將其保藏在農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter),1815UniversityStreet,Peoria,Illinois,61604,并且給予登錄號NRRLB-41967。實施例5:pMDT100的構(gòu)建質(zhì)粒pMDT100是大腸桿菌復(fù)制子，其包含P呵L4199/P短共有呵Q/Pcry歸/cryIIIAstab三聯(lián)啟動子，其驅(qū)動克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(，r/7)的表達(dá)。這個a/^/Z表達(dá)盒和pC194的c^基因(Horinouchi和Weisblum，1982,/Ba"en'o/.150:804-814)兩側(cè)側(cè)翼均為枯草芽孢桿菌a-淀粉酶(amyE)基因的片段，允許通過雙同源重組藉由兩個am;^片段在枯草芽孢桿菌染色體的am;^基因座插入a/r/Z表達(dá)盒和ca/基因。用另一個基因替代pMDT100中的a嚴(yán)/Z基因允許將所述基因插入枯草芽孢桿菌染色體并在枯草芽孢桿菌中表達(dá)。pMDT100的構(gòu)建如下所述。質(zhì)粒pNBT51。根據(jù)制造商的說明，使用QIAGEN⑧質(zhì)粒試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)從大腸桿菌DH5a宿主分離了質(zhì)粒pNBT10(pDG268MCS-PrcryII1A/cryinAstab/SAV;美國專利No.6,255,076)，并用C7al和Seal消化。裂解發(fā)生在qp^/編碼序列大約在密碼子326處的C7al位點，而不是大約在密碼子23處的C/al位點，后者通i^，大腸桿菌DamDNA曱基轉(zhuǎn)移酶導(dǎo)致的曱基化而被阻斷。使用Klenow片段(NewEnglandBiolabs,Inc.，Beverly,MA,USA)和dNTP，根據(jù)制造商的說明將C/al末端平端化。通過TBE緩沖液中0.8。/。的瓊脂糖電泳分析了消化的質(zhì)粒，并使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)純化了約6615bp的載體片段。用Sa/I和Seal消化質(zhì)粒pOS4301(BacillusGeneticStockCenter,OhioStateUniversit,Columbus，OH，USA)，并使用Klenow片段和dNTP將Sa/I末端平端化，如上所述。通過TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳分析了消化的質(zhì)粒，并使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化了攜帶大腸桿菌mxS轉(zhuǎn)錄終止子的約840bp的片段?？梢詮妮d體pKK223-3(GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)(圖5)分離同樣的840bpSfl/IAS"cal片段。根據(jù)制造商的說明，用T4DNA連接酶(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN,USA)將pNBT10載體片l史和攜帶終止子的片段連接在一起，并根據(jù)制造商的說明，用所述連接物轉(zhuǎn)化了大腸桿菌DH5a(GibcoBRL,Gaithersburg,MD,USA)，在37°C在2XYT氨節(jié)青霉素平板上選擇氨千青霉素抗性。將得到的質(zhì)粒命名為pNBT51(pDG268-PcrymA/cryIIIAstab/SAVA)(圖6)。質(zhì)粒pNBT52。用斬I消化質(zhì)粒pNBT51，在ll"C與T4DNA聚合酶(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN,USA)和25iiM每種dNTP—起溫育20分鐘，將末端平端化，然后75。C溫育10分鐘，將聚合酶熱失活。然后用DraIII消化末端平端化的質(zhì)粒，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析，使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化了約5920bp的載體片段。用和五c/136H消化質(zhì)粒pNBT20(pDG268MCS-P短共有咖yQ/SAV;美國專利No.6,255,076),并且使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化了約1641bp的攜帶短共有amj^啟動子(P短共有咖yQ)的片段。如上所述連接pNBT51載體片段和P短共有amyQ片段，并如上所述用所述連接物轉(zhuǎn)化了大腸桿菌DH5a,在37。C在2XYT氨千青霉素平板上選擇氨節(jié)青霉素抗性。使用QIAPREP8小量制備試劑盒(QIAGEN,Valencia,CA,USA)從幾個轉(zhuǎn)化體分離了質(zhì)粒DNA,用印/zI消化，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析。將具有期望的約4873bp和2688bp的限制性片段的一個質(zhì)粒命名為pNBT52(pDG268-P短共有amyQ/PcryiiiA/crylIIAstab/SAVA)(圖7)。質(zhì)粒pNBT53。用^yI和5"acl消化質(zhì)粒pNBT6(pHP13amp-SAV;美國專利No.6，255，076)，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析，使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化了約6438bp的載體片段。用S/I和Sacl消化質(zhì)粒pNBT52,并通過TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳分析，并且使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化了約727bp的攜帶P短共有amyQ/PcryIIIA/cryIIIAstab串聯(lián)啟動子的片段。如上所述連接pNBT6載體片段和P短共有咖^/PCTyII1A/cryinAstab片段，并如上所述用所述連接物轉(zhuǎn)化了大腸桿菌DH5a細(xì)胞，在37。C在2XYT氨芐青霉素平板上選擇氨芐青霉素抗性。使用QIAPREP8小量制備試劑盒(QIAGEN,Valencia,CA，USA)，從幾個轉(zhuǎn)化體分離了質(zhì)粒DNA，用PvwII消化，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析。將具有期望的約4903bp、1320bp和942bp的限制性片段的一個質(zhì)粒命名為pNBT53(pHP13amp-PfeamyQ/PcryI1IA/cryinAstab/SAV)(圖8)。質(zhì)粒pNBT54。用和BawHI消化質(zhì)粒pNBTl(pDG268MCS;美國專利No.6,255,076)，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析，使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化了約6040bp的載體片段。用S/H和6amHI消化質(zhì)粒pNBT53，并通過TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳分析，并且使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化了約1953bp的攜帶P短共有amyQ/PcrymA/crylIIAstab/SAV表達(dá)盒的片段。如上所述連接pNBTl載體片l殳和P短共有amyQ/PwyiiiA/crylIIAstab/SAV片段，并如上所述用所述連接物轉(zhuǎn)化了大腸桿菌DH5a細(xì)胞，在37。C在2XYT氨千青霉素平板上選擇氨千青霉素抗性。使用QIAPREP8小量制備試劑盒，從幾個轉(zhuǎn)化體分離了質(zhì)粒DNA，并通過用S/I和5a,wHI同時消化，然后是TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖凝膠電泳來分析。52將具有期望的約6040bp和1953bp的限制性片段的一個質(zhì)粒命名為pNBT54(pDG268MCS畫P短共有amyQ/PcrymA/cryinAstab/SAV)(圖9)。質(zhì)粒pNBT35。用<S/I和BamHI消化質(zhì)粒pNBT2(pDG268MCSA-PrcrylllA/cryIIIAstab/SAV;美國專利No.6,255,076)，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化了約5394bp的載體片段。用S力I和Ba/wHI消化質(zhì)粒pNBT54，并通過TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳分析，并且使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化了約19bp的攜帶PmamyQ/PcrymA/cryinAstab/SAV表達(dá)盒的片段。如上所述連接pNBT2載體片段和P短共有amyQ/PcrymA/crylIIAstab/SAV片段，并如上所述用所述連接物轉(zhuǎn)化了大腸桿菌DH5a細(xì)胞，在37。C在2XYT氨千青霉素平板上選擇氨千青霉素抗性。使用QIAPREP⑧8小量制備試劑盒，從幾個轉(zhuǎn)化體分離了質(zhì)粒DNA，用7VcoI消化，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析。將具有期望的約5492bp和1855bp的限制性片段的一個質(zhì)粒命名為pNBT35(pDG268MCSA-P短共有myQ/PcrymA/cryniAstab/SAV)(圖10)。質(zhì)粒pNBT30。構(gòu)建了質(zhì)粒pNBT30，其包含基因啟動子的amyL4199變體的PCR克隆(美國專利No.6,100,063)。根據(jù)Pitcher等，1989,見上文的方法分離了地衣芽孢桿菌SJ1904的基因組DNA。使用如下所示的引物950872和991151，通過PCR從地衣芽孢桿菌SJ1904的基因組DNA擴(kuò)增了at^K/卯啟動子(P呵l"99)基因。引物950872并入了祈I限制性位點，而引物991151并入了Sacl限制性位點和PamyM199的變體核苷酸。引物950872:5'-CCAGGCCTTAAGGGCCGCATGCGTCCTTCTTTGTGCT-3'(SEQIDNO:56)引物991151:5'-GAGCTCCTTTCAATGTGATACATATGA-3'(SEQIDNO:57)使用AMPLITAQGoldDNA聚合酶(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA,USA)根據(jù)制造商的推薦進(jìn)行了PCR，只是MgCl2濃度是3mM,而不是標(biāo)準(zhǔn)的1.5mM。擴(kuò)增反應(yīng)(50)il)由下述組成10mMTris-HCl(pH8.3)，50mMKCl，3.0mMMgCl2,200jiM每種dNTP，0.5)iM每條引物，0.25單位AMPLITAQGoldDNA聚合酶，和約200ng模板DNA。在ROBOCYCLER40溫度循環(huán)儀中進(jìn)行PCR，程序為95°C9分鐘的1個循環(huán)；95°C1分鐘、55°C1分鐘和72°C1分鐘的30個循環(huán)；和72°C3分鐘的1個循環(huán)。使用TOPOTA克隆試劑盒(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)將得到的約625bp的PCR產(chǎn)物克隆入載體pCR2.1，并根據(jù)制造商的說明轉(zhuǎn)化入ONESHOTTOP10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)。使用QIAPREP8小量制備試劑盒從幾個轉(zhuǎn)化體分離了質(zhì)粒DNA,并通過用五coRI消化，然后是TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳來分析克隆的PCR片段的存在。將一個具有預(yù)期的約3913bp和640bp的限制性片段的質(zhì)粒命名為pNBT30(pCR2.1-amyL4199)(圖11)。通過DNA測序確認(rèn)了克隆的PCR片段的DNA序列。質(zhì)粒pNBT31。用斬I和Sacl消化質(zhì)粒pNBT3(pDG268MCSAneo-Prcl7inA/cryIIIAstab/SAV;美國專利No.6,255,076),并通過TBE纟爰沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析，使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化了約7931bp的載體片段。用和Sacl消化質(zhì)粒pNBT30,并通過TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳分析，并且使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化了約612bp的攜帶PamyL4i99的片段。如上所述連接pNBT3載體片段和P呵L彬9片段，并根據(jù)制造商的說明用所述連接物轉(zhuǎn)化了大腸桿菌XL1-Blue細(xì)胞(StratageneCorporation,LaJolla,CA,USA),在37。C在2XYT氨芐青霉素平板上選擇氨千青霉素抗性。使用QIAPREP8小量制備試劑盒從幾個轉(zhuǎn)化體分離了質(zhì)粒DNA，用7VcoI消化，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析。將具有預(yù)期的約6802bp和1741bp的限制性片段的一個質(zhì)粒命名為pNBT31(圖12)。質(zhì)粒pNBT36。用鄰I消化質(zhì)粒pNBT35,并使用T4DNA聚合酶和dNTP將末端平端化，如上所述。然后將末端平端化的質(zhì)粒用DmIII消化，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳分析。使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化了約5808bp的載體片段。用Z)raIII和Ec/136II消化質(zhì)粒pNBT31，并通過TBE緩沖液中0.8。/。的瓊脂糖電泳分析，并且使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化了約2"0bp攜帶P呵L4，的片段。如上所述連接pNBT35載體片段和P呵l彬9片段，并根據(jù)制造商的說明用所述連接物轉(zhuǎn)化了大腸桿菌SURE⑧細(xì)胞(StratageneCorporation,LaJolla，CA，USA),在37。C在2XYT氨芐青霉素平板上選擇氨千青霉素抗性。使用QIAPREP8小量制備試劑盒從幾個轉(zhuǎn)化體分離了質(zhì)粒DNA,用Wcol消化，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂4唐電泳分析。將具有預(yù)期的約5492bp和2466bp的限制性片段的一個質(zhì)粒命名為pNBT36質(zhì)粒pMDT100。用DraIII和Sacl消化質(zhì)粒pNBT13(pDG268Aneo-PamyL/P"ymA/crylIIAstab/SAV;美國專利No.6,255,076),并使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化了約6395bp的載體片段。用Drain和5WcI消化質(zhì)粒pNBT36,并通過TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電泳分析，并且使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化了約2873bp的攜帶PamyL4199/P短共有呵Q/Pcry脆三聯(lián)啟動子的片段。如上所述連接pNBT13載體片段和P肌yL499/P短共有amyQ/Pc柳A片段，并如上所述用所述連接物轉(zhuǎn)化了大腸桿菌SURE⑧細(xì)胞，在37。C在2XYT氨千青霉素平板上選擇氨千青霉素抗性。使用QIAPREP8小量制備試劑盒從幾個轉(zhuǎn)化體分離了質(zhì)粒DNA，用消化，并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖分析。將具有預(yù)期的約4974bp和4294bp的限制性片段的一個質(zhì)粒命名為pMDT100(圖14)。實施例6:地衣芽孢桿菌M.Blil904IIDNA曱基轉(zhuǎn)移酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)將地衣芽孢桿菌M.Blil90411DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因插入枯草芽孢桿菌的染色體中，以在該宿主中表達(dá)甲基轉(zhuǎn)移酶，從而允許枯草芽孢桿菌中DNA的曱基化。用5Wd和M/z.,1消化質(zhì)粒pMDT100并通過TBE緩沖液中0.8%的瓊脂糖電用Sacl和Mwl消化質(zhì)粒pMDT138，并且使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化了約1033bp的攜帶M.Blil904II基因的片段。如上所述連接pMDT100載體片段和M,Blil90411基因片段。此連接將M.Blil90411基因置于PamyL4199/P短共有amyQ/Pcry腸/ci'ylIIAstab啟動子的下游和fl尸r//轉(zhuǎn)錄終止子的上游。根據(jù)Anag廳topoulos和Spizizen，1961，■/餘e"'o/.81:741-746的方法用所述連接物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168A4,在37。C在TBAB氯霉素平板上選擇氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化體。在37t:在TBAB新霉素平板上篩選新霉素敏感的抗氯霉素轉(zhuǎn)化體，以確定是否已將DNA通過雙交換插入到枯草芽孢桿菌染色體的基因中。使用如下所示的引物994112和999592(其分別結(jié)合在三聯(lián)啟動子和MBlil90411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶基因內(nèi))和如下所示的引物999611和％0456(其分別結(jié)合在M.Blil90411DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因和基因內(nèi))，通過PCR確認(rèn)了在am;^基因座存在M.Blil904IIDNA曱基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)盒。將在aw少E基因座包含c^基因和M.Blil90411DNA曱基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)盒的一個這樣的轉(zhuǎn)化體，命名為枯草芽孢桿菌MDTIOI。引物994112:5'-GCGGCCGCTCGCTTTCCAATCTGA-3'(SEQIDNO:58)引物999592:5'-ATCGATCAGCTTGGATAAACCCTA-3'(SEQIDNO:59)引物999611:5'-GAGCTCTGCAAGGAGGTATAATTTTG-3'(SEQIDNO:60)引物960456:5'-CGTCGACGCCTTTGCGGTAGTGGTGCTT-3'(SEQIDNO:61)使用DNA聚合酶(NewEnglandBiolabs，Inc.，Beverly,MA，USA)根據(jù)制造商的說明進(jìn)行了PCR。擴(kuò)增反應(yīng)(50pl)由下述組成10mMTris-HCl(pH8.3)，50mMKCl，3.0mMMgCl2，200|iM每種dNTP,0.5pM每條引物，0.25單位r呵DNA聚合酶，和約200ng基因組DNA。在ROBOCYCLER40溫度循環(huán)儀中進(jìn)行PCR，程序為95°C2分鐘的1個循環(huán)；95°C2分鐘、55°C2分鐘和72°C2分鐘的30個循環(huán)；和72°C3分鐘的1個循環(huán)。實施例7:地衣芽孢桿菌感受態(tài)基因的編目在查詢指令中使用術(shù)語"感受態(tài)"為關(guān)鍵字搜索枯草芽孢桿菌數(shù)據(jù)庫(Subtilist;Moszer等，2002，tVmc/^c爿"A30:62-65)產(chǎn)生了50個基因的列表，這些基因在該物種的感受態(tài)發(fā)展中起作用(表l)。使用BLAST(McGi皿is和Madden,2004，iV/e/c爿c/^Wes.32:W20-5),用1x10—10的最小期望分值，在地衣芽孢桿菌ATCC14580的基因組序歹'J(Rey等，2004,Geww7e說W.5:R77)中鑒定了枯草芽孢桿菌感受態(tài)基因的直系同源基因。表1.由枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌基因組編碼的感受態(tài)基因的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>如表1所示，地衣芽孢桿菌ATCC14580基因組表現(xiàn)出攜帶除w戶基因和com^基因之外的感受態(tài)發(fā)展所需全部基因，其中comP基因已經(jīng)通過插入序列IS3祝/1(Lapidus等，2002，F(xiàn)￡MSM/cra&o/.209:23-30)破壞，而co附S或者不存在，或者與枯草芽孢桿菌中的相應(yīng)基因本質(zhì)上不同。沒有活性com尸基因產(chǎn)物，感受態(tài)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)的早期部分不能在地衣芽孢桿菌中正確工作。然而，能通過增加中央轉(zhuǎn)錄因子ComK的表達(dá)而繞過感受態(tài)級聯(lián)的早期部分，ComK誘導(dǎo)編碼DNA結(jié)合和攝取機(jī)制的后期感受態(tài)基因的轉(zhuǎn)錄(Susanna等,2004,乂Ba"en'o/.186:1120-8)。然而，如果MecA蛋白的水平高到足以結(jié)合并失活所有ComK蛋白，那么有可能僅增加com《基因的表達(dá)不足以誘導(dǎo)感受態(tài)。取而代之的，需要增加cowS基因的表達(dá)來克服MecA的活性，并且從而釋放ComK來活化后期感受態(tài)基因的轉(zhuǎn)錄。在枯草芽孢桿菌中，將comS基因嵌入基因第四個氨基酸活化域的編碼區(qū)中。因此，掃描地衣芽孢桿菌中相應(yīng)的區(qū)域Cs/;^直系同源基因)來定位可能的ComS樣序列。圖15中的比較比對顯示，最接近的預(yù)測的地衣芽孢桿菌直系同源物與枯草芽孢桿菌中已知的ComS基因產(chǎn)物略有不同，并且多個已知對生物活性重要的殘基在地衣芽孢桿菌中出現(xiàn)歧化。還不了解地衣芽孢桿菌中推定的ComS直系同源物是否有功能。進(jìn)行了兩種實驗方法。第一種方法涉及增加com〖的表達(dá)以繞過感受態(tài)級聯(lián)的早期部分，而第二種方法涉及增加comS的表達(dá)以避免ComK由MecA/ClpCP復(fù)合物降解(參見圖1)。實施例8:pMRT098的構(gòu)建使用如下所示的引物992129和992130,通過PCR從質(zhì)粒pAXOl(H汪rtl等，2001,,183:2696-2699)擴(kuò)增了矽M啟動子和矽漢基因。引物9921295'-GAGCTCGGATCCCATTTCC-3'(SEQIDNO:62)引物992130-3'(SEQIDNO:63)PCR擴(kuò)增在50^反應(yīng)中進(jìn)行，所述反應(yīng)由下述組成10ngpAXOlDNA，0.4每種引物，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200pM,包含2.5mMMgCl2的IXPCRBufferII和2.5單位AMPLITAQGOLD⑧酶(AppliedBiosystems,Inc.FosterCity,CA，USA)。在ROBOCYCLER40溫度循環(huán)儀中進(jìn)行反應(yīng)，程序為95。C10分鐘的1個循環(huán)；95°C1分鐘、53°C1分鐘和72°C1.5分鐘的25個循環(huán)；和72。C7分鐘的1個循環(huán)。通過0.5XTBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖凝膠電泳使PCR產(chǎn)物可見。期望的片段長約1500bp。使用TA-TOPO⑧克隆試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)將PCR片段克隆入載體pCR2.1,并根據(jù)制造商的說明轉(zhuǎn)化入大腸桿菌ONESHOT⑧感受態(tài)細(xì)胞。在補(bǔ)充有100嗎/ml氨千青霉素的2XYT瓊脂平板上篩選轉(zhuǎn)化體，在37。C溫育16小時。根據(jù)制造商的說明，使用BIOROBOT9600(QIAGENInc.,Valencia,CA，USA)從這些轉(zhuǎn)化體中的幾個純化了質(zhì)粒DNA,并使用M13(-20)正向和M13反向引物(Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA，USA),通過DNA測序確認(rèn)了插入物的DNA序列。將攜帶正確PCR片段的質(zhì)粒命名為pM謂91。用5a附HI和feci消化質(zhì)粒pMRT091和pUC18(Yanisch-Perron等，1985,Ge"e33:103-119)。通過0.5XTBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖凝膠電泳解析消化的產(chǎn)物，使用QIAQUICKDNA提取試劑盒,根據(jù)制造商的說明將來自pUC18的較大載體片段和來自pMRT091的較小片段凝膠純化。使用快速DNA連接試劑盒(RocheAppliedScience,Indianapolis,IN,USA),根據(jù)制造商的說明將兩個純化的片段連接在一起，并將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌XL1SE感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene,Inc.,LaJolla，CA,USA)。在補(bǔ)充有100昭/ml氨芐青霉素的2XYT瓊脂平板上篩選轉(zhuǎn)化體。根據(jù)制造商的說明，使用BIOROBOT9600從幾個轉(zhuǎn)化體中純化了質(zhì)粒DNA，并通過SamHI和Sflcl消化，然后由0.5XTBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析。通過存在約700bp的HIpMRT091片l爻而鑒定正確的質(zhì)粒，并命名為pMRT096。此外，用引物992131和992132，然后用引物992129和992131,通過SOEPCR(Horton等，1989，Gewe77:61-68)，缺失pMRT096的"/i基因中存在的和五coRI位點。引物992131(SEQIDNO:64)引物992132GAGTGGTTATTATTCAAATTGCAGATCAGGCTTTAG-3，(SEQIDNO:65)PCR擴(kuò)增在50(il反應(yīng)中進(jìn)行，所述反應(yīng)由下述組成10ngpAXOlDNA，0.4每種引物，200每種dATP、dCTP、dGTP和dTTP,包含2.5mMMgCl2的IXPCRBufferII和2.5單位AMPLITAQGOLD⑧酶。在ROBOCYCLER40溫度循環(huán)儀中進(jìn)行反應(yīng)，程序為95°C10分鐘的1個循環(huán)；95°C1分鐘、55°C601分鐘和72°C1分鐘的25個循環(huán)；和72°C7分鐘的1個循環(huán)。通過0.5XTBE緩沖液中的0.8。/。瓊脂糖凝膠電泳使PCR產(chǎn)物可見。期望的片段長約700bp。使用TA-TOPO⑧克隆試劑盒將PCR片段克隆入pCR2.1,并根據(jù)制造商的說明轉(zhuǎn)化入大腸桿菌ONESHOT⑧感受態(tài)細(xì)胞。在補(bǔ)充有100昭/ml氨千青霉素的2XYT瓊脂平板上篩選轉(zhuǎn)化體，在37。C溫育16小時。根據(jù)制造商的說明，使用BIOROBOT9600(QIAGENInc.,Valencia,CA，USA)從這些轉(zhuǎn)化體中的幾個純化了質(zhì)粒DNA,并使用M13(-20)正向和M13反向引物(Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA,USA),通過DNA測序確i^了插入物的DNA序列。將攜帶正確PCR片段的質(zhì)粒命名為pMRT092。用5amffl和」val消化質(zhì)粒pMRT096和pMRT092。通過0.5XTBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖凝膠電泳解析消化的產(chǎn)物，使用QIAQUICKDNA提取試劑盒，根據(jù)制造商的說明將來自pMRT096的較大載體片段和來自pMRT092的較小片段凝膠純化。使用快速DNA連接試劑盒，根據(jù)制造商的說明將兩個純化的片段連接在一起，并將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌XL1SE感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene,Inc.,LaJolla,CA,USA)。在補(bǔ)充有100嗎/ml氨芐青霉素的2XYT瓊脂平板上篩選轉(zhuǎn)化體。根據(jù)制造商的說明，使用BIOROBOT9600從幾個轉(zhuǎn)化體中純化了質(zhì)粒DNA，并通過EcoRI和///^III消化，然后由0.5XTBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析。通過用五coRI或///wffll消化時存在單一的4200bp片段而鑒定了正確的質(zhì)粒。將這個構(gòu)建體命名為pMRT098(圖16)。實施例9:pAComS的構(gòu)建如下構(gòu)建質(zhì)粒pAComS:用SamHI力口消化pBD2528(也稱作pComS，Hahn等，1996，Afo/.綠油'o/.21:763-75),用DNA聚合酶I(Klenow片段)處理以產(chǎn)生平末端，并且通過用T4DNA連接酶將載體再次連接而產(chǎn)生對照質(zhì)粒，其除了缺少comS基因外均與pBD2528相同。為了確保正確的曱基化以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化入地衣芽孢桿菌SJ1904，根據(jù)Anagnostopoulos和Spizizen,1961,見上文的過程，將質(zhì)粒pAcomS和pComS轉(zhuǎn)化入本文所述的枯草芽孢才干菌MDT101。在補(bǔ)充有20略/ml卡那霉素的TBAB培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化體。實施例10:擴(kuò)增地衣芽孢桿菌SJl卯4comK基因并將其克隆進(jìn)大腸桿菌載體pMRT098設(shè)計了下述PCR引物從地衣芽抱桿菌SJ1904擴(kuò)增編碼ComK的DNA。加入限制酶位點BamHI和尸WI(下劃線)以便將基因片段克隆進(jìn)pMRT098。引物999722:5'-GTGGATCCgattaggaggatcaaaatg-3，(SEQIDNO:66)引物999723:5'-CAGTACTGCAGtcaatagcgctttttcagctccctgaggatAaattcgtatatc-3，(SEQIDNO:67)使用Expand高保真PCR系統(tǒng)(RocheAppliedScience,Indianapolis,IN,USA)，通過PCR擴(kuò)增了co附K基因片段。根據(jù)Pitcher等，1989,見上文的過程，從地衣芽孢桿菌SJ1904分離了基因組DNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)混合物包含1|ilng/pl的地衣芽孢桿菌SJ1904基因組DNA,1|il引物999722(50pmol/W),1|al引物999723(50pmol/|il)，包含15mMMgCl2的5(il10XPCR緩沖液，1(ildNTP混合物(每種10mM),37.25水，和0.75(il(3.5單位/pl)DNA聚合酶混合物。使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333(Hamburg,Germany)擴(kuò)增片段'程序為94°C2分鐘的1個循環(huán)；94°C15秒、60°C30秒和72°C1分鐘的10個循環(huán)；94°C15秒、60°C30秒和72°C1分鐘的15個循環(huán)，并在每個連續(xù)的循環(huán)中加上5秒延長的72°C;和72°C7分鐘的1個循環(huán)；和4。C保溫。使用NANOSEP30KOMEGAtm萬心設(shè)備，根據(jù)制造商的說明(PallLifeScience,Inc.，AnnArbor,MI,USA)純化了579bpPCR產(chǎn)物。然后用SawHI和尸WI消化579bpPCR產(chǎn)物和載體pMRT098。使用快速DNA連接試劑盒，根據(jù)制造商的說明將所述片段連接在一起。使用兩微升反應(yīng)物，根據(jù)制造商的說明轉(zhuǎn)化大腸桿菌SURE⑧細(xì)胞。由大腸桿菌轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA,并使用1^質(zhì)粒模板、1.6ng引物999722或引斗勿999723(^口上戶斤述)并力口7K至6來觀J序。用AppliedBiosystemsModel377SequencerXL,使用染料終止子化學(xué)進(jìn)行DNA測序。將鑒定為具有正確序列的所得質(zhì)粒命名為pMRT09S/cowK(圖17)。實施例11:構(gòu)建包含在木糖誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控下的地衣芽孢桿菌SJ1904cow尺基因的大腸桿菌質(zhì)粒，其中基因和啟動子由amy丄整合臂從側(cè)翼包圍設(shè)計了下述引物從pMRT074(美國公開申請2003/175902)擴(kuò)增編碼3，整合臂的DNA:引物999726:5'-ctgaaacaacaaaaacggctttac-3'(SEQIDNO:68)引物999727:5'-ACTGAAS￡IIggttgcggtcagcgggatcg-3,(SEQIDNO:69)因為3，-a^y丄整合臂具有天然的尸Wl位點，所以為將3'-am^丄整合臂以片段克隆進(jìn)pMRT098/com《而增加歷w/111切割位點。使用Expand高保真PCR系統(tǒng)，通過PCR擴(kuò)增了目的片段。PCR擴(kuò)增反應(yīng)混合物包含約10ngpMRT074質(zhì)粒DNA,1(xl引物999726(50pmol/|il),1|al引物999727(50pmol/pl)，包含15mMMgCl2的5^IOXPCR緩沖液，1)ildNTP混合物(每種10mM)，37.25pl水，和0.75pi(3.5單位/|11)DNA聚合酶混合物。使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333擴(kuò)增片,殳，程序為94。C2分鐘的1個循環(huán)；94。C15秒、60。C30秒和72。C1分鐘的10個循環(huán)；94°C15秒、60°C30秒和72。Cl分鐘的15個循環(huán)，并在每個連續(xù)的循環(huán)中加上5秒延長的72。C;和72。C7分鐘的1個循環(huán)；和4°C保溫。使用NANOSEP30KOMEGATM離心設(shè)備，根據(jù)制造商的說明純化了450bpPCR產(chǎn)物。然后用///wffll和尸M消化純化的PCR產(chǎn)物和載體pMRT098/comK，由TBE緩沖液中的1%瓊脂糖凝膠電泳分析，并使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化兩個片段。使用快速DNA連接試劑盒，根據(jù)制造商的說明連接片段。使用兩微升反應(yīng)物，根據(jù)制造商的說明轉(zhuǎn)化大腸桿菌SURE⑧細(xì)胞。由大腸桿菌轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA,并用歷"dll和/^l消化，然后由TBE緩沖液中的1%瓊脂糖凝膠電泳分析。將鑒定為具有正確限制圖譜的所得質(zhì)粒命名為pMRT098/cow^K/cw^"'(圖18)。設(shè)計了下述引物從pMRT074擴(kuò)增編碼5'-am;;丄整合臂的DNA:引物999724:5'-AGTCgaattcgactggaagcagagc-3，(SEQIDNO:70)引物999756:5""cI5'-TCAGGAGCTCagtaccattttccctata-3，(SEQIDNO:71)加入￡coRI和5WcI限制性位點以便將5，-am_yZ整合臂克隆進(jìn)pMRT098/comA7"m;;Z3，(如上所述)。使用上述條件，通過PCR擴(kuò)增目的片段。使用NANOSEP30KOMEGA離心設(shè)備，根據(jù)制造商的說明純化了523bpPCR產(chǎn)物。然后用￡coRI和消化523bp的PCR產(chǎn)物和載體pMRT098/cow/^/am7丄3'，由TBE緩沖液中的1°/。瓊脂糖凝膠電泳分析，并使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化兩個片段。使用快速DNA連接試劑盒，根據(jù)制造商的說明連接片段。使用連接物的2pl等分試樣，根據(jù)制造商的說明轉(zhuǎn)化大腸桿菌SURE⑧細(xì)胞。由大腸桿菌轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒DNA，并用五coRI和Sacl消化，然后由IXTBE緩沖液中的1%瓊脂糖凝膠電泳分析。將鑒定為具有正確限制圖i普的所得質(zhì)粒命名為pMRT098/comX/am^y丄弁24(圖19)。實施例12:i也衣芽孑包4干菌SJ1904comK表達(dá)載體pMMar2的構(gòu)建用五coRI,Seal和///"Jill消化質(zhì)粒pMRT098/cowJK/aw_y/#24,并由TAE緩沖液(每升4.84gTris堿，1.14ml水醋酸，和2ml0.5MEDTApH8.0)中的0.7%瓊脂糖凝膠電泳，連同QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒，純化了3178bp片段。通過用五coRI和///w^II消化從pMRT077(WO2003/054163)產(chǎn)生了載體片段，并由TAE緩沖液中的0.7%瓊脂糖凝膠電泳，連同QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒，純化了4340bp片段。然后使用T4DNA連接酶，在16。C用16小時以大致相當(dāng)?shù)哪枬舛冗B接3178bp和4340bp片段。根據(jù)Anagnostopoulos和Spizizen,1961,見上文的過程，使用全部連接混合物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168A4感受態(tài)細(xì)胞。在TBAB紅霉素/林可霉素平板上篩選轉(zhuǎn)化體。根據(jù)Pitcher等，1989,見上文所述的過程，從幾個轉(zhuǎn)化體制備了枯草芽孢桿菌基因組DNA。使用PCR擴(kuò)增，使用Expand高保真PCR系統(tǒng)確認(rèn)了質(zhì)粒構(gòu)建。50piPCR擴(kuò)增反應(yīng)混合物包含約100ng基因組DNA,1pl引物999722(50pmoI/jiil)，1pl引物999727(50pmol/|il),包含15mMMgCl2的5^10XPCR緩沖液，1pidNTP混合物(每種10mM)，37.25pl水，和0.75^(3.5單位/[al)DNA聚合酶混合物。使用EppendorfMastercycler5333擴(kuò)增片段，程序為94°C2分鐘的1個循環(huán)；94°C15秒、60°C30秒和72°C1分鐘的10個循環(huán)；94°C15秒、60°C30秒和72°C1分鐘的15個循環(huán)，并在每個連續(xù)的循環(huán)中加上5秒延長的72°C;和72°C7分鐘的1個循環(huán)；和4°C保溫。包含期望的1029bp擴(kuò)增片段的轉(zhuǎn)化體，其由TBE緩沖液中0.8%瓊脂糖凝膠電泳所確定，命名為pMMar2(圖20)。此外，由枯草芽孢桿菌168A4/pMMar2制備了質(zhì)粒DNA，然后進(jìn)行限制性酶消化，通過凝膠電泳分析，得到期望大小的片段。為了確保正確的曱基化以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化進(jìn)地衣芽孢桿菌SJ1904,根據(jù)Anagnostopoulos和Spizizen,1961，見上文的過程，將質(zhì)粒pMMar2轉(zhuǎn)化進(jìn)本文所述的枯草芽孢桿菌MDT101。在TBAB紅霉素/林可霉素平板上篩選轉(zhuǎn)化體。實施例13:將pMMar2轉(zhuǎn)化進(jìn)地衣芽孢桿菌SJ1904的amjL基因座將包含木糖誘導(dǎo)型啟動子(Kim等，1996，Gewe181:71-6)調(diào)控下的地衣芽孢桿菌cow尺基因的表達(dá)盒，通過染色體整合和溫度敏感質(zhì)粒pMMar2的切除合并入地衣芽孢桿菌SJ1904的基因組DNA。將包含質(zhì)粒pMMar2的地衣芽孢桿菌轉(zhuǎn)化體在45。C涂布于TBAB紅霉素/林可霉素平板上，迫使載體整合。根據(jù)在45。C在TBAB紅霉素/林可霉素平板上生長的能力選擇期望的整合體。然后不加選擇在34。C在VY培養(yǎng)基中培養(yǎng)整合體，誘導(dǎo)切除整合的質(zhì)粒。將細(xì)胞涂布在LB平板或基本培養(yǎng)基平板上，并篩選對紅霉素^:感的菌落。篩選對紅霉素敏感的克隆通過PCR進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)變，檢測整合的xy"::cwwK表達(dá)盒。獲得的菌抹包含整合于aw^丄基因座、驅(qū)動地衣芽孢桿菌com尺表達(dá)的啟動子，將所述菌林命名為地衣芽孢桿菌SJ1904x_y":,comK。實施例14:用pMMar2、pComS或pAComS轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌SJ1904和使用質(zhì)粒Midi試劑盒，從枯草芽孢桿菌MDT101分離了質(zhì)粒pMMar2、pComS和pAComS。用pMMar2、pComS和pAComS質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化了地衣芽孢桿菌菌林SJ1904，并如上所述通過電穿孔用pComS質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化了地衣芽孢桿菌矽"::comK。將獲得的地衣芽孢桿菌轉(zhuǎn)化體分別命名為SJ1904(pMMar2)、SJ1904(pComS)、SJ1904(pAComS)和SJ1904(pComS)。實施例15:地衣芽孢桿菌cowX基因在枯草芽孢桿菌A164A5和地衣芽孢65桿菌SJ1904中的表達(dá)首先如上所述通過轉(zhuǎn)化將攜帶在木糖誘導(dǎo)型矽L4啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控下的地衣芽孢桿菌com^基因的質(zhì)粒pMMar2導(dǎo)入枯草芽孢桿菌164A5。pMMar2載體還攜帶賦予紅霉素抗性的基因。然后將命名為枯草芽孢桿菌164A5/pMMar2的紅霉素抗性轉(zhuǎn)化體，在包含葡萄糖(抑制x_y"啟動子)或葡萄糖加木糖(部分抑制xyM啟動子)或木糖(脫抑制啟動子)的培養(yǎng)基中測試感受態(tài)發(fā)展。使用上述方法，通過在包含1%木糖和/或0.5%葡萄糖的Spizizenl培養(yǎng)基中培養(yǎng)而制備枯草芽孢桿菌164A5/pMMar2和枯草芽孢桿菌164A5感受態(tài)細(xì)胞。使用前在-80。C凍存細(xì)胞。為了轉(zhuǎn)化，將細(xì)胞混合物在37。C水浴中快速解凍。向每種轉(zhuǎn)化混合物加入一^f鼓克pGME086質(zhì)粒DNA和包含0.5%葡萄糖或1%木糖和0.2pg/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基。質(zhì)粒pGME086是pE194(Gryczan等，1982,JS"c加'o/.152:722-735)的衍生物，攜帶來自pC194(Horinouchi等,1982，J5acfen'o/.150:815-825)的氯霉素抗性標(biāo)記。轉(zhuǎn)化混合物在34。C在振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時。l小時后，將反應(yīng)混合物涂布在LB氯霉素/紅霉素平板上。在34。C培養(yǎng)平板24小時。次日計數(shù)菌落，確定轉(zhuǎn)化效率。表2顯示了在以木糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中受體菌抹生長后，轉(zhuǎn)化體的數(shù)目約為在葡萄糖或葡萄糖加木糖中生長后獲得的數(shù)目的200倍。這些結(jié)果證明，異源地衣芽孢桿菌comK基因不僅由砂M啟動子轉(zhuǎn)錄，而且地衣芽孢桿菌ComK蛋白質(zhì)有效地誘導(dǎo)了枯草芽孢桿菌中的感受態(tài)狀態(tài)。表2.使用來自地衣芽孢桿菌的comK基因在枯草芽孢桿菌中的感受態(tài)誘導(dǎo)<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>t對照培養(yǎng)基是標(biāo)準(zhǔn)的枯草芽孢桿菌感受態(tài)培養(yǎng)基(Anagnostopolous和Spizizen,1961,見上文)。J這些數(shù)字是從轉(zhuǎn)化反應(yīng)的1:50稀釋測定的。括號中的數(shù)字來自重復(fù)的實驗。實施例16:DNA微陣列分析使用DNA微陣列比較葡萄糖培養(yǎng)基(cow/:抑制型)上和木糖培養(yǎng)基(comA:誘導(dǎo)型)上生長的地衣芽孢桿菌菌林SJl卯4"".vcww尺的全局轉(zhuǎn)錄語。通過點印CDS特異性寡核苷酸(50mer)而制備DNA微陣列，所述寡核苷酸選自地衣芽孢桿菌ATCC14580基因組中的蛋白質(zhì)編碼基因，如Genbank中所保存的(登錄號CP000002)。寡核苦酸購自MWG-Biotech,Inc.,Highpoint,NC，USA。用于微陣列點印、雜交和分析的方法如Berka等，2003，iVoc.Ato/.JcfldWS^100:5682-5687所述進(jìn)行。在包含0.5%葡萄糖(抑制培養(yǎng)基)或1%木糖(誘導(dǎo)培養(yǎng)基)的SpizizenI培養(yǎng)基中培養(yǎng)地衣芽孢桿菌SJ1904""::com尺細(xì)胞。在接種后1、3和5小時收獲細(xì)胞，并使用Berka等，2003，見上文中所述方法分離總細(xì)胞RNA。通過25嗎總RNA的反轉(zhuǎn)錄制備熒光4果針，4艮據(jù)Berka等，2003,見上文的過程在第一鏈cDNA中并入氨基烯丙基-dUTP。然后根據(jù)Berka等，2003,見上文的過程，通過直接偶聯(lián)至Cy3或Cy5單功能反應(yīng)活性染料(AmershamPharmaciaBiotech,ArlingtonHeights,IL,USA)而標(biāo)記氨基-cDNA產(chǎn)物。用Cy3標(biāo)記來自葡萄糖培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞的探針，并且用Cy5標(biāo)記來自木糖培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞的探針。雜交和洗滌條件與Berka等，2003,見上文中所述相同。寸吏用GENEPIX4000B掃描4義(AxonInstruments,UnionCity,CA,USA)使微陣列片成像。使用GENEPIX⑧軟件(AxonInstruments)將微陣列點的熒光強(qiáng)度值量化(包括背景減除)，并且使用S+ARRAYANALYZERTM軟件(InsightfulCorporation,Seattle,WA，USA)中提供的Lowess功能將獲得的數(shù)字標(biāo)準(zhǔn)化。根據(jù)Cy5/Cy3比例^2.0來指定受到x;;".vcom《表達(dá)單元的表達(dá)誘導(dǎo)的基因。使用DNA微陣列比較葡萄糖培養(yǎng)基Ow7《抑制型)上和木糖培養(yǎng)基(cow《誘導(dǎo)型)上生長的地衣芽孢桿菌菌抹SJ1904矽M.vcomK的全局轉(zhuǎn)錄譜。這個分析的結(jié)果顯示，與葡萄糖培養(yǎng)基相比，木糖培養(yǎng)基上生長的細(xì)胞中com尺轉(zhuǎn)錄水平有實質(zhì)性增加(10至30倍)。然而，在這個實驗中，后期感受態(tài)基因(co/^E，comF和com(7操縱子)的轉(zhuǎn)錄未出現(xiàn)相應(yīng)的增加。先前在枯草芽孢桿菌中的研究(Brzuszkiewicz等，2006，Ato/.Jew/.Sc/.t/6^103:12879-84)表明，comK轉(zhuǎn)錄的增加引起了后期感受態(tài)基因的轉(zhuǎn)錄增加。然而，這種關(guān)系未在地衣芽孢桿菌中觀察到。實施例17:pMDT131的構(gòu)建構(gòu)建了質(zhì)粒pMDT131,以創(chuàng)建賦予氯霉素抗性的溫度敏感型質(zhì)粒。用五coRI消化質(zhì)粒pMRT074(美國公開申請2003/0175902)，然后用T4DNA聚合酶加dNTP處理以產(chǎn)生平末端，如實施例5中所述。然后用iVort消化質(zhì)粒，由TBE緩沖液中0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化了約4355bp的載體片段。用￡co47III和iVo/I消化質(zhì)粒pNBTl，由TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，并使用QIAQUICK⑧凝膠提取試劑盒純化攜帶ca/基因和多克隆位點的約1222bp的片段。使用T4DNA連接酶，如上所述連接pMRT074載體片段和pNBTl片段，并根據(jù)Anagnostopoulos和Spizizen，1961,見上文的過程，用所述連接物轉(zhuǎn)化了枯草芽孢桿菌168A4,在34。C在TBAB氯霉素平板上篩選氯霉素抗性。使用質(zhì)粒Midi試劑盒，從一抹轉(zhuǎn)化體分離了質(zhì)粒DNA,并通過用BflwHI消化，然后由TBE緩沖液中0.8%瓊脂糖凝膠電泳來確認(rèn)，電泳得到了約3779bp和1802bp的期望片段。將獲得的質(zhì)粒命名為pMDT131(圖")。實施例18:枯草芽孢桿菌cowS和地衣芽孢桿菌comK基因在地衣芽孢桿菌中的共表達(dá)-有兩種可能的方法測試下述假說MecA/ClpCP復(fù)合物以意想不到的高活性阻止ComK誘導(dǎo)地衣芽孢桿菌中的后期感受態(tài)基因。第一種方法涉及me"基因的破壞。然而，先前的研究已經(jīng)表明，we"通?？梢宰鳛殂暯臃肿?，靶向受調(diào)控降解的蛋白質(zhì)(Persuh等，1999，Mo/.M/c油'o/.33:886-94)，并且因此，感受態(tài)之外的處理可能對we"-缺陷型細(xì)胞具有負(fù)面影響。第二種方法涉及增加ComS的表達(dá)，其表面上可以從MecA/ClpCP復(fù)合物釋放ComK，保護(hù)它不被降解并且從而使后期感受態(tài)基因能夠被誘導(dǎo)。為了使用這種方法，通過用質(zhì)粒和染色體DNA轉(zhuǎn)化，測試地衣芽孢桿菌菌抹SJ1904w/Avcom尺+pComS(實施例14)的感受態(tài)發(fā)展。地衣芽孢桿菌菌抹SJ1卯4xj^4.vcow尺+pComS(a)在基因座包含xyM::comK轉(zhuǎn)錄單元的拷貝，并且(b)攜帶包含枯草芽孢桿菌cwwS基因拷貝的質(zhì)粒(圖22)。作為對照，在相同的試驗中測試了很多其他地衣芽孢桿菌菌林，包括SJ1卯4背景菌抹，和僅攜帶x;^4::cowX表達(dá)單元、pComS載體或pAComS對照質(zhì)粒的菌4朱(實施例14)。將下述地衣芽孢桿菌轉(zhuǎn)化宿主從冷凍甘油儲液涂布至合適的選擇培養(yǎng)基上，在過夜培養(yǎng)后獲得連片生長SJ1904w":..com尺，SJ1904x_y/A..com/:+pComS,SJ1904+pComS，SJ1904+pAComS和SJ1904。向500ml側(cè)口瓶(side-armflask)中加入包含2。/。木糖的五十毫升SpizizenI培養(yǎng)基。向培養(yǎng)平板上加入另外5ml包含2%木糖的SpizizenI培養(yǎng)基，通過用無菌涂抹棒刮抹而收集細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至無菌管中。向側(cè)口瓶中加入每5ml培養(yǎng)物中的五百微升，獲得Klett讀數(shù)30。在37。C，250rpm溫育培養(yǎng)物11小時。向Falcon2059管加入來自每個11小時培養(yǎng)物的二百五十微升加包含2。/。木糖和2mMEGTA的250^1SpizizenII培養(yǎng)基。向每個管加入一微克轉(zhuǎn)化DNA,或者質(zhì)?；蛘呷旧wDNA，使用lOmMTris-0.1mMEDTA(TE)緩沖液作為陰性對照。對于染色體DNA，將試管在37°C、250rpm溫育1小時，對于質(zhì)粒DNA,將試管在34°C、250rpm溫育1小時。將包含染色體DNA的轉(zhuǎn)化反應(yīng)物涂布在包含100嗎/ml壯觀霉素的TBAB平板上。將包含質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化反應(yīng)物涂布在TBAB紅霉素/林可霉素平板上。對于壯觀霉素選擇在37。C溫育平板，而對于在含有紅霉素的平板上的選擇在34。C溫育。在次日計數(shù)菌落，確定轉(zhuǎn)化效率。表4中的結(jié)果表明，在本實驗所用條件下，含質(zhì)粒攜帶的枯草芽孢桿菌cowS基因的地衣芽孢桿菌受體菌抹(樣品2和3)用染色體DNA每個平板得到了約20至45個轉(zhuǎn)化體，而使用質(zhì)粒DNA時每個平板得到了3至7個轉(zhuǎn)化體。相反，不含枯草芽孢桿菌comS基因的菌林僅得到背景水平的壯觀霉素抗性菌落，沒有紅霉素抗性菌落。com51和com《基因表達(dá)提高的組合大概使地衣芽孢桿菌中的轉(zhuǎn)化效率翻倍，盡管只有com尺表達(dá)提高不誘導(dǎo)感受態(tài)。對源自地衣芽孢桿菌SJ1卯4"/A.:comK+pComS菌林的pMDT131轉(zhuǎn)化的三抹獨立的紅霉素和卡那霉素抗性菌落的PCR分析表明，這些菌林全部包含整合的",".vc^^:表達(dá)盒、pComS質(zhì)粒和基于pE194的質(zhì)粒，證明它們是真正的轉(zhuǎn)化體。表3.用質(zhì)粒和染色體DNA對地衣芽孢桿菌SJ1卯4衍生物進(jìn)行的感受態(tài)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>*三塊板的平均值**四塊^1的平均值***將無DNA對照涂布在包含壯觀霉素的培養(yǎng)基上[用壯觀霉素篩選可能產(chǎn)生低水平的自發(fā)壯觀霉素抗性突變體(Kimura等，1973，Mo/.124:107-115)]。本文描述的和要求保護(hù)的發(fā)明并不局限于本文所公開的具體實施方案的范圍內(nèi)，因為這些實施方案意欲作為本發(fā)明幾個方面的說明。任何等同的實施方案意欲在本發(fā)明的范圍內(nèi)。事實上，從前面的說明中，除本文所顯示和描述的之外，本發(fā)明的多種修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。這些修改也意欲落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在沖突的情況下，以包括定義的本公開為準(zhǔn)。本文引用了許多參考文獻(xiàn)，其公開的內(nèi)容通過提述以其整體并入。權(quán)利要求1.獲得芽孢桿菌屬轉(zhuǎn)化體的方法，包括(a)將外源DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)通過至少一個拷貝導(dǎo)入的第一核酸構(gòu)建體而成為感受態(tài)的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，所述第一核酸構(gòu)建體包含與編碼ComS多肽的多核苷酸可操作連接的啟動子區(qū)，其中編碼ComS多肽的多核苷酸對于芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是外源的，所述細(xì)胞在導(dǎo)入第一核酸構(gòu)建體之前為非感受態(tài)的；和(b)分離包含所述DNA的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體。2.權(quán)利要求1的方法，其中編碼ComS多肽的多核苷酸選自下組(i)多核苷酸，其編碼的ComS多肽包含與SEQIDNO:2,SEQIDNO:4，SEQIDNO:6,SEQIDNO:8，或SEQIDNO:10優(yōu)選具有至少60%同一性的氨基酸序列，更優(yōu)選至少65%同一性，甚至更優(yōu)選至少70%同一性，甚至更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85%同一性，最優(yōu)選至少90%同一性，和甚至最優(yōu)選至少95%同一性；(ii)多核苷酸，其包含與SEQIDNO:1,SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:7，或SEQIDNO:9優(yōu)選具有至少60%同一性的核苷酸序列，更優(yōu)選至少65%同一性，甚至更優(yōu)選至少70%同一性，甚至更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85%同一性，最優(yōu)選至少90%同一性，和甚至最優(yōu)選至少95%同一性；(iii)多核苷酸，其在優(yōu)選至少中嚴(yán)緊性條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊性條件下，和最優(yōu)選至少高嚴(yán)緊性條件下，與SEQIDNO:1，SEQIDNO:3，SEQIDNO:5，SEQIDNO:7，或SEQIDNO:9，或其全長互補(bǔ)鏈雜交；和(iv)多核苷酸，其編碼ComS變體，該ComS變體包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2，SEQIDNO:4,SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，或SEQIDNO:10。3.權(quán)利要求1的方法，其中ComS多肽包含或其組成為SEQIDNO:2,SEQIDNO:4，SEQIDNO:6,SEQIDNO:8,或SEQIDNO:10;或其保持ComS多肽活性的片段。4.權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含至少一個拷貝的導(dǎo)入的第二核酸構(gòu)建體，所述第二核酸構(gòu)建體包含與編碼ComK多肽的多核苷酸可操作連接的啟動子區(qū)，賦予芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞更進(jìn)一步的感受態(tài)。5.權(quán)利要求4的方法，其中編碼ComK多肽的多核苷酸選自下組(i)多核苷酸，其編碼的ComK多肽包含與SEQIDNO:12，SEQIDNO:14,SEQIDNO:16,SEQIDNO:18,SEQIDNO:20,SEQIDNO:22，SEQIDNO:24，SEQIDNO:26,SEQIDNO:28，SEQIDNO:30,SEQIDNO:32,SEQIDNO:34,SEQIDNO:36，SEQIDNO:38,SEQIDNO:40,SEQIDNO:42，SEQIDNO:44，SEQIDNO:46,SEQIDNO:48，或SEQIDNO:50優(yōu)選具有至少60%同一性的氨基酸序列，更優(yōu)選至少65%同一性，甚至更優(yōu)選至少70%同一性，甚至更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85°/。同一性，最優(yōu)選至少90%同一性，和甚至最優(yōu)選至少95%同一性；(ii)多核苷酸，其包含與SEQIDNO:11，SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，SEQIDNO:17，SEQIDNO:19，SEQIDNO:21,SEQIDNO:23，SEQIDNO:25,SEQIDNO:27，SEQIDNO:29,SEQIDNO:31，SEQIDNO:33，SEQIDNO:35，SEQIDNO:37,SEQIDNO:39，SEQIDNO:41，SEQIDNO:43,SEQIDNO:45，SEQIDNO:47，或SEQIDNO:49優(yōu)選具有至少60%同一性的核苷酸序列，更優(yōu)選至少65%同一性，甚至更優(yōu)選至少70%同一性，甚至更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85%同一性，最優(yōu)選至少90%同一性，和甚至最優(yōu)選至少95%同一性；(iii)多核苷酸，其在優(yōu)選至少中嚴(yán)緊性條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊性條件下，和最優(yōu)選至少高嚴(yán)緊性條件下，與SEQIDNO:ll,SEQIDNO:13，SEQIDNO:15,SEQIDNO:17，SEQIDNO:19，SEQIDNO:21，SEQIDNO:23,SEQIDNO:25,SEQIDNO:27,SEQIDNO:29，SEQIDNO:31,SEQIDNO:33,SEQIDNO:35，SEQIDNO:37，SEQIDNO:39，SEQIDNO:41，SEQIDNO:43，SEQIDNO:45，SEQIDNO:47，或SEQIDNO:49，或其全長互補(bǔ)鏈雜交；和(iv)多核苷酸，其編碼ComK變體，該ComK變體包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18,SEQIDNO:20，SEQIDNO:22，SEQIDNO:24,SEQIDNO:26,SEQIDNO:28，SEQIDNO:30，SEQIDNO:32,SEQIDNO:34，SEQIDNO:36，SEQIDNO:38，SEQIDNO:40,SEQIDNO:42，SEQIDNO:44，SEQIDNO:46，SEQIDNO:48,或SEQIDNO:50。6.權(quán)利要求4的方法，其中ComK多肽包含或其組成為SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18,SEQIDNO:20,SEQIDNO:22，SEQIDNO:24，SEQIDNO:26,SEQIDNO:28,SEQIDNO:30，SEQIDNO:32，SEQIDNO:34，SEQIDNO:36,SEQIDNO:38,SEQIDNO:40，SEQIDNO:42,SEQIDNO:44，SEQIDNO:46，SEQIDNO:48,或SEQIDNO:50;或其保持ComK多肽活性的片段。7.獲得感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞的方法，包括(a)向非感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞導(dǎo)入至少一個拷貝的第一核酸構(gòu)建體，其包含與編碼ComS多肽的多核苷酸可操作連接的啟動子區(qū)，其中編碼ComS多肽的多核苷酸對于芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是外源的；和(b)分離包含編碼ComS多肽的多核苷酸的感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞。8.權(quán)利要求7的方法，其中編碼ComS多肽的多核苷酸選自下組(i)多核苷酸，其編碼的ComS多肽包含與SEQIDNO:2,SEQIDNO:4，SEQIDNO:6,SEQIDNO:8，或SEQIDNO:10優(yōu)選具有至少60%同一性的氨基酸序列，更優(yōu)選至少65%同一性，甚至更優(yōu)選至少70%同一性，甚至更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85%同一性，最優(yōu)選至少90%同一性，和甚至最優(yōu)選至少95%同一性；(ii)多核苷酸，其包含與SEQIDNO:1，SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,或SEQIDNO:9優(yōu)選具有至少60%同一性的核苷酸序列，更優(yōu)選至少65%同一性，甚至更優(yōu)選至少70%同一性，甚至更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85%同一性，最優(yōu)選至少90%同一性，和甚至最優(yōu)選至少95%同一性；(iii)多核苷酸，其在優(yōu)選至少中嚴(yán)緊性條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊性條件下，和最優(yōu)選至少高嚴(yán)緊性條件下，與SEQIDNO:1，SEQIDNO:3，SEQIDNO:5，SEQIDNO:7，或SEQIDNO:9,或其全長互補(bǔ)鏈雜交；和(iv)多核苷酸，其編碼ComS變體，該ComS變體包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2，SEQIDNO:4,SEQIDNO:6，SEQIDNO:8,或SEQIDNO:10。9.權(quán)利要求7的方法，其中ComS多肽包含或其組成為SEQIDNO:2，SEQIDNO:4,SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，或SEQIDNO:10;或其保持ComS多肽活性的片段。10.權(quán)利要求7-9中任一項的方法，其中感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含至少一個拷貝的導(dǎo)入的第二核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含與編碼ComK多肽的多核苷酸可操作連接的啟動子區(qū)，賦予芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞更進(jìn)一步的感受態(tài)。11.權(quán)利要求10的方法，其中編碼ComK多肽的多核苷酸選自下組(i)多核苷酸，其編碼的ComK多肽包含與SEQIDNO:12,SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18，SEQIDNO:20,SEQIDNO:22，SEQIDNO:24，SEQIDNO:26,SEQIDNO:28，SEQIDNO:30,SEQIDNO:32，SEQIDNO:34，SEQIDNO:36,SEQIDNO:38,SEQIDNO:40,SEQIDNO:42,SEQIDNO:44,SEQIDNO:46，SEQIDNO:48,或SEQIDNO:50優(yōu)選具有至少60%同一性的氨基酸序列，更優(yōu)選至少65%同一性，甚至更優(yōu)選至少70%同一性，甚至更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85%同一性，最優(yōu)選至少90%同一性，和甚至最優(yōu)選至少95%同一性；(ii)多核苦酸，其包含與SEQIDNO:11,SEQIDNO:13，SEQIDNO:15,SEQIDNO:17，SEQIDNO:19,SEQIDNO:21，SEQIDNO:23,SEQIDNO:25，SEQIDNO:27,SEQIDNO:29,SEQIDNO:31，SEQIDNO:33，SEQIDNO:35，SEQIDNO:37,SEQIDNO:39，SEQIDNO:41，SEQIDNO:43，SEQIDNO:45，SEQIDNO:47，或SEQIDNO:49優(yōu)選具有至少60%同一性的核苷酸序列，更優(yōu)選至少65%同一性，甚至更優(yōu)選至少70。/。同一性，甚至更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85%同一性，最優(yōu)選至少90°/。同一性，和甚至最優(yōu)選至少95%同一性；(iii)多核苷酸，其在優(yōu)選至少中嚴(yán)緊性條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊性條件下，和最優(yōu)選至少高嚴(yán)緊性條件下，與SEQIDNO:ll,SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，SEQIDNO:17，SEQIDNO:19,SEQIDNO:21,SEQIDNO:23，SEQIDNO:25，SEQIDNO:27，SEQIDNO:29，SEQIDNO:31，SEQIDNO:33,SEQIDNO:35，SEQIDNO:37，SEQIDNO:39,SEQIDNO:41，SEQIDNO:43，SEQIDNO:45，SEQIDNO:47,或SEQIDNO:49或其全長互補(bǔ)鏈雜交；和(iv)多核苷酸，其編碼ComK變體，該ComK變體包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:12，SEQIDNO:14,SEQIDNO:16，SEQIDNO:18，SEQIDNO:20,SEQIDNO:22，SEQIDNO:24，SEQIDNO:26，SEQIDNO:28，SEQIDNO:30,SEQIDNO:32,SEQIDNO:34,SEQIDNO:36,SEQIDNO:38，SEQIDNO:40,SEQIDNO:42,SEQIDNO:44,SEQIDNO:46，SEQIDNO:48，或SEQIDNO:50。12.權(quán)利要求10的方法，其中ComK多肽包含或其組成為SEQIDNO:12，SEQIDNO:14,SEQIDNO:16,SEQIDNO:18,SEQIDNO:20,SEQIDNO:22，SEQIDNO:24，SEQIDNO:26，SEQIDNO:28，SEQIDNO:30，SEQIDNO:32，SEQIDNO:34，SEQIDNO:36，SEQIDNO:38,SEQIDNO:40,SEQIDNO:42,SEQIDNO:44,SEQIDNO:46,SEQIDNO:48,或SEQIDNO:50;或其保持ComK多肽活性的片#:。13.產(chǎn)生生物物質(zhì)的方法，包含宿主細(xì)胞，所述DNA編碼或參與具有生物活性的物質(zhì)的表達(dá)，其中通過至少一個拷貝的導(dǎo)入的核酸構(gòu)建體使芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞成為感受態(tài)，所述核酸構(gòu)建體包含與編碼ComS多肽的多核苷酸可操作連接的啟動子區(qū)，其中編碼ComS多肽的多核香酸對于芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是外源的，所述宿主細(xì)胞在導(dǎo)入核酸構(gòu)建體之前是非感受態(tài)的；和(b)回收所述具有生物活性的物質(zhì)。14.權(quán)利要求13的方法，其中編碼ComS多肽的多核苷酸選自下組(i)多核苦酸，其編碼的ComS多肽包含與SEQIDNO:1,SEQIDNO:3，SEQIDNO:5，或SEQIDNO:7優(yōu)選具有至少60%同一性的氨基酸序列，更優(yōu)選至少65%同一性，甚至更優(yōu)選至少70。/。同一性，甚至更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85%同一性，最優(yōu)選至少90%同一性，和甚至最優(yōu)選至少95%同一性；(ii)多核苷酸，其包含與SEQIDNO:2,SEQIDNO:4，SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，或SEQIDNO:10優(yōu)選具有至少60%同一性的核苷酸序列，更優(yōu)選至少65%同一性，甚至更優(yōu)選至少70%同一性，甚至更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85%同一性，最優(yōu)選至少卯°/。同一性，和甚至最優(yōu)選至少95%同一性；(iii)多核苦酸，其在優(yōu)選至少中嚴(yán)緊性條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊性條件下，和最優(yōu)選至少高嚴(yán)緊性條件下，與SEQIDNO:l，SEQIDNO:3，SEQIDNO:5，SEQIDNO:7，或SEQIDNO:9，或其全長互補(bǔ)鏈雜交；和(iv)多核苦酸，其編碼ComS變體，該ComS變體包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2，SEQIDNO:4，SEQIDNO:6,SEQIDNO:8，或SEQIDNO:10。15.權(quán)利要求13的方法，其中ComS多肽包含或其組成為SEQIDNO:2，SEQIDNO:4，SEQIDNO:6,SEQIDNO:8，或SEQIDNO:10;或其保持ComS多肽活性的片段。16.權(quán)利要求13-15中任一項的方法，其中感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含至少一個拷貝的導(dǎo)入的第二核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含與編碼ComK多肽的多核苷酸可操作連接的啟動子區(qū)，賦予芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞更進(jìn)一步的感受態(tài)。17.權(quán)利要求16的方法，其中編碼ComK多肽的多核苷酸選自下組(i)多核苷酸，其編碼的ComK多肽包含與SEQIDNO:12,SEQIDNO:14,SEQIDNO:16，SEQIDNO:18，SEQIDNO:20,SEQIDNO:22，SEQIDNO:24，SEQIDNO:26,SEQIDNO:28,SEQIDNO:30,SEQIDNO:32，SEQIDNO:34，SEQIDNO:36,SEQIDNO:38,SEQIDNO:40，SEQIDNO:42,SEQIDNO:44,SEQIDNO:46,SEQIDNO:48,或SEQIDNO:50優(yōu)選具有至少60%同一性的氨基酸序列，更優(yōu)選具有至少65%同一性，甚至更優(yōu)選至少70%同一性，甚至更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85%同一性，最優(yōu)選至少卯％同一性，和甚至最優(yōu)選至少95%同一性；(ii)多核苷酸，其包含與SEQIDNO:11，SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，SEQIDNO:17，SEQIDNO:19，SEQIDNO:21，SEQIDNO:23,SEQIDNO:25，SEQIDNO:27,SEQIDNO:29,SEQIDNO:31，SEQIDNO:33,SEQIDNO:35,SEQIDNO:37,SEQIDNO:39,SEQIDNO:41,SEQIDNO:43，SEQIDNO:45，SEQIDNO:47,或SEQIDNO:49優(yōu)選具有至少60%同一性的核苷酸序列，更優(yōu)選至少65%同一性，甚至更優(yōu)選至少70%同一性，甚至更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85%同一性，最優(yōu)選至少90%同一性，和甚至最優(yōu)選至少95%同一性；(iii)多核苷酸，其在優(yōu)選至少中嚴(yán)緊性條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊性條件下，和最優(yōu)選至少高嚴(yán)緊性條件下，與SEQIDNO:11,SEQIDNO:13,SEQIDNO:15，SEQIDNO:17，SEQIDNO:19，SEQIDNO:21，SEQIDNO:23,SEQIDNO:25，SEQIDNO:27，SEQIDNO:29，SEQIDNO:31,SEQIDNO:33，SEQIDNO:35，SEQIDNO:37，SEQIDNO:39，SEQIDNO:41，SEQIDNO:43，SEQIDNO:45,SEQIDNO:47,或SEQIDNO:49或其全長互補(bǔ)鏈雜交；和(iv)多核苷酸，其編碼ComK變體，該ComK變體包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16,SEQIDNO:18，SEQIDNO:20，SEQIDNO:22，SEQIDNO:24，SEQIDNO:26，SEQIDNO:28,SEQIDNO:30，SEQIDNO:32，SEQIDNO:34，SEQIDNO:36，SEQIDNO:38，SEQIDNO:40,SEQIDNO:42，SEQIDNO:44，SEQIDNO:46,SEQIDNO:48,或SEQIDNO:50。18.權(quán)利要求16的方法，其中ComK多肽包含或其組成為SEQIDNO:12,SEQIDNO:14，SEQIDNO:16,SEQIDNO:18,SEQIDNO:20，SEQIDNO:22，SEQIDNO:24,SEQIDNO:26，SEQIDNO:28,SEQIDNO:30，SEQIDNO:32，SEQIDNO:34,SEQIDNO:36,SEQIDNO:38，SEQIDNO:40,SEQIDNO:42，SEQIDNO:44，SEQIDNO:46,SEQIDNO:48，或SEQIDNO:50;或其保持ComK多肽活性的片段。19.感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，其包含至少一個拷貝的導(dǎo)入的第一核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含與編碼ComS多肽的多核苷酸可操作連接的啟動子區(qū)，其中編碼ComS多肽的多核苷酸對于芽孢桿菌宿主屬細(xì)胞是外源的，所述細(xì)胞在導(dǎo)入第一核酸構(gòu)建體之前是非感受態(tài)的。20.權(quán)利要求19的感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，其中編碼ComS多肽的多核苷酸選自下組(i)多核苷酸，其編碼的ComS多肽包含與SEQIDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDNO:8，或SEQIDNO:10優(yōu)選具有至少60。/。同一性的氨基酸序列，更優(yōu)選至少65%同一性，甚至更優(yōu)選至少70%同一性，甚至更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85。/。同一性，最優(yōu)選至少90%同一性，和甚至最優(yōu)選至少95%同一性；(ii)多核苷酸，其包含與SEQIDNO:1，SEQIDNO:3，SEQIDNO:5，SEQIDNO:7,或SEQIDNO:9優(yōu)選具有至少60%同一性的核苦酸序列，更優(yōu)選至少65。/。同一性，甚至更優(yōu)選至少70%同一性，甚至更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85%同一性，最優(yōu)選至少卯％同一性，和甚至最優(yōu)選至少95%同一性；(iU)多核苷酸，其在優(yōu)選至少中嚴(yán)緊性條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊性條件下，和最優(yōu)選至少高嚴(yán)緊性條件下，與SEQIDNO:1，SEQIDNO:3，SEQIDNO:5,SEQIDNO:7,或SEQIDNO:9,或其全長互補(bǔ)鏈雜交；和(iv)多核苷酸，其編碼ComS變體，該ComS變體包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2,SEQIDNO:4，SEQIDNO:6,SEQIDNO:8,或SEQIDNO:10。21.權(quán)利要求19的感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，其中ComS多肽包含或其組成為SEQIDNO:2,SEQIDNO:4，SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，或SEQIDNO:10;或其保持ComS多肽活性的片段。22.權(quán)利要求19-21中任一項的感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，其進(jìn)一步包含至少一個拷貝的導(dǎo)入的第二核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含與編碼ComK多肽的多核苷酸可操作連接的啟動子區(qū)，賦予芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞更進(jìn)一步的感受態(tài)。23.權(quán)利要求22的感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，其中編碼ComK多肽的多核苷酸選自下組(i)多核苷酸，其編碼的ComK多肽包含與SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16,SEQIDNO:18，SEQIDNO:20，SEQIDNO:22，SEQIDNO:24,SEQIDNO:26，SEQIDNO:28,SEQIDNO:30,SEQIDNO:32,SEQIDNO:34,SEQIDNO:36，SEQIDNO:38，SEQIDNO:40,SEQIDNO:42，SEQIDNO:44，SEQIDNO:46，SEQIDNO:48，或SEQIDNO:50優(yōu)選具有至少60%同一性的氨基酸序列，更優(yōu)選至少65°/0同一性，甚至更優(yōu)選至少70%同一性，甚至更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85%同一性，最優(yōu)選至少90%同一性，和甚至最優(yōu)選至少95%同一性；(ii)多核苷酸，其包含與SEQIDNO:11，SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，SEQIDNO:17，SEQIDNO:19，SEQIDNO:21,SEQIDNO:23，SEQIDNO:25，SEQIDNO:27，SEQIDNO:29,SEQIDNO:31，SEQIDNO:33,SEQIDNO:35,SEQIDNO:37，SEQIDNO:39,SEQIDNO:41,SEQIDNO:43，SEQIDNO:45,SEQIDNO:47，或SEQIDNO:49優(yōu)選具有至少60%同一性的核苷酸序列，更優(yōu)選至少65%同一性，甚至更優(yōu)選至少70%同一性，甚至更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85%同一性，最優(yōu)選至少90%同一性，和甚至最優(yōu)選至少95%同一性；(iii)多核苦酸，其在優(yōu)選至少中嚴(yán)緊性條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊性條件下，和最優(yōu)選至少高嚴(yán)緊性條件下，與SEQIDNO:ll,SEQIDNO:13，SEQIDNO:15，SEQIDNO:17,SEQIDNO:19，SEQIDNO:21，SEQIDNO:23，SEQIDNO:25，SEQIDNO:27，SEQIDNO:29，SEQIDNO:31，SEQIDNO:33，SEQIDNO:35，SEQIDNO:37，SEQIDNO:39，SEQIDNO:41,SEQIDNO:43，SEQIDNO:45,SEQIDNO:47,或SEQIDNO:49或其全長互補(bǔ)鏈雜交；和(iv)多核苦酸，其編碼ComK變體，該ComK變體包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:12,SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18，SEQIDNO:20,SEQIDNO:22，SEQIDNO:24,SEQIDNO:26，SEQIDNO:28,SEQIDNO:30，SEQIDNO:32，SEQIDNO:34,SEQIDNO:36,SEQIDNO:38,SEQIDNO:40，SEQIDNO:42,SEQIDNO:44,SEQIDNO:46,SEQIDNO:48，或SEQIDNO:50。24.權(quán)利要求22的感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，其中ComK多肽包含或其組成為SEQIDNO:12,SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18，SEQIDNO:20，SEQIDNO:22，SEQIDNO:24，SEQIDNO:26，SEQIDNO:28,SEQIDNO:30,SEQIDNO:32,SEQIDNO:34,SEQIDNO:36,SEQIDNO:38，SEQIDNO:40，SEQIDNO:42，SEQIDNO:44，SEQIDNO:46，SEQIDNO:48,或SEQIDNO:50;或其保持ComK多肽活性的片段。25.權(quán)利要求19-24中任一項的感受態(tài)芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，其已經(jīng)用外源DNA轉(zhuǎn)化。26.通過權(quán)利要求1-6中任一項的方法獲得的芽孢桿菌屬轉(zhuǎn)化體。27.通過權(quán)利要求13-18中任一項的方法獲得的生物物質(zhì)。28.產(chǎn)生親本芽孢桿菌屬細(xì)胞的突變體的方法，其包括(a)向親本芽孢桿菌屬細(xì)胞中導(dǎo)入包含核酸的外源DNA,以l奮飾親本芽孢桿菌屬細(xì)胞中編碼多肽的基因，這導(dǎo)致在相同條件下培養(yǎng)時與親本細(xì)胞相比產(chǎn)生較少的所述多肽的突變細(xì)胞，其中通過至少一個拷貝的導(dǎo)入的第一核酸構(gòu)建體使親本芽孢桿菌屬細(xì)胞成為感受態(tài)，所迷核酸構(gòu)建體包含與編碼ComS多肽的多核苦酸可操作連接的啟動子區(qū)，其中編碼ComS多肽的多核苷酸對于親本芽孢桿菌屬細(xì)胞是外源的，所述細(xì)胞在導(dǎo)入第一核酸構(gòu)建體之前是非感受態(tài)的；和(b)分離所述突變細(xì)胞。29.權(quán)利要求28的方法，其中編碼ComS多肽的多核苷酸選自下組(i)多核苦酸，其編碼的ComS多肽包含與SEQIDNO:2,SEQIDNO:4，SEQIDNO:6，SEQIDNO:8,或SEQIDNO:10優(yōu)選具有至少60%同一性的氨基酸序列，更優(yōu)選至少65%同一性，甚至更優(yōu)選至少70%同一性，甚至更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85%同一性，最優(yōu)選至少90%同一性，和甚至最優(yōu)選至少95%同一性；(ii)多核苷酸，其包含與SEQIDNO:1，SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,SEQIDNO:7，或SEQIDNO:9優(yōu)選具有至少60%同一性的核苷酸序列，更優(yōu)選至少65%同一性，甚至更優(yōu)選至少70%同一性，甚至更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85%同一性，最優(yōu)選至少90。/。同一性，和甚至最優(yōu)選至少95%同一性；(iii)多核苷酸，其在優(yōu)選至少中嚴(yán)緊性條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊性條件下，和最優(yōu)選至少高嚴(yán)緊性條件下，與SEQIDNO:1,SEQIDNO:3，SEQIDNO:5，SEQIDNO:7，或SEQIDNO:9，或其全長互補(bǔ)鏈雜交；和(iv)多核苷酸，其編碼ComS變體，該ComS變體包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:2,SEQIDNO:4，SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，或SEQIDNO:10。30.權(quán)利要求28的方法，其中ComS多肽包含或其組成為SEQIDNO:2，SEQIDNO:4，SEQIDNO:6，SEQIDNO:8，或SEQIDNO:10;或其保持ComS多肽活性的片段。31.權(quán)利要求28-30中任一項的方法，其中親本芽孢桿菌屬細(xì)胞進(jìn)一步包含至少一個拷貝的導(dǎo)入的第二核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含與編碼ComK多肽的多核苷酸可操作連接的啟動子區(qū)，賦予芽孢桿菌屬細(xì)胞更進(jìn)一步的感受態(tài)。32.權(quán)利要求31的方法，其中編碼ComK多肽的多核苷酸選自下組(i)多核苷酸，其編碼的ComK多肽包含與SEQIDNO:12,SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18，SEQIDNO:20，SEQIDNO:22，SEQIDNO:24，SEQIDNO:26,SEQIDNO:28，SEQIDNO:30，SEQIDNO:32，SEQIDNO:34，SEQIDNO:36,SEQIDNO:38,SEQIDNO:40，SEQIDNO:42，SEQIDNO:44，SEQIDNO:46，SEQIDNO:48，或SEQIDNO:50優(yōu)選具有至少60%同一性的氨基酸序列，更優(yōu)選至少65%同一性，甚至更優(yōu)選至少70%同一性，甚至更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85%同一性，最優(yōu)選至少卯％同一性，和甚至最優(yōu)選至少95%同一性；(ii)多核苷酸，其包含與SEQIDNO:11，SEQIDNO:13,SEQIDNO:15,SEQIDNO:17,SEQIDNO:19，SEQIDNO:21,SEQIDNO:23，SEQIDNO:25,SEQIDNO:27,SEQIDNO:29，SEQIDNO:31,SEQIDNO:33,SEQIDNO:35，SEQIDNO:37,SEQIDNO:39,SEQIDNO:41,SEQIDNO:43,SEQIDNO:45，SEQIDNO:47，或SEQIDNO:49優(yōu)選具有至少60%同一性的核芬酸序列，更優(yōu)選至少65%同一性，甚至更優(yōu)選至少70%同一性，甚至更優(yōu)選至少75%同一性，甚至更優(yōu)選至少80%同一性，甚至更優(yōu)選至少85%同一性，最優(yōu)選至少90%同一性，和甚至最優(yōu)選至少95%同一性；(iii)多才亥苷酸，其在優(yōu)選至少中嚴(yán)緊性條件下，更優(yōu)選至少中-高嚴(yán)緊性條件下，和最優(yōu)選至少高嚴(yán)緊性條件下，與SEQIDNO:ll，SEQIDNO:13，SEQIDNO:15,SEQIDNO:17，SEQIDNO:19，SEQIDNO:21，SEQIDNO:23，SEQIDNO:25，SEQIDNO:27,SEQIDNO:29,SEQIDNO:31，SEQIDNO:33,SEQIDNO:35,SEQIDNO:37,SEQIDNO:39,SEQIDNO:41，SEQIDNO:43，SEQIDNO:45，SEQIDNO:47，或SEQIDNO:49或其全長互補(bǔ)鏈雜交；和(iv)多核苷酸，其編碼ComK變體，該ComK變體包含取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18,SEQIDNO:20,SEQIDNO:22,SEQIDNO:24，SEQIDNO:26,SEQIDNO:28，SEQIDNO:30，SEQIDNO:32,SEQIDNO:34,SEQIDNO:36，SEQIDNO:38，SEQIDNO:40，SEQIDNO:42，SEQIDNO:44，SEQIDNO:46，SEQIDNO:48，或SEQIDNO:50。33.權(quán)利要求31的方法，其中ComK多肽包含或其組成為SEQIDNO:12，SEQIDNO:14，SEQIDNO:16，SEQIDNO:18，SEQIDNO:20,SEQIDNO:22，SEQIDNO:24,SEQIDNO:26,SEQIDNO:28,SEQIDNO:30,SEQIDNO:32,SEQIDNO:34,SEQIDNO:36,SEQIDNO:38,SEQIDNO-AO,SEQIDNO:42，SEQIDNO:44，SEQIDNO:46,SEQIDNO:48,或SEQIDNO:50;或其保持ComK多肽活性的片段。34.通過權(quán)利要求28-33中任一項的方法獲得的突變芽孢桿菌屬細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明涉及為用外源DNA轉(zhuǎn)化而在非感受態(tài)芽孢桿菌屬細(xì)胞中獲得遺傳感受態(tài)的方法。文檔編號C12N15/75GK101657538SQ200780051674公開日2010年2月24日申請日期2007年12月19日優(yōu)先權(quán)日2006年12月21日發(fā)明者蘭迪·伯卡,巴巴拉·徹里,瑪麗亞·唐,米歇爾·馬蘭塔申請人:諾維信股份有限公司