專利名稱：天花單克隆抗體的制作方法
天花單克隆抗體
相關申請
本申請要求2006年8月23日提交的申請?zhí)枮?0/839,579的美國臨時申 請的優(yōu)先權，該申請的內容在此全部納入作為參考。
背景技術：
天花是一種由痘病毒家族中成員-天花病毒所引起的嚴重的，高度傳染， 有時會致命的傳染性疾病。數(shù)千年來，天花暴發(fā)時有發(fā)生，但繼一個成功的 全球疫苗接種計劃之后，這種疾病于1977年被有效消除。該疾病消除后， 由于不再需要預防，公眾中常規(guī)天花的疫苗接種隨即停止。因此，當前人口 中很大一部分人尚未免疫接種天花。所以天花病毒的生物恐怖襲擊將極具破 壞性。重要的是，如果發(fā)生了這樣的襲擊，疫苗接種將過于緩慢，不能有效 遏止天花在目標人口中的迅速蔓延。因此，人類需要一種用于治療天花感染 的速效和有效成分。

發(fā)明內容
本發(fā)明部分地基于一個意外發(fā)現(xiàn)，即與天花病毒密切相關的痘病毒家族 成員一牛痘病毒的B5R抗原的人源化單克隆抗體能有效地中和(抑制)天花 感染。
因此，本發(fā)明一方面涉及一種含有直接抗B5R抗原的抗原結合域的人源 化單克隆抗體。這種人源化單克隆抗體(hB5RmAb)被施予患牛痘病毒感染 的患者時，能放慢牛痘病毒感染進程。它可具有與EM-1000雜交瘤細胞株 (ATCC Deposit Designation PTA-7594)所產(chǎn)生的單克隆抗體相同的抗原表位 特異性。該人源化抗體可包括與SEQIDNO:l (如下所示)相同，最多有兩 個單氨基酸差異的第一重鏈互補決定區(qū)(CDR)序列，與SEQIDNO:2 (如 下所示)相同，最多有四個單氨基酸差異的第二重鏈CDR序列，與SEQID
5NO:3 (如下所示)相同，最多有四個單氨基酸差異的第三重鏈CDR序列； 以及與SEQIDNO:4 (如下所示)相同，最多有四個單氨基酸差異的第一輕 鏈CDR序列，與SEQIDNO:5 (如下所示)相同，最多有三個單氨基酸差異 的第二輕鏈CDR序列，與SEQIDNO:6 (如下所示)相同，最多有三個單氨 基酸差異的第三輕鏈CDR序列。該人源化抗體可由含上述重鏈和輕鏈CDR 序列的單個多肽組成。
本發(fā)明另 一方面涉及一種包含上述抗體的培養(yǎng)細胞。
本發(fā)明再一方面涉及一種編碼多肽的分離的核酸，該多肽包括含有上述 重鏈或輕鏈CDR序列的人源化重鏈可變區(qū)序列。
本發(fā)明又一方面涉及包含上述核酸之一 的培養(yǎng)細胞。
從以下詳細描述以及權利要求書中可以看到本發(fā)明的其它特點或優(yōu)點。 發(fā)明詳細描述
以下所述為來自供體(如大鼠或小鼠)抗牛痘病毒B5R抗原的單克隆 抗體的新型人源化單克隆抗體(hB5RmAb)，可用于檢測天花病毒并抑制其 感染宿主細胞的能力。將鼠類單克隆抗體(mAb)作為治療劑施予人體，能 產(chǎn)生具有潛在危險的免疫應答。本發(fā)明的人源化單克隆抗體不會引發(fā)這種免 疫應答，因此可用作治療劑或預防劑。
此處所用的術語"單克隆抗體"，指含有免疫球蛋白重鏈或輕鏈可變 區(qū)的任何多肽。該多肽包括如二價抗體，單價抗體，單鏈抗體(即含有重 鏈和輕鏈可變區(qū)的單個多肽)，F(xiàn)ab片段，雙鏈抗體，微型抗體，以及與氨 基酸序列形成的其融合體，所述氨基酸序列與任何免疫球蛋白不相關或序列 同源性低(即低于60%)。
術語"人源化單克隆抗體"指有至少一個可變區(qū)框架序列與人類框架 序列接近或相同的上述任一種多肽，例如一種從人免疫球蛋白噬菌體展示庫 分離出來的抗體。
由此處所述的被hB5RmAb識別的B5R蛋白(Genbank CAA46496)序 列顯示如下LLL (SEQIDNO:7)
可用本領域熟知的分析方法來測定B5R抗原的親代或人源化抗體的親和 性。例如，參見Azimzadeh et al., J. Immunol Methods, 141(2): 199-208 (1991) 和Ota et al., Hybridoma, 17(5):471-7 (1998)。 hB5RmAb可具有與EM-1000雜 交瘤(如下所示)產(chǎn)生的抗體相同的B5R抗原表位特異性。表位定位的方法 早已確立并易于實行，如Steinmann " a/., J Wra/. 78(17):9030-40 (2004)中所 示。
此處所述的hB5RmAb可具有如下第一、第二和第三重鏈互補決定區(qū) (H-CDRsl-3)，其來源于供體(如大鼠或小鼠)抗B5R抗原的單克隆抗
體:
H畫CDR 1 H畫CDR 2 H-CDR 3
NYHVH CSEQIDNO:l) LMWRDGDTSYNPTLKS (SEQ ID NO:2) GSEYYGLLGYVMGA (SEQ ID NO:3)
它們可具有如下第一、第二和第三輕鏈互補決定區(qū)(L-CDRsl-3): L-CDR 1KASKSISKSLA (SEQ ID NO:4)
L-CDR2 SGSTLQS (SEQIDNO:5) L-CDR 3QQHNEYPVT (SEQ ID NO:6)
如上述發(fā)明內容部分所指出，此處所述hB5RmAb的每個CDR序列與如 上所列SEQ ID NOs: 1-6相比，可包括數(shù)個氨基酸差異
H-CDR 1與SEQ ID NO:l相比最多2個單個氨基酸的差異 與SEQ IDNO:2相比最； 與SEQ IDNO:3相比最； 與SEQ ID NO:4相比最； 與SEQ IDNO:5相比最；
H-CDR 2 H-CDR 3 L-CDR 1 L陽CDR 2
4個單個氨基酸S 4個單個氨基酸的差異 4個單個氨基酸的差異 3個單個氨基酸的差異L誦CDR 3與SEQ ID NO:6.相比最多3個單個氨基酸的差異 所述差異可包括氨基酸替換、刪除、插入和增加。當該差異為氨基酸替換 時，優(yōu)選保守性氨基酸替換。保守性氨基酸替換是指一個氨基酸被另一個具有 相似化學特性的氨基酸替換。表1說明20種基因編碼的氨基酸可根據(jù)其化學 性質的分組。
表l:氨基酸根據(jù)化學性質分組酸性中性脂肪族芳香族堿性
天門冬氨 酸，谷氨酸天冬酰胺，谷氨酰胺 半胱氨酸，蛋氨酸， 脯氨酸，絲氨酸，蘇 氨酸丙氨酸，甘氨酸，異 亮氨酸，亮氨酸，纈 氨酸組氨酸，苯丙氨 酸，色氨酸，酪 氨酸精氨酸， 賴氨酸
引入上述任何突變的技術都是本領域眾所周知的(例如，在易錯宿主細胞
中的定點突變，易錯PCR和序列復制)。包含上述任何突變類型的 hB5RmAb，其結合B5R的能力可通過一些常用技術非常有效地測得，例如， 通過ELISA或噬菌體展示技術。這些分析的高通量版本都是本領域所已知的， 可與誘變技術結合用來分離具有更高抗原親和力的hB5RmAb，而不需要進行 額外的努力。參見美國專利No. 6,916,474。
對于hB5RmAb的可變區(qū)，考慮到作為抗原結合區(qū)來源的供體抗體的類別 或類型，可以使用任何人受體可變區(qū)框架序列。該人受體可變區(qū)框架序列也 可以為共有序列，即在若干自然發(fā)生的序列基礎上產(chǎn)生的一種序列。優(yōu)選所 用的人受體框架與供體抗體具有相同或相似的種類或類型。優(yōu)選地，將人類 III組Y (gamma)種系框架用于復合重鏈，將人I組K (kappa)種系框架用于 復合輕鏈。hB5RmAb的重鏈和輕鏈可以各自包含來自供體可變區(qū)框架序列的 高達約15個殘基。在hB5RmAb框架區(qū)序列內包含供體可變區(qū)框架殘基可以增 強抗體對其抗原的親和力。例如，在美國專利No. 5,998，586和No.6,056,957中 描述了選擇合適供體框架殘基的方法。
考慮到抗體可能需要的功能，特別是效應子功能，此處所述的hB5RmAb 的恒定區(qū)域被選中。例如，該恒定區(qū)域可以是人IgA,IgE,IgG或IgM域。當 hB5RmA是為了治療用途并需要抗體效應子功能時，尤其可使用IgG人恒定區(qū)域，特別是IgGl和IgG3同種型。修飾的人恒定區(qū)域還可用于一個或多個氨基 酸殘基被更改或刪除以改變某個特定效應子功能的情況。
此處所述的hB5RmAb可含有附加的效應子或報道分子(例如，融合多 肽)。此外，重鏈或輕鏈的恒定區(qū)的氨基酸序列可以用編碼功fe性的非免疫 球蛋白多肽的氨基酸序列來替代，如親和標記物，熒光蛋白，酶或毒素分 子。因此，抗體分子的剩余部分不必只包括免疫球蛋白的序列。
本發(fā)明的再一方面包括編碼形成hB5RmA的人源化重鏈和輕鏈的DNA 序列。含有該DNA序列的克隆和表達載體以及由該DNA序列轉化的宿主細 胞，以及在轉化的宿主細胞內產(chǎn)生含有表達該的DNA序列的抗體分子的方 法，也都屬于本發(fā)明的再一方面。構建載體的一般方法，轉染方法和培養(yǎng)方 法均為本領域所熟知，且不需要額外的努力易于實現(xiàn)。編碼抗-B5R供體氨 基酸序列的DNA序列可通過如國際專利申請WO 93/16184中所示的熟知方 法容易地獲得。例如，抗-B5R編碼序列可從合適的雜交瘤細胞株通過基因 克隆或cDNA克隆獲得。陽性克隆可用重鏈或輕鏈所需的適當探針進行篩 選。此外，可使用PCR克隆。
人類受體的氨基酸序列可通過任何一種標準方法獲得。例如，編碼人類 受體框架的DNA序列，如人i組輕鏈和人m組重鏈，都為本領域技術人員 所熟知且廣泛應用。
標準分子生物學技術可用于制備所需的DNA序列。該序列可完全或部 分地用寡核苷酸合成技術合成，可適當采用定點突變和PCR技術。例如，可 采用Jones "a/.A^ww， 321, 522 (1986)中所述的寡核苷酸定向合成。還可釆 用Verhoeyen &a/.， 5Wewce, 239, 1534-1536 (1988)中所述的預先存在可變區(qū)的 寡核苷酸定點突變。此外，還可采用Queen " 尸rac. Ato/. Jcad. L/S4 86, 10029-10033 (1989)和WO 90/07861中所述的用T4 DNA聚合酶進行的缺 口寡核苷酸的酶填充技術。
核苷酸也可以從各種商業(yè)來源訂購，如Sigma-Genosys公司(sigma-
genosys.com/oligo.asp)， 米德蘭認證試齊U公司 (mcrc@oligos.com)， 大美 國基因公司(The Great American Gene Company, genco.com) ， ExpressGen公司(expressgen.com) ， Operon Technologies公司(力口禾U福尼亞州，阿拉米 達)以及許多其它公司。
任何合適的宿主細胞和載體系統(tǒng)可用于編碼hB5RmA重鏈或輕鏈的 DNA序列的表達。優(yōu)選地，采用真核宿主細胞(如，哺乳動物)表達系統(tǒng)， 尤其合適的哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞和骨髓瘤或雜交瘤細胞株。
在一種實施方式中，hB5RmAb由雜交瘤細胞株EM-1000分泌。本申請 人已經(jīng)按照布達佩斯條約，向位于美國弗吉尼亞州20110-2209馬納薩斯的美 國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏了該EM-1000雜交瘤細胞株 (ATCC保藏編號PTA-7594)。保藏的該雜交瘤細胞株取自與本申請日前由 EMAB LLC, 3 Hunt Road, Lexington, MA 02421所保藏的相同的保藏物。保 藏的雜交瘤細胞會不加限制地在ATCC存放處保藏30年，或最新請求提出 后的5年，或本專利的有效期，以較長期限為準；如果在該期限內保藏物失 活則將被替換。
上述hB5RmAb可包含在藥物組合物中，作為預防或治療用途。例如， 一種藥物組合物可包括有效量的hB5RmAb和藥學上可接受的載體。 一般 地，該有效量將產(chǎn)生一個循環(huán)的hB5RmAb濃度，其足以定量結合被感染主 體內循環(huán)的天花或牛痘病毒或使感染進程放慢。盡管如此，正如本領域技術 人員所公認的，有效量將會發(fā)生變化，這取決于感染的嚴重性，干預的階 段，主體的一般健康狀況和年齡，以往的治療手段，給藥途徑，賦形劑使 用，以及和其它預防和治療手段共同使用的可能性。
本發(fā)明的范圍還包括一種通過給有需要的患者施予有效量的上述抗體， 用于治療主體天花感染的方法。接受治療的患者可被認為是具有或正處于與 天花感染有關的危險條件下。術語"治療"指給患者施予該組合物，目的是 為了治愈，緩和，減輕，補救或改善紊亂、紊亂的癥狀、疾病繼發(fā)的狀態(tài)、 或對這種疾病的易感性。"有效量"指能在接受治療的患者上產(chǎn)生醫(yī)學上所 需結果的組合物的用量。
為了實踐本發(fā)明的方法，含hB5RmAb的組合物可通過腸外途徑系統(tǒng)給 藥。給藥時，優(yōu)選該治療組合物以無熱源，腸外可接受的水溶液的形式給 藥。制備該種腸外可接受的蛋白質溶液，同時適當考慮pH，等滲性，穩(wěn)定性等，都屬于本領域的技能?？刹捎玫哪c外可接受的載體和溶劑是甘露醇， 水，林氏液和生理鹽溶液。
根據(jù)需要，hB5RmAb可連續(xù)給藥一段時間。連續(xù)注入組合物并在一段 時間維持其系統(tǒng)濃度的方法均為本領域已知的。例如，此處所述的組合物可 從滲透性小型泵或其它隨時間釋放的裝置中釋放或傳輸。初級滲透性小型泵 的釋放率可用處于釋放口的微孔性、快速反應的凝膠調節(jié)。滲透性微型泵可 用于在較長時間(如，從一小時到一周)控制組合物的釋放。這種微型泵及 其它緩釋裝置可從商業(yè)上獲得，如DURECT公司(加利福尼亞，庫柏提諾 市)。活性組合物也可以栓劑的形式直腸給藥。
以下具體實施例僅為說明本發(fā)明，不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余
內容。不需進一步說明，相信本領域技術人員可以基于本說明書，最大程度 地利用本發(fā)明。此處引用的所有出版物的全部內容在此納入作為參考。
用抗-BR5單克隆抗體中和體內牛痘病毒
抗牛痘病毒的病毒包膜蛋白B5R的鼠雜交瘤抗-BR5在DMEM中生長 (Schmelz et al., J Virol" 68(1):130-147 (1994);和Galmiche et al.， Virology, 254(1):71-80(1999))，該單克隆抗體在蛋白G瓊脂糖凝膠上進行純化。
6至8周齡的Balb/c小鼠(3只/組)用107噬斑經(jīng)鼻內感染形成牛痘病 毒單位。五個小時后，經(jīng)intraperitonally注射10或30嗎抗-BR5單克隆抗體 或預-免疫鼠IgG (PI)。然后每隔一天監(jiān)測小鼠體重，持續(xù)12天。比較用 未配對單側"則試各個劑量的抗-BR5和PI動物的結果。
在對照動物中，第2天觀察到小鼠體重下降，第6天達到高峰，并在第 12天回升。在抗-BR5治療動物中，觀察到類似模式。但是，在第6天接受 30g抗-BR5的動物體重下降明顯較少(與PI情況相比pO.OOl)。
人源化抗-BR5單克隆抗體
抗-BR5輕鏈和重鏈可變區(qū)的cDNA經(jīng)PCR擴增，并亞克隆到pCRII (Invitragen公司)進行序列測定。通過若干獨立的克隆獲得核苷酸序列。選擇從獨立的克隆中得到的相同cDNA序列來表示抗-BR5抗體的輕鏈或重鏈 可變區(qū)。
將CDR移植應用于大鼠抗-BR5抗體的人源化。為保留結合親和力和特 異性，在將CDR移lt到人類框架時，保留V區(qū)域構型是很重要的。經(jīng)過氨 基酸序列比較，人類抗體IC4的框架區(qū)域被用作大鼠抗-BR5的人源化的框架 供體。
設計并合成四對引物(每對約80個堿基長度)以編碼人源化抗-BR5可 變區(qū)的蛋白質序列，包括信號肽。每對引物約20個核苷酸重疊?；虻难b 配和擴增包括四個步驟(1)對4對互補寡核苷酸進行退火，并用Klenow 片段經(jīng)4個單獨反應將其延伸；(2)由此產(chǎn)生的4個dsDNA片段經(jīng)兩兩混 合，變性，再退火，以兩個不同反應延長(3)由此產(chǎn)生的兩個dsDNA片段 經(jīng)混合，變性，再退火和延伸，以形成最后的全長dsDNA;和(4)由此產(chǎn) 生的DNA用引物經(jīng)PCR擴增，以便在兩端引入効"I位點。然后PCR片段 經(jīng)^fefll消化，并插入到各自的J^al-消化的pVK和pVg4載體。
然后測試人源化抗-BR5的特異性，詳情如下所述。將編碼人源化抗-BR5重鏈和輕鏈的質粒共轉染至C0S-7細胞內，然后收集并純化取自培養(yǎng)細 胞的用完的上清液。通過^Western blot分析，測試人源化抗-BR5與在COS - 7 細胞或大腸桿菌內表達的B5R胞外域的相互作用能力。
為發(fā)展穩(wěn)定的可產(chǎn)生人源化抗-BR5的細胞株，用脂質轉染胺試劑 (lipofectamine) 2000 (invigrogen)將編碼人源化抗-BR5重鏈和輕鏈的質 粒共轉染至CHO/dhfr-細胞內。轉染24小時后，用選擇培養(yǎng)基(20nM甲氨 蝶呤阿爾法MEM)將細胞置于到96孔組織培養(yǎng)板。用耐甲氨蝶呤的克隆測 試人源化IgG的產(chǎn)生。有限稀釋適用于鑒別高產(chǎn)單克隆細胞株。
其它實施方式
本說明書中披露的所有特征可以任意組合合并。說明書中披露的每一特 征可被另一種具有相同，相當或類似目的的特征所取代?；谏鲜雒枋觯绢I域技術人員可以很容易地確定本發(fā)明的本質特征， 并且在不違背本發(fā)明精神和范圍的情況下，可做出本發(fā)明的各種變化和修 改，以使其適應不同用途和條件。因此，本發(fā)明也涉及其它實施方式。
權利要求
1、一種人源化單克隆抗體，包含抗B5R抗原的抗原結合域，其中抗體與該B5R抗原結合。
2、 根據(jù)權利要求1的單克隆抗體，其中將該抗體施予患牛痘病毒感染 的患者時，使感染進程放慢。
3、 根據(jù)權利要求1的人源化單克隆抗體，其中該抗體包括與SEQ ID NO:l相同，最多有兩個單氨基酸差異的第一重鏈CDR序列，與SEQID NO:2相同，最多有四個單氨基酸差異的第二重鏈CDR序列，與SEQ ID NO:3相同，最多有四個單氨基酸差異的第三重鏈CDR序列；以及與SEQ ID NO:4相同，最多有四個單氨基酸差異的第一輕鏈CDR序列，與SEQ ID NO:5相同，最多有三個單氨基酸差異的第二輕鏈CDR序列，與SEQ ID NO:6相同，最多有三個單氨基酸差異的第三輕鏈CDR序列。
4、 根據(jù)權利要求3的人源化單克隆抗體，其中該抗體由單一的多肽組成。
5、 根據(jù)權利要求3的人源化單克隆抗體，其中第一重鏈CDR序列與 SEQIDNO:l相同，第二重鏈CDR序列與SEQ ID NO:2相同，第三重鏈 CDR序列與SEQ ID NO:3相同；以及第一輕鏈CDR序列與SEQ ID NO:4相 同，第二輕鏈CDR序列與SEQIDNO:5相同，第三輕鏈CDR序列與SEQ ID NO:6相同。
6、 根據(jù)權利要求5的人源化單克隆抗體，其中該抗體由單一的多肽組成。
7、 根據(jù)權利要求1的人源化單克隆抗體，其中該抗體具有與由ATCC保 藏編號PTA-7594的細胞株產(chǎn)生的單克隆抗體相同的抗原表位特異性。
8、 根據(jù)權利要求7的人源化單克隆抗體，其中該抗體由ATCC保藏編號 PTA-7594的細胞株產(chǎn)生。
9、 根據(jù)權利要求7的人源化單克隆抗體，其中該抗體由單一的多肽組成。
10、 一種分離的核酸，包括編碼一多肽的一核酸序列，該多肽包括一人源化免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，所述人源化免疫球蛋白重鏈可變區(qū)含有與SEQ IDNO:l相同，最多有兩個單氨基酸差異的第一重鏈CDR序列，與SEQ ID NO:2相同，最多有四個單氨基酸差異的第二重鏈CDR序歹:i，與SEQ ID NO:3相同，最多有四個單氨基酸差異的第三重鏈CDR序列。
11、 根據(jù)權利要求10的核酸，其中第一重鏈CDR序列與SEQIDNO:l 相同，第二重鏈CDR序列與SEQ ID NO:2相同，第三重鏈CDR序列與SEQ ID NO:3相同。
12、 根據(jù)權利要求ll的核酸，其中該編碼的多肽包含SEQIDNO:7。
13、 一種分離的核酸，包括編碼一多肽的核酸序列，該多肽包括一人源 化免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，所述人源化免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)含有與SEQ IDNO:4相同，最多有四個單氨基酸差異的第一輕鏈CDR序列，與SEQ ID NO:5相同，最多有三個單氨基酸差異的第二輕鏈CDR序列，以及與SEQ ID NO:6相同，最多有三個單氨基酸差異的第三輕鏈CDR序列。
14、 根據(jù)權利要求13的核酸，其中第一輕鏈CDR序列與SEQIDNO:4 相同，第二輕鏈CDR序列與SEQ ID NO:5相同，第三輕鏈CDR序列與SEQ ID NO:6相同。
15、 根據(jù)權利要求13的核酸，其中該多肽包含SEQIDNO:8。
16、 一種含有權利要求1的單克隆抗體的培養(yǎng)細胞。
17、 一種含有權利要求3的單克隆抗體的培養(yǎng)細胞。
18、 一種含有權利要求11的核酸的培養(yǎng)細胞。
19、 一種含有權利要求13的核酸的培養(yǎng)細胞。
20、 根據(jù)權利要求19的培養(yǎng)細胞，進一步包括一分離的核酸，該分離 的核酸含有編碼一多肽的核酸序列，該多肽包括一人源化免疫球蛋白重鏈可 變區(qū)，所述人源化免疫球蛋白重鏈可變區(qū)含有與SEQIDNO:l相同，最多有 兩個單氨基酸差異的第一重鏈CDR序列，與SEQIDNO:2相同，最多有四 個單氨基酸差異的第二重鏈CDR序列，與SEQIDNO:3相同，最多有四個 單氨基酸差異的第三重鏈CDR序列。
21、 一種治療患者天花感染的方法，該方法包括將有效量的權利要求1 的抗體施予有需要的患者。
全文摘要
本發(fā)明公開了抗牛痘病毒B5R表面抗原的人源化單克隆抗體。該抗體可有效治療天花感染。本發(fā)明還公開了編碼該抗體重鏈和輕鏈的核酸，以及表達它們的細胞。
文檔編號C12P21/08GK101553255SQ200780039448
公開日2009年10月7日 申請日期2007年8月22日 優(yōu)先權日2006年8月23日
發(fā)明者瑪麗-海倫妮·朱文, 讓-皮埃爾·基內 申請人:奎爾斯根制藥有限責任公司